Moleküler Tıp ve Gen Tedavisine Giriş Kerimi E. GÖKAY, M.D., Ph.D. 2005 Gökay Biyotek Ltd. Şti. / Medikal Yayın Grubu Önsöz: Moleküler biyoloji, genetik ve hücre biyolojisi ana dallarını kendine baz alan ilk uygulamalı (klinik) tıp dalı, moleküler tıp, iki ana temel eksen üzerine inşaa edilmiştir; molekuler genetik tanı (bakınız: diğer yayınlarımız ve www.genetik.web.tr) ve moleküler genetik tedavi. Gen tedavisi, moleküler tıp dalında tedavi veya bir baska deyisle genetik modifikasyon ayağını oluşturan tüm uygulamaları kapsayan genel bir terimdir. Bu eserin amacı konuyla ilgilenen hekim meslekdaşlarımız ve diğer tüm ilgililere Moleküler Tıpta teadvi ayağında gelinen son noktayı yanlızca bugün ile sınırlı kalmadan ileriye dönük bir bakış açısı ile özetlemektir. 1970 lerin başında moleküler biyolojide rekombinant DNA teknolojisi dalında yaşanan gelişmeler moleküler tıp ve gen tedavisine giden yolda ilk yeşil ışığı yakmıştır. Zira modern DNA mühendisliği bize insan gibi kompleks bir organizmada görev yapan genleri dahi intonlarından ayrılmış mini cdna (komplementer DNA) dizinleri olarak alarak, virüs promoter dizinleri veya bakteri plazmidleri gibi birtakım başka DNA parçaları ile birleştirmek suretiyle yeni sentetik ve fonksiyonel genler inşaa etme imkanını vermektedir. Doğal olarak böyle bir teknoloji genetik hastalıkların tedavisinde bu güne kadar hayal bile edemediğimiz yeni tedavi yöntemleri vaat etmektedir. Dahası genetik modifikasyon veya gen tedavisi her geçen gün ortaya konan yeni uygulamarı ile (DNA bazlı aşılar, DNAzyme fonksiyonel grupları, sirna katologları ve benzeri) tıp biliminde bambaşka bir çağa girdiğimizin bir habercisidir. İlk Gen tedavisi klinik denemesi 1991 yılında bir immün yetmezlik hastalığı olan Adenozin deaminaz (ADA) yetmezliğnin tedavisi amacıyla yanlızca iki hastadan ibaret bir grup üzerinde yapılmıştır. Bu iki hastadan biri tedavi sonrası yanlızca orta derecede iyileşme göstermiştir. Ancak diğer hasta (Ashi DeSilva) en iyi tahminlerinde ötesinde bir düzelme göstererek tıp literatürüne ilk başarılı gen tedavisi olgusu olarak girmiştir. 1990 larda bu başarının ardından birçok yeni deneme daha gerçekleştirilmiştir. Ancak çok üzücüdür ki, 1998 yılında Pennsylvania Üniversitesinde yapılan bir denemede Jesse Gelsinger isimli hasta dogrudan uygulanan gen tedavisine bağlı bir komplikasyon sonucu kaybedilmştir. Bu olgunun ardından her ne kadar gen tedavisi ciddi olark eleştirilmiş hatta ivme kaybetmiş olsada, gen tedavisi ve kök-hücre terapi yöntemleri konvansiyonel medikal yöntemlerle bu güne kadar tedavi edilmelerinin hatta imkansiz olduğunu düşündüğümüz hastalıklar için yep yeni ve pırıl, pırıl bir ümit vat etmektedir. Unutulmamalıdırki deneysel cerrahi girişimler, kötü cerrahi teknik, ekipman yetersizliği, anestezi veya nakahat dönemi komplikasyonları gibi nedenlerle geçtiğimiz yüzyılda
kaybedilen hasta sayısı burada sayamayacağımız kadar çoktur. Jesse Gelsinger olgusu ise her ne kadar üzücü olsa da, bu olgu hastanın doğrudan gen tedavi girişimine bağlı bir komplikasyondan dolayı kaybedildiği dokumante edilmiş tek olgudur. Bu gerçek ileriye yönelik gen tedavisinde risk ve potansiyel başarı analizi yapılırken akılda tutulmalıdır. Moleküler tıpta tedavi uygulamaları endikasyon bakımından iki ana grup hastaya yöneliktir. Birinci grup hastalarda gen tedavisi, özgün bir genetik hastalık taşıdığı saptanmış kişilerde bu hastalığın giderilmesi veya kontrol altına alınması amacıyla uygulanmaktadır. İkinci grup hastalarda ise, hastanın özgün genetik yapısı bilinmemesine veya normal sınırlar içinde olmasına rağmen, (kanser hastalığı veya viral hastalıklar gibi) başlıca çevresel etkenli birtakım hastalıklarda bağışıklanma veya tedavi amacıyla hastaların belli organ yada dokularında bazı gen ürünlerinin yapay yollarla üretilmesi amacına yönelıktir. Bir başka deyişle gen tedavisi uygulamaları yanlızca genetik hastalıkların tedavisi amacıyla sınırlı değildir. Ancak ister özgün bir genetik hastalığın tedavisi, isterse çevresel etkenli bir hastalığın tedavisine yönelik olsun, tüm gen tedavisi uygulamalarında ortak olan unsur tedavide kullanılan anahtar terapötik ajanın doğal yada modifiye bir gen yada yapay moleküer bir genetik modifikasyon aracı olmasıdır (sirna veya DNAzyme benzeri sentetik moleküller gibi). Gen tedavisinde hedef alınan dokunun niteliği bakımından moleküler tıpta tedavi protokollerini başlıca iki gruba ayırabiliriz; Somatik genoterapi ve Germinal genoterapi. Somatik genoterapi uygulamalarında gen tadavisi için hedef alınan doku yanlızca hastanın bünyesel (somatik) dokularıdır. Bu niteliği ile uygulanan ajan veya uygulama yöntemi ne olursa olsun, somatik genoterapi uygulaması yanlizca hasta bireyin kendisine yöneliktir ve kesinlikle bu tedavinin hastanın ileri nesilleri (projenisi) üzerinde hiçbir kalıcı etkisi yoktur. Doğal olarak çevresel hastalıkların tedavisine yönelik gen tedavisi uygulamalarının tümü ve genetik hastalıklara yönelik uygulanan tedavi yöntemlerin büyük çoğunluğu somatik genoterapi grubuna dahildir. Germinal genoterapi amaçlı gen tedavisi yöntemlerinde özgün olarak hedeflenen doku bireyin reprodüktif (germinal) hücreleridir. Yani burada amaç ileri nesilleri etkileyecek kalıcı bir genetik modifikasyon yaratmaktır. Doğal olarak insanlar üzerinde bu tip deneysel uygulamalar birçok ülkede etik komiteler ve kanunlar çerçevesinde yasaklanmıştır. Bu sebeple, ailevi genetik hastalıkların tedavisinde potansiyel bir uygulama yöntemi olmasının dışında germinal dokuya yönelik gen tedavisinin bugün için veya yakın gelecekte hiç bir klinik uygulaması mevzubahis değildir. Ne var ki, germinal genoterapi ve germinal genetik modifikasyon birçok tarım bitkisi ve laboratuvar denek hayvanları üzerinde başarı ile uygulanmış ve halen uygulanmaktadır. Gen tedavisinde kullanılan moleküler genetik terapötik ajanın hastaya uygulanma yöntemi bakımından ise moleküler tıpda tedavi protokollerini ex vivo gen tedavisi, lokalize in vivo gen tedavisi ve sistemik in vivo gen tedavisi olmak üzere başlıca üç ana gruba ayırabiliriz. Kelime kökünden de anlaşılacağı üzere, ex vivo gen tedavisi uygulamalarında terapötik ajanın uygulanacağı hedef hücreler hastadan veya uygun bir
donörden temin edilir ve bünye dışında bu hücrelere genetik modifikasyon uygulanır. Ex vivo protokollerde genellikle hedef hücreler gen tedavisi uygulandıktan sonra test edilip yapay ortamlarda çoğaltıldıktan sonra hastaya nakledilir. Bu yöntem kemik iliği veya deri gibi dokulardan elde edilen bilhassa kök hücrelerin hedef alındığı gen tedavisi protokollerinde büyük avantaj ve başarı vaat etmektedir. In vivo gen tedavisi protokollerinde ise genetik modifikasyon yöntemi sistemik yada lokal yollarla dogrudan hastaya uygulanır. Doğal olarak sistemik bir genetik hastalığın nihai tedavisi amaçlamdığında sistemik in vivo gen tedavisi tercih sebebi olabilir. Ancak henüz moleküler tıp protokolleri arasında böylesine geniş kapsamlı, etkin ve güvenilir bir rutin uygulama günümüzde mevcut değildir. Ancak, genetik aşılama, lokal organ ve doku tutulumlarında paliatif ve küratif tedavi ayrıca bazı sistemik hastalıklarda lokalize veya paliatif tedavi uygulamalarında birçok lokalize in vivo gen tedavisi protokolleri geliştirilmiş, bunların bir kısmı üçüncü basamak klinik deneme aşamasına gelmiş ve yakında rutin medikal uygulamalar arasına girmesi beklenen uygulamalardır. Bu sebeple lokalize in vivo gen tedavisi protokolleri bu eserde ağırlıkla ele aldığımız temel konudur. Terapötik moleküler ajanların hedef hücrelere etkin bir şekilde ulaştırılması gen tedavisinde ne yazıkki önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu güne kadar yapılan araştırmalar göstermiştir ki, muhtemelen çizgili kas dokusu haricinde başka hiçbir doku veya organa genetik materyalin doğrudan enjekte edilmesi veya parenteral yolla uygulanması etkin bir gen tedavisi için kesinlikle yeterli değildir. Bu sebeple gen tedavisinde moleküler terapötik ajanların hedef doku ve hücrelere ulaştırılması için bir takım ek biyolojik, kimyasal veya fiziksel yöntemler geliştirilmiştir. Terapötik ajanın hedef doku ve hücrelere ulaştırılmasında kullanılan yönteme göre gen tedavisi protokollerini öncelikle virolojik ve virolojik olmayan yöntemler olmak üzere iki ana gruba ayırıyoruz. Virolojik gen tedavisi protokollerinde hedef doku ve hücrelere ulaştırılmak istenen genler moleküler klonlama yöntemlerile önce biyolojik olarak modifiye edilmiş taşıyıcı bir virüsün genomuna nakledilir ve kendi kendine çoğalma yeteneğini kaybetmiş olan bu taşıyıcı virüsler doku kültürleründe çoğaltılır ve laboratuvar koşullarında arındırılır. Hastaya nakledilmek istenen hedef genleri taşıtan bu virüsler taşıyıcı virüsün tipine göre uygun bir şekilde (parenteral yolla, solunum yoluyla, v.s.) hastaya belli doz ve kürlerde uygulanır. Doğal olarak gen tedavisinde kullanılan virüsler etkinlik bakımından halen elimizde bulunan en etkin gen tedavisi araçları arasındadır. Ne var ki, biyolojik bir ajan olmaları ve yapıları ne olursa olsun sonuçta hücre için bir patojen olmaları nedeniyle modifiye virüslerin kullanıldığı tüm virolojik gen tedavisi protokolleri bir takım ciddi riskler ve istenmeyen bir takım yanetkiler içerebilmektedir. Bunun yanı sıra taşıyıcı virüslerin laboratuvar ortamında yaratılması yoğun bir çaba gerektiren pahalı bir işlemdir. Ayrıca seçilen taşıyıcı virüsün biyolojik ve genetik yapısı çerçevesinde virolojik gen tedavisi protokolleri daima bir takım teknik kısıtlamalara tabidir.
Gen tedavisinde virolojik olmayan yöntemleri ise başlıca iki ana alt gruba ayırıyoruz: kimyasal/sentetik taşıyıcılar ve fiziksel/mekanik taşıyıcılar. Gen tedavisinde kullanılan en başlı kimyasal/sentetik taşıyıcılar modifiye yağasitlerinden oluşan katiyonik lipozomlardır. Bilhassa in vitro gen tedavisi protokollerinde lipozomların etkinliği kanıtlanmış ve başarıyla uygulanmaktadır. Öteyandan gen tabancası (özellikle bitkilerde), elektroporasyon ve mekanik gerdirme lokalize in vivo gen tedavisi protokollerinde büyük başarı ve yeni uygulama alanları vaat etmektedir. Başlangıçta söylediğimiz gibi, bu eserin amacı konuyla ilgilenen bireyleri moleküler tıp uygulamaları ve gen tedavisi konusunda bilgilendirmektir. Ancak unutulmamalıdır ki, moleküler tıp ve gen tedavisi henüz modern tıpta yeni ve halen oluşum aşamasında olan bir branştır. Bu nedenle, her ne kadar ileriye yönelik bir perspektif ile ele almış olsak da, bu eserde yer alan bilgilerin güncelliği zaman içerisinde ister istemez değişecektir. Konuyla ilgilenen okurlarımızın yeni gelişimleri takip edebilmeleri amacıyla bu esere dair adendumlara gerek hasıl oldukça Gökay BIOTECH web sitelerinde yer verilecektir. (www.gbt-genetik.com) (www.genetik.web.tr) Tüm okurlarımıza sağlıklı ve bilginin ışığında parlak yarınlar dilerim. Dr. Kerimi Erden GÖKAY, Gökay-BIOTECH Ltd., CEO DİKKAT Moleküler Tıp ve Gen tedavisine giriş başlıklı yayınımızın Önsöz bölümü yukarıda ücretsiz olarak istifadenize sunulmuştur. Bu kitabın devamını okumak veya diğer Gökay-BIOTECH yayınlarından edinmek için lütfen YAZILI OLARAK halkla ilişkiler ofisimize başvurunuz. Tüm yayınlarımız CD-ROM (Windows - Adobe Acrobat formatında) veya kağıt baskı tarzında istenebilir. Başvurularda istenen adet ve formatın belirtilmesi rica olunur. Her hakkı saklıdır.
NOT: www.genetik.web.tr sitemizden ilgi alıntı aşağıda ek bilgi olarak sunulmuştur. İzinsiz çoğaltılması ve kaynak göstererek dahi alıntı yapılması halinde bu fiilleri işleyen kişi, kurum ve kuruluşlar hakkında telif haklarının ihlali kapsamında hukuki işlem başlatılacaktır. *Genetik tanı yöntemleri ve uygulamaları: Genetik analiz, bir diğer değişle moleküler genetik tanı, bireylerin taşımakta oldukları kalıtsal bozukluklar veya risk faktörlerinin şahıstan ve/veya aile fertlerinden temin edilen DNA, RNA, kromozom, protein veya birtakım biyokimyasal metabolitlerin analizi suretiyle değerlendirilip rapor edilmesidir. Bu anlamda uygulama amacına göre yürütülecek genetik analiz tek bir numune ve tek bir testten ibaret olabileceği gibi, çok sayıda numuneyi ve bir seri farklı testi de içerebilir. Ancak genetik testlerin uygulamada gerektirdiği yüksek teknoloji ve bilgi birikiminden dolayı, yapılan analizlerin amaca uygun ve anlamlı olması kesinlikle testlerin bu konuda özgün eğitim görmüş uzman kadrolarca yapılıp yorumlanmalarını zorunlu kılmaktadır. Genetik analiz kapsamında yapılan testler incelenen materyalin niteliğine veya yapılan analizin türüne göre dört ana guruba ayrılır. Doğrudan testler, şahsın genetik materyalini meydana getiren DNA veya RNA moleküllerinin PCR, RFLP veya sekanslama gibi yöntemlerle doğrudan analizini içerir. İlinti testleri (linkage testing) ise esas hastalığı meydana getiren genetik faktörün yerine incelenmesi daha kolay veya daha az zaman alıcı olan ancak bu hastalık genleri ile beraber kalıtsal geçiş gösterdiği bilinen ilintili işaretlerin analizidir. Biyokimyasal testler ise hastalıklı genler sonucu ortaya çıkan metabolizma bozukluklarının vücut doku veya sıvılarında biriken bazı metabolitlere yada söz konusu gen ürünü olan proteinlere nitelik yada nicelik yönünden bakılması suretiyle yapılan analizdir. Sitogenetik testler ise genetik hastalığa yol açan genetik anomaliyi barındıran kromozom veya kromozomların yapısal, sayısal veya kısmi içerik bakımından incelenmesidir. Genetik analiz diğer rutin laboratuar testleri ile bazı benzer unsurlar içerse de, birçok yönden bu testlerden farklıdır. Genetik analizin en büyük farklılığı diğer rutin testler gibi yalnızca hastada halen semptom veren bir olgunun tanısında değil en geniş anlamı ile hastanın taşımakta olduğu henüz belirgin hale gelmiş veya gelmemiş bütün kalıtsal hastalık ve risk faktörlerini rapor etmesidir. Bu anlamda genetik analiz hekimler için hasta takibinde veya bireyler için çocuk sahibi olmak gibi kişisel kararlar vermede sağlayacağı katkı bakımından bütün diğer test yöntemlerinin çok, çok ötesindedir.
Genetik analizi farklı kılan ikinci faktör ise analiz sonuçlarının yalnızca hasta bireyle sınırlı kalmayıp aynı zamanda diğer aile fertlerine de yansımasıdır. Örneğin genetik danışmanlık çerçevesinde istenmiş bir genetik analiz raporu test sonuçlarının yanı sıra mutlak surette kişinin ve ilgili aile fertlerinin elde edilen sonuçlar hakkında bilgilendirilmesi, gerekiyorsa olgunun ailede tıbbi yönden takibi ve durumdan etkilenen bireylere sunulması uygun olacak psikososyal hizmetlere dair önerileri de içermelidir. Bir çok genetik hastalık aslında nadir olmasına nazaran kesin tanı konulması sonuçları bakımından hem bireyler hem de aileleri için göz ardı edilemeyecek kadar önemlidir. Bu sebeple genetik analiz yalnızca bu konuda uzman belli başlı laboratuarlarca yapılmalıdır. Ne var ki, sağlık sektörü çalışanlarının hastalarına en iyi ve eksiksiz hizmeti verebilmeleri ancak hızla gelişen genetik analiz ve moleküler tıptaki yenilikleri yakından takip etmeleri ile mümkündür. Unutulmamalıdır ki genetik analizden anlamlı ve kesin bir sonuç alınması için bazen farklı metodolojilerin kullanıldığı birden fazla testin yapılması, ailenin diğer fertlerinin de test edilmesi yada bir tıbbi genetik uzmanına konunun danışılması gerekebilir. İnsanlar üzerinde yapılan genetik analizleri uygulama amaçları bakımından üç ana guruba ayırmak mümkündür; 1) Klinik genetik analiz, 2) Araştırmaya yönelik genetik analiz ve 3) Deneysel amaçlı genetik analiz. Klinik genetik analiz uygulamalarında toplanan numuneler bir bireyin ve/veya aile ferdinin klinik yönden takibi, tanı veya tedavisi amacıyla incelenir ve yazılı olarak rapor edilir. Klinik genetik analizin bir diğer uygulaması ise klinik veya adli amaçlı genotipleme, maternite veya paternite testleridir. Amerika Birleşik Devletleri nde klinik genetik analiz testleri yapan merkezlerin CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) şartlarına uyması ve CDC (Centers for Disease Control and Prevention) tarafından onaylanmış olması gerekmektedir. Yurdumuzda buna muadil bir makam olmamakla beraber bu tip uygulamaları yapan merkezler Sağlık Bakanlığınca ruhsatlandırılmaktadır. Doğaldır ki klinik genetik analiz satın alınan bir hizmet olarak belli bir ücrete tabidir. Ancak bu analizin rapor edilme süresi ve bedeli analizi yapan laboratuara ve analiz kapsamında yapılan testlerin nitelik ve niceliğine göre değişkenlik gösterecektir. Burada tüketiciye tavsiyemiz genel olarak basit ama yeterli sonuç vermeyen yada gereksiz yere vakit kaybettiren aşırı kompleks testlerden mümkün ölçüde kaçınılmasıdır. Araştırmaya yönelik genetik analizde tanısı önceden başka yöntemlerle konmuş özgün bir bireyden veya benzer semptom yada bulgulara haiz bir grup bireyden toplanan numuneler
söz konusu tıbbi olguyu daha iyi anlamak veya bu klinik olguya yönelik daha etkin bir klinik genetik analiz metodu saptamak amacıyla incelenirler. Araştırmaya yönelik genetik analizler ruhsatlı standart hizmetler kapsamı dışında ve genellikle merkezlerin kendi öz kaynaklarıyla finanse edilerek yapıldığından çoğunlukla rapor edilmezler. Ancak numuneyi veren bireyin talep etmesi halinde kişi için potansiyel klinik bir anlam taşıyan sonuçlar standart yöntemlerle de doğrulandıkları takdirde resmi bir rapor halinde ilgili bireye duyurulur. Bunun dışında araştırmaya yönelik genetik analiz amacıyla kullanılacak numuneler için bireylerin başka bir takip yada sonuç talebi söz konusu olamaz. Öte yandan analiz sonuçları da araştırmaya katılan bireyleri teşhir edecek şekilde üçüncü şahıslara duyurulamaz. Deneysel amaçlı genetik analiz kapsamında yapılan testler henüz bilimsel olarak geçerliliği kanıtlanmamış veya sonuçları henüz klinik olguların teşhis yada takibinde netlik kazanmamış uygulamalardır. Bu tip testler ileride klinik genetik analiz kapsamına girebileceği gibi terk de edilebilirler. O sebeple bu tip test sonuçlarının bireylere bildirimi bu gerçeği yazılı olarak bildirmek kaydıyla analizi yapan kurumun inisiyatifine bırakılmıştır. Ne var ki, bulguların rapor edilmesi yada kurum tarafından bu tip analizlerin ücret karşılığı hizmet kapsamına alınması durumunda testlerin ruhsat şartlarına uygun olarak yapılması zorunludur. Anlaşılacağı üzere, araştırmaya yönelik veya deneysel amaçlı genetik analizler daha ziyade teknik hizmet üreten merkezlerin ARGE (araştırma-geliştirme) projeleri kapsamında yürüttükleri faaliyetlerdir. Burada öncelikli amacımız klinik genetik analiz uygulamalarının tanıtımı olduğundan araştırmaya yönelik veya deneysel amaçlı genetik analizler konusunda daha fazla detaya girilmeyecektir. Ancak bu tip analizlerin hem bireyler hem de araştırmacı hekimler için sağlayabileceği imkanlar da hiçbir suretle göz ardı edilmemelidir. (Daha fazla bilgi için Gökay-BIOTECH'e başvurunuz.) * Daha ayrıntılı bilgi için diğer Gökay-BIOTECH yayınlarına, www.genetik.web.tr sitesine veya doğrudan firmamıza başvurunuz.