Klinik Virolojide Moleküler Yöntemlerin Kullanımı Doç Dr. Kenan Midilli İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Geleneksel viroloji Altın standart: Hüce kültürü ile virusların izolasyonu Kısıtlılıkları: - sonuç alma süresinin uzun olması - Teknik güçlükler, güvenlik sorunları - Hücre ve/ya da doku sağlamada güçlükler - Tüm olası virusları üretebilecek tek bir hücre serisinin olmaması - Kontaminasyon sorunları
Viral seroloji Hastalığın akut döneminde antikorların henüz gelişmemesi Doğrulama: Akut-nekahat dönemi karşılaştırması Antijen saptama: duyarlılık ve özgüllük sorunları; farklı tiplerin saptanmasında güçlükler
Kapsamlı bir viroloji laboratuvarının Daha çok epidemiyolojik veri sağlayan, klinikte hastanın bakımına doğrudan katkı sağlayacak veri üretmeyen, genellikle belli araştırma merkezleri ile kısıtlı bir laboratuvar olarak kalmasına neden oldu Antiviral tedavi seçeneklerinin yok/son derece kısıtlı olması; çoğu viral infeksiyonun özgül tedavisiz iyileşmesi de zorlayıcı bir talebin gelmemesine neden oldu
1980 sonrasında. Antiviral ilaçlarda patlama ve beraberinde gelen antiviral direnç sorunu Yeni virusların ortaya çıkması Transplantasyon ve bağışıklık sorunu olanlardaki viral infeksiyonların öneminin anlaşılması Özellikle daha hızlı ve kantitiatif sonuçlarla hasta tedavi sonuçlarında sağlanan iyileşmeler ile birlikte: ZAMANINDA ve HASTALARIN TANI, TEDAVİSİ ve İZLENMESİNDE BELİRLEYİCİ ROL OYNAYAN SONUÇLARI VEREBİLECEK BİR KLİNİK LABORATUVARA GEREKSİNİM DOĞDU
Bu gereksinimi karşılamak için: Daha hızlı sonuç veren hücre kültür yöntemleri: Shell-vial, hibrid hücreler, genetiği-değiştirilmiş hücreler Hızlı antijen testleri: Lateral akış, partikül agglutinasyon Hibridizasyon yöntemleri
Nükleik asit amplifikasyon teknikleri ve diğer moleküler yöntemler 1980 lerin sonunda çığır açıcı oldu Üstünlükleri: Hızlı sonuç vermeleri Daha duyarlı ve özgül sonuç vermeleri İlk yatırım maliyetlerinin giderek düşmesi Kantitatif sonuç vermeleri İyi standardize edilmiş ticari kitlere dönüştürülmeleri Teknik iyileştirmeler Alttiplerin ayırtedilmesine olanak vermeleri
Kısıtlılıkları: Teknik karmaşıklık, deneyim gerektirmeleri Kontaminasyon sorunları Genellikle tek bir etkene yönelik olarak tasarlanmış olmaları Bazı klinik durumlar açısından hala yavaş sonuç veriyor olmaları Biyolojik örneklerde inhibisyon sorunları Standardizasyon sorunları Maliyet yüksekliği
Bunların aşılmasında: Real time PCR ve diğer saptama sistemlerinn geliştirilmesi Otomatize, standardize edilmiş ticari test kit ve formatlarının geliştirilmesi Revers hibiridizasyon ve array teknolijilerindeki gelişmeler Çoklu saptamaya olanak veren platformların geliştirilmesi: Luminex, DNA array teknoljileri, multipleks PCR, minyatürize sistemler
Sonuç olarak moleküler teknikler: Viral hepatitler ve HIV MSS virus infeksiyonları Solunum yolları virusları CYBH lar Bazı gastroenterit yapan viruslar Arboviruslar ın tanısında, tedavi seçeneklerinin belirlenmesinde, antiviral tedavinin izlenmesinde birinci seçenek haline geldiler.
Klinik viroloji laboratuvarı test yelpazesini: Bulunduğu bölge ve hastanenin hizmet verdiği popülasyonu, verdiği hizmetleri Bulunduğu bölgedeki diğer kurumlara ait benzer laboratuvarın verdikleri hizmetlerle birlikte - test maliyetlerini, - kendisinin kaldırabileceği işyükü kapasitesini, insan kaynakları ve mevcut teknik altyapısını gözönünde bulundurarak belirlemelidir
Hangi test formatı seçiminde: Ek yatırım maliyeti getiriyor mu Klinik gereksinimleri karşılmak açısından uygun zamanda sonuç veriyor mu İyi standardize ve validasyonu yapılmış ticari kit var mı varsa laboratuvarın test kapsitesi açısınan maliyeti uygun mu İster ticari ister ev-yapımı test olsun bunun rutin kullanıma geçirilerek sonuç vermeden önce laboratuvar tarafından yapılması gereken kalite kontrol, validasyon ve standardizasyon işlemlerini yapabilecek durumda mı
Hepatit, HCMV ve HIV Klinik viroloji laboratuvarlarının en büyük işyükünü oluşturan ve hemen hemen tüm laboratuvarlar tarafından yapılan yaygın testlerdir.
Hepatit, HCMV ve HIV Kanla bulan virusların gerektirdiği ek yasal düzenlemelere uygun kit Ancak bu testlerin de laboratuvarda kullanılmaya başlanmadan önce belli validasyon ve kalite kontrol işlemlerinden geçirilerek ilgili laborauvardaki performanslarının değerlendirilmesi gerekir. Dış kalite programları
Hepatit, HCMV ve HIV Kitlerin büyük çoğu real-time PCR temelli olup kantitatif sonuç verir Kantitiatif kitlerin kullanım amaçları tedavinin izlenmesine yöneliktir; tarama ve tanı amaçlı olarak tasarlanmamışlardır Ancak alt duyarlılık sınırları kalitatif sonuç gereksinimini ortadan kaldıracak kadar düşük düzeylerdedir????
Hepatit, HCMV ve HIV Direnç ve genotiplendirme testleri: Klinik gereksinimler ve laboratuvarın teknik ve insan donanımı gözönünde bulundurularak yapılmalıdır. HBV, HIV ilaç direnci ve HCV genotiplendirme için reverse hibridizasyona dayalı ticari kitler var DNA dizi analizine dayalı HIV ticari direnç kiti var DNA dizi analizi ile her üçü ev-yapımı test olarak yapılabilir Kalite kontrolü!!!!
Hepatit, HCMV ve HIV HCMV ilaç direnci için ticari kit yok. Son zamanlarda HCV ile infekte kişilerde IL-28 polimorfizmlerini saptamaya yönelik testler kullanıma sunulmaya başladı Bu testi ve diğer bazı farmakogenetik testleri (abakavir duyarlılığı gibi) testleri kim yapacak???
Transplant alıcılarında görülen viral infeksiyonlar HCMV izlenmesi Pre-emtif tedavi HCMV reaktivasyonu açısından prediktif viral yük değerleri belirlenmiş kitler tercih edilmeli Prediktif değerleri bilinmeyen bir kit kullanılacaksa ilgili pediktif değerlerin belirlenmesi gerekir.
Transplant alıcılarında görülen viral infeksiyonlar EBV PTLD (posttransplant lenfoproliferatif hastalık) EBV yükünün izlenmesi: Haftalık Erken tedavi olanağı: Rituximab
Transplant alıcılarında görülen viral infeksiyonlar BKV: Böbrek transplant alıcılarında nefropati Red ile karıştırılabilir Serum BK virus düzeylerinin izlenmesi
MSS virus infeksiyonları HSV-1,2, VZV HHV-6 Enterovirus EBV CMV
Solunum yolları virusları Ağır alt solunum yolları infeksiyonlarından sorumlu virus yelpazesi genişlemekte, özellikle bağışıklık sorunu olanlar ve uç yaşlardakiler Bazı viruslar (PIV, HMpV): DFA ile saptamada güçlük Moleküler yöntemler daha iyi sonuç
Solunum yolları virusları Çoklu saptama sistemleri (20 ve üzeri virus): Lumineks, multipleks PCR, vd. Maliyet?
HPV ve diğer CYBH etkenleri En erken ticari kitlere dönüştürülen testler: HPV ve C. trachomatis HPV saptanması ve genotiplendirmesi için değişik formatlarda testler mevcut: Hybride-capture, multiplekx PCR, real-time PCR, array a dayalı Çoklu saptamaya yönelik paneller de mevcut
Gastroenterit etkeni viruslar Çoğu için hızlı antijen testleri mevcut Ancak özellikle noroviruslar ve diğer etkenler (astrovirus vd.) için en uygun yöntem moleküler testler Çoklu saptama panelleri de mevcut.
Yeni ve yeniden önem kazanan viruslar; egzotik viruslar Hastanelerdeki klinik viroloji laboratuvarlarının görev alanında mı? Referans laboratuvarlarına gönderme sorunları? Sonuç alma zamanı Endemik hale gelmiş olanlara bakılmalı mı?
Adenovirus DNA - Qualitative Real- Time PCR (For Diagnosis) Adenovirus DNA Quantitative Real- Time PCR (For Prognosis/Monitoring of Known Positive Patients) BK Virus DNA - Qualitative Real-Time PCR (For Diagnosis) BK Virus DNA - Quantitative Real-Time PCR (For Prognosis/Monitoring of Known Positive Patients) Chlamydia Trachomatis Molecular Amplification - Transcription-Mediated Amplification (TMA); Obtain Collection Kits from Materials Distribution Customer Service Cytomegalovirus DNA - Qualitative Real-Time PCR (For Diagnosis) Cytomegalovirus DNA - Quantitative Real-Time PCR (For Prognosis/Monitoring of Known Positive Patients) Epstein-Barr Virus DNA - Qualitative Real-Time PCR (For Diagnosis) Epstein-Barr Virus DNA - Quantitative Real-Time PCR (For Prognosis/Monitoring of Known Positive Patients) Enterovirus RNA - Qualitative Real- Time PCR Hepatitis C Virus RNA - Qualitative Real-Time PCR Herpes Simplex Virus DNA - Qualitative Real-Time PCR Herpes Simplex Virus DNA Typing - HSV 1/2 Typing Real-Time PCR Human Herpes Virus Type 6 DNA - Qualitative Real-Time PCR (For Diagnosis) Human Herpes Virus Type 6 DNA - Quantitative Real-Time PCR (For Prognosis/Monitoring of Known Positive Patients) Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA Qualitative Detection - Transcription- Mediated Amplification (TMA); Use for Diagnosis Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA Quantitation - Quantitative Real-Time PCR; Use for Prognosis and Therapeutic Monitoring Human Metapneumovirus RNA - Qualitative Real-Time PCR Influenza Virus Type A RNA - Qualitative Real-Time PCR Influenza Virus Type A RNA Human H1 and H3; Novel H1 Subtyping - Qualitative Real- Time PCR Influenza Virus Type B RNA - Qualitative Real-Time PCR Neisseria Gonorrhoeae Molecular Amplification Transcription-Mediated Amplification (TMA); Obtain Collection Kits from Materials Distribution Customer Service
Norovirus RNA - Qualitative Real-Time PCR Parainfluenza Virus Type 1 RNA - Qualitative Real-Time PCR Parainfluenza Virus Type 2 RNA - Qualitative Real-Time PCR Parainfluenza Virus Type 3 RNA - Qualitative Real-Time PCR Parechovirus RNA Qualitative Real- Time PCRli> Parvovirus B19 DNA - Qualitative Real- Time PCR Respiratory Virus Panel for RSV A and B RNA, Influenza Viruses A and B RNA, Parainfluenza Viruses 1,2, and 3 RNA, Adenovirus DNA, Metapneumovirus RNA, and Rhinovirus RNA Qualitative Real-Time PCR Respiratory Syncytial Virus RNA - Qualitative Real-Time PCR Rhinovirus RNA - Qualitative Real-Time PCR Varicella Zoster Virus DNA - Qualitative Real-Time PCR West Nile Virus RNA - Qualitative Real- Time PCR Hepatitis A, B, C and D Testing Hepatitis B Virus DNA Quantitation Molecular Amplification (For Monitoring of Known Positive Patients) (Send Out) Hepatitis C Virus Antibody - Enzyme Immunoassay Hepatitis C Virus RNA Qualitative Real-Time PCR (For Diagnosis) Hepatitis C Virus RNA Quantitation Molecular Amplification (For Monitoring of Known Positive Patients) (Send Out) Hepatitis C Virus Genotyping Nucleic Acid Sequencing (Send Out) Retrovirology (HIV-1, HIV-2, HTLV-I/II) Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA Qualitative Detection - Transcription- Mediated Amplification (TMA); Use for Diagnosis Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA Quantitation - Quantitative Real-Time PCR; Use for Prognosis and Therapeutic Monitoring Human Immunodeficiency Virus Type 1 Genotyping Nucleic Acid Sequencing (Send Out) Human T Cell Leukemia Virus-I/II Antibody - Enzyme Immunoassay (Send Out) Chlamydia Trachomatis and Neisseria Gonorrhoeae Testing Chlamydia Trachomatis Molecular Amplification Transcription-Mediated Amplification (TMA); Obtain Collection Kits from Materials Distribution Customer Service Neisseria Gonorrhoeae Molecular Amplification Transcription-Mediated Amplification (TMA); Obtain Collection Kits from Materials Distribution Customer Service Print
Klinik viroloji laboratuvarı ayrıca: Klinisyenleri olası viral etkenler; saptama yöntemleri ve uygun örnekler konusunda bilgilendirmeli Gerekiyorsa test sonuçlarını yorumlamalı Danışmanlık hizmeti: Halka ve klinisyenlere Klinisyenlere laboratuvarda yapılmayan testler konusunda yardımcı olmalı
Klinik viroloji laboratuvarı ayrıca: Kendi varlığı ve kapasitesi konusunda hastane çapında farkındalık yaratmalı Hastane infeksiyonlarının kontrolü, hasta ve sağlık çalışanı güvenliği konusunda sağlık çalışanlarının eğitimine katılmalı Hastane ya da toplumda dolaşmakta olan salgın etkenleri ya da potansyel salgın etkenleri konusunda uyarıcı olmalıdır.