KROMATOGRAFİ Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin,biri sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması, tanınması ve saflaştırılması yöntemlerinin genel adıdır. Çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla,sabit faz üzerinde, değişik hızlarla hareket etmeleri veya sürüklenmeleri esasına dayanır
Kromatografi tekniğinin temelinde üç ana unsur yer alır. Sabit faz: Bu faz daima bir "katı" veya bir "katı destek üzerine emdirilmiş bir sıvı tabakasından" oluşur. Hareketli faz: Bu faz daima bir "sıvı" veya "gazdan" oluşur. Sabit faz, hareketli faz ve karışımında yer alan maddeler arasındaki etkileşimin türü: Kromatografide "yüzey tutunması veya adsorpsiyon" ile "çözünürlük" gibi olgular temel etkileşim türlerini oluştururlar.
İlk kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903) tarafından geliştirilen bir yöntemdir. Tsvett bu yöntemi bitki pigmentlerinin(klorofil A,klorofilB ve ksantofil) renkli bileşenlerini ayırmakta kullanılmıştır. Kullandığı kolonda renkli bandlar oluştuğundan, bu ayırma yöntemine kromatografi adını vermişti
Bir parça kağıt şeridin aşağı hizasından 1 cm kadar yukarısına bir damla siyah mürekkep damlatınız Kağıt şeridi, mürekkep damlattığınız kısım su hizasının üstünde kalacak şekilde su tankına batırınız ve dik bir şekilde tutunuz. Su,kapiler etkisiyle kağıt üzerinde yukarı doğru yürürken mürekkebi çözer ve sürüklemeye başlar. Mürekkebin içindeki bileşenler kağıt üzerinde farklı hızlarda ilerleyerek ayrılmış olur.
Kromatografi nin Sınıflandırılması 1-Uygulama Biçimine Göre 2-Ayrılma Mekanizmalarına Göre 3-Faz Tiplerine Göre
1-Uygulama Biçimine Göre - Düzlemsel kromatografi Kağıt kromatografisi İnce tabaka kromatografisi (TLC) -Kolon kromatografisi Gaz kromatografisi (GC) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) Süperkritik akışkan kromatografisi
2-Ayrılma Mekanizmalarına Göre Adsorpsiyon kromatografisi Dağılma kromatografisi İyon değiştirme kromatografisi Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi İyon çifti kromatografisi Afinite kromatografisi
3-Faz Tiplerine Göre -Sıvı kromatografisi Sıvı-Katı kromatografisi Sıvı-Sıvı kromatografisi -Gaz kromatografisi Gaz-Katı kromatografisi Gaz-Sıvı kromatografisi
KOLON KROMATOGRAFİSİ
Protein karışımı depo (tampon) mobil faz (tampon) sabit faz (katı porlu matriks) elüent Kolon kromatografisi:biyomoleküllerin saflaştırılmasında sıklıkla kullanılır Kolon, biyomolekülleri seçici adsorblayan bir maddeyle (katı porlu matriks) doldurulur SABİT FAZ biyomolekül karışımı kolona tatbik edilir HAREKETLİ FAZ Tampon çözelti (MOBİL FAZ) ile yıkanan kolon tarafından, adsorbe edilmeyenler önce adsorbe edilenler daha geç kolonu terkeder.
Başlıca katı dolgu maddeleri (hareketsiz faz) şunlardır: Silika jel: Genellikle nötür ve asidik yapıdaki bileşikler için uygundur. Alumina: Genellikle nötür ve bazik yapıdaki bileşikler için uygundur. Sellüloz: Genellikle biyokimyasal maddeler için uygundur. Hareketli faz görevini üstlenecek çözücüler; Sikloheksan, Kloroform (kansorojen), Metanol, Petrol eter, Metilen klorür, Etanol, Benzen(kansorojen), Etil asetat, Aseton, Toluen, Dietil eter, Karbon tetraklorür(kansorojen), n-butanol İzopropanol olabilir.
1903 yılında Tsvet bitki pigmentleriyle çalışırken kolon dolgu maddesi olarak kireç kullanmıştı. Günümüzde ise çoğunlukla silika jel ve alumina kullanılmaktadır.
Kolon Kromatografi Tipleri Kolondaki dolgu maddesi ve seçilen elüsyon metoduna göre gruplandırılır: i.jel filtrasyonu büyüklük ii.iyon değişim yük iii.affinite (bağlanma)
i.jel Filtrasyon Kromatografi Karışımdaki moleküllerin molekül büyüklüklerinde göre ayrılması esasına dayanır Kolon, jel boncuklar(belli büyüklüğe sahip ve karışımdaki bileşenlerle etkileşmeyen bir madde) ile doldurulur katı matriks Biyomolekül karışımını içeren tampon, kolondan geçirilir Küçük moleküller,jel boncuklar arasındaki boşluklara girer,kolondan geç çıkarlar. Büyük moleküller,jel boncuklar arasındaki boşluklara giremez ve kolondan hızlı bir biçimde sürüklenerek önce çıkarlar.
Kromatografik ayırma sırasında bozunması veya degişikliğe uğraması istenmeyen protein ya da enzim gibi biyolojik moleküllerin birbirinden ayrılması için kullanılır. Bu yöntem ile polimerlerin molekül ağırlığı dağılımı da tayin edilebilir Avantaj Büyük miktarda : biyomolekül karışımı saflaştırılabilir Dezavantaj: Yavaş ayırım
ii.iyon exchange (değiş-tokuş) Kromatografi Maddelerin iyonik grupları ile iyon değiştiricideki iyonik grupların eşdeğer miktarlarının karşılıklı yer değiştirmesi esasına dayanır İyon değiştirme kromatografisi, kullanılan iyon değiştiricinin anyon veya katyon aktarmasına göre sırasıyla anyon değiştirme kromatografisi veya katyon değiştirme kromatografisi olarak adlandırılır. Anyon değiştirme kromatografisinde,kolon içindeki sabit tabaka olan matrixe kovalent bağlı iyonlar pozitif yüklüdür,bu iyonlar kolondan geçirilen çözeltideki anyonları kendine çeker,çözeltideki anyonlar ayrılır,sadece katyonlar ortamdan çıkar. Katyon değiştirme kromatografisinde ise,benzer sistemle çözeltideki katyonlar ayrılır,anyonlar ortamdan çıkar.
Anyon Değiştirici I Cl- Cl- ve I- karışımının nitrat bağlanmış anyon değiştirici RNO 3 ile bileşenlerine ayrılmasında geçerli dengeler aşağıdaki biçimdedir: Cl- + RNO 3 RCl + NO 3 I- + RNO 3 RI + NO 3 R: Çözünmeyen Matriks RNO 3 : Anyon Değiştirici
İyon değiştirmeyi etkileyen faktörler Hareketli faz derişimi Hareketli faz ph sı Kompleks oluşturucu etki İyon değiştirme kromatografisinin uygulanması Ayrılmaları güç olan bazı iyonları ve asitlerin Aminoasitler Seyreltik iyon çözeltileri deriştirmede Asit ve baz elde edilmesinde NaCl NaOH + Cl
iii.affinite Kromatografisi Enzim, hormon,vb spesifik proteinlerin saflaştırılmasında kullanılır.kolonun dolgu maddesine,(dekstran, poliakrilamid, selüloz vb)spesifik protein ile kompleks yapabilen bir ligand bağlanır: Ligand ile kompleks yapan spesifik protein,katı desteğe bağlanarak kolonda tutulurken; serbest proteinler kolonu terkederler. Bağlı protein, daha sonra, ph değişikliği / tuz çözeltileri veya ligand ilavesiyle kolondan elüe edilir Seçiciliği fazla olan bu yöntem,kromatografi tekniklerinin en yenisidir. Antijen Antikor Enzim Substrat gibi oldukça spesifik etkileşimlere dayanır. Reseptör İlaç
Kolon Kromatografisi a)gaz Kromatografi (GC) b)yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi (HPLC)
a) Gaz kromatografisi GC Bir karışımda gaz halinde bulunan veya kolayca buharlaştırılabilen bileşenlerin birbirinden ayrılması amacıyla gaz kromatografisi yöntemi kullanılır. Bu yöntemde ayrılma, bileşenlerin farklı katı yüzeylerdeki farklı adsorpsiyon ilgilerine göre gerçekleşir. Numunede bulunan bileşenler bir cihazla spektrum haline getirilir ve bu spektrumda bulunan her pik ayrı bir bileşeni gösterir.
Hareketli faz olarak helyum, azot veya argon gibi inert bir gaz kullanılır ve bu gaza taşıyıcı gaz adı verilir. Kolon içinde kullanılan sabit faz; silika, alumina veya karbon gibi bir katı ise yöntem, gaz-katı kromatografisi adını alır. Eğer sabit faz kiezelguhr gibi inert katı bir dolgu maddesi üzerine tutturulmus uçucu olmayan bir sıvı film ise yöntem gaz-sıvı kromatografisi adını alır. Bu şekilde kullanılan kolonlara dolgulu kolonlar denilir. Gaz kromatografisi yönteminde kolonlar 2-10 mm iç çapında ve 1-5 m boyundadır. Fakat inert bir katı dolgu maddesi üzerine uçucu olmayan bir sıvı kaplanması yerine, bu sıvı filminin doğrudan ince bir cam veya silika kapiler borunun iç yüzeyine tutundurulmasi ile 0.2-0.5 mm iç çapinda ve 10-50 m gibi çok uzun kapiler kolonların kullanılması mümkün olabilir. Bu nedenle kapiler kolonların verimliligi ve ayırıcılığı, dolgulu kolonlara oranla çok daha iyidir.
Gaz kromatografisinde, ilk olarak örneğin buharlaştırılması için ısıtılan bir bölme vardır. Hemen ardından sıcaklığı programlanabilen bir fırın içine yerleştirilmiş olan kolon gelmektedir. Sıvı örnekler bir şırıngayla bir septumdan giriş kısmına enjekte edilirler. Kolon çıkışına yerleştirilen bir dedektörden sinyal izlenir ve bir integratör ile kaydedilir. Gaz kromatografisi yönteminde incelenebilen maddeler için belli sıcaklıktaki alıkonma sürelerinin birbirinden farklı olmasından yararlanarak nitel analiz yapılabilir.bir maddenin alıkonulma süresi, belli bir kolon için, belli sıcaklıkta ve belli taşıyıcı gaz akış hızında sabit bir değerdir. Bu sebeple de,bir iç standart maddesinin analiz örneğine eklenmesi ve sonuçların bu maddeye bağlı olarak belirtilmesi daha çok tercih edilen bir yoldur. Gaz kromatografisi yönteminde nicel analiz ise kromatogramdaki piklerin altlarında kalan alanların hesaplanması ile veya pik yüksekliğinin ölçülmesi ile yapılır.örneğin, enjekte ettigimiz bir karışımda baslangıçta eşit miktarlarda A ve B bilesenlerinin olduğunu varsaydığımız bir durumda, kromatogramda bu bilesenlere ait piklerin altında kalan alanlar da birbirine eşit olacaktır.
Bir bileşen kolondan ne kadar erken çıkarsa, o bileşene ait pik de o kadar keskin elde edilirken, kolondan geç çıkan bileşenlere ait pikler ise geniş ve yayvan olarak elde edilmektedir. Bu ise istenmeyen bir durumdur. Bu durumu önlemek için sıcaklık programlaması yöntemi uygulanır. Baslangıçta kolon sıcaklığı düşük tutulur ve zamanla doğrusal bir biçimde arttırılır.
b) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi HPLC Sıvı kromatografi bir ayırma tekniğidir. Bir sıvıda çözünmüş ayrılacak bileşenler, bir kolon içerisinde bulunan genellikle katı bir destek üzerindeki sabit faz ile farklı etkileşmelere girerek, kolon içinde değişik hızlarda ilerler. Kolonu değişik zamanlarda terkederler ve böylece birbirlerinden ayrılırlar. Burada taşıyıcı faz olan sıvı, pompalarla kolona basıldığından yüksek akış hızındadır. Bu nedenle ayırma daha kısa sürede ve tam olarak gerçekleşmektedir. Ayrılan bileşik, kolon çıkışına bağlanan uygun bir dedektörle tesbit edilip miktarıyla orantılı olarak kaydedilir. Yüksek hızda gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı sıvı kromatografi sistemlerine, Yüksek Basınç Sıvı Kromatografi (HPSC) denir Normal Faz Sıvı Kromatografisi: Polar sabit faz ve apolar veya düşük polariteye sahip hareketli faz Ters Faz Sıvı Kromatografisi: Sabit faz apolar, hareketli faz ise polardır
Ters faz kromatografisinin avantajları 1. Normal faz kromatografide, sıvı fazın kontrolü çok önemli ve kritiktir.hareketli faz bileşimindeki küçük değişiklikler kromatogramda belirgin farklılıklara neden olabilir. 2. Dengeye ulaşma normal faz kromatografide çok yavaştır. 3. Normal faz kromatografide polar maddelerin elüsyonu çok yavaştır ve yayvan piklere sebep olu 4. Apolar çözücüler çok pahalıdır, ayrıca nemden uzak tutmak zordur.
HPLC nin avantajları HPLC kolonu, rejenerasyon gerekmeksizin pek çok kez kullanılabilir. HPLC tekniği kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır ve tekrarlanabilirlik daha yüksektir. Nicel analiz kullanılabilir. Analiz süresi kısadır. Duyarlık yüksektir.