NAT Yöntem onayı Dr. A. Arzu Sayıner Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD
Yöntem onayı (minimum) Doğruluk Ticari test (Verifikasyon) Tekrarlanabilirlik (intra-,inter-assay) Doğrusallık (kantitatif ise) Laboratuvar yapımı test Doğruluk (Validasyon) Tekrarlanabilirlik (intra-,inter-assay) Doğrusallık (kantitatif ise) Duyarlılık Özgüllük Rabenau HF et al, J Clin Virol 2007 Kalitatif HSV
Problem LYT kalitatif HSV DNA PCR CE belgeli test kantitatif HBV DNA PCR
LYT Analitik duyarlılık Analitik duyarlılık (saptama alt sınırı) Probit analizi CLSI 5 örnek x 12 çalışma (60 veri) Örnekler saptama alt sınırının altı ve üstü olacak şekilde farklı konsantrasyonlarda analit içermelidir. %95 olasılıkla saptanan en düşük konsantrasyon, saptama alt sınırı olarak seçilir. Farklı matriksler ve genotipler için yeniden değerlendirilmelidir.
LYT Kesinlik (Tekrarlanabilirlik) Çalışma içi 1P ve 1 N üçer kez çalışılır. (Rabenau) Çalışmalar arası 1P ve 1N üç ayrı günde birer kez (gerekirse ayrı kişiler tarafından) çalışılır. (Rabenau) CLSI Saptama alt sınırı civarında 3 farklı konsantrasyondaki örneğin >15 gün ikişerli çalışılması Gerekiyorsa sayı azaltılabilir ancak ölçüm gücü de azalır. Sonuçlar SD ve %CV olarak incelenir. Kabul edilebilir değer? (sayısal değer veya log10 karşılığı kullanılabilir) CV %15, kantitasyon alt sınırı için %20, biyokimya testleri için %30 Her bir konsantrasyon için ayrı hesaplanarak konsantrasyon kesinlik ilişkisi belirlenebilir.
LYT - Özgüllük Çapraz reaksiyon Benzer genetik yapıya sahip mo Örnekte bulunması olası flora üyeleri Benzer hastalık veya koinfeksiyon yapan mo Hedef NA dizisine benzer diziye sahip mo (GenBank BLAST ile tarama) İnterferans Hb Lipid Bilirubin İlaçlar, antikoagülanlar,
LYT - Özgüllük İnterferans yaratabilecek maddeyi içeren, hedefi içeren ve içermeyen örneklerin eş zamanlı çalışılması Örnek sayısı : En az 20 (Rabenau) Çapraz reaksiyon yapabilecek mo yüksek konsantrasyonda (10 5 kopya/ml) olmalıdır.
LYT - Doğruluk Yeni test ile belirlenen değer ile beklenen değer arasındaki yakınlık. İçeriği bilinen standart örneklerin çalışılması Standartlar, kalite kontrol örnekleri Yöntemlerin karşılaştırılması (örnek ikiye bölünür). Örnekler Gerçek hasta popülasyonunu temsil etmeli Farklı genotipleri içermeli Negatif ve farklı düzeylerde pozitif örnekler içermeli Farklı matriksler kullanılacaksa, her biri ayrı ayrı değerlendirilmeli Kalan hasta örnekleri saklama koşulları önemli! Diğer laboratuvarlardan edinilecek örnekler Ticari kaynaklar Örnek sayısı >20 olmalı. LYT için 50 pozitif, 100 negatif örnek.(burd) LYT için 3 YP, 3 DP, 3 negatif (Rabenau)
LYT-Doğruluk değerlendirme Saçılma grafiği Scatter diagram Dışarıda kalanlar incelenmeli Korelasyon / Regresyon analizi Eğim ve korelasyon katsayısı ile uyum belirlenir. Eğimin 1 e yakın olması, korelasyon katsayısının r 2 0.95 olması önerilir. Farklılık grafiği (Blant-Altman grafiği) Ölçülen sapmanın, kabul edilebilir aralık ile olan ilişkisi incelenir. Referans testi doğru olarak kabul ettiği için yeni testin üstün olduğu durumlarda sorun olabilir. Klinik verilere göre doğruluk belirleme 2x2 tablo ile değerlendirilir. Kappa değeri >0.80 önerilir.
Yöntem onayı (minimum) Ticari test (Verifikasyon) Doğruluk Tekrarlanabilirlik (intra-,inter-assay) Doğrusallık (kantitatif ise) Kantitatif HBV Laboratuvar yapımı test (Validasyon) Doğruluk Tekrarlanabilirlik (intra-,inter-assay) Doğrusallık (kantitatif ise) Duyarlılık Özgüllük Rabenau HF et al, J Clin Virol 2007
CE belgeli test - Kesinlik Burd YP 1 örnek + DP 1 örnek 3er kez 5 gün Rabenau Çalışma için (intra-assay) P 3 örnek + DP 3 örnek 3er kez Çalışmalar arası (inter-assay) P 1 örnek + DP 1 örnek Birer kez 3 gün Değerlendirme Sayısal değer ve log10 karşılığı kullanılır. SD ve %CV hesaplanır. Firmanın sonuçları ile karşılaştırılır.
CE belgeli test - Doğruluk Burd 20 hasta örneği İkişer kez 2-5 çalışma veya YP ve DP standartlar İkişer kez 2-5 çalışma Rabenau P 3 örnek + DP 3 örnek + Negatif 3 örnek Yöntem Referans örneklerin çalışılması Referans yöntem ile karşılaştırma Değerlendirme xy eğrisi ve regresyon analizi Bland-Altman grafiği ve bias hesaplanması 2x2 tablo ve kappa değeri
CE belgeli test - Doğrusallık Yöntem: Bir adet yüksek pozitif değeri bilinen örnekten 10 katlık en az 3 (CLSI: 5-7) dilüsyon hazırlanır. Her dilüsyon aynı çalışmada çift çalışılır. Dilüent: negatif plazma, su, SF olabilir. Kaydedilmelidir. Değerlendirme Beklenen değer (x) ile bulunan değerler (y) regresyon analizi ile değerlendirilir. Değerler log10 olarak girilir. Tekrarlar tek tek veya ortalama değer olarak kullanılabilir. Genelin dışında kalan bir adet örnek ihmal edilebilir. Daha çok olması testin tekrarlanabilirlik sorunu olduğunu gösterebilir. Linear regresyon analizinde ideal değer r²:1
Kaynaklar Burd EM. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clinical Microbiology Reviews 2010;23:550-576. Rabenau HF et al. Verification and validation of diagnostic laboratory tests in clinical virology. Journal of Clinical Virology 2007;40:93-98.