BAZI SATUREJA UÇUCU YAĞLARININ ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELERİ

14. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı, Bildiriler, 29-31 Mayıs 2002, Eskişehir, Eds. K.H.C.Başer ve N.Kırımer Web de yayın tarihi: Haziran 2004 ISBN 975-94077-2-8 BAZI SATUREJA UÇUCU YAĞLARININ ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELERİ A. D. Azaz 1, F. Demirci 2, F. Satıl 1, M. Kürkçüoğlu 2, Kemal Hüsnü Can Başer 2 Balıkesir Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, 10100 Balıkesir Anadolu Üniversitesi, Tıbbi ve Aromatik Bitki ve İlaç Araştırma Merkezi (TBAM), 26470 Eskişehir ÖZET:Satureja cinsi (Lamiaceae) Türkiye'de 5'i endemik 15 türle temsil edilmektedir ve bunlardan S. pilosa ve S. icarica Türkiye için yeni kayıtlardır. Türkiye'nin farklı bölgelerinden toplanan S. pilosa, S. icarica, S. boissieri ve S. coerulea' nın çiçek açma döneminde toplanan toprak üstü kısımları hidrodistilasyona tabi tutularak elde edilen uçucu yağların GC ve GC/MS metotları ile analizleri yapıldı. Her bir yağın ana bileşenleri tespit edildikten sonra antibakteriyel ve antifungal aktiviteleri belirlenerek hem birbirleri hem de literatür bulguları ile karşılaştırmaları yapıldı. GİRİŞ Lamiaceae Türkiye'de en yaygın türlere sahip familyalardan birisidir. Bu familyaya ait olan Satureja cinsi Türkiye'de 5'i endemik 15 türle temsil edilmektedir. S. pilosa Velen. ve, S. icarica P.H.Davis Türkiye'de son zamanlarda yeni kayıt olarak saptanmıştır (Davis,1982; Tümen ve ark.,1998a, Tümen ve ark., 2000). Birçok Satureja türü yöresel olarak "kekik", sivri kekik, "kılıç kekik", "keklik otu", "catlı" veya "firibu" isimleri ile bilinmektedir (Tümen ve ark., 2002). Ayrıca Türkiye'nin değişik bölgelerinde baharat, çay ve şifalı bitki olarak da kullanılmakta olan birçok Satureja türünün uçucu yağının kimyasal bileşenleri çalışılmıştır (Başer ve ark., 2001; Tabanca ve ark., 1999; Tümen ve ark., 1992; Tümen ve ark., 1993; Tümen ve ark., 1997; Tümen ve ark., 1998 a,b,c; Tümen ve Başer, 1996). Tarımda, besinlerin korumasında ve tıpta funguslara karşı etkili maddelere büyük gereksinim duyulmaktadır. Antifungal kemoterapi konusunda dünya çapında araştırmalar yoğun şekilde sürdürülmektedir (Cormican ve Pfaller, 1996, Espinel ve Ingroff, 1998). Bu araştırmada, dört farklı lokaliteden toplanan S. pilosa, S. icarica, S. coerulea (Batı Anadolu dan) ve S. boissieri (Güneydoğu Anadolu dan) türlerinin uçucu yağlarının GC ve GC/MS analizleri yapılmış ve her bir yağın patojen bakteri ve mayalar ile saprofitik filamentöz funguslara karşı gösterdikleri antifungal ve antibakteriyel özellikleri değerlendirilmiştir. MATERYAL VE YÖNTEM Bitki Materyali ve Yağlarının İzolasyonu Çiçeklenme devresinde toplanan S. pilosa, S. icarica, S. coerulea ve S. boissieri nin toplanma yerleri ve tarihleri Tablo I de verilmiştir. Gölgede kurutulmuş bitki materyalleri 349

Clevenger Hidrodistilasyon cihazında 3 saat süre ile işleme tabi tutulmuştur. Yağların kuru ağırlık üzerinden hesaplanan değerleri de Tablo I de gösterilmiştir. Bitki materyalleri Balıkesir Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi ve Anadolu Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Herbaryumunda (ESSE) muhafaza edilmektedir. Gaz Kromatoğrafisi Yağların GC analizleri Shmadzu GC-17A kullanılarak yapılmıştır. CP Sil 5 CB kolonu (25 m x 0,25mm) taşıyıcı olarak nitrojen gazı ile kullanılmıştır (1 ml/dak). Fırın ısısı 60 ºC ye programlanmış ve 5 ºC/dak. oranı için sürekli 260 0 C de 40 dakika tutulmuştur. Split oranı 50 ml/dak, enjektör ve FID dedektör ısıları da 250 ºC ye ayarlanmıştır. Gaz Kromatografisi/ Mass Spektroskopi Analizler için CP-Sil 5CB (25m x 0,25 Ø) kolonu ile Shimadzu GCMS QP5050 A sistemi kullanılmıştır. GC fırın ısısı 60ºC ye ayarlanmış ve 5ºC/dak. için 260ºC de 40 dakika tutulmuştur. Split akışı 50 ml/dak., Enjektör ısısı 250ºC ye ayarlanmış, MS 70 ev da alınmıştır. Mass seviyesi 30 dan 425 m/z arasındadır. Ana Bileşenlerin İzolasyonu Uçucu yağlarda tespit edilen ana bileşiklerin teşhisi Wiley GC/MS ve TBAM kütüphaneleri kullanılarak yapılmıştır. İzole edilen bileşenlerin nisbi yüzde miktarları, FID kromatogramlarından hesaplanmıştır.yağlarda belirlenen bileşenler Tablo II de verilmiştir. Antimikrobiyal Metotlar Mikrodilüsyon denemeleri Koneman ve ark.,1997 ye göre yapılmıştır. Uçucu yağların stok solüsyonları DMSO da hazırlanmıştır. Uçucu yağların seri solüsyonları 96- kuyulu mikrotiter plakalar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yeni yetiştirilmiş bakteri süspansiyonları çift kuvvet Mueller-Hinton Broth (Merck) ve Candida albicans maya süspansiyonu 10 8 CFU/mL (Mc Farland) ye standartlanmıştır. Büyüme kontrolü için steril saf su kullanılmıştır. Her mikrobiyal süspansiyonun 100µL si kuyucuklara eklenmiştir. Yalnızca mikroorganizmasız antibakteriyel ajanların seri dilüsyonlarını içeren son sıra negatif kontrol olarak kullanılmıştır. 37 ºC de 24 saat inkübasyon süresi sonunda bulanıklılığın olmadığı son kuyu MIC olarak belirlenmiştir. Bu araştırmada kullanılan patojen mikroorganizmalar Anadolu Üniversitesi, Fen Fakültesi ve Osman Gazi Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji Bölümünden sağlanmıştır (Tablo II). Fungal Spor İnhibisyonu Konidi elde etmek amacıyla funguslar Czapex-Dox Agar besiyerinde, 9 cm lik petri kapları kullanılarak 25 ºC de 7-10 gün süre ile geliştirilmişlerdir. Konidi süspansiyonları %5 (w/v) DMSO ihtiva eden %1 (w/v) sodyum klorür süspansiyonu kullanılarak hazırlanmıştır. Spor süspansiyonları (Hadacek ve Greger, 2000) e göre filtre edildikten sonra tüplere alınarak 20 ºC de muhafaza edildi. Daha sonra ayrı ayrı birer öze damlası alınan spor süspansiyonları; Czapex Dox ve Malt Ekstrakt Agar besiyerleri içeren petri kaplarının merkezine tatbik edilmiştir. Her uçucu yağın stok solüsyonlarından 200 µl alınarak 9 mm çapındaki kağıt disklere emdirilmiş ve daha önce besiyerine tatbik edilen spor süspansiyonlarının üzerine yerleştirilmiştir. Petri kapları 72 saat süresince 25 ºC de 350

inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresince spor çimlenmesi 8 saat aralıklarla Olympus BX-50 araştırma mikroskobu kullanılarak izlenmiştir. Aspergillus niger Tieghg (BUB Czp.30), Penicillium sublateritium Biourge (BUB Czp.69), P. canescens Sopp (BUB Czp.38) ve P. steckii Zalewski (BUB Czp.28) bu denemelerde kullanılan filamentöz mikrofunguslar olup, toprak örneklerinden izole edilerek Balıkesir Üniversitesi, Fen- Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümünde saklanmaktadır. SONUÇ VE TARTIŞMA Uçucu yağlar, dört farklı lokaliteden toplanan; S. pilosa, S. icarica, S. coerulea ve S. boissieri nin toprak üstü kısımlarından elde edilmiş ve GC ve GC/MS kullanılarak analizleri yapılmıştır. Analizlerden çıkan ana bileşenler Tablo I de verilmiştir. Analizler, karvakrol ün (% 42.1-59.2) S. pilosa, S. icarica ve S. boissieri yağlarındaki ana bileşik olduğunu göstermektedir. Buna karşılık S. coerulea yağında ana bileşik olarak seskiterpen hidrokarbonlar (β-karyofillen % 10.6; karyofillen oksit % 8.0 ve germakren-d % 4.7) yer almaktadır. Timol ise (% 2.3) sadece S. boissieri de oldukça düşük bir yüzde ile bulunmaktadır. Başka bir araştırmamızda S. hortensis in kültüre alınmış formlarında karvakrol, doğal formlarında ise timol ana bileşik olarak belirlenmiştir. Türkiye nin doğusunda yetişen bitki örnekleri yağlarında timol ün ana bileşen olarak tespit edilmesine karşın batısında yetişenlerde ana bileşiğin karvakrol olduğu saptanmıştır (Başer ve ark., 2002) Tümen ve ark. (1998a) S. icarica ve S. pilosa yağlarının kompozisyonlarını araştırmışlar ve karvakrol ün ana bileşen olduğunu rapor etmişlerdir. Tümen ve ark.(1998 a ve 1998 c) tarafından yapılan araştırmalarda S. icarica uçucu yağlarının temel bileşenleri karvakrol (% 52.04-55.97), borneol (% 5.15-5.81), γ-terpinen (% 5.80-6.91) ve p-simen (% 13.14-17.01); S. coerulea nın β-karyofillen (% 10.3-12.2), karyofillen oksit (% 3.9-5.7), borneol (% 4.4-8.2), 1,8- sineol (% 0.1-1.5), limonen (% 0.3-5.1) ve germakren- D (% 12.8-20.6); S. pilosa nın ise karvakrol (% 5.07-53.49), p-simen (% 4.70-17.39), geraniol (% 1.19-4.52) ve borneol (% 0.96-8.83) olarak rapor edilmiştir. Önceki bir araştırma (Başer ve ark.,2001) da sonuçları çeşitli lokalitelerden toplanan S. wiedemanniana uçucu yağlarının antibakteriyel aktivitelerinde karvakrol ve timol ün patojen mikroorganizmaların inhibisyonu açısından güçlü bir etkisinin olabileceği rapor edilmiştir. Satureja türleri uçucu yağlarının önemli bir antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu çeşitli araştırmacılar tarafından rapor edilmiştir (Müller-Riebau ve ark.,1995; Akgül ve Kıvanç, 1998; Kıvanç ve Akgül, 1998). Bu araştırmamızda mikrodilüsyon-broth deneyi ile S. pilosa uçucu yağının patojen bir maya olan Candida albicans üzerinde % 31.25 µl lik bir değer ile güçlü bir MIC nuna sahip olduğu gösterilmiştir. Diğer test edilen yağların da C. albicans a karşı aktif oldukları görülmüştür. Patojen bakterilerden Pseudomonas aeruginosa üzerinde diğer yağlara göre S. icarica yağının daha iyi inhibe edici bir aktiviteye sahip olduğu saptanmıştır. Enterobacter aerogenes üzerinde ise S. pilosa ve S. icarica yağları 62.5 µg/ml konsantrasyon değeri ile standart chloromphenicol e göre daha güçlü inhibisyon göstermiştir. Salmonella typhimurium ise S. coerulea uçucu yağı hariç tüm yağlar tarafından standart düzeyinde inhibe edilmiştir. Genel sonuç olarak test edilen tüm patojen bakteriler Satureja yağları tarafından inhibe edilmişlerdir (Tablo II). 351

Tablo I. Satureja Türlerinin Toplanma Yerleri, Uçucu Yağ Verimleri ve Ana Satureja sp S. boissieri Hausskn. ex Boiss. S. coerulea Janka in Velen. S. icarica P. H. Davis S. pilosa Velen. Lokalite ve toplama tarihi C7: Adıyaman 30.09.2001 A1: Kırklareli: Dereköy 29.10.2001 A1:Çanakkale:Gökçeada 23.09.2001 B1: Balıkesir: Edremit 22.09.2001 Bileşikleri ESSE a Yağ RRI b Ana bileşik (%) c verimi (%) 13985 1.1 1273 Karvakrol 44.8 1007 p-simen 35.5 1048 γ -Terpinen 6.5 1276 Timol 2.3 13983 0.6 1422 β-karyofillen 10.6 1565 Karyofillen oksit 8.0 1151 Borneol 6.3 1471 Germakren D 4.7 1022 Limonen 4.3 1374 β-borbonen 3.6 1563 Spatulenol 3.0 13984 0.8 1273 Karvakrol 59.2 1007 p-simen 15.7 1151 Borneol 4.5 1048 γ-terpinen 4.4 1218 Metil karvakrol 2.0 13986 0.4 1273 Karvakrol 42.1 1007 p-simen 8.1 1238 Geraniol 7.6 1151 Borneol 4.7 1490 -Bisabolen 4.3 1218 Metil karvakrol 3.1 a ESSE: Anadolu Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Herbaryumu, Eskişehir, Türkiye b RRI: Apolar kolonda n-alkene karşı hesaplanan relatif kalma zamanı c (%) : FID de bulunan relatif yüzdeler Üç inkübasyon günü süresince yapılan gözlemlerde tüm yağlar tarafından Penicillium canescens sporlarının çimlenmesi inhibe edilirken, Aspergillus niger, P. steckii ve P. sublateritium spor çimlenmesinin inhibe edilmediği saptanmıştır. Bu durum, kullanılan uçucu yağlara karşı P. canescens sporlarının daha hassas olduğu şeklinde yorumlanabilir. Timol ve karvakrol ü % 1 den az ihtiva eden S. coerulea nın da timol ve karvakrol ü ana bileşik olarak taşıyan türlerle aynı antibakteriyel ve antifungal aktiviteyi göstermesi, seskiterpen hidrokarbonlarının da bu aktivitelere yüksek seviyede sahip olabilecekleri fikrini doğurmaktadır. 352

Tablo II. Farklı Lokalitelerden Toplanan Satureja Uçucu Yağlarının Antimikrobiyal Aktiviteleri (MIC) Mikroorganizmalar Kaynak A B C D St Escherichia coli ATCC 25292 125 125 125 62.5 62.5 Staphylococcus aureus ATCC 6538 62.5 125 125 62.5 7.81 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 125 125 125 62.5 250 Enterobacter aerogenes NRRL 3567 125 125 62.5 62.5 125 Proteus vulgaris NRRL 123 125 125 62.5 62.5 31.25 Salmonella typhimurium NRRL 4420 62.5 125 62.5 62.5 62.5 Candida albicans OGU 62.5 62.5 31.25 62.5 125* Aspergillus niger BUB Czp. 30 - - - - +* Penicillium sublateritium BUB Czp. 69 - - - - +* Penicillium canescens BUB Czp. 38 + + + + +* Penicillium steckii BUB Czp. 28 - - - - +* A: S. boissieri B: S. coerulea C: S. pilosa D: S. icarica St: Chloramphenicol * Ketoconazole (-): Spor çimlenmesi, (+): Spor inhibisyonu KAYNAKLAR Akgül A. and Kıvanç M. (1988), Inhibitory effects of six Turkish Thyme-like spices on some common food-borne bacteria. Die Nahrung 32, 201-203. Başer K. H. C., Özek T., Kırımer N. and Tümen G. (2002), A comparative study of the essential oils of wild and cultivated Satureja hortensis. J. Essent. Oil Res. (In press) Cormican M. D. and Pfaller M. A. (1996), Standardization of antifungal susceptibility testing. J. Antimicrob. Chemother. 38, 561-578. Davis P. H. (1982), Flora of Turkey and the East Aegean Islands. Vol. 7, Edinburgh University Press, Edinburgh, p. 319. Espinel-Ingroff A. (1998), In vitro activity of the new triazole voriconazole (UK-109,496) against opportunistic filamentous and dimorphic fungi and common and emerging yeast pathogens. J. Clin. Microbiol. 36, 198-202. Hadecek F. and Greger H. (2000), Testing of antifungal natural product: methodologies, comparability of result and assay choice. Phytochem. Anal. 11, 137-147. Kıvanç M. and Akgül A. (1989), Inhibitory effects of spice essential oil on yeast. Turk. J. Agric. For. 13, 68-71. 353

Koneman E. W., Allen S. D., Janda W. M., Schreckenberger P. C. and Winn W. C. (1997), Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, pp.785-856. Müller-Riebau F., Beger B. and Yegen O. (1995), Chemical composition and fungitoxic properties to phytopathogenic fungi of essential oils selected aromatic plants growing wild in Turkey. J. Agric. Food Chem. 43, 2262-2266. Tabanca N., Kürkçüoğlu M., Başer K. H. C. and Duman H. (1999), Composition of the essential oil of Satureja spinosa L. 2000 Years of Natural Products Research, Amsterdam, The Netherlands. Tümen G., Sezik E. and Başer K. H. C. (1992), The essential oil of Satureja parnassica Heldr. & Sart. ex Boiss. subsp. sipyleus. Flav. Fragr. J. 7, 43-46. Tümen G., Başer K. H. C. and Kırımer N. (1993), The essential oil of Satureja cilicica P. H. Davis. J. Essent. Oil Res. 5, 547-548. Tümen G. and Başer K. H. C. (1996), The essential oil of Satureja spicigera (C. Koch) Boiss. from Turkey. J. Essent. Oil Res. 8, 57-58. Tümen G., Kırımer N. and Başer K. H. C. (1997), The essential oils of Satureja L. occurring in Turkey, in: Proceeding of the 27 th International Symposium on Essential Oils. (Franz C. H., Mathe A. and Buchbauer G., eds.) Allured Publishing Corporation, Vienna, Austria, pp. 250-254. Tümen G., Kırımer N., Ermin N. and Başer K. H. C. (1998a), The essential oils of two new Satureja species for Turkey, S. pilosa and S. icarica. J. Essent. Oil Res. 10, 524-526. Tümen G., Kirimer N., Ermin N. and Başer K. H. C. (1998b), The essential oil of Satureja cuneifolia. Planta Med. 64, 81-83. Tümen G., Başer K. H. C., Demirci B. and Ermin N. (1998c), The essential oils of Satureja coerulea Janka and Thymus aznavourii Velen. Flav. Fragr. J. 13, 65-67. Tümen, G., Satıl, F., Duman, H., Başer, K.H.C., Two New Records for the Flora of Turkey: Satureja icarica P.H. Davis, S. pilosa Velen Tr. J. of Botany, 24(2000) 211-214. Tümen, G., Satıl, F., Dirmenci, T., Öztekin, M., Ticareti Yapılan Satureja L. Türlerinin Doğadaki Durumu TBAG/Ç.Sek. 1001T011, yayınlanmamış proje notları (2002). 354