Materyal ve Yöntemler. Materyal

Transkript

1 Nar Ekşisi ve Sumak Ekşisi nin Escherichia coli O157 ve Listeria monocytogenes Üzerine Antimikrobiyal Etkisinin Belirlenmesi Buket Kunduhoğlu, Sevil Pilatin Osmangazi Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Eskişehir. Özet Nar Ekşisi ve Sumak Ekşisi, Türkiye de çeşitli yöresel yemeklerin yapımında sıklıkla kullanılan ve kullanıldıkları yemeklere ve salatalara asitlik ve lezzet kazandıran maddelerdir. Bunların elde edildikleri bitkilerin (Punica granatum ve Rhus coriaria) antimikrobiyal etkileri konusunda çeşitli çalışmalar yapılmış ve antimikrobiyal etkili oldukları belirlenmiştir. Bu çalışmada da adı geçen lezzet vericilerin patojen bakteriler olan Escherichia coli O157, Listeria monocytogenes in üzerindeki antimikrobiyal aktiviteleri test edilmiştir. Antimikrobiyal aktivite disk diffüzyonu yöntemiyle belirlenmiştir ve her iki bakterinin de gelişimini inhibe etmiştir. Determination of Antimicrobial Effects of Punica granatum and Rhus coriaria concentrate Against the Escherichia coli O157 and Listeria monocytogenes Abstract Pomegranate and Sumac concentrates are used very often in Turkish Cuisine as flavoring to making some salads and foods. These concentrates gives to foods sweet/sour taste. There are some researches about antimicrobial effects of plants (Punica granatum and Rhus coriaria) which are these concentrates originated from and it was determined that they showed antimicrobial effect to some test microorganisms. In this study antimicrobial activity of these flavorings indicated above were tested towards some pathogens like Escherichia coli O157, Listeria monocytogenes. Antimicrobial activity was determined by disc diffusion method and growth of both bacteria was inhibited with these two concentrates. Giriş Nar Ekşisi ve Sumak Ekşisi, özellikle Türkiye nin güneyinde çeşitli yöresel yemeklerin ve salataların yapımında sıklıkla kullanılmakta ve kullanıldıkları yemeklere, salatalara tatlı/ekşi bir lezzet kazandırmaktadır. Bunların elde edildikleri bitkilerin (Punica granatum: Nar ve Rhus coriaria: Sumak) antimikrobiyal etkileri konusunda çeşitli çalışmalar yapılmış ve antimikrobiyal etkili oldukları belirlenmiştir. Türkiye de yetişen üç Rhus coriaria türünün antibakteriyel ve antifungal aktivitesini inceleyen bir çalışmada (Sökmen ve ark., 1999), bitkinin methanol, kloroform n- bütanol ve etil asetat ektrelerinin Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Branhamella catarrhalis, Escherichia coli, Clostridium perfringens ve Candida albicans üzerine antimikrobiyal aktiviteleri denenmiştir. Sonuçta n- bütanol ve etil asetat ektrelerinin B. catarrhalis e antimikrobiyal etki gösterdiği bildirilmiştir. Rhus coriaria ve diğer bazı Rhus türlerinin toz haline getirilen yaprak ve meyvelerinin antibakteriyel özelliklere sahip oldukları diğer bazı araştırmacılar tarafından da bildirilmiştir (Saxena ve ark., 1994; Mc Cutcheon ve ark., 1994) ve bu türün Karadeniz bölgesindeki, insanlar tarafından yara iyileştirici olarak kullanıldığı belirlenmiştir (Sezik, 1991).

2 Yapılan bir çalışmada (Machado ve ark., 2002), Punica granatum dan elde edilen punicalaginin, methisiline dirençli 6 Staphylococcus aureus suşuna karşı antimikrobiyal aktivitesi denenmiştir. Punicalagin in (250 µg) antibakteriyel aktivitesi test edilen bütün bakterilere karşı 20 mm lik bir inhibisyon bölgesi oluşturduğu gözlenmiştir. Minimum inhibitor konsantrasyon ise 61.5 µg /ml olarak belirlenmiştir Navarro ve ark. (1996), Meksika da geleneksel tıpta bulaşıcı hastalıkların tedavisinde kullanılan bazı bitki türlerinden elde edilen yirmi metanolik bitki özünün, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ve Candida albicans a karşı potansiyel antimikrobiyal aktiviteni belirlemişlerdir. Metanolik bitki özlerinin antimikrobiyal aktivitesi disk diffüzyon yöntemiyle belirlenmiştir. Eucalyptus globulus Labill, Punica granatum L., Artemisia mexicana Willd. ve Bacconia arborea Watt. ya ait ekstraktların test edilen mikroorganizmalara karşı güçlü bir aktiviteye sahip oldukları bildirilmiştir. Dığrak ve ark. (2001) Rhus coriaria da dahil olmak üzere Türkiye de bulunan bazı tıbbı bitkilerin antibakteriyal ve antifungal aktivitelerini belirlemişlerdir. Antimikrobiyal aktivite, Bacillus megaterium DSM 32, Bacillus brevis FMC 3, Bacillus subtilis IMG 22, Bacillus cereus FMC 19, Escherichia coli DM,Enterobacter aerogenes CCM 2531, Pseudomonas aeruginosa DSM 50071, Staphylococcus aureus Cowan 1, Listeria monocytogenes Scott A ve Micrococcus luteus LA 2971, Candida tropicalis ve Candida albicans CCM 314 kullanılarak disk difüzyon metoduyla test edilmiştir R. coriaria, kullanılan bütün denemelerde, bakterilere karşı mm lik inhibisyon zonları belirlemişlerdir. Bu çalışmada evlerde, küçük imalathanelerde ve son zamanlarda da daha büyük çaplarda üretilip büyük marketlere kadar ulaşan bu geleneksel lezzet vericilerin patojen bakterilere olan inhibitor etkisi araştırılmıştır. Bu iki lezzet vericinin, özellikle salata gibi ısıl işlem görmeden tüketilen gıdalarda kullanılmasından dolayı, Escherichia coli O157, Listeria monocytogenes test mikroorganizması olarak seçilmiştir. Materyal ve Yöntemler Materyal Çalışmada kullanılan nar ekşisi ve sumak ekşisi lokal marketlerden alınmış ve ph değerleri belirlenmiştir. Çalışmada kullanmak üzere steril distile su ile çeşitli yüzdelerde %75, %50 ve %25) çözeltileri hazırlanmıştır. Escherichia coli O157 ve Listeria monocytogenes kültürleri Anadolu Üniversitesi, Fen Fakültesi nden sağlanmıştır. Türlerin kontrolü PCR ile yapılmıştır. Bakteriler kullanılıncaya kadar yatık Nütrient Agar tüplerinde, buzdolabı sıcaklığında muhafaza edilmiştir, ayda bir pasajları yapılmıştır. Yöntemler Nar ekşisi ve sumak ekşisinin belirtilen mikroorganizmalar üzerindeki antimikrobiyal aktivitesini belirlemek için disk diffüzyon yöntemi kullanılmıştır. Ayrıca kullanılan konsantrasyonlarda çözeltilerin statik mi yoksa sidal etkili mi olduğunu belirlemek amacıyla tüp dilüsyon yöntemi kullanılarak minimal inhibe edici konsantrasyon belirlenmiştir. Kontrol olarak, nar ekşisi ve sumak ekşisi ile aynı ph daki sitrik asit ve tartarik asit çözeltileri kullanılmıştır. Nar ekşisi ve sumak ekşisinden çözelti hazırlanması: Çalışmalarda kullanmak üzere nar ekşisi ve sumak ekşisinin steril distile su ile %75, %50 ve %25 lik çözeltileri hazırlanmıştır. Ayrıca nar ekşisi ve sumak ekşisi direkt olarak da çalışmalarda kullanılmıştır.

3 Bakterilerin deneyler için hazırlanışı: Escherichia coli O157 nütrient brota ekilmiş ve saat 35 o C de inkübe edilmiştir. Listeria monocytogenes Nütrient Brotha ekilmiş ve saat 30 o C de inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda, disk difüzyon ve tüp dilüsyon yönteminde kullanılmak üzere sıvı kültürün bulanıklığı Mc Farland No: 0.5 tüpü (%1.175 BaCl 2, 0.5 ml; 0.36 N H 2 SO 4, 99.5 ml) ile karşılaştırılmıştır ve gerektiğinde yoğunluk ayarlamak için steril Nutrient Broth kullanılmıştır. Disklerin hazırlanışı: Whatman No: 1 filtreden 6 mm çapında diskler çıkarılmış ve bunlar koyu renkli şişelere belirli sayıda (20 adet/şişe) konarak otoklavda steril edilmiştir. Daha sonra üzerlerine nar ekşisi ve sumak ekşisinin farklı konsantrasyonlardaki çözeltilerinden 0.2 şer ml konulmuştur, böylece her bir diskin 0.01 ml çözelti emmesi sağlanmıştır. Disk diffüzyon yöntemi: Nütrient Agar plakları hazırlanmış (15 ml/petri) ve cama yazar kalemle alt kapağı dörde bölünmüştür. Plaklar bir gece 35 o C de inkübe edilerek besiyeri yüzeylerinin kuruması sağlanmıştır. E. coli O157 ve L. monocytogenes in Nutrient Broth kültüründen 0.1 er ml alınarak, plakların yüzeyine ekilmiş ve steril drigalski spatülüyle iyice yayılmıştır. Bakteri kültürünün besiyerine diffüze olmasından sonra, nar ekşisi ve sumak ekşisinin farklı konsantrasyonlarını içeren diskler aseptik olarak petrilere yerleştirilmiştir. Kontrol plaklarına yukarıda anlatılan şekilde E. coli O157 ve L. monocytogenes kültürlerinden ekilmiş, sonra bu plaklara, ph sı 2.20 olan sitrik asit tamponu ile hazırlanmış diskler yerleştirilmiştir. E. coli O157 ekilmiş plaklar 35 o C de, L. monocytogenes ekilmiş plaklar ise 30 o C de, 24 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonucunda plaklar incelenmiş ve disklerin çevresinde şeffaf zonların varlığı (bakteri üremesi gözlenmeyen dairesel bölge) inhibisyon zonu olarak değerlendirilmiştir. Tüm deneyler dört paralelli olarak yapılmıştır. Tüp dilüsyon yöntemi: Bu deney nar ekşisi ve sumak ekşisinin bakteriler üzerindeki inhibitör etkisinin sidal mi yoksa statik mi olduğunu belirlemek amacıyla yapılmıştır. Bu işlem için, steril edilmiş kapaklı tüplere nar ekşisi ve sumak ekşisinin farklı konsantrasyonlarından her bir tüpe 2 şer ml konulmuş, ardından aynı tüplere E. coli O157 ve L. monocytogenes kültürlerinden 0.2 şer ml ekilmiş ve iyice karıştırılmıştır. Ekim işleminden hemen sonra her bir tüpten mikropipetle örnek alınarak, nutrient agar plaklarına ekim yapılmış ve aynı işlem, 2., 4. ve 6. saatlerde tekrarlanmıştır. Tüm deneyler iki paralelli olarak yapılmıştır. Bulgular ve Tartışma Nar ekşisi ve sumak ekşisinin ph ları ölçülmüş ve Çizelge 1 deki değerler elde edilmiştir. Çizelge 1: Nar ekşisi ve sumak ekşisinin ve bunlardan hazırlanan farklı yoğunluklardaki çözeltilerin ph değerleri. ph Direkt %75 %50 %25 Nar ekşisi Sumak ekşisi Çizelgeden 1 de görüldüğü gibi, nar ekşisi ve sumak ekşisinin ph değeri oldukça düşüktür. Bakteri inhibisyonunun sadece asitlikten kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirleyebilmek amacıyla tüm denemelere ph sı 2.0 olan sitrik asit ve 1.95 olan tartarik asit de dahil edilmiştir.

4 Disk diffüzyonu yöntemi kullanılarak nar ekşisi ile yapılan çalışmaların sonuçları Çizelge 2 de verilmiştir. İnhibisyon zon çaplarına disk çapı dahil edilerek ölçüm yapılmış ve sonuçlar 4 paralelin ortalaması alınarak çizelgede bu şekilde ifade edilmiştir. Çizelge 2: Nar ekşisi ile yapılan antimikrobiyal aktivite çalışmasından elde edilen zon çapları (6 mm disk çapı dahil). Bakteri Zon Çapı (mm) Kontroller Sitrik Tartarik Direkt % 75 % 50 % 25 asit asit L. monocytogenes E. coli O Nar ekşisi E. coli O157 ve L. monocytogenes e tüm yoğunluklarda inhibitör etki göstermekle birlikte, L. monocytogenes e olan inhibitör etkisinin daha fazla olduğu belirlenmiştir. Disk diffüzyonu yöntemi kullanılarak sumak ekşisi ile yapılan çalışmaların sonuçları Çizelge 3 de verilmiştir. Çizelge 3: Sumak ekşisi ile yapılan antimikrobiyal aktivite çalışmasından elde edilen zon çapları (6 mm disk çapı dahil). Bakteri Zon Çapı (mm) Kontroller Sitrik Tartarik Direkt % 75 % 50 % 25 asit asit L. monocytogenes E. coli O Sumak ekşisi de benzer şekilde E. coli O157 ve L. monocytogenes e inhibitör etki göstermiştir. L. monocytogenes e olan inhibitör etkinin tüm konsantrasyonlarda oldukça fazla olduğu gözlenmiştir. En düşük konsantrasyonda bile, E. coli ye olandan daha fazla inhibitör etkili olmuştur. Tüp dilüsyon yöntemi kullanılarak yapılan çalışmalarda, içlerinde dilüe edilmemiş (direkt) ve %75, 50 ve 25 oranında nar ekşisi ve sumak ekşisi bulunan tüplere iki paralel halinde bakterilerden ekilmiştir. Bu şekilde hazırlanan tüpler iyice karışmaları sağlandıktan sonra, uygun sıcaklık derecelerinde inkübasyona bırakılmış ve ekim anından başlayarak, 2., 4. ve 6. saatlerde 0.1 ml örnek alınarak nütrient agar plaklarına ekim yapılmıştır. Nar ve sumak ekşilerinin direkt olarak kullanıldığı tüplerden, ekimden hemen sonra, Nütrient Agar plaklarına örnekleme yapılmış ve inkübasyon sonrasında hiçbir plakta üreme gözlenmemiştir. Her iki bakteriyi ayrı ayrı içeren dilüsyon serilerinden yapılan ekimlerin sonuçları 2. saatten itibaren negatif çıkmış yani nütrient agar plaklarında ikinci saat dahil olmak üzere 4. ve 6. saatlerde plaklarda bakteri gelişimi gözlenememiştir. Buna göre nar ekşisi ve sumak ekşisinin kullanılan bakterilere sidal etkili olduğu sonucu çıkarılabilmektedir.

5 Kaynaklar Dığrak, M., Alma, M. H., Ilçim, A., Antibacterial and Antifungal Activities of Turkish Medicinal Plants. Pharmaceutical Biology, 39 (5): Machado T.B., Pinto A.V., Pinto M.C.F.R., Leal I.C.R., Silva M.G., Amaral A.C.F., Kuster R.M., Netto-dosSantos K.R., In vitro activity of Brazilian medicinal plants, naturally occurring naphthoquinones and their analogues, against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Int. J. Antimicrobial Agents. 21 (3): McCutcheon, A.R., Ellis, S.M., Hancock, R.E.W., Towers G.H.N., Antifungal screening of medicinal plants of British Columbian native peoples. J. Ethnopharmacology. 44(3), Navarro V., Villarreal M.L., Rojas G., Lozoya X., Antimicrobial evaluation of some plants used in Mexican traditional medicine for the treatment of infectious diseases J. Ethnopharmacology. 53 (3): Saxena, G., McCutcheon, A.R., Farmer, S., Towers G.H.N., Hancock, R.E.W., Antimicrobial constituents of Rhus glabra. J. Ethnopharmacology. 42(2), Sezik, E., Tabata, M., Yeşilada, E., Honda, G., Goto, K., IkeshiroY., Traditional medicine in Turkey I, Folk medicine in Northeast Anatolia. J. Ethnopharmacology.35, Sokmen S., Jones, B.M., Ertürk, M., The in vitro antibacterial activity of Turkish medicinal plants. J. Ethnopharmacology. 67: