ERZURUM İLİNDEKİ BAZI SÜT SIĞIRI İŞLETMELERİNDE KULLANILAN KABA, KONSANTRE VE KARMA YEMLERDE TOTAL AFLATOKSİN, AFLATOKSİN B 1 VE OKRATOKSİN İLE SÜTTE AFLATOKSİN M 1 DÜZEYLERİNİN TESPİTİ Nebahat POLAT Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları Anabilim Dalı Tez Yöneticisi: Doç. Dr. Mehmet GÜL Yüksek Lisans Tezi - 2012
I İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR... IV SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ... V TABLOLAR DİZİNİ... VII ŞEKİLLER DİZİNİ... IX ÖZGEÇMİŞ... X ÖZET... XI ABSTRACT... XIII 1. GİRİŞ... 1 2. GENEL BİLGİLER... 3 2.1 Mikotoksinler... 3 2.1.1. Tarihçe... 5 2.1.2. Gıdaların Mikotoksinlerle Kontaminasyon Yolları... 7 2.1.3. Sınıflandırma... 7 2.1.4. Mikotoksin Oluşumunu Etkileyen Faktörler... 9 2.1.4.1. Bağıl Nem veya Su Aktivitesinin Etkisi... 10 2.1.4.2. Ortam Sıcaklığının Etkisi... 11 2.1.5. Mikotoksinlerin Önemi... 12 2.2. Aflatoksinler... 13 2.2.1. Süt ve Süt Ürünlerinde Aflatoksin Mı Oluşumu... 16 2.2.2. Aflatoksin oluşumunu etkileyen faktörler... 18 2.2.3. Aflatoksinlerin Etki Şekilleri... 19 2.2.4. Aflatoksinlerin Etkileri... 19 2.2.5. Gıda ve Yemlerde Aflatoksinler için Belirlenen Sınır Değerler... 22
II 2.3. Okratoksin... 25 2.4. Diğer Bazı Önemli Mikotoksinler... 29 2.4.1. Trikotesenler... 29 2.4.2. Zearalenon... 29 2.4.3. Fumonisinler... 30 2.4.4. Patulin... 31 2.4.5. Sterigmatosistin... 31 3. GEREÇ ve YÖNTEM... 33 3.1. Gereç... 33 3.1.1. Yem örneklerinin alınması... 33 3.1.2. Yem örneklerinin analizinde kullanılan kitler... 34 3.2. Yöntem... 35 3.2.1. Total aflatoksin... 35 3.2.1.1. Analiz için numunelerin hazırlanması... 35 3.2.1.2. Test Protokolü... 35 3.2.2. Aflatoksin B 1... 36 3.2.2.1. Analiz için numunelerin hazırlanması... 36 3.2.2.2. Test Protokolü... 36 3.2.3. Okratoksin... 37 3.2.3.1. Analiz için numunelerin hazırlanması... 37 3.2.3.2. Test Protokolü... 37 3.2.4. Aflatoksin M 1... 38 3.2.4.1. Analiz için numunelerin hazırlanması... 38 3.2.4.2. Test Protokolü... 38
III 3.2.5. İstatistiksel Analiz... 39 4. BULGULAR... 40 5. TARTIŞMA... 48 6. SONUÇ ve ÖNERİLER... 59 KAYNAKLAR... 60
IV TEŞEKKÜR Yüksek Lisans öğrenimim boyunca yardım ve ilgisini esirgemeyen danışman hocam Doç. Dr. Mehmet GÜL e, Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları öğretim üyeleri Prof. Dr. Armağan HAYIRLI, Doç.Dr. Mehmet Akif YÖRÜK ve Doç. Dr. Halit İMİK e yardımlarından dolayı teşekkür ederim. Tezimin yürütülmesinde yardımlarını esirgemeyen Yrd.Doç.Dr. Özgür KAYNAR, 9. Kolordu Komutanlığı A Tipi Gıda Kont. Mfz. Komutanı Uzm. Dr. Vet. Hek. Yarbay Okan Ali AKSOY ile tez bulgularımın istatistiksel analizlerini yapan Doç. Dr. Ömer ÇOBAN a teşekkür ederim. Ayrıca bana her koşulda destek olan çok değerli aileme, eşim Doç. Dr. Bülent POLAT a ve çocuklarıma teşekkür ederim. Bu çalışma Atatürk Üniversitesi Rektörlüğü tarafından BAP 2010/150 nolu proje ile maddi olarak desteklenmiştir.
V SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ n : Örnek sayısı P : İstatistiki önem seviyesi Mg : Miligram ppm : Milyonda kısım Ppb : Milyarda kısım Ppt : Triyonda kısım Nm : Nanometre (10-9 m) Ng : Nanogram (10-9 g) % : Yüzde AFL : Aflatoksin AFL B 1 : Aflatoksin B 1 AFL B 2 : Aflatoksin B 2 AFL G 1 : Aflatoksin G 1 AFL G 2 : Aflatoksin G 2 AFL M 1 : Aflatoksin M 1 AFL M 2 : Aflatoksin M 2 OTA : Okratoksin A OTB : Okratoksin B ASP : Aspergillus ZEN : Zearalenon FB 1 : Fumonisin B 1 FAO : Gıda ve Tarım Organizasyonu WHO : Dünya Sağlık Teşkilatı
VI ATP : Adenozin trifosfat LPO : Lipid peroksidasyonu HPLC : Yüksek performanslı likit kromatografi TLC : İnce tabaka kromatografisi GC : Gaz kromatografisi ELISA : Enzim bağlı immün assay IARC : Uluslararası Kanser Arastırma Kuruluşu A S : Su aktivitesi ºC : Santigrat derece Ph : Asidite derecesi DNA : Deoksiribonükleik asit RNA : Ribonükleik asit CO 2 : Karbondioksit O 2 : Oksijen : Ortalama : Standart hata min. : En düşük max. : En yüksek UV : Ultraviole DAS : Diasetoksiskirperol DON : Deoksinivalenol NIV : Nivalenol TMB : Tetrametil benzidin HRP : Horse radish peroxidase
VII TABLOLAR DİZİNİ Tablo 2.1. Mikotoksin çeşitleri, kaynakları, hedef hayvan, doku veya organlar.... 8 Tablo 2.2. Mikotoksin oluşumunu etkileyen başlıca faktörler... 9 Tablo 2.3. Türkiye'de gıda maddelerinde bulunmasına izin verilen aflatoksin (AFL) düzeyleri (μg/kg; ppb)... 23 Tablo 2.4. Çeşitli ülkelerde süt ve süt ürünlerinde bulunmasına izin verilen maksimum AFLM1 düzeyleri.... 24 Tablo 2.5. Türkiye'de gıda maddelerinde bulunmasına izin verilen okratoksin düzeyleri (μg/kg; ppb)... 28 Tablo 3.1. İncelenen mikotoksinlerin mevsimlere göre farklı yem kaynaklarından alınan örnek sayıları... 33 Tablo 3.2. Erzurum için 2011 yılı aylık ortalama sıcaklık ve nem değerleri... 34 Tablo 4.1. İşletmelerden alınan kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki total aflatoksin değerleri... 40 Tablo 4.2. İşletmelerden alınan kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki AFLB 1 değerleri... 41 Tablo 4.3. İşletmelerden alınan kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki Okratoksin değerleri... 42 Tablo 4.4. İşletmelerdeki ineklerden alınan sütlerdeki AFLM 1 değerleri... 43 Tablo 4.5. Mevsimlere göre kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki total aflatoksin değerleri (ppb)... 43 Tablo 4.6. Mevsimlere göre kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki AFLB 1 değerleri (ppb)... 44
VIII Tablo 4.7. Mevsimlere göre kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki Okratoksin değerleri... 46 Tablo 4.8. Mevsimlere göre inek süt örneklerindeki AFLM 1 değerleri... 47
IX ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 4.1. Mevsimlere göre kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki total aflatoksin değerleri... 43 Şekil 4.2. Mevsimlere göre kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki AFLB 1 değerleri... 45 Şekil 4.3. Mevsimlere göre kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki okratoksin değerleri... 46 Şekil 4.4. Mevsimlere göre inek süt örneklerindeki AFLM 1 değerleri... 47
X ÖZGEÇMİŞ 1977 yılında Tarsus ta doğdu. İlk, orta ve lise öğrenimini Adana da tamamladı. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi nde 1994 yılında başladığı yükseköğrenimini 1999 yılında tamamladı. Özel sektörde 1999-2006 yılları arasında Veteriner Hekim olarak görev yaptı. Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı na 2007 yılında Veteriner Hekim olarak atandı. Halen bu görevine devam etmekte olup evli iki çocuk annesidir.
XI ÖZET ERZURUM İLİNDEKİ BAZI SÜT SIĞIRI İŞLETMELERİNDE KULLANILAN KABA, KONSANTRE VE KARMA YEMLERDE TOTAL AFLATOKSİN, AFLATOKSİN B 1 VE OKRATOKSİN İLE SÜTTE AFLATOKSİN M 1 DÜZEYLERİNİN TESPİTİ Bu araştırma, Erzurum ilindeki süt sığırı işletmelerinde süt sığırlarının tükettikleri, kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerinde çeşitli mikotoksinler (Total aflatoksin, Aflatoksin B 1, Okratoksin) ile bu yemlerle beslenen ineklerin sütlerinde Aflatoksin M 1 varlığını tespit etmek amacıyla yapıldı. İşletmelerden alınan örneklerdeki en düşük ve en yüksek total aflatoksin miktarları rakamsal olarak sırasıyla kaba yemler için 5,57±0,36-7,51±0,75 ppb, konsantre yemler için 5,23±0,34-7,07±0,60 ppb, karma yemler için 6,45±0,23-9,86±0,31 ppb olarak saptandı. En düşük ve en yüksek Aflatoksin B 1 düzeyleri rakamsal olarak sırasıyla kaba yemler için 2,67±0,86-3,06±1,01ppb, konsantre yemler için 1,89±0,34-2,40±0,56 ppb, karma yemler için 2,35±0,44-3,29±0,59 ppb olarak belirlendi. En düşük ve en yüksek okratoksin düzeyleri rakamsal olarak sırasıyla kaba yemler için 6,96±0,29-7,20±0,34 ppb, konsantre yemler için 4,58±0,29-5,32±0,31 ppb, karma yemler için 5,08±0,72-6,98±0,70 ppb olarak tespit edildi. İşletmelerden alınan sütlerde bulunan Aflatoksin M 1 değeri rakamsal olarak en düşük 0,030±0,00038 ppb en yüksek 0,035±0,0061 ppb olarak belirlendi. Belirtilen mikotoksin düzeylerinin genel olarak sonbahar ve yaz mevsiminde kış ve ilkbahar mevsimine göre daha düşük olduğu gözlendi.
XII Araştırmada total aflatoksin, Aflatoksin B 1 ve okratoksinin genel ortalama değerleri sırasıyla kaba yemde 6,692; 2,863; 7,093 ppb, konsantre yemde 6,013; 2,175; 4,933 ppb ve karma yemde 7,835; 2,881; 5,851 ppb olarak saptandı. Aflatoksin M 1 in genel ortalama değeri 0,03 ppb olarak belirlendi. Araştırmada elde edilen sonuçlar incelendiğinde, karma yemlerle alınan Aflatoksin B 1 in inek sütüne % 1,219±0,4139 oranında Aflatoksin M 1 olarak geçtiği tespit edildi. Sonuç olarak Erzurum ili süt sığırı işletmelerinden alınan kaba yem, konsantre yem ve hayvanlara verilen kaba, konsantre yem karmalarında total aflatoksin, Aflatoksin B 1 ve okratoksin ile inek sütünde Aflatoksin M 1 e rastlanmış olmakla birlikte, bu tespit edilen mikototoksin değerlerinin Türk Gıda Kodeksi nde belirtilen sınırların altında olduğu gözlendi. Anahtar kelimeler: Mikotoksin, Kaba yem, Konsantre yem, İnek sütü
XIII ABSTRACT DETERMINATION of TOTAL AFLATOXIN, AFLATOXIN B 1, OCHRATOXIN in FORAGE, CONCENTRATED, and MIXED FEED SAMPLES and MILK AFLATOXIN M 1 LEVEL in SOME DAIRY FARMS in ERZURUM This study was made to detect various mycotoxins (Total aflatoxin, Aflatoxin B 1, Ochratoxin) in forage and concentrate feeds which were provided for consumption and milk aflatoxin M 1 which could be presented in milk from cows consumed these feeds. Minimum and maximum total aflatoxin levels in collected samples from the farms were 5,57±0,36-7,51±0,75 ppb in forage feeds, 5,23±0,34-7,07±0,60 ppb in concentrated feeds, and 6,45±0,23-9,86±0,31 ppb in mixed feeds. Minimum and maximum Aflatoxin B 1 levels were 2,67±0,86-3,06±1,01 ppb for forage feeds, 1,89±0,34-2,40±0,56 ppb for concentrated feeds, and 2,35±0,44-3,29±0,59 ppb for mixed feeds. Minimum and maximum ochratoxin levels were 6,96±0,29-7,20±0,34 ppb for forage feeds, 4,58±0,29-5,32±0,31 ppb for concentrated feeds and 5,08±0,72-6,98±0,70 ppb for mixed feeds. Minimum and maximum Aflatoxin M 1 level in milk samples from the farms were 0,030±0,00038 ppb and 0,035±0,0061 ppb, respectively. Mycotoxin levels were lower in samples collected in the fall and summer than the spring and winter seasons. The mean level of total aflatoxin, Aflatoxin B1 and ochratoxin were 6,692; 2,863; 7,093 ppb in forage feeds, 6,013; 2,175; 4,933 ppb in concentrated feeds and 7,835; 2,881; 5,851 ppb in mixed feeds, respevtively. The mean level of Aflatoxin M 1 were 0,03 ppb.
XIV According to evaluated results, 1,219±0,4139 % of Aflatoxin B1 in consumed mixed feeds was passed into the milk. In conlusion, total aflatoxin, Aflatoxin B 1 and Ochratoxin were detected in forage; concentrate and mixed feed samples which were sold for comsumption and consumed by cows but the detected levels were lower than the limits in Turkish Food Codex. Key words: Mycotoxin, Forage feed, Concentrated feed, Cow milk
1 1. GİRİŞ Hayvanların sağlıklı yaşam sürebilmeleri ve sağlıklı hayvansal gıdaları üretebilmeleri için yeterli, dengeli ve kaliteli beslenmesi şarttır. Yemler, hayvanların yaşamsal ihtiyaçlarını ve verim özelliklerini devam ettirebilmeleri için ihtiyaç duyduğu çeşitli vitamin, mineral, protein, yağ ve karbonhidrat gibi besin maddelerini içerirler. Bu nedenle hayvanların, yeterli ve dengeli beslenmesinde, hayvanlardan elde edilen ürünlerinin miktar ve kalitesinin artırılmasında yemlerin önemli bir yeri vardır. Hayvanların beslenmesinde bu kadar önemli olan yemler, içerikleri nedeniyle mikroorganizmaların gelişip çoğalabilmeleri için de çok iyi bir besi yeri işlevi görürler. Yemler; uygun olmayan üretim, hasat, işleme ve depolama şartlarında mikroorganizmalarla kontamine olabilirler. Bu durum yemlerin kısa sürede bozulmasına ve besin değerlerini kaybetmesine yol açmasının yanı sıra hayvanlar için de zararlı olabilirler. Bazı mantarlar üredikleri ortamda, metabolizma ürünü olarak, "mikotoksin" denilen toksinleri oluştururlar. Bugün 300 den fazla mantar türünün mikotoksin ürettiği ve bunlardan 20 sinin önemli zehirlenmelere sebep olduğu bilinmektedir. Mikotoksinleri üreten mantarlar rüzgar ve hava akımlarıyla taşınmak suretiyle her ortamda bulunabilirler 1,2. Mikotoksin kontaminasyon düzeyi iklim koşullarına, ürünün cinsine ve coğrafi konuma bağlı olarak mevsimden mevsime, yıldan yıla farklılık gösterebilir 2. Mikotoksin üreten mantarlar, bitkiyi hasat öncesi dönemde veya hasat sonrasında enfekte edebilirler. Mantarlar büyüme, gelişme ve mikotoksin üretimi için belli koşullara ihtiyaç duyar. Bu koşullar özetle; nem, sıcaklık, substrat tipi, besinsel faktörler, atmosfer oksijen ve karbon dioksit düzeyleri, diğer mantar türlerinin varlığı ve
2 genetik şartlar olarak sıralanabilir. Toksin üretimi aynı zamanda böcek potansiyeli, bitkisel ilaçlar, baharatlar, Krebs döngüsü ara ürünleri, besin katkı maddeleri gibi faktörlerden de etkilenebilir 1,2. Mikotoksinler; Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria ve Claviceps gibi fungus türlerinin sekonder metabolizması sonucu oluşan, düşük molekül ağırlıklı, çok çeşitli kimyasal yapıya sahip doğal toksinlerdir. İnsan ve hayvan sağlığı üzerinde güçlü ve çeşitli toksik etkiler oluşturmaktadırlar 2. Tahıllar dahil birçok ürünün aflatoksinler tarafından kontaminasyonunu engellemek günümüzde önemle durulan konulardan biridir. Kontamine olmamış tohum kullanımı, haşerelerin ve hastalıkların kontrolü, aşılama, ürün olgunlaştıktan sonra olabildiğince çabuk hasat yapma, mekanik hasarı en aza indiren hasat tekniklerinin kullanımı gibi uygulamalar mantar yerleşimi ve aflatoksin oluşumunu engelleyebilir 3. Erzurum ilinde hayvansal üretim yapan işletmelerin birçoğu, kaba yemlerin hasat edilmesi, kurutulması ile kaba ve konsantre yemlerin depolanması konusunda halen modern yöntemlere tam olarak geçiş yapamamıştır. Kış mevsiminin uzun sürdüğü bu bölgede kaba ve konsantre yemler uygun olmayan koşullarda da depolanabilmektedir. Bu çalışma, Erzurum ilindeki sütçü işletmelerde süt sığırlarının tükettikleri, kaba yem, konsantre yem ve ahırda tüketime sunulan karma yemlerde bulunan çeşitli mikotoksinler (total aflatoksin, Aflatoksin B 1, okratoksin) ile bu yemlerle beslenen ineklerin sütlerinde Aflatoksin M 1 varlığını belirlemek amacıyla yapılmıştır.
3 2. GENEL BİLGİLER 2.1 Mikotoksinler Mikotoksinler, çeşitli fungus türleri tarafından üretilen kimyasal özellikli toksinler olup, bu toksinlerle kontamine olan gıdaları tüketen insanlar ve hayvanlarda karsinojenik ya da toksik etkilere yol açabilmektedirler 4,5. Mikotoksin terimi Yunanca mantar anlamına gelen 'mukes' ve latince zehir anlamına gelen 'toxicum' yani toksin kelimelerinin birleştirilmesinden türetilmiştir 6. Mikotoksinler küflerin sekonder metabolitleridir ve iz miktarda (mg - µg seviyelerinde) üretilirler. Mikotoksinleri belirli funguslar üretmekte olup, her birinin ürettiği mikotoksin farklı yapıdadır. Küf mantarı gıda maddesinde gelişip toksin oluşturduktan sonra, tamamen elimine olsada ürettiği toksin gıda maddesinin tüketilmesi sonucu toksik etkisini gösterir 7. Mikotoksin oluşturan mantarlar dünyanın her bölgesinde bulunmaktadır. Tarımsal ürünler; tarlada, hasat döneminde, depolama veya hazırlama süreçlerinde, özellikle sıcaklık ve nem gibi mantarların gelişmesine uygun şartlar oluştuğunda, funguslarla dolayısıyla mikotoksinlerle kontamine olabilirler. Mikotoksinler, hem gelişmiş hem de gelişmekte olan ülkelerde küflerin gelişiminde uygun zemin hazırlayan çevresel, sosyal ve ekonomik şartların meteorolojik koşullarla birleşmesi nedeniyle önemli sorunlara yol açmaktadır 8. Bu sebeple, yemlerden kaynaklanan çeşitli olumsuzluk faktörleri arasında mantar invazyonları ve mikotoksinlerden ileri gelen kontaminasyonlarla çoğunlukla karşılaşılmaktadır. Bu kontaminasyonların genellikle hayvanlarda klinik semptomlar göstermemesi, gerek hayvan sağlığını ve ekonomisini gerekse kalıntılarının toplum sağlığını etkilemesi nedeniyle, üzerinde önemle durulması gereken konuların başında gelmektedir 9.
4 Mantar küflerinin hemen her yerde bulunabilmeleri, birçok gıda ve yem maddesinde gelişerek toksinlerini oluşturabilmeleri nedeniyle, mikotoksinler çok önemli doğal toksinler olarak kabul edilmektedir. Gıda ve Tarım Organizasyonu (FAO), 1985 yılında, dünya gıda üretiminin % 25'inin mikotoksinlerle kontamine olduğunu bildirmiştir. Bu durum tarımsal ürün kaybı, hayvan ve süt kayıpları; üreticinin yüksek maliyetleri, tüketicinin yüksek fiyatla ürün almasının yanı sıra sağlık giderlerinin artmasına yol açan ekonomik kayıpların en önemlilerindendir 10. Günümüzde insan ve hayvanlarda zehirlenmelere neden olan veya ilaç olarak kullanılan çok sayıda mikotoksin ve mikotoksin sentezleyen mantar türleri tespit edilmiştir. Yapılan çalışmalarla 300'den fazla mantar türünün yaklaşık 200 çeşit toksin ürettiği belirlenmiştir. Bunlar arasında ergot alkaloidleri (ergotamin, ergokristin, ergosin, ergokriptin, ergokornin vb), aflatoksinler (Aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2, M 1, M 2 vb), sterigmalosistin, siteroviridin, okratoksin, zearalenon ve trikotesenler (trikotesen toksin, neosolaniol, nivalenol, fusarenon vs) sayılabilir 11. Bu mikotoksinleri tüketen insan ve hayvanlarda önemli toksikolojik problemlere rastlanılmaktadır. Mikotoksinlerin önemlilerinden olan sitreoviridin, solunum sisteminde ve kaslarda felçlere neden olup Doğu Asya'da görülen Kalp Beriberi hastalığının nedenidir. Bazı Penicillium türü mantarlardan sentezlenen okratoksin ve sitrinin, tubuler nekroza sebep olan önemli mikotoksinlerdendir. Çok sayıda mantar türü tarafından oluşturulan zearalenon, insan ve hayvanlarda fusariotoksikozise neden olmasının yanı sıra anabolizan amaçla kullanılmaktadır 11. Mikotoksinlerin kimyasal yapıları incelendiğinde bir çoğunun aromatik, daha az bir kısmının da alifatik yapıda olduğu görülmektedir. Genellikle yüksek sıcaklıklara dirençlidirler. Ancak sıcaklık derecelerine ve uygulama sürelerine göre farklı stabilite
5 gösterebilirler. Genellikle kendilerinin sentezledikleri toksinlerden olumsuz etkilenmezler. Mikotoksinler bakteri toksinlerinin aksine küçük moleküllü bileşikler olduğundan bunların immunolojik yöntemlerle belirlenmesinde poliklonal antikorlar yeterli olur. Oysa bakteriyel toksinlerin belirlenmesinde monoklonal antikorlara gereksinim duyulmaktadır. Bazı mikotoksinler endotoksin olarak misel içinde birikirken, birçoğunun miselden substrata doğru salgılandığı ve diffüze olduğu görülmektedir. Bu nedenle küflü gıda ve yemlerden miseller uzaklaştırılsa bile ürünün mikotoksin tehlikesi ortadan kalkmamaktadır 3. Mikotoksin bulaşmış yemleri tüketen ineklerin metabolizmasıyla mikotoksin süte geçmekte ve insan sağlığı açısından potansiyel risk oluşturmaktadır. Gremmels 12, ineklerin tükettiği çeşitli yemlerin (konsantre; aflatoksin, fumonisin, zearalenon, trikotesen, ergot alkaloidler, mera otu; lolitrem, paspalitrem, penitrem A, ergovalin ve ergot alkaloidler, trikotesen, silaj yemi; patulin, mikofenolik asit, rokfortin) mikotoksin içerdiğini belirtmiştir. Yetiştiriciler açısından hayvan yemlerinin mikotoksinler ile kontaminasyonu, özellikle nemli koşullarda küflerin üremesi nedeniyle engellenememektedir 13. 2.1.1. Tarihçe Fungusların neden olduğu bilinen en önemli ve en eski mikotoksikozis vakası organlarda çeşitli nekroz ve gangrenlere sebep olan ergotizmdir. Bu hastalık Claviceps purpurea ile kontamine olmuş tahıl tanelerinin tüketilmesi ile ortaya çıkmış ve Orta Çağ Avrupası nda "Kutsal Ateş" olarak tanınmıştır 14. Hastalığın nedeni halusinojen etkiye sahip olan ergot alkaloidleridir. Bu hastalığın yaygın olduğu çağlarda şifa bulmak için manastır ve kiliselere giden hastalar, burada kontamine olmamış ürünleri tükettiklerinde hastalıktan kurtulmuş ve bunu kilisenin mucizesi olarak kabul etmişlerdir 15.
6 Tarihte diğer önemli mikotoksikozis olayı Rusya'da ikinci dünya savaşı sırasında görülmüştür. Rusya'nın Orenburg bölgesinde 1942-1944 yılları arasında binlerce insanın ölümü ile sonuçlanan mikotoksikosis olayı "Alimentary Toxic Aleukia" (beslenmeye bağlı toksik etki ile kanda lökosit sayısının düşmesi sonucu oluşan lösemi) olarak tarihe geçmiştir. Bu büyük yıkıma, savaş nedeniyle zorunlu olarak tarlada bekletilen tahılların yol açtığı anlaşılmıştır 3,16,17. Fusarium spp. türlerinin neden olduğu ergotizm, Penicillium spp. nin neden olduğu sarı pirinç zehirlenmesi gibi mikotoksikozisler geçmişte özellikle Rusya, Japonya ve Avrupa'da salgınlar halinde seyreden hastalıklara neden olmuşlardır 18. Amerika Birleşik Devletleri'nde 1952 ve 1957 yıllarında küflü mısır yiyen domuzlarda, 1958'de küflü mısır ile hazırlanan yemlerle beslenen ev köpeklerinde akut hepatit görülmüştür. Küflü yemlerden yapılan analizlerde Aspergillus flavus ve Penicillium rubrum izole edilmiştir 19. İngiltere'de, 1960 yılında 100.000'den fazla hindinin ölümüne neden olan karaciğer nekrozu (Turkey-X Disease) üzerinde yapılan araştırmalar sonucunda ilk kez aflatoksikozis belirlenmiştir 20. Yapılan çalışmalarda ölümlerin Brezilya'dan getirilen fıstık küspelerinden kaynaklandığı anlaşılmıştır 21. Turkey-X hastalığının ortaya çıkmasından kısa bir süre sonra hindiler de olduğu gibi tavuk ve ördek yavrularında da zehirlenmeler görülmüş, bu hastalık; akut hepatik nekroz, belirgin safra kanalı hiperplazisi, akut iştahsızlık, kanatlarda zayıflık ve uyuşukluk gibi belirtilerle karakterize edilmiştir 22. Hindistan'da 1984 yılında, 400 kişinin zehirlendiği, 106 ölüm vakası gözlenen bir olay kaydedilmiş, bu olaya sebep olan mısırlarda 0,25-15,6 ppm arasında aflatoksin kalıntısı bulunduğu ortaya konulmuştur 23. Ülkemizde aflatoksin sorunu 1960'lı yıllarda gündeme gelmiştir. Aflatoksikozis 1967 yılında Kanada'ya gönderilen 10 ton iç fındık ve 1971 yılında ABD'ye ihraç edilen
7 45 parti antepfıstığının 31 i aflatoksin içerdiği gerekçesiyle iade edilmesi sonucu ortaya çıkmıştır 24. Aflatoksinin bulunuşu ile toksik etkiye sahip sekonder metabolitler önem kazanmış ve 40 yıldır üzerinde sayısız araştırmaların yürütüldüğü oldukça geniş bir madde grubu oluşmuştur. Bugün gelinen noktada insanları bu toksik grubun etkilerinden korumak amacıyla mikotoksinlerin gıda ve yemlerde bulunabilecek en yüksek miktarları yasal düzenlemelerle belirlenmekte, her ülkenin sınır değerleri farklı olsa da uluslararası belli normlar oluşturmak için çaba sarf edilmektedir 3. 2.1.2. Gıdaların Mikotoksinlerle Kontaminasyon Yolları Gıdaların mikotoksinlerle kontaminasyonu çeşitli yollarla gerçekleşmektedir. Gıdanın gözle fark edilir şekilde küflenmesi mikotoksinin direkt kontaminasyonuna neden olur. Bitkisel ürünlerden; tahıllarda, baklagil danelerinde (soya fasulyesi, fasulye vb), fındık, yer fıstığı, ceviz, Antep fıstığı, badem, ayçiçeği tohumu, pamuk tohumu gibi yağlı tohumlarda, meyvelerde ve baharatta mikotoksin kontaminasyonu direkt yolla ve önemli düzeyde meydana gelmektedir. Gözle görülür şekilde üründe küf şekillenmesi ürünün tüketimini olanaksız hale getireceğinden ciddi bir risk taşımaz. Ancak ürünün çok az bir kısmında başlayan küflenme özellikle depolanma sürecinde mikotoksin riskini arttırır. Bitkisel ürünlerde mikotoksin kontaminasyonu tarlada olgunlaşma evresinden başlayarak, hasatta, kurutma aşamasında ve ağırlıklı olarak da depolanma döneminde meydana gelir 3. Mikotoksinler, belirlenmiş yapılarına göre kanserojenik, mutajenik, teratojenik, östrojenik, nörotoksik ve immüno toksik etki yapabilirler 25. 2.1.3. Sınıflandırma Mikotoksinler genellikle üretici mantar çeşidine göre Aspergillus toksinleri (aflatoksinler, aspergillik asit, okzalik asit), Penisilyum toksinleri (rugulosin, okratoksinler, patulin) ve Fusarium toksinleri (zearalenon, trikotesen, fusarin C) olarak
8 sınıflandırılırlar 26. Mikotoksin çeşitleri, kaynakları, hedef hayvan, doku veya organlar üzerindeki etkileri Tablo 2.1 de özetlenmiştir 23. Tablo 2.1. Mikotoksin çeşitleri, kaynakları, hedef hayvan, doku veya organlar 23. Mikotoksinler Mantar çeşidi Hedef organ, doku ve oluşan etki Aflatoksinler Sitrinin Okratoksin Patulin Sterigmatosistin Aspertoksin Penisillik asit A. flavus A. parasiticus P. puberulum Penicillium citrinum Aspergillus terreum A.ochraceus P. viridicatum A. clavatus P. Patulum A. versicolor A. nidulans P. puberulum A. ochraceus Karaciğer; gelişme hızı ve veriminde azalma; sarılık, kanama, Sürgün, karaciğer kanseri, bağışıklık sisteminin baskılanması Sinirsel belirtiler sürgün gelişme geriliği, karaciğer ve böbrek nekrozu, kalp ve iskelet kasında rniyopati, karaciğer kanseri K.ciğer ve böbrek hasarı, iştah kaybı, sürgün, bağ. Sist. baskılama Sinirsel belirtiler, beyin kanaması, deri kanseri Karaciğer kanseri Rubratoksin P. rubrum Aflatoksinlere benzer Luteoskirin Sikloklorotin Rugulosin Zearalenon Sporidesmin Trikotesenler P. islandicum P. rugulosum F. roseum ve diğer Fus.türleri S. bakeri Fusaryum Trikoderma, Sefalosporium Besin veya ürün çeşidi Tahıl yağlı tohum küspesi Süt Tahıllar Tahıllar, otlar Silaj, elma, yemler Tahıllar, pirinç, Yemler Öncelikle etkilenen hayvan * insanlar Kanatlılar, dornuzlar Kanatlılar, insanlar Sığırlar Deri kanseri, kanamalar Tahıllar, mısır * Tahıl, baklagiller, yağlı tohumlar Karaciğer hasarı ve kanseri Pirinç Kanatlılar Ostrojenik etki Karaciğer hasarı, safra kanalı tıkanması, ışığa aşırı duyarlılık Dermatit, deride nekroz, kanamalar, anemi, granülositopeni vb. Tahıllar Tahıllar, otlar * * Gevişenler, domuzlar Gevişenler Tahıllar, yemler * Streoviridin P.citreoviridae MSS, kalp ve solunum felci Pirinç, tahıllar * Butenolid F. tricinctum Bacaklarda gangren, kuyrukta nekroz Tahıllar, mısır, ot Sığırlar Penitremler Pen. türleri Kas titremeleri, felç, çırpınmalar Tahıllar * Lolitremler Acremonium Tremorlar, hareket düzensizlikleri, Gevişenler, Çavdar vb. loliae çırpınmalar, şok, spaszm gibi at Fumonisinler Fusarium türleri Beyin ve akciğer yangısı Mısır At, domuz, kanatlılar 4-ipomeanol Fus. solanii Akciğer ödemi, pnömoni, amfizem Küflü tatlı patates Sığır Kojik asit A. flavus A. Oryzae Çırpınmalar, ödem Mısır * Okzalik asit A. niger A. oxalicum Mide irkiltisi, MSS ve böbrek hasarı, kanama, kan kalsiyumunda azalma Bitkiler C. purpurea C. Kuru gangren, aşırı uyarı, kanın * Ergot alkaloidleri Tahıllar Paspali pıhtılaşması Satratoksinler Stachybotrys Kemik iliği, deri, mukozalar Tahıllar, otlar * Territremler A. terreus MSS. tremorlar, nöro-musk. kav. Tahıllar, otlar * *: Tüm hayvan türleri *
9 Mikotoksin zehirlenmelerinde sağaltım genellikle başarısızlıkla sonuçlanmaktadır. Bu nedenle, mikotoksikozise karşı profilaktik önlemler önem taşımaktadır. Yem ham maddeleri ve karma yemlerin uygun koşullarda üretilip saklanması, olası kontaminasyon durumlarında da mikotoksinlerin fiziksel ya da kimyasal yöntemlerle inaktivasyonu, yine kontamine yemlerin mikotoksine dirençli olan hayvan türleri aracılığıyla değerlendirilmesi veya tüketimden kaldırılması mikotoksikozise karşı alınabilecek başlıca proflaktik önlemlerdir 27. Mikotoksinlerin keşfinden beri, belirlenebilmeleri için birkaç yöntem geliştirilmiştir. Bugün rutin olarak kullanılan yöntemler; yüksek performanslı likit kromatografi (HPLC), ince tabaka kromatografisi (TLC), gaz kromatografisi (GC), enzim bağlı immun assay (ELISA) dir 5. 2.1.4. Mikotoksin Oluşumunu Etkileyen Faktörler Bitkilerin fungal kontaminasyonu ve toksinlerin biyosentezi, çevresel koşullara bağlıdır. Bunlar; bitkinin hasat öncesi sağlık durumu, meteorolojik koşullar, hasat tekniği, depolama öncesi gecikme, deponun nemi ve sıcaklığıdır 25. Mikotoksin oluşumunu etkileyen fiziksel, kimyasal ve biyolojik faktörler Tablo 2.2 de özetlenmiştir. Tablo 2.2. Mikotoksin oluşumunu etkileyen başlıca faktörler 26 Fiziksel Faktörler Kimyasal Faktörler Biyolojik Faktörler Kurutma hızı CO 2 Mikroorganizma yükü Bağıl nem O 2 Mikrobiyal flora Sıcaklık Mineral içeriği Böcek zararı Mekanik zarar Kimyasal işlemler Hastalık zararı Paçal yapılması Subsratın özelliği Bitki çeşidi Kızışma Bitki stresi
10 Tahıllar, baklagil daneleri, yer fıstığı, fındık, ceviz, badem, yağlı tohumlar, baharat ve bazı meyveler küflere karşı doğal korunma sistemlerine sahiptirler. Bitkisel ürünlerin çoğu hasat işleminden önce küf kontaminasyonundan korunur. Çünkü dış etkenlere karşı biyolojik olarak kabuk, çekirdek veya tohum kabuğu ile korunmaktadırlar. Ayrıca eterik yağlar, antibiyotik etkili maddeler ve fitositler dış yapıda bulunmaktadır. Ancak tarlada, hasatta, harmanlama veya depolama süresince ürünlerin kırılması, ezilmesi, kuş veya böceklerin meydana getirdiği mekanik zararlar ürünün savunma gücünü azaltmaktadır. Bulaşan küflerin spektrumuna etki eden diğer faktörler; tarımsal ürün veya gıdanın türü, kimyasal kompozisyonu, ürünün yetiştirildiği klima zonu, ürünün olgunluk durumudur. Her şeyden önce tarımsal ürünün veya gıdanın küf spektrumunda bulunan küflerin potansiyel mikotoksin üreticisi olup olmadıkları önem taşımaktadır. Kontamine küfler mikotoksin üreticisi olsalar bile toksinin sentezlenmesinde; ürünün nem içeriği, sıcaklık, işleme ve depolama sırasındaki havanın bağıl nemi önemlidir. Ayrıca atmosferik oksijen, diğer modifiye atmosfer gazları, ışık, süre, ph gibi faktörlerin de etkisi bulunmaktadır 3. 2.1.4.1. Bağıl Nem veya Su Aktivitesinin Etkisi Tarımsal ürünün nem içeriği, atmosfer bağıl neminden etkilendiği için sıcaklık ve bağıl nem; fungus sporlarının çimlenmesi, misellerin gelişmesi ve toksin oluşumunu etkileyen en önemli faktörlerdir. Fungusların gıda maddeleri üzerinde gelişebilmeleri ve toksin oluşturmaları atmosferdeki bağıl nem oranı arttıkça kolaylaşır. Bir başka ifade ile fungusların gıdalarda gelişme ve toksin oluşturmaları, gıdanın düşük su aktivitesi (A S ) ile sınırlandırılabilir. A S değeri ürün içinde bağlı olmayan ve mikroorganizmaların kullanabildikleri suyu ifade ettiğinden, üründeki mikrobiyolojik duruma ilişkin su oranına kıyasla daha fazla anlam ifade etmektedir. Atmosfer bağıl nemi ile gıdanın A S
11 değeri arasında pozitif bir ilişki vardır. Bağıl nem arttıkça ürün üzerindeki su buhar basıncı artarak, ürünün A S değerinin yükselmesine yol açar. Fungusların min. A S : 0,80 0,85 değerlerinde rahatlıkla gelişebilirler. Kserofilik Eurotium türleri ve Monascus bisporus min. A S : 0.61-0.62 değerlerinde bile varlıklarını sürdürürler. Nem içeriği % 13,2-14,0 olan kurutulmuş tahılların uzun süre depolanması sırasında Asp. flavus ve Asp. parasiticus'un gelişebilmesi için depoda bağıl nemin artması ve dane nem oranının % 17-19' a kadar yükselmesi gerekir 3. 2.1.4.2. Ortam Sıcaklığının Etkisi Funguslar genellikle geniş sıcaklık aralığında gelişebilirler. Aflatoksin üreten küfler min. 6-8, mak. 50-60 C lerde üreyebildikleri halde toksin oluşumu için min. 10-13, mak. 42 C de ortam sıcaklığına gereksinim duyarlar. Bunların optimum gelişmeleri 35-38 C olduğu halde maksimum toksin konsantrasyonuna 25-30 C lerde ulaşılır. Penicillium ve Fusariumlar düşük sıcaklıklarda (< 5 C) gelişebilmelerine karşılık Aspergillus türleri bu sıcaklıklarda üreyemez ve toksin oluşturamaz. Asp. ochraceus diğer Aspergillus türlerine oranla daha düşük sıcaklık derecelerinde okratoksin (OTA) sentezleyebilir 3. Mikotoksin sentezi için uygun sıcaklığın yanı sıra, oksijen ve enerji varlığı önemli etkenlerdir 28. Mikotoksinler, hemen hemen tüm hayvan türleri ve insanlarda zehirlenme yapabilmeleri, ayrım göstermeksizin hemen her çeşit besin ve yemde kontaminasyona yol açmaları, maymunlar da dahil olmak üzere pek çok hayvan türünde karsinojenik olmaları, küflü yemleri yiyen hayvanların et, süt, yumurta gibi ürünlerinde kalıntılarına rastlanılması ve insanlarda karsinojen olabilmeleri nedeniyle, aflatoksinler hala yoğun biçimde araştırılan en önemli mikotoksin grubunu teşkil etmektedir 23.
12 2.1.5. Mikotoksinlerin Önemi Mikotoksinlerle kontamine olan yemlerle beslenen hayvanlarda akut ve kronik mikotoksikozise neden olmaları ve bu hayvanlardan elde edilen hayvansal ürünlerin toplum sağlığı açısından sorun oluşturmaları nedeniyle mikotoksinler toksikolojide önemli bir yere sahiptir 27,29. Mikotoksinlerin; bulaşıcı olmaması, ilaç ve antibiyotik tedavisine düşük oranda cevap vermesi, salgın şekilde görülmelerinin kontamine olmuş bir besin veya yemle ilişkili olması önemli özelliklerindendir. Toksisitenin derece ve şiddeti; konakçının yaşı, cinsiyeti ve beslenme durumuna göre değişmektedir 30,31. Mikotoksin problemi, besinlerdeki küflerin miktarı ve insidansındaki artış farkedilecek boyutlardadır. Hava şartlarının etkisi altında, hasat mevsimi ve büyüme devresindeki artış çok daha belirgindir. Tarımda yeterince gelişmiş tekniklerin kullanılmaması sonucu, ürünlerin hasat sonrası tarlada uzun bir süre kalmaları, gerek bu esnada gerekse harmanlama ve taşıma sırasında birçok kez yağmura maruz kalmaları da mikotoksinlerle kontaminasyonuna yol açabilmektedir 23. Soğuk ve yağışlı mevsimlerde tarımsal ürünlerin (mısır vb) olgunlaşması gecikebilir. Bu durum, üründe küf ve mikotoksin oluşumuna yardımcı olabilmektedir 32. Mikotoksinlerle kontamine gıdalar, hayvanların sağlığı için önemli bir risk teşkil etmekte ve çiftlik hayvanlarının verimlerinin düşmesinden dolayı büyük ekonomik kayıplara neden olmaktadır 33. Mikotoksikozisde çoğunlukla akut toksisite görülmesine rağmen, uzun süreyle düşük miktarda toksin alınımında kronik toksisiteye de yol açabilmektedir 34. Mikotoksikozde ölüm ya da akut semptomlardan ziyade kronik etkiler daha sık görülmektedir 35. Kronik mikotoksikozise uzun süre maruz kalınması
13 böbrek, karaciğer problemleri, immun sistem bozuklukları ve kanser gibi birçok hastalığa neden olmaktadır 36. 2.2. Aflatoksinler Aflatoksinler mikotoksinler içerisinde en kuvvetli biyolojik karsinojenler olarak bilinmektedir. Aflatoksinler, depolanmış hemen her çeşit yem, yem maddeleri, besinler ve doğada yaygın bir şekilde bulunan hepatokarsinojenik, mutajenik, teratojenik ve toksijenik metabolitlerdir 37-40. Aflatoksinler Aspergillus'un üç türü olan Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus ve nadiren Aspergillus nomius tarafından üretilirler. Asp. flavus sadece aflatoksin B üretirken diğer iki tür hem aflatoksin B hem de aflatoksin G üretmektedir 41,42. Aflatoksinler, yaygın olarak çeşitli tahıllar, süt ve süt ürünleri ile meyve sularında saptanmıştır 43. Aspergillus flavus dünyada daha yaygın olarak bulunur. Aspergillus parasiticus ise çoğunlukla tropik ve subtropik iklim zonlarında görülür. Sıklıkla toprakta rastlanmakla birlikte havada, canlı veya ölü hayvanlar ve bitkiler üzerinde de bulunurlar. Küflerin aflatoksin üretimleri; genetik potansiyel, çevre koşulları (A S, sıcaklık, substrat, ph, redoks potansiyeli) ve fungusla substratın bulaşması gibi faktörlere bağlıdır 3. Aflatoksinler, difurokumarosiklopentenon ile difurokumarolakton gruplarında sınıflandırılmıştır. Aflatoksinler, su ve polar organik çözücülerde çözülebilir. Aflatoksinler, alkaloidlerle ve oksidasyon maddeleriyle kolayca parçalanabilir fakat normal gıda işleme sıcaklıklarında parçalanmaz 34. Hekzan, petrol eteri, izooktan gibi yağ çözücüleri dışındaki organik çözücülerde iyi çözünürler. Sudaki çözünürlükleri 10-20 mg/l arasındadır 23, 44. Aflatoksin B 1 (AFLB 1 ) tarımsal ürünlerde ki belirli Aspergillus spp. tarafından üretilen son derece toksik ve karsinojenik metabolitlerdir 45. Aflatoksin B 1 ve AFLB 2
14 içeren yemleri tüketen hayvanların sütünde, bu toksinlerin hidroksillenmiş metabolitleri olan aflatoksin M 1 (AFLM 1 ) ve aflatoksin M 2 'ye (AFLM 2 ) dönüştürülmektedir 46. Hayvanların yemlerinde yüksek düzeyde AFLBı bulunması, sütlerinde yavrularını zehirleyebilecek miktarlarda AFLMı bulunmasına yol açabilmektedir 47. Aflatoksinlerin, aflatoksin B 1, B 2, G 1 ve G 2 olmak üzere dört ana fraksiyonu vardır. Bunların dışında önemli iki aflatoksin türevi olan aflatoksin M 1 ve M 2, AFLB 1 ve B 2 'nin hidroksi türevleridir 10,48. Ayrıca özellikle memelilerde, ana metabolitlerin biyotransformasyonu sonucu oluşan Aflatoksin P 1 (AFLP 1 ), Q 1 (AFLQ 1 ), B 2a (AFLB 2a ) ve G 2a (AFLG 2a ) olarak isimlendirilen aflatoksinler de tanımlanmıştır 20,48-50. İlk olarak, ultraviyole (UV) ışığı altında mavi renkli floresan veren iki bileşen AFLB 1 ve AFLB 2, sarı yeşil renkte floresan veren diğer iki bileşen ise AFLG 1 ve AFLG 2 olarak adlandırılmıştır. Daha sonra, aflatoksinli yemleri tüketen hayvanların sütlerinde bu toksinin bir türevinin olduğu ortaya çıkmış ve sütte bulunmasından dolayı da buna süt toksini (milk toxin) anlamında aflatoksin M adı verilmiştir 51,52. En yüksek toksisite AFLB 1 ve AFLB 3 (parasitikol)'e aittir, AFLG 2 ve AFLM 2 ise en düşük toksisiteyi göstemektedir. Tarımsal ürünlerde, gıdalarda ve yemlerde en sıklıkla görülen aflatoksinlerin toksisite sıralaması; AFLB 1 > AFLM 1 = AFG 1 > AFLB 2 > AFLG 2 > AFLM 2 şeklindedir. Başka hayvanlar üzerinde belirlenen LD 50 dozlarında da bu sıranın fazla değişmediği, bazı hallerde toksik sıralamada AFLM 1 ' in AFLG 1 'in, AFLM 2 'nin de AFLG 2 'nin önüne geçtiği veya eşit düzeyde olduğu belirtilmektedir 3,16. Yem ve besinlerle alınan aflatoksinlerin büyük bir kısmı dışkı ve idrar ile atılmaktadır. Ancak sindirim kanalından sınırlı ölçüde emilip kana geçen toksinler plazmadan çabuk ayrılır; başlıca karaciğer ve kaslarda dağılım gösterirler. Vücuda giren AFLB 1 ' in % 85-90'ı ilk 24 saat içinde dışkı (% 75), idrar (% 15-20) ve sütle değişikliğe
15 uğramadan veya metabolitleri halinde atılır. Büyük oranda dışkıyla atılması ağızdan alınan toksinin sindirim kanalından sınırlı şekilde emildiğini göstermektedir. Yemlerdeki kontaminasyonun sona ermesi halinde sütte 3-6 gün, idrar ve dışkıda 6-9 gün sonra aflatoksin kalıntılarına rastlanılmamaktadır. Yemlerle alınan AFLB 1 'in süt sığırlarında yaklaşık % 0,18 i koyunlarda ise % 0,1 i süte (AFLM 1 ) geçmektedir. Süt ineği yemlerine 400 ppb ve daha yüksek düzeylerde AFLB 1 bulunması sütlerinde yavrularını zehirleyebilecek miktarda AFLM 1 bulunmasına yol açabilmektedir. Özellikle karaciğer düzeyinde etkin hale geçen bu toksinler, yağda ve suda çözünebilen türevlere (AFLQ 1, AFLP 1, AFLB 2a, AFLM 1, AFLM 2 ) dönüştürülürler. Bu ürünlerin büyük çoğunluğu safra yoluyla atılır ve bu aşamada bileşikler bağırsak yoluyla dolaşıma girerek karaciğere ulaşırlar 53. Aflatoksinlerin esas olarak küflü gıdalarda görülmesine karşın doğrudan insan tüketimine sunulan gıdalarda da aflatoksin oluşabileceği, çeşitli işleme yöntemlerinin bunu tamamen ortadan kaldırmadığı ve hayvan yeminde bulunabilecek aflatoksinlerin çok az bir oranda da olsa et, süt ve yumurta gibi gıdalara geçerek insan sağlığı açısından risk oluşturabileceği ifade edilmektedir 40. Aflatoksinler, karaciğer düzeyinde mikrozimal enzim sistemleriyle değişikliğe uğratılarak etkinlik kazanırlar. İnsan ve hayvanlarda biyolojik etkinlik gösteren bu toksinler, hücresel düzeyde nükleoproteinler, nükleik asitlerle makromoleküler düzeyde tepkimeye girerler. Protein yapımında aksama ve yavaşlamalarla birlikte, hücresel yaşam işlevinin korunmasında yaşanan sorunlar sonucunda karaciğer nekrozu ve tümör oluşumları gerçekleşmektedir. Aflatoksinler, karaciğerde GSH-S transferaz (Glutation- S-Transferaz) enzimince katalize edilen tepkimeler sonucunda GSH ile konjuge edilerek veya epoksit hidrataz enzimince aflatoksikole çevrilerek zararsız hale getirilmeye
16 çalışılır. Ancak uzun süre ve fazla miktarda aflatoksin alımında açıklanan detoksifikasyon işlevi yetersiz kalır ve ciddi sağlık sorunları gözlemlenir. Başta keçiler olmak üzere diğer ruminantlarda AFLB 1 etkin bir biçimde detoksifiye edilmektedir 54. Üründe toksik küf bulunması her zaman aflatoksize neden olmazken, sağlıklı görünen ürünlerde aflatoksize rastlanabilmektedir 45. Küf olgusuna neden olan mantar sayısı veya koloni genişliğiyle aflatoksinlerin oluşma düzeyleri arasında doğrusal bir ilişki yoktur. Genellikle ürünün ve ortamın giderek azalan nem içeriği, kullanılabilir besin madde kompozisyonu, aşırı sporlanma, küflenme süresi ve iklim koşulları aflatoksin oluşum düzeyini sınırlayabilmektedir. Bu nedenle ağır bir biçimde küflenmiş yemlerde 0,0115 ppm aflatoksin bulunabilirken, dikkati çekmeyecek düzeyde küf içeren ürünlerde 1000 ppm'e kadar AFLB 1 bulunabilmektedir 55. Çevre sıcaklıklarına karşı oldukça dayanıklı olan bu toksinler ancak 300 C'nin üzerinde tamamen etkisiz hale gelirler. Henüz besinlerdeki aflatoksini tamamen etkisiz hale getirebilecek fiziksel, kimyasal ya da biyolojik yöntem bulunamamıştır. Bu nedenle mikotoksin bulaşmış karma yemler hala hayvan sağlığı için ciddi sorunlar oluşturmaktadır 53. 2.2.1. Süt ve Süt Ürünlerinde Aflatoksin Mı Oluşumu Besinleri kontamine eden aflatoksinlerin keşfinden kısa bir süre sonra, aflatoksin içeren yem maddelerinin hayvanlar tarafından yenilmesiyle süt ve diğer hayvansal ürünlerde de aflatoksinin oluşabileceği bildirilmiştir 22. Aflatoksinler içerisinde en toksik etkiye sahip olan Aflatoksin B 1, kontamine olan yemlerle alındıktan sonra, süt hayvanları tarafından metabolize edilerek monohidroksi türevi olan aflatoksin M 1 şeklinde sütten atılır. Aflatoksin M 1 hayvanların AFLB 1 tüketmesinden birkaç saat sonra sütte tespit edilebilirler. Sütteki AFLM 1, AFLB 1 in miktarı ile doğru orantılı olarak artış gösterir 37.
17 Mikotoksinler süt ürünlerinde iki nedenle bulunabilmektedir. Birincisi, tüketilen kontamine yemlerdeki toksinlerin metabolitlerin süte geçmesi sonucu sütün kontaminasyonu (AFLB 1, AFLM 1 ), ikincisi ise süt ürününün direkt olarak küf kontaminasyonuna maruz kalması sonucu mikotoksin oluşmasıdır 26,47. Süt ve ürünlerinde AFLM 1 in yanı sıra AFLM 2, okratoksin (OTA), siklopiyazonik asit, trikotesen, zearalenon, patulin ve fumonisin mikotoksinleri de bulunabilmektedir 47,56. Aflatoksin M 1 laktasyondaki hayvanların AFLB 1 içeren yemlerle beslenmesinden sonra sütle atıldığı için süt ve peynir, yoğurt, süt tozu, tereyağı gibi süt ürünlerinde bulunabilmektedir 57. Aflatoksin B 1 ile kontamine yem katkı maddelerinin hayvanlar tarafından tüketilmesiyle AFLB 1 'in yaklaşık %1-3 ü sütte AFLM 1 olarak ortaya çıkmaktadır 58. Aflatoksin B 1 'in bir türevi olan AFLM 1 'in oluşumu, karaciğerde gerçekleşmekte ve süt veren memelilerin sütleri ile idrarda bulunmakta ve özellikle karaciğerde tahribatlara sebep olmaktadır 59. IARC tarafından yayınlanan raporda, tükettikleri gıdalardaki aflatoksin kontaminasyonunun yaygın olduğu Çin ve Filipinler gibi ülkelerde, karaciğer kanseri vakalarına daha sık rastlandığı bildirilmektedir 60,61. Halk sağlığını yakından ilgilendiren bu konu üzerinde birçok ülkede uzun yıllar çeşitli kontrol ve izleme programları yürütülmüş ve elde edilen sonuçlara göre çeşitli gıda ve hayvan yemlerinde bulunmasına izin verilen aflatoksinler için sınır değerler belirlenmiştir 62,63. Ülkemizde ise bu konu ile ilgili en son yasal düzenleme 2009 yılında yayınlanmış olup hala yürürlüktedir 64.
18 2.2.2. Aflatoksin oluşumunu etkileyen faktörler Aflatoksin oluşumunu etkileyen faktörler başlıca üç kategoride sınıflandırılabilir; bunlar fiziksel, besinsel ve biyolojik faktörlerdir. Fiziksel faktörler; sıcaklık, ph, nem, hava ve atmosferdeki gazların seviyesini içermektedir. Aflatoksinler sadece 12-42 C sıcaklıkları arasında ürerler. Optimal sıcaklık 25-35 C olmakla birlikte 7,5-40 C arasında üreyebilmektedir. Yine koşullara bağlı olmak üzere aflatoksin üretim süresi 24 saat ile 4-10 gün arasında değişebilmektedir. Aflatoksin üretimi için minimum su aktivitesinin ise 0,85 olduğu bildirilmiştir 18. Normal ısılarda son derece dayanıklı olan aflatoksinlerin tümüyle parçalanmaları için yüksek sıcaklıklara gerek vardır. Kısa sürede yüksek ısı uygulaması (pastörizasyon işlemi) sütlerdeki aflatoksin miktarında önemli bir değişikliğe neden olmamaktadır 23. Aflatoksinler gıda ve yem maddelerinde çok stabildir, ancak çok düşük veya yüksek ph'larda (3'ten düşük ve 10'dan büyük), okside edici ajanlarla ve oksijen olan ortamda UV ışığına maruz kaldıklarında hızla aktivasyonlarını yitirmektedirler 10. Küf oluşumu düşük nem seviyesinde (<% 12-13) belirgin derecede azalmakta, ancak toksisitesinde herhangi bir değişiklik olmamaktadır 23. CO 2 ve O 2 varlığı aflatoksin üremesi ve küfün oluşumunda etkilidir. Havadaki % 20 CO 2 seviyesi aflatoksin üretimini ve küfün gelişimini belirgin biçimde engellemektedir. Havadaki oksijen konsantrasyonunun %10 oranında azalması da aflatoksin üretimini baskılamaktadır 65. Aflatoksin sentezinde inorganik tuzlarda etkili olup, başlıca çinko, manganez duyarlılığı artırırken, kadmiyum demir karışımı küf gelişimini ve aflatoksin üretimini baskılamaktadır 65.
19 Aflatoksin oluşumunu etkileyen biyolojik faktörler ise; mikroorganizma yükü (küf suşunun toksijenik olup olmadığı, toksijenik ise toksin üretme kabiliyeti), mikrobiyal flora, bitki tür, böcek hasarı, ayrıca birden fazla parazit veya mantar türünün mevcut olup olmaması mantarların üremesini ve mikotoksin oluşturmasını etkilemektedir 23,24. 2.2.3. Aflatoksinlerin Etki Şekilleri Aflatoksinler doğrudan etkili değildirler; sitozolik ve stokrom P 450 sistemiyle birçok metabolite çevrilirler. Karaciğerde stokrom P 450 vasıtasıyla uğradıkları metabolik değişiklikler sonucu oluşan epoksit türevleri (AFLB 1-2,3-epoksit vb) etkili olmaktadır. Klinik olarak toksik ve karsinojenik etkileri tümüyle bu metabolitleriyle ilgilidir 23. Gıdalardaki en tehlikeli kanserojenlerden olan aflatoksinler, hücre içerisine, oradan da çekirdeğe geçerek DNA'ya bağlanmaktadır. Toksik etkilerini DNA çift sarmalını şablon olarak kullanıp, mrna sentezini gerçekleştiren RNA polimerazın DNA'ya bağlanmasını engelleyerek göstermektedirler 66. Aflatoksin B 1 biyolojik reaktif bir bileşiktir ve birçok biyokimyasal sistemi değiştirmektedir. Aflatoksin B 1 'in hepatokarsinojitesi biyotransformasyon ile ilgilidir. Bu toksin DNA, RNA ve proteine kovalent formda bağlanan yüksek bir reaktif elektrofilik epoksittir 48. 2.2.4. Aflatoksinlerin Etkileri Aflatoksinlerin toksik etkileri; hepatotoksisite, hepatokarsinojite, nefrotoksisite, teratojenite, immun sistemin bozulması ile hastalıklara karşı yatkınlık, büyümenin yavaşlaması besin maddelerinden yararlanmanın azalması olarak sayılabilmektedir 43. Bu mikotoksinlerin DNA, RNA ve protein sentezi inhibisyonu; çeşitli enzim aktivitelerinde azalma; glukoz metabolizması depresyonu; fosfolipidler, serbest yağ asitleri, trigliseritler, kolesterol ve esterleri dahil olmak üzere lipid sentezi inhibisyonu
20 ve pıhtılaşma faktörü inhibisyonu gibi metabolik etkileri vardır 67. Bu toksik etkiler, tüketilen toksinin miktar ve sıklığına, çevresel faktörlere, hayvanın yaşına, cinsiyetine, sağlık durumuna ve beslenme alışkanlıklarına bağlı olarak değişmektedir 9,68. Aflatoksinlere dişi farelerin erkek farelere göre daha az duyarlı olduğu; bu durumun da östrojenik hormonların koruyucu etkisinden kaynaklandığı bu nedenle cinsiyetin AFL lere duyarlılık açısından önemli olabileceği belirtilmiştir 9. Aflatoksinler alınan toksin miktarına bağlı olarak akut, subakut ve kronik nitelikte zehirlenmelere yol açmaktadırlar. Aflatoksinlerin toksisitelerine tamamen dirençli bir hayvan türü henüz bilinmemektedir 2,69. Civciv, piliç ve ördek yavruları en duyarlı olanlardır, bunları sırasıyla hindi yavrusu, sülün palazı, tavuklar ve bıldırcınlar izlemektedir. Memeliler arasında ise aflatoksinden etkilenme sırası; 3-12 haftalık domuzlar, gebe domuzlar, yetişkin domuz, sığır ve koyunlar şeklindedir. Alabalıklar ve köpekler de aflatoksine duyarlı hayvanlardır. Alabalıklarda, çok düşük konsantrasyonda bile karaciğer kanseri etkisi görülmektedir 70. Düşük konsantrasyonlarda bile kontamine yemlerin tüketimi, aflatoksinlere duyarlı hayvanlarda 72 saat içinde ölüme yol açabilmektedir 26. Aflatoksin B 1 öncelikle hepatosellüler karsinom oluşturur, ancak mide karsinomu ile kolon adenokarsinomuna da yol açabilmektedir. AFLB 1 diğer aflatoksinler göre en kuvvetli karaciğer karsinojenidir. Aflatoksin M 1 in karsinojenik gücünün aflatoksin B 1 'den 10 kat daha düşük olduğu belirtilmektedir 10. AFLG 1 böbrek tümörleri, AFLB 2 karaciğer tümörlerine neden olabilmektedir 34. Aflatoksinler, bir çeşit immun sistem baskılayıcısıdırlar ve organizmayı çeşitli mikroorganizmalara karşı duyarlı hale getirmektedirler 20. Sığırlarda yem tüketimi ile yemden yararlanma oranında azalma, süt üretiminde düşme, üreme performansında azalma, karaciğer problemleri ve immun sistemin
21 baskılanması başlıca görülen etkilerdir. Kilo kaybı ve anoreksi ile seyreden doğal aflatoksikozise buzağılar daha duyarlıdır 32. Atlarda deneysel aflatoksikozis vakalarında, anoreksi, titreme, kırmızı-kahverengi idrar ya da kanlı gaita gözlemlenmektedir 22 Aflatoksinler, karaciğer dejenerasyonu ve tümörü, büyümede gerilemeye neden olmaktadırlar 71. Domuzlarda yem alımında ve dolayısıyla büyüme oranında azalma ve immun sistemin baskılanması görülmektedir. Ayrıca ikterus, hemoraji, ağırlık kaybı ve akut ölüm görülebilmektedir. Köpek ve kedilerde aflatoksikozis sonucu anoreksi, kusma, ikterus, poliüri, polidipsi, hemoraji ve pulmoner ödem, immun sistem baskılanması ve paraziter, viral, bakteriyel enfeksiyonlara duyarlılıkta artış gözlenebilmektedir 22. Tavşanlar, aflatoksinlere karşı aşırı duyarlılıkları nedeniyle deneysel çalışmalarda en çok kullanılan memelilerdir. Bu hayvanlarda yem ve su tüketiminde azalma, kilo kaybı, dehidratasyon ve uyuşukluk en önemli semptomlardandır 27. Epidemiyolojik çalışmalar ile deney hayvanlarındaki araştırmalar AFL'ler ve karaciğer kanseri arasında istatistiksel olarak belirgin bir ilişki olduğunu ortaya koymuştur. Aflatoksinlerin halk sağlığı üzerindeki olumsuz etkilerinin ortaya çıkması sonucunda, bu konuyla ilgili çeşitli kuruluşlar harekete geçmiş ve 19 Haziran 1993 tarihinde Dünya Sağlık Teşkilatına (WHO) bağlı Uluslararası Kanser Araştırma Kuruluşu (IARC) tarafından AFLB 1 birinci dereceden, (yeterli kanıt elde edilmiş insan karsinojenleri) AFLM 1 ise ikinci dereceden (muhtemel insan karsinojenleri; 2B sınıfı) karsinojenler içerisinde yer almıştır 72,73. Yapılan araştırmalar AFLB 1 in, kanser vakaları içerisinde dünyada yedinci sırada olan primer hepatoselüler karsinoma arasında ilişki olduğu 43,74, başka bir çalışmada ise AFLB 1 in en güçlü faktör olduğu belirtilmektedir 75.
22 2.2.5. Gıda ve Yemlerde Aflatoksinler için Belirlenen Sınır Değerler Aflatoksin içeren ürünlerin detoksifikasyonunda tamamen etkin yöntemlerin olmayışı, tarımsal ürün ihraç eden ülkelerin ürünlerinin birçoğunun mikotoksinlerle kontamine olması, gerek gıda gerekse yemlerin kontrol edilmesini gerekli kılmaktadır. İlk olarak WHO, FAO gibi organizasyonlar, gıdalarda kabul edilen aflatoksin miktarını 30 ppb olarak belirlemiş ve bu miktardan fazla aflatoksin içeren gıdaların ithal edilmemesi kararı almışlardır. Bu sınır değerler zaman içerisinde düşürülmüştür. Aynı tarihlerde bazı Avrupa ülkeleri WHO ve FAO normlarından daha düşük miktarları benimsemiş, UNICEF gibi kuruluşların da çocuklar tarafından tüketilecek gıda maddelerinde daha düşük sınır değerlerin saptanmasında katkısı olmuştur. Günümüzde 60 kadar ülke aflatoksin, okratoksin A, sitrinin, patulin, zearalenon, deoksinivalenol, Trikotesen-2 toksin, fumonisin gibi mikotoksinlerin gıda ve yemlerde bulunabilecek en yüksek düzeylerini yasal olarak belirlemiştir 3. En toksik olan AFLB 1 'in gıda ve yemlerdeki sınır değerleri ayrı bir öneme sahiptir. Ülkemizde tüm tarım ürünleri ve gıdalarda 5 ppb AFLB 1 ' in üzerinde AFLB 1 bulunmasına izin verilmemektedir. Aynı sınır değer; tüm gıdalar için İspanya, Hollanda, Rusya ve Çekoslovakya tarafından da kullanılmaktadır. Macaristan ve İrlanda' da AFLB 1 miktarı tüm gıdalarda 5 ppb olarak benimsenmekle birlikte bu sınır değer yasal zorunluluk değil, önerilen değerdir. Bu ülkelere karşılık Federal Almanya gıdalarda ancak 2 ppb, bebek ve çocuk gıdalarında ise 0,05 ppb düzeyinde AFLB 1 'e izin vermiştir. Yavru hayvanların karma yemlerinde genelde ergin hayvanların yemlerinde öngörülen sınır değerlerin yarısı kadarına izin verilmiştir. Avrupa Birliği ülkelerinde her bir yem maddesinde 50 ppb AFLB 1, karma yemlerde de 10 ve 20 ppb ye izin verilmiştir.
23 Türkiye' de yemler için kabul edilen yasal sınır değerler gıdalarla kıyaslandığında Avrupa normlarına daha fazla uymaktadır 3. Tablo 2.3. Türkiye'de gıda maddelerinde bulunmasına izin verilen aflatoksin (AFL) düzeyleri (μg/kg; ppb) 64 Gıda Maddesi Maksimum limit (μg/kg) 2.1. AFLATOKSİN B 1 B 1 +B 2 +G 1 +G 2 M 1 2.1.1.Fındık, antepfıstığı gibi sert kabuklu meyveler, yer fıstığı, yağlı tohumlar, kuru meyveler ve 5,0 10,0 - bunlardan üretilen işlenmiş gıdalar 2.1.2.Yerfıstığı (doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi 8,0 15,0 - tutulacak olan) 2.1.3.Tahıllar (karabuğday (Fagopyrum sp.) dahil) ve bunlardan üretilen işlenmiş gıdalar (doğrudan 2,0 4,0 - tüketilen veya gıda bileşeni olarak kullanılan) 2.1.4. Mısır (doğrudan tüketime sunulmadan veya gıda bileşeni olarak kullanılmadan önce sınıflandırma, ayıklama gibi fiziksel işlemlere tabi 5,0 10,0 - tutulacak olan) 2.1.5. Çiğ süt, ısıl işlem görmüş süt, süt bazlı ürünlerin üretiminde kullanılan süt - - 0,050 2.1.6. Baharatların aşağıdaki türleri için; Kırmızıbiber (Capsicum spp.) (bunların kurutulmuş meyveleri, kırmızıbiber ve acı kırmızıbiberin bütün ve toz hali dahil) Karabiber (Piper spp.) (bunların meyveleri, akbiber 5,0 10,0 - ve karabiber dahil) Hintcevizi/Muskat (Myristica fragrans) Zencefil (Zingiber officinale) Zerdeçal (Curcuma longa) 2.1.7. Bebek ve küçük çocuk ek gıdaları 0,10 - - 2.1.8.Bebek formülleri ve devam formülleri (bebek sütleri ve devam sütleri dahil) - - 0,025 2.1.9. Bebekler için özel tıbbi amaçlı diyet gıdalar 0,10-0,025 2.1.10.Diğer gıda maddeleri (bulunması muhtemel riskli gıdalar) 5,0 10,0 0,5
24 Birçok ülkede sütte bulunmasına izin verilen AFLM 1 limit değeri 0,05 ve 0,5 ppb düzeylerindedir 76,77. Türkiye de Tarım ve Köyişleri Bakanlığı'nın (Tarım Orman ve Hayvancılık Bakanlığı) 2009 yılında Resmi Gazetede yayınlanan tebliğinde yaptığı son düzenleme (Tebliğ No: 2009/22) ile çeşitli ürünlerde bulunması gereken Aflatoksin üst limitleri yeniden düzenlenmiştir (Tablo 2.3.). Tablo 2.4. Çeşitli ülkelerde süt ve süt ürünlerinde bulunmasına izin verilen maksimum AFLM1 düzeyleri 64,78. Ülkeler Ürün Maksimum Limit (µg/kg) Belçika Süt, süt tozu, kondanse süt 0,1 Romanya Süt ve mamülleri 0 Avusturya Çocuk ve bebekler için pastörize sütler 0,01 Diğer sütler ve süt ürünleri 0,05 Tereyağı 0,02 Peynir 0,25 Çekoslavakya Süt 0,05 ABD Süt ve ürünleri 0,5 Brezilya Süt ve ürünleri 0,5 İsviçre Süt, süt tozu, kondanse süt 0,05 Bebekler için süt 0,01 İsveç Sıvı süt ürünleri 0,05 Hollanda Süt ve diğer sıvı süt ürünleri 0,05 Peynir 0,2 Tereyağ 0,02 Almanya Süt 0,05 Bebek sütleri 0,01 Rusya Süt ve süt ürünleri 0,05 Çocuk gıdaları 0 Türkiye Süt ve süt ürünleri 0,05 Avrupa Birliği'ne üye ülkelerin saptadıkları aflatoksin sınır değerlerinde bile büyük farklılıklar görülmektedir. Bu ülkelerin bir kısmı, sınır değerleri tüm gıdalar için belirlerken, bir kısmı da gıdaları gruplandırarak veya süt ürünlerini kendi içlerinde ayırarak sınır değerler belirlemişlerdir. Ürünler bazında limitler belirleyen ve sınır değerleri en düşük olan ülkeler başında Almanya, Avusturya, İsviçre, İngiltere dir. Bazı
25 ülkeler ise sınır değerleri yasal olarak belirlememiş öneri olarak sunmuştur 3. Birçok ülke ile ülkemizdeki süt ve süt ürünlerinde bulunmasına izin verilen maksimum AFLM 1 tolerans değerlerinin karşılaştırılması Tablo 2.4'de verilmiştir. 2.3. Okratoksin Okratoksin A ve B ilk kez Güney Afrika lı kimyacılar tarafından tanımlanmış olup Aspergillus ochraceus K-804 suşundan izole edilmiştir 79. Okratoksinler, bitkisel ürünlerin doğal kontaminantı olarak yem ve gıdalara geçmektedir 80. Okratoksinler, A.ochraceus, A.melleus, A.alliaceus, A.ostianus, A.sclerotorium, A.albertensis, A.wentii, A.auricomus, A.niger, A.sulphureus ve P.viridicatum mantarları tarafından üretilen mikotoksinlerdir 2,76. Okratoksinlerin A, B, C ve D olmak üzere dört çeşidi saptanmıştır. Okratoksin A (OTA) doğada sık olarak bulunması ve neden olduğu patolojik durumlar itibariyle oldukça önemlidir 81. Okratoksin A 'nın Danimarka'da domuzlarda görülen bir tür nefropatiden ve kümes hayvanlarındaki mikotoksikozdan sorumlu olduğu, Balkan endemik nefropatisinde (BEN) ve Kuzey Afrika'da yaygın görülen üriner sistem tümörlerinde rol oynadığı belirtilmektedir 2,82. Okratoksin A 12-karboksi grubundan L-fenilalanine bağlanmış bir pentaketit türevi olup hidroksikumarin yapısındadır 82. Okratoksin A 'nın doğal dekloro analoğu olan Okratoksin B (OTB), OTA'dan 10 kat daha az toksiktir 2,80. Okratoksin A ile OTB'nin farkı, OTA'nın dihidrometilisokumarin halka sisteminde C5 pozisyonunda klor atomu taşımasıdır. Bu klor atomunun varlığına ilaveten fenolik hidroksil grubu da toksisiteyi arttırmaktadır 83. Tüm bileşikler, sıcaklık ve hidrolize çok dayanıklı olan, amid bağıyla birleşmiş fenilalanin-dihidroisokumarin bileşikleridir 83. Beyaz, kristal bir toz olan OTA, ksilen ile yeniden kristalize edilebilir. Kristal formda erime noktası 169 0 C'dir. Işık ve havada stabil değildir. Ultraviyole ışık altında,
26 asit solüsyonda ve yeşil alkalin solüsyonda mavi fluoresans vermektedir. Toksisiteleri aflatoksinlerden daha az olan bu mikotoksinlere, peynirlerde çok sık rastlanılmamaktadır 84. Kontaminasyon genellikle ılıman iklim, hasat ve hasat sonrası depolama koşulları ile yakından ilişkilidir 2,83. Toksinler başlıca sıcaklık, substratın nem miktarı ve tipi, mikroflora varlığı, mevcut mantarın suşu ve tohumun kalitesine bağlı olarak değişiklik göstermektedir 2. Asp. Achraceus un optimum gelişme sıcaklığı 28 C olup, OTA oluşturabilmek için de 20-30 C sıcaklığa gereksinim duyar. En çok toksin üretimi 30 C de % 95 bağıl nemde gerçekleşir. Sıcaklığın azalması durumunda (15 C) yüksek bağıl neme (% 99 bağıl nem) ihtiyaç duyar. Penicillium türleri ise düşük sıcaklıklarda toksin oluşturabilirler. Pen. verrucosum 5-10 C sıcaklıkta okratoksin üretebilmektedir. Sıcak iklimlerde yetiştirilen tahıllarda OTA kontaminasyonundan Asp. ochraceus, Kanada, İskandinav ülkeleri gibi soğuk-serin kuşakta yetiştirilen tahıllardaki OTA'dan ise Pen. aurantiogriseum ve Pen. Verrucosum sorumludur. Bu iki küf türü 2 C de bile gelişimlerini sürdürebilir. Kserofilik küflerden biri olan Asp. Ochraceus tahıllarda nem içeriği % 15-16 olduğunda gelişebilmektedir. Optimum gelişme sıcaklığının altında OTA miktarı azalırken, penisilik asit miktarı artmaktadır. Pen. aurantiogriseum ve Pen. verrucosum' un da minimum su aktivite değerleri oldukça düşüktür (A S = 0.79; 0.80-0.81). Toksinin üretimi ph 5,5'ta demir, bakır ve çinko varlığında maksimumdur. Ilıman iklim koşullarında Penicillium OTA'nın ana kaynağıdır 83. Okratoksinlerin oluşturdukları klinik tabloya okratoksikozis denilmektedir. İnsanlar OTA'ya ya doğrudan bu mantar türünün geliştiği gıdalarla veya bunları tüketen hayvanların hayvansal ürünlerinin tüketmesi sonucu maruz kalmaktadır. Yapılan bir çalışmada OTA'nın temel toksik etki mekanizmasının; ATP azalmasına bağlı olarak
27 mitokondriyel solunumun inhibisyonu, trna sentezinin inhibisyonu ve lipit peroksidasyonun (LPO) artması olduğu ileri sürülmektedir 85. Okratoksin A'nın yaptığı renal lezyonlar; proksimal tubulün dejenerasyonu, renal kortekste interstisyel fibrozis, glomerülün hiyalinizasyonu ve tubuler epitelin atrofisidir. Okratoksin A, böbrek hücrelerinde belli bölgeleri inhibe ederek bu hücrelerdeki apoptotik tipte lezyona neden olurlar 2. Sporların solunması da bir diğer kontaminasyon yoludur. Okratoksin A'nın immünosüpresif, hepatonefrotoksik, teratojenik, apoptozis indükleyicisi, genotoksik ve LPO artırıcısı olduğu gösterilmiştir 85,86. Okratoksin A nın insan sütünde veya inek sütünde bulunabilmesi nedeniyle bebekler açısından potansiyel sağlık riski oluşturduğu 80, OTA içeren yonca tüketiminin sığırlarda aborta yol açtığı 87 belirtilmesine rağmen, birçok araştırmacı OTA ile kontamine olan tarım ürünlerinin yem olarak kullanılması durumunda geviş getiren yetişkin hayvanlarda sorun oluşturmadığını; domuz ve kümes hayvanları gibi geviş getirmeyen hayvanların et ve et ürünlerini kontamine edebildildiklerini bildirmişlerdir 2,83,88. Geviş getiren hayvanlarda özellikle protozoonların (% 88) ve kısmen bakterilerin (% 12) rumende OTA'nın Oα'ya hidrolizinden sorumlu olduğu ve yemlerle alınan OTA nın rumende daha az toksik Oα ya dönüşmesiyle ruminantların OTA toksikasyonuna daha az duyarlı olduğunu bildirmiştir 89. Türkiye de Tarım ve Köyişleri Bakanlığı'nın (Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı) 2009 yılında Resmi Gazetede yayınlanan tebliğinde yaptığı son düzenleme (Tebliğ No: 2009/22) ile çeşitli ürünlerde bulunması gereken Okratoksin üst limitleri yeniden düzenlenmiştir (Tablo 2.5). AB komisyonu (123/2005/EC) OTA nın limit seviyesini ham tahılda 5, diğer ürünlerde 3 ppb olarak belirlemiştir. Günlük tolere edilebilir miktar olarak 5 ng/kg OTA'ya müsaade edilmektedir 83. Tahıllarda
28 bulunabilecek maksimum OTA miktarı İsviçre' de 2 ppb, Hollanda' da 3 ppb, Fransa ve Avusturya' da 5 ppb, İngiltere' de 10 ppb olarak benimsenmiştir. Yunanistan kahve için 20 ppb, Macaristan ve Çek Cumhuriyeti de tüm gıdalar için 20 ppb OTA konsantrasyonu sınır değerlerini kullanmaktadırlar 3. Tablo 2.5. Türkiye'de gıda maddelerinde bulunmasına izin verilen okratoksin düzeyleri (μg/kg; ppb) 64 Gıda Maddesi Maksimum limit (μg/kg) 2.2. OKRATOKSİN A 2.2.1. İşlenmemiş tahıllar 5,0 2.2.2. Tahıldan elde edilen tüm ürünler (doğrudan tüketime sunulan tahıllar ve işlenmiş tahıl ürünleri dahil) 3,0 2.2.3. Kurutulmuş asma meyveleri (kuşüzümü, kuru üzüm ve çekirdeksiz üzüm dahil) 10,0 2.2.4. Kavrulmuş kahve çekirdeği ve öğütülmüş kahve 5,0 2.2.5. Kahve ekstraktı, çözünebilir kahve ekstraktı veya çözünebilir kahve 10,0 2.2.6. Şarap (köpüklü şarap/şampanya dahil, likör şarapları ve hacmen alkol miktarı en az % 15 olan şaraplar hariç) ve meyve şarapları 2,0 2.2.7. Aromatize şarap, aromatize şarap bazlı içki ve aromatize şarap kokteyli 2,0 2.2.8. Üzüm suyu, üzüm suyu konsantresi, üzüm nektarı ile doğrudan tüketime sunulan üzüm şırası-konsantresi 2,0 2.2.9. Bebek ve küçük çocuk ek gıdaları 0,5 2.2.10. Bebekler için özel tıbbi amaçlı diyet gıdalar 0,5 2.2.11. Diğer gıda maddeleri (bulunması muhtemel riskli gıdalar) 10,0 Okratoksin A, IARC tarafından "Grup IIB" (muhtemel karsinojen) olarak sınıflandırılmıştır. OTA dolaylı karsinojen mekanizması aracılığıyla epigenetik karsinojen olarak da adlandırılmaktadır. Ancak aynı zamanda DNA'ya doğrudan bağlanabilmesi nedeniyle doğrudan karsinojen olarak kabul edilmektedir 77.
29 2.4. Diğer Bazı Önemli Mikotoksinler 2.4.1. Trikotesenler Trikotesenler; Fusarium, Stachbotry, Trichotheciumi, Kerticimosporium, Cephalosporium ve Cylindrocarpen mantarlarının sekonder metabolitleri olarak oluşan mikotoksinlerdir. Bu mantarlar da diğer mantarlar gibi belirli sıcaklık ve nem ortamında gelişirler. Seskiterpen yapısında bileşikleri içeren geniş bir gruptur 90. Trikotesen, diasetoksiskirperol (DAS), deoksinivalenol (DON), nivalenol (NIV) bu grupta yer alan en önemli mikotoksinlerdir. Toksisite sıralamaları Trikotesen> DAS > DON > NIV şeklindedir. DON, gıda ürünlerinde en sık rastlanan mikotoksindir 2,90. Fusarium mikotoksinlerinden olan trikotesenler, potansiyel protein sentezi inhibitörüdürler 91. Tarla küflerine dahil olan Fusarium'lar saprofit ve fitopatojen karakterli türlerdir. Tarımsal ürünlerde çürüme etkeni olan saprofitlere oranla fusarioza neden olan fitopatojenler çok daha önemlidir 3. Trikotesenler; biyolojik aktif bileşikler olup, Rusya'da ATA, Japonya'da Kırmızı Küf Zehiri, Amerika'da Küflü Mısır Toksikozu olarak bilinen pek çok mikotoksikozlara sebep olmuştur 92. 2.4.2. Zearalenon Zearalenon (ZEN) Fusarium türü mantarlar tarfından üretilen üzüm, mısır ve yüksek nem içeriği olan çoğunlukla saman yığınlarında oluşan lakton yapıya sahip östrojenik yapılı mikotoksindir. Bu metabolit, direkt bir toksin olmaktan ziyade hormon benzeri kimyasal yapı gösterir. Yemler ZEN içerdiğinde, hayvanlarda seri östrojenik hastalıklar görülmektedir. Amerika'da östrojenizm olarak tanımlanan hastalığın F-2 toksini olarak bilinen ZEN in ile küflü mısırlarda şekillendiği rapor edilmiştir 3. Zearalenon güçlü östrojenik etkisinin yanında karaciğer lezyonlarına neden olmakta,
30 daha sonrada hepatokarsinomayı tetikleyebilmektedir. Çeşitli çalışmalarda, hem insan diyetinde hem de hayvan yemlerinde ZEN oluşma insidansı yüksek bulunmuştur 93. Mısır, öğütülmüş arpa ve buğday gibi hububatlardan hazırlanan yemlerin Zen içermesi durumunda, özellikle domuzda genital problemlere neden olmaktadır. Semptomlar, prepubertal dönemdeki dişi domuzda vulvada ödem veya vajina ve rektumda sarkma şeklindedir. Üreme ile ilgili problemler; infertilite veya kuru gangren, abort ve gelişim bozukluğu gibi sorunlardır 94. Yemle 1,3 mg/kg ve üzeri ZEN alındığında süt metabolizması, 10 mg/kg ve üzeri alımlarda dölverimi, 25 mg/kg üzeri alımlarda ise vulva etkilenmektedir. Almanya daki yem kanununda ZEN için tolere edilebilir düzey preruminant buzağıda 0.25, dişi düvelerde/süt ineklerinde 0,5 mg/kg dır. Düveler rasyonla 25-30 mg/kg ZEN tükettiklerinde önemli bir semptom gözlenmemiş, laktasyonda olmayan inekler ise rasyonla 40 mg/kg ZEN aldıklarında korpus luteumun lize olduğu bildirilmiştir 95. 2.4.3. Fumonisinler Lökoensefalomalazi olarak bilinen hastalığın nedeni olan Fumonisinler, Fusarium maniliforme ve Fusarium proliferatum gibi dünyada çok yaygın küflerce üretilen mikotoksinlerdir. 10 kadar tipi tanımlanan bu mikotoksinlerin en bilineni fumonisin B 1 (FB 1 ) dir 94,96. Genel toksisiteleri nonkompetitif olarak ribozom fonksiyonlarını etkileyerek, protein biyosentezini inhibe etmelerine dayanır 97. Fusarium türleri mısır ve mısır içerikli gıdalarda yaygın olarak bulunmaktadır. Ayrıca arpa ve durum buğdayları F. moniliforme ile kontamine olabilmektedir 98,99. Fumonisin B 1 'in sıçanlarda hepatotoksik, hepatokarsinojenik, nefrotoksik olduğu bildirilmiştir. Hayvanlarda pek çok hastalığa ve insanlarda da ösefagal kansere neden olan fumonisinler, atlarda lökoensefalomalazi ve domuzlarda pulmoner ödem şeklinde
31 seyreden fötal sendroma neden olmaktadır 100,101. Gebe domuz, sıçan, fare ve kobaylarla yapılan çalışmalarda fumonisinin reprodüktif sistem problemlerine neden olduğu gösterilmiştir. Ayrıca embriyotoksik olduğu ve spontan abortları indüklediği de saptanmıştır 96,99. 2.4.4. Patulin Patulin; Penicillium, Aspergillus ve Byssochlamys funguslarının çeşitli türleri tarafından üretilen mikotoksindir. Doğada yaygınlığı ve biyolojik etki gücü itibariyle önemli bir toksindir. İnsanlar açısından meyve ve meyve sularında bol miktarda bulunabilmesi nedeniyle önem taşımaktadır 92. Asidik ortamda ısıtıldığında stabil olan patulin miktarı çürümüş elmada ve elma suyunda önemli sayılacak seviyelere çıkabilmektedir 102,103. Patulinin antimikrobiyel etkiye sahip olması, gram pozitif ve negatif bakterilerin gelişmelerini engelleyen geniş bir spektrum göstermesi onun bir süre antibiyotik olarak kabul edilmesine neden olmuştur. Hatta sulu çözeltileri gönüllü hastalarda nezle tedavisinde kullanılmıştır. Ancak kısa süre sonra hem memelilerde hem de bitkilerde toksik etkisi gösterilmiş ve antibiyotikler grubundan çıkarılarak mikotoksinlere dahil edilmiştir 3. Patulin, pek çok canlı için toksik bir maddedir. Sülfhidril gruplarına olan afinitesi nedeniyle bazı enzimleri inhibe etmektedir 102. Patulinin, sıçanlarda lenfosit sayısında ve kapiller permeabilitede artma gibi değişikliklere neden olabildiği tespit edilmiştir. Kromozom kırılmaları ile karekterize çekirdek gelişim bozukluklarından sorumlu tutulmuş ve dolayısıyla karsinojen bir madde olduğu bildirilmiştir 102,103. 2.4.5. Sterigmatosistin Sterigmatosistinin en önemli üreticisi Aspergillus versicolor'un belli suşlarıdır. Aflatoksin biyosentezinde de ara ürün olarak görülen sterigmatosistin bir endotoksin
32 olup, suda çözünmez. Ortama ancak misellerin parçalanması veya otoliz sonucu geçmektedir. Aflatoksine benzer bir yapı göstermesine karşılık toksin kumarin bileşiği değildir. Bileşik UV ışınları altında brik rengi floresan verir. Asp. versicolor 4-40 C arasındaki sıcaklıklarda gelişir. Optimum gelişme sıcaklığı 25-30 C olan bu funguslar sterigmatosistini 15-32 C lerde sentezler. Reçel, konfitür, marmelat gibi ürünlerde % 30 oranında şeker bulunması sterigmatosistin oluşumunu engeller. Tahıllardan pirinç ve buğdayda, yeşil kahve çekirdeğinde ve yer fıstığında görülür 3.
33 3. GEREÇ ve YÖNTEM 3.1. Gereç 3.1.1. Yem örneklerinin alınması Araştırmanın materyalini 2011 yılında Erzurum ilinde bulunan 11 farklı işletmeden alınan kaba yem, konsantre yem ve yemliklerinden alınan karma yem ile bu işletmelerdeki ineklerden alınan süt örnekleri oluşturdu. Tablo 3.1. İncelenen mikotoksinlerin mevsimlere göre farklı yem kaynaklarından alınan örnek sayıları (n) Çalışma Materyali İncelenen Mikotoksinler Kaba yem Total aflatoksin Aflatoksin B 1 Okratoksin Kış 11 11 11 İlkbahar 11 11 11 Yaz 11 11 11 Sonbahar 11 11 11 Toplam 44 44 44 Konsantre Yem Total aflatoksin Aflatoksin B 1 Okratoksin Kış 11 11 11 İlkbahar 11 11 11 Yaz 11 11 11 Sonbahar 11 11 11 Toplam 44 44 44 Karma Yem Total aflatoksin Aflatoksin B 1 Okratoksin Kış 11 11 11 İlkbahar 11 11 11 Yaz 11 11 11 Sonbahar 11 11 11 Toplam 44 44 44 İnek Sütü Aflatoksin M 1 Kış 11 İlkbahar 11 Yaz 11 Sonbahar 11 Toplam 44
34 Örnekler ilkbahar (Nisan), yaz (Temmuz), Sonbahar (Ekim) ve kış (Aralık) mevsimlerinde alındı. İncelenen mikotoksinlerin mevsimlere göre farklı yem kaynaklarından alınan örnek sayıları (n) Tablo 3.1 de özetlenmiştir. Meteroloji Genel Müdürlüğü nden alınan Erzurum için 2011 yılı aylık ortalama sıcaklık ve nem değerleri Tablo 3.2 de verilmiştir. Tablo 3.2. Erzurum için 2011 yılı aylık ortalama sıcaklık ve nem değerleri 104 Ortalama Sıcaklık (ºC) Ortalama Nem (%) Ocak -8,4 81 Şubat -7,7 80 Mart -1,5 75 Nisan 5,6 72 Mayıs 9,6 70 Haziran 14,6 63 Temmuz 19,6 53 Ağustos 19,4 48 Eylül 13,9 54 Ekim 6,7 62 Kasım -5,5 80 Aralık -11,4 82 Kaba yem, konsantre yem ve hayvanların yemliklerinden alınan yem karışımı (ortalama 50 g) steril plastik poşetlere, süt örnekleri (10 ml) ise steril tüplere konularak, soğuk zincirde laboratuvara getirildi. 3.1.2. Yem örneklerinin analizinde kullanılan kitler Çalışmada örneklerin değerlendirilmesi amacıyla total aflatoksin için Aflatoxin Low Matrix Detection (Helica Biosystem INC; Cat. No.: 981AF01LM), AFLB 1 için Aflatoxin B 1 Detection Elisa Kit (Helica Biosystem INC; Cat. No.: 941BAFL01B1), Okratoksin için Ochratoxin A Assay Elisa Kit (Helica Biosystem INC; Cat. No.: 941OCH01M) ve AFLM 1 için Aflatoxin M 1 Assay Elisa Kit (Helica Biosystem INC; Cat. No.: 961AFLM01M) test kitleri kullanıldı.
35 3.2. Yöntem Kaba yem, konsantre yem ve hayvanların yemliklerinden alınan yem karışımında total aflatoksin, Aflatoksin B 1 ve Okratoksin analizi ile süt örneklerinde Aflatoksin M 1 düzeyinin belirlenmesi amacıyla test kiti üretici firmasının (Helica Biosystem INC) belirttiği protokoller uygulandı. Tüm örnekler Elisa yöntemi ile değerlendirildi. 3.2.1. Total aflatoksin 3.2.1.1. Analiz için numunelerin hazırlanması 1. Örnekler, öğütülmüş kahve tozuna benzer ölçüde öğütülüp, numunelerden 20 gr tartıldı ve numune kabına aktarıldı. 2. Her numune için %80 lik metanol hazırlanarak numune kaplarına aktarıldı ve 2 dk karıştırıldı. 3. Numune kaplarından alınan 5-10 ml süpernatant, Whatman #1 filtre kağıdı ile süzüldü. 4. Numuneler yıkama solüsyonu ile 1/10 oranında sulandırıldı. 3.2.1.2. Test Protokolü 1. Kırmızı renkli mikro kuyucuklara 200 μl Assay Diluent eklendi. Daha sonra kuyucuklara kit standartlarından ve numunelerden 100 µl eklenerek karıştırıldı. Bu örneklerden 100 er µl alınarak antikor kaplı kuyucuklara 100 er µl aktarıldı ve 30 dk oda ısında inkübasyona bırakıldı. 2. İnkubasyon sonrası kuyucuklar boşaltılarak 300 µl yıkama tamponu (PBS-Tween) ile 3 kez yıkandı. 3. Yıkama sonrası her kuyucuğa 100 µl konjugat eklendi ve oda ısısında 30 dakika inkübe edildi.
36 4. İnkubasyon sonrası kuyucukların içi boşaltılarak 300 µl yıkama tamponu (PBS- Tween) ile 3 kez yıkama işlemi tekrarlandı. 5. Yıkama sonrası her kuyucuğa 100 µl TMB substrattan aktarıldı ve 10 dk oda ısında inkübasyona bırakıldı. 6. Bütün kuyucuklara 100 µl Stop solüsyonu eklenerek ELISA okuyucuda 450 nm ile okutuldu. Sonuçlar Excel programında değerlendirildi. 3.2.2. Aflatoksin B 1 3.2.2.1. Analiz için numunelerin hazırlanması 1. Test edilecek her örnek için ekstraksiyon solüsyonu (30 ml distile su ve 70 ml metanol) hazırlandı. 2. Örnekler, öğütülmüş kahve tozuna benzer büyüklükte olacak şekilde öğütüldü. 3. 20 gr örnek 100 ml ekstraksiyon solüsyonunda çözdürüldükten sonra kapalı kapta en az 2 dk karıştırıldı. 4. Partikül içeriğinin çökmesi beklendikten sonra 5-10 ml ekstrakt elde edecek şekilde Whatman #1 filtre kağıdı ile süzüldü. 3.2.2.2. Test Protokolü 1. Tüm reaktifler oda ısısına getirildi. 2. Mikroplaka tutucusuna her örnek ve standart sayısı kadar dilusyon kuyucuklarından ve antikor kaplı kuyucuklardan yerleştirildi. 3. Her dilüsyon kuyucuğuna 200 μl konjugat (HRP) eklendi. 4. Her biri için yeni bir pipet ucu kullanarak, standart ve örneklerden 100 μl konjugat eklenmiş kuyucuklara ilave edildi. Pipetaj yapılıp karıştırılan örneklerden antikor kaplı kuyucuklara 100 er μl aktarıldı ve 15 dk oda ısısında inkübe edildi.
37 5. Kuyucuk içerikleri ters çevirip dikkatli bir şekilde boşaltıldı ve kuyucuklar distile su ile 5 kez yıkandı. 6. Substrat reaktifinden (TMB) bütün kuyucuklara 100 μl eklenerek 5 dk oda ısısında inkübe edildi. 7. Stop Solüsyonundan bütün kuyucuklara 100 μl eklenerek ELISA okuyucuda 450 nm ile okutuldu. Sonuçlar Excel programında değerlendirildi. 3.2.3. Okratoksin 3.2.3.1. Analiz için numunelerin hazırlanması 1. Test edilecek her örnek için ekstraksiyon solüsyonu (30 ml distile su ve 70 ml metanol) hazırlandı. 2. Örnekler, öğütülmüş kahve tozuna benzer büyüklükte olacak şekilde öğütüldü. 3. 20 gr örnek 100 ml ekstraksiyon solüsyonunda çözdürülerek kapalı kapta en az 2 dk karıştırıldı. 4. Partikül içeriğinin çökmesini beklendikten sonra 5-10 ml ekstrakt elde edecek şekilde Whatman #1 filtre kağıdı ile süzüldü. 3.2.3.2. Test Protokolü 1. Tüm reaktifler oda ısısına getirildi. 2. Mikroplaka tutucusuna örnek ve standart sayısı kadar dilusyon kuyucuklarından ve antikor kaplı kuyucuklardan yerleştirildi. 3. Her dilüsyon kuyucuğuna 200 μl konjugat (HRP) eklendi. 4. Her biri için yeni bir pipet ucu kullanarak standart ve örneklerden 100 μl konjugat eklenmiş kuyucuklara ilave edildi. Pipetaj yapılıp karıştırılan örneklerden antikor kaplı kuyucuklara 100 er μl aktarıldı ve 15 dk oda ısısında inkübe edildi.
38 5. Kuyucuk içerikleri ters çevirip dikkatli bir şekilde boşaltıldı ve kuyucuklar distile su ile 5 defa yıkandı. 6. Substrat reaktifinden (TMB) tüm kuyucuklara 100 μl eklenerek 5 dk oda ısısında inkübe edildi. 7. Stop Solusyonundan tüm kuyucuklara 100 μl eklenerek ELISA okuyucuda 450 nm ile okutuldu. Sonuçlar Excel programında değerlendirildi. 3.2.4. Aflatoksin M 1 3.2.4.1. Analiz için numunelerin hazırlanması 1. Süt örnekleri 2 saat süreyle buzdolabında bekletildi ve sonrasında 2000 g de 5 dk santrifüjlenerek yağın ayrılması sağlandı. 2. Üstteki yağ tabakası aspire edildi, altta kalan plazma test için kullanıldı. 3.2.4.2. Test Protokolü 1. Kitin içerisinde bulunan standartlar ile ölçüm yapılacak örneklerden kuyucuklara 200 μl aktarılarak oda ısında (19-25ºC) ışık görmeyen bir yerde 2 saat inkübasyona bırakıldı. 2. Kuyucuklar boşaltıldıktan sonra yıkama solusyonu ile 3 kez yıkandı. 3. Yıkama tamamlandıktan sonra tüm kuyucuklara Aflatoksin HRP konjugattan 100 μl eklendi ve oda ısısında (19-25ºC) 15 dk süreyle ışık görmeyen bir yerde inkübasyona bırakıldı. 4. Kuyucuklar boşaltılıp yıkama solüsyonu ile 3 kez yıkandı. 5. Yıkama tamamladıktan sonra bütün kuyucuklara TBM Substrattan 100 μl eklenerek oda ısısında (19-25ºC) ve karanlık bir ortamda 20 dk inkübasyona bırakıldı. 6. Son aşamada kuyucuklara Stop Solüsyonundan 100 μl eklenip, Elisa okuyucusunda 450 nm de okutuldu. Sonuçlar Excel programında değerlendirildi.
39 3.2.5. İstatistiksel Analiz Araştırmanın analitik ve deskriptif analizlerinin yapılmasında SPSS 9.0 istatistik paket programından (SPSS, 1997) 105 yararlanılmıştır. Total aflatoksin, AFLB 1, Okratoksin ve AFLM 1 e ait verilerin analizinde aşağıdaki doğrusal analiz kullanılmıştır. Model istatistik notasyonla, Y ijk =µ+a i +c i +e ijk Y ijk : Normal dağılış gösteren total aflatoksin, AFLB 1, Okratoksin ve AFLM 1 i µ: Populasyon ortalamasını a i : Mevsim etkisini (ilkbahar, yaz, sonbahar, kış) c i : Kovaryansı (İşletmeler) e ijk : Ortalaması 0, varyansı σ 2 e olan (N~(0, σ 2 e)) şansa bağlı hatayı göstermektedir. Aflatkosin B 1 ile AFLM 1 arasındaki ilişki [ ( ) ] denklemi ile belirlendi.
40 4. BULGULAR İşletmelerden alınan kaba yem, konsantre yem ve karma yemde bulunan total aflatoksin değerleri incelendiğinde tüm örneklerin Türk Gıda Kodeksinde total aflatoksin için belirtilen sınır değerin (10 ppb) altında olduğu gözlenmiştir (Tablo 4.1). Tablo 4.1. İşletmelerden alınan kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki total aflatoksin değerleri Kaba yem Konsantre yem Karma yem İşletme min. max. min. max. min. max. No 1 5,57±0,36 5,35 6,56 5,23±0,34 4,58 5,85 6,45±0,23 5,92 6,88 2 5,75±0,22 5,38 6,27 6,89±0,61 5,80 7,98 6,72±0,33 5,89 7,50 3 5,99±0,28 5,52 6,66 6,86±0,60 5,79 7,90 7,03±0,64 5,78 8,58 4 6,03±0,33 5,38 6,81 6,23±0,37 5,44 6,89 7,71±0,83 5,60 9,20 5 6,61±0,53 5,34 7,48 6,07±0,41 5,22 6,78 7,80±0,92 5,32 9,38 6 6,79±0,51 5,61 7,64 5,78±0,39 4,98 6,50 7,70±1,00 5,30 9,35 7 6,82±0,57 5,84 7,80 5,86±0,35 4,82 6,23 7,60±1,13 4,92 9,62 8 7,32±0,96 5,84 9,98 5,50±0,37 4,80 6,15 7,50±1,40 3,98 9,75 9 7,51±0,75 6,76 9,74 5,38±0,32 4,77 5,98 8,66±0,92 6,25 9,81 10 7,42±0,76 6,66 9,68 5,27±0,34 4,62 5,90 9,16±0,54 7,98 9,72 11 7,50±0,69 6,81 9,56 7,07±0,60 5,89 8,20 9,86±0,31 9,01 9,85 İşletmelerden alınan örneklerdeki total aflatoksin miktarları kaba yemler için en düşük 5,57±0,36 ppb (İşletme no:1), en yüksek 7,51±0,75 ppb (İşletme no:9), konsantre yem için en düşük 5,23±0,34 ppb (İşletme no:1), en yüksek 7,07±0,60 ppb (İşletme no:11), karma yemler için en düşük 6,45±0,23 ppb (İşletme no:1), en yüksek 9,86±0,31 ppb (İşletme no:11) olarak saptanmıştır. İşletmelerdeki tüm yemler ele alındığında total aflatoksin değeri rakamsal olarak en düşük konsantre yemde 5,23±0,34 ppb (İşletme no:1) en yüksek ise karma yemde 9,86±0,31 ppb (İşletme no:11) belirlenmiştir (Tablo 4.1).
41 İşletmelerden alınan kaba yem, konsantre yem ve karma yemde bulunan AFLB 1 değerleri incelendiğinde tüm örneklerin Türk Gıda Kodeksinde AFLB 1 için belirlenen sınır değeri olan 5 ppb nin altında olduğu gözlendi (Tablo 4.2). Tablo 4.2. İşletmelerden alınan kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki AFLB 1 değerleri Kaba yem Konsantre yem Karma yem İşletme min. max. min. max. min. max. No 1 2,67±0,86 1,17 4,22 2,26±0,46 1,20 3,40 2,49±0,33 1,75 3,18 2 3,02±0,98 1,32 4,84 2,40±0,56 1,25 3,50 3,29±0,59 1,75 4,30 3 3,05±0,99 1,33 4,76 2,33±0,55 1,22 3,42 3,18±0,58 1,70 4,22 4 2,99±0,96 1,30 4,68 2,29±0,54 1,20 3,40 3,10±0,58 1,62 4,18 5 2,89±0,95 1,24 4,60 2,32±0,36 1,48 2,98 2,99±0,54 1,60 3,98 6 2,71±0,91 1,13 4,37 1,89±0,34 1,22 2,58 2,54±0,51 1,38 3,48 7 2,80±0,91 1,22 4,42 2,09±0,31 1,39 2,72 2,80±0,52 1,50 3,82 8 2,75±0,90 1,19 4,37 1,96±0,33 1,25 2,60 2,68±0,49 1,42 3,50 9 3,06±1,01 1,29 4,92 2,10±0,36 1,30 2,80 3,40±0,58 1,85 4,35 10 2,71±0,88 1,18 4,29 2,07±0,49 1,20 3,20 2,35±0,44 1,35 3,22 11 2,85±0,93 1,25 4,49 2,20±0,35 1,40 2,88 2,89±0,54 1,55 3,96 İşletmelerden alınan örneklerdeki AFLB 1 düzeyleri kaba yemler için en düşük 2,67±0,86 ppb (İşletme no:1), en yüksek 3,06±1,01ppb (İşletme no:9), konsantre yem için en düşük 1,89±0,34 ppb (İşletme no:6), en yüksek 2,40±0,56 ppb (İşletme no:2), karma yemler için en düşük 2,35±0,44 ppb (İşletme no:10), en yüksek 3,29±0,59 ppb (İşletme no:2) olarak saptandı. İşletmeler için AFLB 1 değeri rakamsal olarak en düşük konsantre yemde 1,89±0,34 ppb (İşletme no:6) en yüksek ise karma yemde 3,29±0,59 ppb (İşletme no:2) tespit edildi (Tablo 4.2). İşletmelerden alınan kaba yem, konsantre yem ve karma yemde bulunan okratoksin değerleri incelendiğinde tüm numunelerin Türk Gıda kodeksinde okratoksin için belirlenen sınır değeri olan 10 ppb nin altında olduğu gözlendi (Tablo 4.3.).
42 Tablo 4.3. İşletmelerden alınan kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki Okratoksin değerleri Kaba yem Konsantre yem Karma yem İşletme min. max. min. max. min. max. No 1 7,05±0,47 5,76 7,78 4,85±0,87 3,90 6,32 5,08±0,72 3,75 6,38 2 7,03±0,27 6,41 7,68 5,24±0,32 4,60 5,80 6,50±0,81 4,98 8,15 3 7,15±0,29 6,49 7,83 5,16±0,32 4,55 5,75 5,51±1,30 2,82 5,16 4 7,16±0,31 6,45 7,93 5,19±0,43 4,44 6,22 5,35±1,29 2,75 7,82 5 7,20±0,34 6,57 8,18 4,98±0,40 4,40 6,12 6,26±0,80 3,99 7,55 6 6,96±0,29 6,33 7,59 4,76±0,26 4,30 5,42 6,43±0,48 5,18 7,42 7 7,21±0,39 6,65 8,34 5,32±0,31 4,75 5,90 6,98±0,70 5,22 8,22 8 7,05±0,27 6,41 7,63 4,63±0,28 4,12 5,35 5,67±0,58 4,52 6,72 9 7,07±0,33 6,25 7,73 4,58±0,29 4,10 5,30 5,50±0,60 4,30 6,66 10 7,04±0,46 5,80 7,83 4,86±0,54 3,98 6,20 5,25±0,67 3,98 6,42 11 7,13±0,40 6,33 8,19 4,70±0,27 4,25 5,40 5,82±0,57 4,74 6,88 İşletmelerden alınan örneklerdeki okratoksin miktarları kaba yemler için en düşük 6,96±0,29ppb (İşletme no:6), en yüksek 7,21±0,39 ppb (İşletme no:7), konsantre yem için en düşük 4,58±0,29 ppb (İşletme no:9), en yüksek 5,32±0,31 ppb (İşletme no:7), karma yemler için en düşük 5,08±0,72 ppb (İşletme no:1), en yüksek 6,98±0,70 ppb (İşletme no:7) olarak saptandı. Tüm işletmelerde okratoksin rakamsal olarak en düşük konsantre yemde 4,58±0,29 ppb (İşletme no: 9) en yüksek ise kaba yemde 7,20±0,34 ppb (İşletme no: 5) belirlendi (Tablo 4.3). İşletmelerden alınan süt örneklerinde bulunan AFLM 1 değerleri incelendiğinde tüm numunelerin Türk Gıda kodeksinde AFLM 1 için belirlenen sınır değeri olan 0,05 ppb nin altında olduğu gözlendi. Aflatoksin M 1 değeri rakamsal olarak en düşük 0,030±0,0038 ppb (İşletme no: 1) en yüksek 0,035±0,0061 ppb (İşletme no: 5) olarak belirlendi (Tablo 4.4).
43 Tablo 4.4. İşletmelerdeki ineklerden alınan sütlerdeki AFLM 1 değerleri İnek sütü İşletme No min. max. 1 0,030±0,0038 0,0231 0,0370 2 0,034±0,0059 0,0238 0,0469 3 0,033±0,0057 0,0236 0,0452 4 0,032±0,0044 0,0242 0,0398 5 0,035±0,0061 0,0240 0,0478 6 0,032±0,0042 0,0242 0,0390 7 0,032±0,0044 0,0240 0,0387 8 0,031±0,0041 0,0238 0,0385 9 0,030±0,0044 0,0236 0,0378 10 0,031±0,0038 0,0239 0,0375 11 0,032±0,0044 0,0239 0,0395 Tablo 4.5. Mevsimlere göre kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki total aflatoksin değerleri (ppb) Mevsim n Kaba yem Konsantre yem Karma yem İlkbahar 11 7,955 a 6,757 a 9,187 a Yaz 11 6,825 b 6,693 a 8,811 a Sonbahar 11 5,912 c 5,197 b 6,075 b Kış 11 6,076 b 5,405 b 7,267 b SEM 0,1930 0,2200 0,2630 P ** ** ** Genel ortalama 44 6,692 6,013 7,835 **: p<0.01 a, b, c : Aynı sütunda farklı harfle ifade edilen ortalamalar arasındaki farklılıklar önemlidir. Total AFL 10 8 6 4 2 0 İlkbahar Yaz Sonbahar Kış Kaba yem Konsantre yem Karma yem Şekil 4.1. Mevsimlere göre kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki total aflatoksin değerleri (ppb)
44 Mevsimlerin kaba yem, konsantre yem ve karma yemlerdeki total aflatoksinler üzerine etkisi incelendiğinde sırasıyla, ilkbaharda 7,955; 6,757; 9,187 ppb, yaz mevsiminde 6,825; 6,693; 8,811 ppb, sonbaharda 5,912; 5,197; 6,075 ppb ve kış mevsiminde 6,076; 5,405; 7,267 ppb olarak bulundu. Mevsimlerin kaba yem üzerine etkisi incelendiğinde en düşük sonbahar mevsiminde daha sonra yaz ve kış mevsiminde en yüksek ise ilkbahar mevsiminde olduğu gözlendi (p<0.01). Konsantre ve karma yemlerde sonbahar ve kış mevsiminde gözlenen total aflatoksin değerlerinin ilkbahar ve yaz mevsimlerine göre düşük olduğu görüldü (p<0.01). Total aflatoksinin genel ortalama değerleri ise kaba yemde 6,692 ppb, konsantre yemde 6,013 ppb ve karma yemde 7,835 ppb olarak saptandı (Tablo 4.5; Şekil 4.1). Tablo 4.6. Mevsimlere göre kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki AFLB 1 değerleri (ppb) Mevsim n Kaba yem Konsantre yem Karma yem İlkbahar 11 4,539 a 2,904 a 3,835 a Yaz 11 4,429 a 2,852 a 3,577 b Sonbahar 11 1,244 b 1,455 b 1,622 d Kış 11 1,240 b 1,487 b 2,488 c SEM 0,0280 0,0930 0,0650 P ** ** ** Genel ortalama 44 2,863 2,175 2,881 **: p<0.01 a, b, c, d : Aynı sütunda farklı harfle ifade edilen ortalamalar arasındaki farklılıklar önemlidir. Kaba, konsantre ve karma yemlerdeki AFLB 1 in üzerinde mevsimlerin etkisine bakıldığında sırasıyla ilkbaharda 4,539; 2,904; 3,835 ppb, kış mevsiminde 1,240; 2,852; 3,577 ppb, sonbaharda 1,244; 1,455; 1,622 ppb ve yaz mevsiminde 4,429; 1,487; 2,488 ppb olarak bulundu. Mevsimlerin kaba yemdeki AFLB 1 düzeyleri üzerine etkisi incelendiğinde sonbahar ve kış mevsiminde ilkbahar ve yaz mevsimine göre düşük
45 olduğu gözlendi. Kaba yemde olduğu gibi konsantre yemlerde de AFLB 1 düzeylerinin sonbahar ve kış mevsiminde ilkbahar ve yaz mevsiminden daha düşük olduğu tespit edildi. Karma yemlerde AFLB 1 düzeyleri mevsimlere göre büyükten küçüğe doğru sırasıyla; ilkbahar, yaz, kış ve sonbahar mevsimlerinde gözlendi (p<0.01). Aflatoksin B 1 in genel ortalama değerleri ise kaba yemde 2,863 ppb, konsantre yemde 2,175 ppb ve karma yemde 2,881 ppb olarak saptandı (Tablo 4.6; Şekil 4.2). AFLB 1 5 4 3 2 1 0 İlkbahar Yaz Sonbahar Kış Kaba Yem Konsantre Yem Karma yem Şekil 4.2. Mevsimlere göre kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki AFLB 1 değerleri (ppb) Kaba yem, konsantre yem ve karma yemlerdeki okratoksinin, mevsimsel değişiklikleri değerlendirildiğinde, sırasıyla ilkbaharda 7,882; 5,430; 7,291 ppb, yaz mevsiminde 7,169; 5,610; 6,998 ppb, sonbaharda 6,658; 4,358; 4,275 ppb ve kış mevsiminde 6,662; 4,334; 4,840 ppb olarak bulundu. İlkbahar ve yaz mevsimlerindeki kaba, konsantre ve karma yemlerdeki okratoksin değerlerinin sonbahar ve kış mevsimlerinden daha yüksek olduğu belirlenmiştir (p<0.01). Okratoksinin genel ortalama değerleri ise kaba yemde 7,093 ppb, konsantre yemde 4,933 ppb ve karma yemde 5,851 ppb olarak saptandı (Tablo 4.7; Şekil 4.3).
46 Tablo 4.7. Mevsimlere göre kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki Okratoksin değerleri Mevsim n Kaba yem Konsantre yem Karma yem İlkbahar 11 7,882 a 5,430 a 7,291 a Yaz 11 7,169 b 5,610 a 6,998 a Sonbahar 11 6,658 c 4,358 b 4,275 b Kış 11 6,662 c 4,334 b 4,840 b SEM 0,1150 0,1020 0,2170 P ** ** ** Genel Ortalama 44 7,093 4,933 5,851 **: p<0.01 a, b, c : Aynı sütunda farklı harfle ifade edilen ortalamalar arasındaki farklılıklar önemlidir. Okratoksin 8 6 4 2 Kaba Yem Konsantre Yem Karma yem 0 İlkbahar Yaz Sonbahar Kış Şekil 4.3. Mevsimlere göre kaba yem, konsantre yem ve karma yem örneklerindeki okratoksin değerleri (ppb) İşletmelerdeki ineklerden alınan süt örneklerindeki AFLM 1 in mevsimsel etkileri incelendiğinde ilkbaharda 0,04 ppb, yaz mevsiminde 0,02 ppb, sonbaharda 0,02 ppb ve kış mevsiminde 0,04 ppb olarak belirlendi. İlkbahar ve kış mevsimi ile yaz ve sonbahar mevsimleri arasında AFLM 1 yönünden istatistiksel fark önemli bulundu (p<0.01). Aflatoksin M 1 in genel ortalama değeri 0,03 ppb olarak saptandı (Tablo 4.8; Şekil 4.4). Karma yemlerle alınan AFLB 1 in inek sütüne % 1,219±0,04139 oranında [( ) ] AFLM 1 olarak geçtiği belirlendi.
47 Tablo 4.8. Mevsimlere göre inek süt örneklerindeki AFLM 1 değerleri Mevsim n AFLM 1 İlkbahar 11 0,04 a Yaz 11 0,02 b Sonbahar 11 0,02 b Kış 11 0,04 a SEM 0,001 P ** Genel Ortalama 44 0,03 **: p<0.01 a, b : Aynı sütunda farklı harfle ifade edilen ortalamalar arasındaki farklılıklar önemlidir. AFLM 1 0,04 0,03 0,02 0,01 0 İlkbahar Yaz Sonbahar Kış AFLM1 Şekil 4.4. Mevsimlere göre inek süt örneklerindeki AFLM 1 değerleri (ppb)