Reaktif Maddeler Kannabinoidler Mikrolevha EIA Oral Sıvı Uygulaması Cozart RapiScan Toplayıcısı M146R5 (Ekim 2005) Edisyon: 001 Amaçlanan Kullanım Oral Sıvı için Cozart Kannabinoidler EIA seti klinik ve adli laboratuarlarda kullanım için Cozart RapiScan Oral Sıvı toplama sistemiyle birlikte kullanılmak üzeredir. Bu toplama sistemiyle 5 ng/ml lik kesme konsantrasyonunda insan ağzı sıvısındaki Kannabinoidler takibi için niteliksel sonuçlar sağlar. Toplama sistemi örneğin 1:3 lük seyreltilmesini içerdiğinden, bu seyreltilmemiş insan ağzı sıvısındaki 15 ng/ml ye eşittir. Bu belgenin geri kalanı 5 ng/ml lik kesme konsantrasyonundan bahsedecektir. Bu tahlil sadece bir ön analitik test sonucu sağlar. Test sonuçlarını, özellikle de pozitif bir ön sonuç alacak şekilde, istismar eden bütün ilaçlar hakkında klinik değerlendirme ve profesyonel yargıya başvurulmalıdır. Daha kesin bir analitik sonuç elde etmek için daha özel bir kimyasal metot alternatifi kullanılmalıdır. Gaz kromatografisi/kütle spektrometrisi (GC-MS) tercih edilen kesinleştirme yöntemidir. Bu ürünün işyeri testi için gerekli kriterleri sağladığını belirlemek organizasyonların sorumluluğudur. Testin Prensibi Oral Sıvı için Cozart Kannabinoidler EIA seti insan ağzı sıvısındaki Kannabinoidlerin tespiti için rekabetçi bir enzim bağışıklık sistemi tahlilidir. Mikrotitre şeritlerinin çukurları anti-kannabinoid antikorlarıyla kaplıdır. İlk kuluçka sırasında yaban turpu peroksidazıyla (HRP) etiketlenmiş Kannabinoidler, mikrotitre şeritlerindeki anti- Kannabinoidler antikorlarının bağlanma yerleri için hasta örneğindeki serbest Kannabinoidler ile yarışır. TMB substrat çözeltisinin eklenmesinden önce çukurlar fazla enzim materyalinin kaldırılması için yıkanır. Durdurma çözeltisinin eklenmesi tepkimeyi durdurur ve soğurganlıklar spektrofotometresel olarak 450 nm'de okunur. M146R5-5 tabaklı set«anti-kannabinoidler Kaplı Levha- (5 levha) Kırılmaya hazır 12 x 8 çukur şerit. Kuru formdaki polistiren levha üzerinde sabitlenmiş anti- Kannabinoidler çok klon antikorlar. 0.001% BSA içerir. Enzim Eşleniği (1,0 ml) Yaban turpu peroksidazıyla etiketlenmiş ve protein matriste dengeleyicilerle seyreltilmiş kannabinoid türevi. Çalışan seyreltmelerle ilgili veri sayfası ektedir. Enzim Seyreltici (20 ml) Dengeleyici ve protein matris içeren tampon çözelti. Kullanıma hazır. Oral Sıvı Örneği Tampon Çözeltisi (50 ml) Oral sıvı örneklerini seyreltmede kullanılacak protein matrisi ve dengeleyicileri içeren tampon çözelti. Kullanıma hazır. Yıkama Tampon Çözeltisi (50 ml) 30 x konsantre. Saklama halinde kristaller oluşabilir. Kullanımdan önce her şişeyi 1500 ml ye kadar saf suyla seyreltin. Substrat Çözeltisi (55 ml) 3,3, 5,5 - tetramethylbenzidine içeren bir şişe. Durdurma Çözeltisi (55 ml) 1 M sülfürik asit içeren bir şişe. Bu çözeltiyi aşındırıcı olarak kullanın. Negatif Kalibratör (2 ml) Kannabinoidler için negatif oral sıvı matrisi. Pozitif Kalibratörler (bütün seviyelerde 2 ml) 5 ng/ml Δ9THC içeren oral sıvı matrisi. 10 ng/ml Δ9THC içeren oral sıvı matrisi. 50 ng/ml Δ9THC içeren oral sıvı matrisi. Reaktiflerin Saklanması ve Kararlılığı Açılmış/ açılmamış bütün reaktifleri 2-8 C sıcaklıkta saklayınız. Reaktifler, reaktif etiketleri üzerinde belirtilen son kullanma tarihlerine kadar kararlıdır. Mikrotitre şeritlerinin fazlası hemen kurutuculu mühürlenebilir folyo keseyle yeniden paketlenmelidir. Saklama koşullarını yerine getirme konusunda başarısızlık tahlil performansını olumsuz etkileyebilir. 1 of 3 Cannabinoids (Oral Fluid)
Saklama halinde yıkama tamponunda kristaller oluşabilir. Yıkama tamponunu seyreltirken bütün bunların transfer edildiğinden emin olun. Substratın rengi berrak olmalıdır. Herhangi bir mavi renklenme reaktifin kirlendiğini ve atılması gerektiğini gösterir. Substratı ışığa maruz bırakmayınız. Herhangi bir set bileşeninde bulanıklık veya çökelme, bozulmaya işaret eder ve bileşen atılmalıdır. 2 of 3 Cannabinoids (Oral Fluid)
Örnek Toplanması ve Saklanması Lütfen Cozart RapiScan Toplayıcısıyla örnek toplama prosedürünü anlatan talimatlara (MDK004) başvurunuz. Örnek hemen analiz edilemezse, 28 güne kadar 2-8 C sıcaklıkta veya daha uzun süre için -20 C sıcaklıkta saklayınız. Örneğin kirlenmesinden şüpheleniliyorsa yeni bir örnek elde ediniz. Oral sıvı örneğinin toplanmasından önce yiyecek veya içecek tükettiğinizde 10 dakika bekleyiniz. Bütün örnekleri potansiyel olarak enfekte olabileceklerini düşünerek kullanınız. Uyarılar ve Önlemler 1. Set reaktifleri civarında yiyecek ve içeceklerin bulundurulması tavsiye edilmez. 2. Bütün deri şikayetleri, kesikler ve yıpranmalar uygun şekilde korunmalıdır. 3. Kalibratörler sentetik oral sıvı kullanılarak hazırlanmıştır. Ancak, kalibratörler ve bütün oral sıvı örnekleri potansiyel olarak enfekte oldukları düşünülerek kullanılmalıdır. 4. Bazı tahlil reaktifleri bakır veya kurşun boru tesisatlarıyla reaksiyona girerek potansiyel olarak patlayıcı metal azidleri oluşturabilecek olan sodyum azid içerir. Bu reaktifleri elden çıkarırken azid birikmesini önlemek için her zaman büyük miktarda suyla yıkayınız. 5. Pipet reaktifleri ağzınıza almayınız. 6. Sodyum azidi örneklere koruyucu olarak eklemeyiniz. 7. Mikrobik kirlenmeleri önlemek için bütün kapları kullanılmadıkları zaman kapalı tutunuz. 8. Reaktifleri son kullanım tarihlerinden sonra kullanmayınız. 9. Farklı setlerden, üreticilerden veya parti numaralarından reaktifleri karıştırmayınız. 10. Reaktifleri dondurmayınız. 11. Reaktiflerin mümkün olduğu kadar doğrudan günışığından uzak tutulması tavsiye edilir. 12. Durdurma Çözeltisi aşındırıcıdır; özenle kullanınız. 13. Örnek eklenmesi 30 dakikadan fazla sürmemelidir. Reaktifin Hazırlanması 1. Yıkama Tamponunu 1:30 oranında saf suyla seyrelterek hazırlayınız. 2. Ekteki veri sayfasında belirtildiği gibi çalışma kuvvetinde Enzim Eşleniği ni hazırlayınız. Prosedür Tahlil Prosedürü Not: Kullanımdan önce bütün reaktifleri oda sıcaklığına (20-27 C ) getiriniz. Operatörün takdir yetkisine bağlı olarak bütün örnekler, kalibratörler ve kontroller kopyalarıyla test edilebilir. 1. Tahlilden önce bütün örnekleri, kontrolleri ve kalibratörleri 2 de 1 oranında tampon çözeltisiyle seyreltiniz. 2. Her çukura örneğin, kalibratörün veya kontrolün 50 µl sini ekleyiniz. (Yukarıdaki not 13 ye bakınız.) 3. Her test çukuruna 100 µl çalışma kuvvetinde Enzim Eşleniği ekleyiniz. 4. 30 dakikalığına kuluçkaya yatırınız. 5. Levhayı levha yıkayıcısını kullanarak 350 µl Yıkama Tampon Çözeltisiyle dört kere yıkayınız. 6. Her çukura 100 µl Substrat Çözeltisi ekleyiniz ve 30 dakikalığına kuluçkaya yatırınız. 7. Her çukura 100 µl Durdurma Çözeltisi ekleyiniz. 8. 450 nm de 15 dakikadaki soğurganlığı ölçün. Gerekli Olan ama Sağlanmayan Materyaller 1. Pozitif ve negatif kontroller. 2. 450nm filtreli otomatik mikrotitre levhası okuyucusu. 3. Tek kullanımlık uçlu hassasiyet pipetleri. Kirlenmeyi önlemek için her reaktif için temiz uçlar kullanınız. 4. Otomatik mikrotitre levhası yıkama makinası, manuel mikrotitre levhası yıkayıcı veya seyreltilmiş yıkama tamponu çözeltisini dağıtmak için 350μL sekiz kanallı pipet. 5. 30 dakikalık süreleri tutmak için süre ölçer. 6. Yıkama tamponu konsantresinin seyreltilmesi için temiz ölçme silindiri. 7. Saf veya iyonsuzlaştırılmış su. Kalite Kontrol Her tahlilde kalibratörler dahil edilmelidir. Durdurulmuş tahlil 15 dakika içinde okunmalıdır. Kontroller setle birlikte sağlanmamıştır ama kullanıcılar dış kalite kontrollerin uygulanmasıyla ilgili uygun kurallara 3 of 3 Cannabinoids (Oral Fluid)
uymalıdırlar. Negatif kontrol, 5ng/mL kalibratörden daha yüksek bir soğurganlığa sahip olmalıdır. Pozitif kontrol, 5ng/mL kalibratörden daha düşük bir soğurganlığa sahip olmalıdır. Pozitif veya negatif kontroller sırasıyla 5ng/mL kalibratörden daha düşük veya yüksek soğurganlığa sahip değillerse, tahlil sonuçları geçersizdir. Tahlil tekrar edilmelidir, kontrol sonuçları hala yukarıda belirtilen limitlerin dışındaysa Cozart Bioscience Ltd. in Teknik Servis i ile temasa geçiniz. 4 of 3 Cannabinoids (Oral Fluid)
Sonuçların Değerlendirilmesi Pozitif Sonuç 5ng/mL Kesme Kalibratörü nden küçük veya ona eşit soğurganlığa sahip bütün örnekler pozitif olarak değerlendirilir. Negatif Sonuç 5ng/mL Kesme Kalibratörü nden büyük soğurganlığa sahip bütün örnekler negatif olarak değerlendirilir. Not: Reaktiflerin saflığının bozulması, gerekli yeterliklere sahip olmayan enstrümanların kullanılması veya etiketteki talimatları takip etme konusundaki diğer başarısızlıklar, performans karakteristiklerini ve etikette belirtilen veya ima edilen iddialarını etkileyebilir. Yetersizlikler Bu tahlilden elde edilen pozitif sonuç GC/MS gibi başka bir genel olarak kabul gören bağışıklık harici metotla kesinleştirilmelidir. Test yalnızca insan oral sıvısıyla kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Burada listelenmemiş başka maddelerin ve/ya faktörlerin testle etkileşme ve teknik veya prosedürel hatalar gibi yanlış sonuçlar ortaya çıkarma ihtimali vardır. Cihazın analitik performansında bozulma veya setin taşıma sırasında zarar görmesi durumunda lütfen Cozart Bioscience Ltd. ın Teknik Servis i ile temasa geçiniz. Özgüllük Aşağıdaki bileşikler 10,000ng/mL de çapraz tepkirlik için test edilmiştir. Hiçbirinin çapraz tepkimeye girmediği tespit edilmiştir: 6-Acetyl Morphine 7-Aminoflunitrazepam Alprazolam Amitriptyline Amobarbital Amphetamine Anhydroecgonine Anhydroecgonine methyl ester Ascorbic Acid Aspirin Benzoylecgonine Buprenorphine Butalbarbital Caffeine Chlordiazepoxide Chloroquine Chlorpheniramine maleate Clonazepam Cocaethylene Cocaine Codeine Cotinine Desalkylflurazepam Desmethylflunitrazepam Lorazepam LSD MBDB MDA MDEA MDMA Meperidine Methadone Methamphetamine Midazolam Morphine Morphine-3-Glucuronide Nalorphine Naloxone Nicotine Nitrazepam Norbuprenorphine Norcodeine Nordiazepam Norfluoxetine Nor-LSD Normorphine Oxazepam Oxycodone Dextromethorphan Oxymorphone Diazepam Paracetamol Dihydrocodeine Pentobarbital Dothiepin Phencyclidine Ecgonine methyl ester Pheniramine EDDP Phenobarbital EMDP Phentermine (-) Ephedrine β Phenylethylamine (+) Ephedrine Phenylpropanolamine Fenfluramine Pholcodeine Fentanyl Prazepam Flunitrazepam Propoxyphene Fluoxetine Propranolol Flurazepam (-) Pseudoephedrine Heroin (+) Pseudoephedrine Hexobarbital Ranitidine Hydrocodone Salicylate Hydromorphone Secobarbital 3-Hydroxyflunitrazepam Temazepam Ibuprofen Tramadol Ketamine Triazolam LAAM Tyramine Lidocaine Warfarin Çapraz-Tepkiyenler Bileşik ng/ml Test edilen Görünür THC ng/ml Çapraz Tepkirl ik 11-Hidroksi-Δ9-100 >50 - THC 50 43.8 87.6 10 <5 - Kannabidiol 100,00 42.9 0.04 0 50,000 27.3 0.05 10,000 6.8 0.07 5,000 <5-11NorKarboksiΔ9T HC Bibliografi 10 >50-5 36.7 733.2 1 <5 - Shoshana Zevin, Peyton Jacob III, Pierangelo Geppetti, Neal L Benowitz, Drug and Alcohol Dependence 60 13-18 (2000) Daha fazla bilgi için: COZART plc, 92 Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, UK. Telefon: 01235 861483 Faks: 01235 835607 www.cozart.biz 5 of 3 Cannabinoids (Oral Fluid)
6 of 3 Cannabinoids (Oral Fluid)