PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI

YAKLAŞIMLAR Proteinler moleküller uzaklaştırılır: dışındaki karışımdan Proteinler çöktürülür. Örneğin, ham özüte streptomisin sülfat eklenerek DNA çöktürülür. Daha sonra da santrifüjleme ile uzaklaştırılır. (TCA- NH 4 sülfat- organik çözücüler kullanılarak) Santrifüjlemeyle ayrılıp ileri saflaştırma işlemleri uygulanır.

PROTEİNLER çoğunlukla;; Büyüklük ve şekil, Toplam yük, Yüzeyde bulunan hidrofobik gruplar, Kullanılan durağan faza bağlanma kapasitesi gibi özelliklerinin farklı olmasına dayanarak KROMATOGRAFİK YÖNTEMLERLE ayrılıp saflaştırılabilir.

Kolon kromatografisi kolon dolgu maddesi (durağan faz, matris) ile doldurulmuş alttan musluklu basit bir cam boruda gerçekleştirilebilir. Protein karışımı uygun bir elüsyon çözeltisiyle kolonda sürüklenir. Durağan fazla etkileşim (adsorbsiyon) ve kolondan ayrılma (dezorbsiyon) özelliği bakımından farklı proteinler belli zaman aralıklarında veya hacimlerde toplanarak farklı fraksiyonlara ayrılır.

Kolondan çıkan fraksiyonların otomatik olarak belli hacimlerde toplandığı ve absorbsiyonlarının ölçüldüğü sistemler de vardır. Böyle bir sistemde elüsyon çözeltisi rezervuarla kolona gönderilebileceği gibi, peristaltik pompa ile sürekli de beslenebilir. Kolondan geçen farklı fraksiyonlar fraksiyon kollektörü tarafından ayrı kaplarda toplanır ve absorbsiyonları belirlenebilir ya da enzim aktivitesi ölçülerekizlenebilir.

Kolon kromatografisinin farklı temellere dayanan çeşitli tipleri vardır: Elektrik yükü veya hidrofobik grupların dağılımı gibi bazı yapısal özelliklere dayanan: iyon değişimi kromatografisi, hidrofobik etkileşim kromatografisi, metal- kelat kromatografisi Protein ve dolgu maddesi arasındaki yapısal ve işlevsel uyum ve etkileşim temeline dayanan: afinite kromatografisi (lektin afinite kromatografisi, immünopürifikasyon) Molekül boyutuna dayanan: jel geçirgenlik kromatografisi(jel filtrasyonu veya moleküler elek tekniği de denir)

İYON DEĞİŞİMİ KROMATOGRAFİSİ Proteinleri oluşturan amino asitler farklı yan zincirlere sahiptir. Aspartik ve glutamik asit ph 7.0 değerinde negatif yüklü asidik gruplar taşırken; lizin, arjinin ve histidin pozitif yüklü bazik gruplar içerir.

aspartik asit glutamik asit arginin histidin lizin

Her protein, bu beş amino asiti farklı oranlarda içerdiğinden, moleküllerin yükleri de farklı (pozitif veya negatif) olur. Proteinin net yükü yapısındaki bu amino asitlerin miktarına ve protein çözeltisinin ph sına bağlı olarak değişir. Proteinler toplam yüklerinin 0 olduğu ph değerinin (izoelektrik nokta, pi) üzerindeki ph değerlerinde negatif, altındaki ph değerlerinde ise pozitif elektrik yüküne sahiptir.

İyon değişimi kromatografisinin temelini, proteinin yüklü grupları ile katı matriks arasındaki elektrostatik etkileşimler oluşturmaktadır.

+ yüklü iyon değiştirici matrisler ANYON DEĞİŞTİRİCİLER, + + + + + + + - yüklü iyon değiştirici matrisler KATYON DEĞİŞTİRİCİLER - - - - - - -

Proteinler, ya kullanılan tampon çözeltisinin ph sını ya da tuz konsantrasyonun u değiştirmek suretiyle kolondan ayrılırlar.

Bir anyon değiştiricide negatif yüklü proteinlerin ayrılması. Kolon ayırımı yapılacak proteinle zıt yükte olan dolgu maddesi (matriks) ile doldurulur. (a) Pozitif ve negatif yüklü proteinlerden oluşan karışım kolona yüklenir. Zıt yüke sahip proteinler kolon dolgu maddesine adsorbe olurken, matriksle aynı yükte olanlar kolonu terkederler. (b) Kolon içinde tutulmuş proteinlerin ayrılması için, kolon NaCl çözeltisi ile yıkanır. Tuz iyonları (karşıt iyonlar, counter ions) matriks yüzeyindeki yüklü gruplarla rekabet ederek ilgili proteinin kolondan ayrılmasına yol açarlar. Tuz konsantrasyonunun kademeli olarak artırılması ile, daha fazla yüke sahip proteinlerin de kolonu terketmesi sağlanır.

GENEL ANYON DEĞİŞTİRİCİLER de yer alan + yüklü gruplar: Aminoetil C 2 H 4 N + H 3 Dietilaminoetil C 2 H 4 NH + (C 2 H 5 ) 2 Trietilaminoetil C 2 H 4 N + (C 2 H 5 ) 3 GENEL KATYON DEĞİŞTİRİCİLER de yer alan - yüklü gruplar: Sülfo SO 3 - Karboksimetil CH 2 COO -

Anyon değiştirici mi, katyon değiştirici mi seçmeliyiz? Ayırmak istediğimiz proteinin ph stabilitesi önem taşır. pi değerinin üzerindeki ph değerlerinde (yani yüklü olduğu durumda mı daha kararlı, yoksa pi değerinin altındaki ph değerlerinde (yani + yüklü olduğu durumda mı daha kararlı? Hangisinde daha kararlı ve dayanıklı ise onu seçmeliyiz.

ph 4-9 un dışındaki ph değerlerinde stabilitesini koruyan protein sayısı azdır. Onun için adsorban sayısı sınırlıdır. En çok kullanılan adsorbanlar selüloz, agaroz ve dekstranın karboksimetil (CM) ve dietilaminoetil (DEAE) türevleridir.

Tablo 2. Proteinlerin ayrılmasında kullanılan iyon değişimi matriksleri a,b. Anyon değiştirici matriksler Polistiren Anyon değiştirme kapasitesi Katyon değiştirici matriksler Katyon değiştirme kapasitesi AG 1 Kuvvetli AG 50W Kuvvetli AG 2 Kuvvetli Bio- Rex 70 Zayıf Bio- Rex 5 AG 3- X4A Bio- Rex MSZ 1- X8 Orta Kuvvetli Kuvvetli Sellüloz Aminoetil sellüloz Zayıf CM- sellüloz Zayıf DEAE- sellüloz Zayıf Benzil DEAE- sellüloz Zayıf ECTEOLA- sellüloz Zayıf PEI- sellüloz Zayıf QAE- sellüloz Kuvvetli TEAE- sellüloz Zayıf DEAE- sepasel (sephacel) Zayıf

Sefadeks (sephadex) Dekstran esaslı matrikslerdir. DEAE- sefadeks (A- 25 veya A- 50) Zayıf CM- sefadeks (C- 25 veya C- 50) Zayıf QAE- sefadeks (A- 25 veya A- 50) Kuvvetli SP- sefadeks (C- 25 veya C- 50) Kuvvetli Sefaroz (sepharose) Agaroz esaslı matrikslerdir. DEAE- sefaroz CL- 6B Zayıf CM- sefaroz CL- 6B Zayıf DEAE- sefaroz (hızlı akışlı) Zayıf CM- sefaroz (hızlı akışlı) Zayıf Q sefaroz (hızlı akışlı) Kuvvetli S sefaroz (hızlı akışlı) Kuvvetli a Kısaltmalar: CM, karboksimetil; DEAE, dietilaminoetil; ECTEOLA, epiklorohidrin trietanolamin; PEI, polietilenimin; Q, kuaterner amin; QAE, dietil- [2- hidroksipropil]- aminoetil; S, sülfonat; SP, sülfopropil; TEAE, trietilaminoetil. bsephadex, Sephacel ve Sepharose Pharmacia tarafından üretilmektedir. Sellülozun çeşitli türevleri Whatman, Sigma ve diğer bazı üretici firmalardan da sağlanabilir. AG ve Bio- Rex Bio- Rad firması tarafından üretilen polistiren esaslı matrikslerdir. Başka firmalar da benzer maddeler üretmektedirler (örneğin, Dow ("Dovex"), Rohm ve Haas ("Amberlite") gibi.

Por özelliği önemli mi? EVET Çünkü bağlama kapasitesi etkilenir. MW 10.000-100.000 proteinler için; DEAE- Sephacel veya Sepharose; Daha büyük proteinler için Sephadex A- 25 veya C- 25 kullanılır.

İyon değişimi kromatografisinde hareketli faz daima tamponlanır. Tamponlanmayan çözeltiler, proteinler yerine, anyon değiştiricilerin yüzeyinde OH ve katyon değiştiricilerin yüzeyinde H + iyonlarının lokalize olmasına (Donnan etkisi) yol açar. Bu da olumsuz iyon değişimlerine ve protein denatürasyonuna neden olur.

Bu teknikte sabit fazın (matrikse bağlı yan zincirlerin) proteinlerle oluşturduğu hidrofobik etkileşimlerden yararlanılır. Bu etkileşimin derecesine göre farklı proteinlerfarklızamanlarda kolonuterkederler.

Sabit fazdaki hidrofobik ligantlara örnekler; Örnek, yüksek derişimde tuz içeren (not: denatürasyona yol açmayacak türden olmalı, örneğin amonyum sülfat) bir tamponda çözündürülerek kolona yüklenir. Proteinler tampondaki tuz konsantrasyonu azaltılarak kolondan ayrılır.

METAL- KELAT KROMATOGRAFİSİ Bu teknikte sabit fazın (matrikse bağlı yan zincirlerin) proteinlerle oluşturduğu metal komplekslerinden yararlanılır.

Örneğin, İmmobilize Metal Afinite Kromatografisi (IMAC) Bu teknik, Psödoafinite (Yalancı İlgi) teknikleri olarak da adlandırılan bir gup teknik içinde ele alınmaktadır. Bu grubun diğer örnekleri ise: Tiyofilik Adsorpsiyon Kromatografisi (TAC)dir. Boya Ligand Kromatografisidir.

AFİNİTE (İLGİ) KROMATOGRAFİSİ Bu yöntem biyolojik etkileşim temeline dayanır ve bu nedenle son derece özgül ayırımların yapılabilmesini sağlar.

A (makromolekül) + B (ligand) A:B biyolojik yanıt Bu teknikte proteinler ligand adı verilen maddelere geri dönüşümlü olarak bağlanırlar. Ligandlar, aktif taşıyıcıya kovalent olarak bağlanan ve saflaştırılacak makromoleküle özel ve seçimli afinite gösteren küçük moleküllerdir. Örneğin, antikor, bir enzimin inhibitörü, kofaktörü ve özel hallerde substratı olabilir. Birçok ligand önce inert destek metaryaline bağlanır ve kromatografi kolonunapaketlenir. Bu sistemde sadece istenilen protein kolondaki liganda bağlanır. Diğer proteinler bağlanmadan ayrılır. Daha sonra kolonun uygun bir tampon ile yıkanması sonucunda istenmeyen proteinler tamamen uzaklaştırılır. Bir sonraki adımda ise tamponun uygun bir şekilde değiştirilmesi ile liganda bağlanan protein kolondan geri kazanılır.

Yöntemin, ligand ile ayrılacak protein arasındaki etkileşimin tipine göre farklı uygulamaları vardır:

İMMÜNOPÜRİFİKASYON İmmobilize protein A veya İmmobilize protein G veya İmmobilize protein L içeren kolonda ANTİKOR saflaştırma yapılabilir.

I. Adım: İmmünoadsorban hazırlanır. Antijenler (mavi) katı matrise (pembe yuvarlaklar, selüloz, agaroz vb.) kovalent olarak bağlanır (İMMOBİLİZASYON). II. Adım: Protein karışımı (ör. Serum) kolondan geçirilir. Antijene afinitesi olan antikorlar (kırmızı) antijene kovalent olmayan etkileşimlerle bağlanacak ve kolonu daha geç terkedecektir. III. Adım: Antijene tutunmuş antikoru kolondan ayırmak için elüsyon sıvısı (yüksek derişimde tuz içeren ve/veya düşük ph da bir tampon) geçirilir. IV. Adım: Kolondan toplanan örneğin (elüent) dializ edilerek tuzlardan arındırılması

JEL GEÇİRGENLİK KROMATOGRAFİSİ Bu yöntemde proteinler molekül büyüklüklerinin farklı olması esasına göre ayrılırlar. (JEL FİLTRASYONU, MOLEKÜLER ELEK TEKNİĞİ)

JEL GEÇİRGENLİK KROMATOGRAFİSİ Kolon dolgu maddesi küresel yapılı ve belirli boyutta gözeneklere sahip inert jel parçacıklarından oluşmuştur. Farklı boyutta molekülleri içeren bir çözelti kolondan geçirildiğinde, büyük moleküller gözenekli taneciklerin aralarındaki boşluklardan geçerek kolonda hızla ilerlerler; gözenek boyutlarından küçük moleküller ise gözenek içerisine diffüzlenir ve molekül küçüldükçe artan bir alıkonma süresi ile kolondan çıkarlar.

Jel geçirgenlik kromatografisinde kullanılabilecek matris materyallerinden örnekler. Ticari adı Matriks tipi Üretici ph aralığı Sıcaklık stabilitesi ( o C) Sefadeks Dekstran Pharmacia 2 120 Sefaroz Agaroz Pharmacia 4-9 40 Sefaroz CL Çapraz bağlı agaroz Pharmacia 3-14 120 Sefasiril Dekstran/bis Pharmacia 2-11 120 Ultrogel A Agaroz IBF 4-9 40 Biogel A Agaroz Bio- Rad 4-9 40 Biogel P Poliakrilamid Bio- Rad 2-10 120

HPLC Amino asitler, karbohidratlar, lipidler, nükleik asitler, proteinler, pigmentler, streoidler ve diğer biyolojik aktif moleküllerin ayrılmasında ve tanımlanmasında çok iyi sonuçlar veren bu teknik temelde otomatik hale getirilmiş modern bir sıvı kromatografi tekniğidir.

HPLC nin klasik sıvı kromatografilerine göre önemli üstünlükleri vardır: 1) çözünme (ayrıştırma) ve analiz hızı klasik yöntemlerden çok yüksektir, 2) kolonları yeniden doldurulmadan ve yenilenmeksizin sürekli kullanılabilir, 3) ayırma gücünü etkileyen değişkenler sıkı şekilde kontrol edilebildiğinden tekrarlanabilirliği son derece yüksektir, 4) aletin çalışması ve verilerin analizi kolaylıkla otomatikleştirilir, 5) büyük boyuttaki (preparatif) ayırım süreçlerine uygulanabilir.

2 8 6 2 Waters 2795 Alliance HPLC, 486 and Peaksimple... 9 6 Make: Waters Model: 2795 Price $19,900 Waters 2795 Alliance HPLC is an integrated solvent and sample management platform which combines two traditional high- performance liquid chromatography (HPLC) components: a solvent management system and a sample management system.... more

GAZ KROMATOGRAFİSİ (GC) Kromatografik bir sistemde hareketli faz gaz, durağan faz da inert katı partiküller üzerini kaplayan bir sıvı olduğunda bu tekniğe gaz- sıvı kromatografisi ya da kısaca gaz kromatografisi (GC) denir.

GAZ KROMATOGRAFİSİ (GC) Gaz kromatografisi temelde dağılım olayına dayanır. Durağan faz, yüksek sıcaklık derecelerine dayanıklı, paslanmaz çelik veya camdan bir tüp (kolon) içine doldurulur. İnert bir gaz (genelde helyum, azot veya argon) (hareketli faz) yüksek basınç altında kolondan geçirilir. Çalışılan materyale ait örnek buharlaştırılarak gaz fazına sokulur ve durağan fazdan geçmesi sağlanır. Örnekteki bileşenler hareketli faz ile katı destek üzerindeki durağan sıvı faz arasında dağılırlar. Durağan faza ilgisi olan moleküllerin kolondaki hareketleri daha yavaş olur.

GAZ KROMATOGRAFİSİ (GC) Gaz kromatografisi çok küçük moleküllerin son derece iyi ayrılmasını sağlayan; basit, çok yönlü, hızlı bir tekniktir ve çok duyarlıdır. Bununla birlikte, bu kromatografideki en önemli kısıtlama örneğin uçucu ve yüksek sıcaklık derecelerine (200-250oC) dayanıklı olması gerekliliğidir. Bu nedenle, gaz kromatografisi ancak uçucu ya da uçucu türevi hazırlanabilen moleküllerin ayırımında kullanılabilir.

5890II PIDELCD VOA GC Code:Z- 5890IIPIDELCD1 Price:$21,900.00 "Hewlett Packard - 5890 Series II Gas Chromatograph with Packed Inlet, O.I. Corp. PID/ELCD, O.I. Corp. 4560 Purge & Trap Concentrator with MPM16 Autosampler (other options available), Pentium IV Computer Data System with ChemStation. Tested System with Six (6) Month Warranty, Installation and Training Options are Available."

GAZ KROMATOGRAFİSİ (GC)- KÜTLE SPEKTROMETRİSİ (MS)

HPLC-KÜTLE SPEKTROMETRİSİ (MS)

PROTEİN ÇÖZELTİSİNİN KONSANTRE EDİLMESİ

HOMOJENİZASYON 1) Parçalama 2) Filtrasyon ve/veya santrifüjleme Berrak homojenat [HAM ÖZÜT (EKSTRE)] İçindeki protein miktarını bulabiliriz! Direkt kullanım Enzim deneyi Elektroforez Aktivite testleri Yapı analizleri Konsantre etme Kuru matriks polimerinin kullanımıyla Ultrafiltrasyonla Diyalizle Liyofilizasyonla Çöktürmeyle Saflaştırma Kromatografiyle Elektroforezle

Özütteki protein miktarı çok az olabilir. Ayırma ve saflaştırma işlemlerini küçük hacimlerle yürütmek daha kolay, hızlı ve ekonomiktir. Daha az kayıplara yol açar. Diğer moleküllerin engelleyici etkisi olabilir.

KONSANTRE ETME : Çözücü hacmini azaltarak veya (istenen) protein(ler)i ayırarak ya da istenmeyen diğer molekülleri uzaklaştırarak (istenen) protein(ler)in konsantrasyonunu artırma NASIL YAPILIR? Kuru matriks polimerinin kullanımıyla Ultrafiltrasyonla Diyalizle Liyofilizasyonla Çöktürmeyle

KURU POLİMER KULLANIMI Proteinler gibi büyük moleküllerin girişine uygun olmayan porlara sahip polimerler (örneğin, Sephadex G-25) kullanılır. protein küçük molekül

ULTRAFİLTRASYON: Su ve diğer küçük moleküller yarı geçirgen bir zardan geçmeye zorlanır. Örneğin, Centricon tipi ultrafiltrasyon tüpü kullanılır.

DİYALİZ: Su ve diğer küçük moleküller yarı geçirgen bir zardan geçmeye zorlanır.

Değişik büyüklüklerdeki molekülleri içeren çözelti, makromolekülleri geçirmeyen fakat su vb. küçük moleküllerin geçişine izin veren, yarı geçirgen bir zar yapısındaki diyaliz tüpüne konulup düşük iyonik kuvvette uygun bir tampona (veya saf suya) daldırılır. Zarın porları genellikle molekül ağırlığı 10.000 den daha fazla olan makromoleküllerin geçişine izin vermeyecek kadar küçüktür. Bu nedenle, diyaliz tüpünün içindeki su (ve küçük iyonlar) dışarı çıkarken içeride ayırımı istenen molekülün konsantre bir çözeltisi kalır.

Bu yöntem; Tuzların uzaklaştırılması Proteinlerin daha konsantre hale getirilmesi Proteinin içinde bulunduğu tamponun değiştirilmesi amacıyla kullanılabilir.

LİYOFİLİZASYON: Dondurarak vakumda kurutma Liyofilizasyon, donmuş durumdaki bir çözücünün (suyun) vakum altında doğrudan gaz haline geçmesini (buharlaşmasını) sağlayan süblimasyon temeline dayalı bir tekniktir.

LİYOFİLİZATÖRDE GERÇEKLEŞTİRİLİR.

Liyofilizasyon yüksek sıcaklığa duyarlı materyallerin kurutulması ya da konsantre edilmesi için en etkin yöntemlerden biridir. Pratikte, biyolojik materyal bir liyofilizasyon şişesinin veya kabının çeperlerinde donmuş bir kabuk oluştururarak konsantre hale geçer. Dondurma işlemi için, örnekle yarı yarıya doldurulmuş kap kuru buz- aseton banyosuna yerleştirilir ve 45 o açı yapacak pozisyonda tutularak yavaşça döndürülür. Sulu çözelti kabın çeperinde tabakalar halinde donar; bu da suyun buharlaşması için geniş bir yüzey sağlar. Kap daha sonra, bir soğutma ünitesi ve bir vakum pompasından oluşan, liyofilizatöre bağlanır. İşlem sonunda sıvı tamamen uzaklaştırılmışsa, kabın dibinde hafif tüysü toz görünümündeki proteinlerkalır. Bu işlemde çözeltideki tuzlar da konsantre olacağından, daha önce tuzların uzaklaştırılması için diyaliz işlemine gerek duyulabilir.

ÇÖKTÜRME Pb + 2I PbI 2

ÇÖKTÜRME İstenilen ya da istenmeyen moleküllerin çöktürülerek katı halde ayrılması temeline dayanır. Proteinleri çöktürmek için çeşitli maddeler kullanılabilir. Analitik amaçlı çöktürme için trikloroasetik asit (TCA) veya organik çözücüler (aseton, etanol, metanol) kullanılır. Preparatif amaçlı çöktürme için tuzlar (örneğin, amonyum sülfat), organik çözücüler (aseton, etanol, metanol) veya polietilen glikol (PEG) gibi organik polimerler kullanılır.

Trikloroasetik asit (TCA) ile Çöktürme Kuvvetlibir asit olan TCA, proteindekiamino asitlerin yan zincirlerindeki yükleri değiştirerek iç elektrostatik dengeyi bozarak proteinin denatürasyonuna yol açar ve çözünürlüğü azalan denatüre protein çöker. Birçok protein son konsantrasyonu % 5 (hacim/hacim) TCA ilavesiyle çöker. Molekül ağırlığı 20.000 in altında olan proteinler için % 10 civarında TCA eklenmesi gerekebilir. Sıvı faz santrifüjleme ile uzaklaştırılarak çökelti birkaç kez tampon (veya liyofilize edilecekse saf su) ile yıkanır ve az miktarda tamponda (veya saf suda) süspanse edilir.

Organik Çözücüler ile Çöktürme Aseton, etanol, metanol gibi organik çözücüler proteinlerin çözünürlüğünü azaltarak çökmelerine yol açarlar. 10 o C ın üzerinde hızla denatürasyona yol açacaklarından, işlem soğukta (0-4 o C) gerçekleştirilir.

Tuz (Amonyum Sülfat) ile Çöktürme ( Salting Out ) Ortama eklenecek nötral bir tuz, genellikle denatürasyona yol açmadan, proteinlerin agregasyonuna (biraraya gelmelerine) ve çözeltiden ayrılarak çökmelerine yol açar. Farklı proteinler farklı tuz konsantrasyonlarında çökerler. Tuz olarak, etkinliği ve çözünürlüğü yüksek, ph yı fazla etkilemeyen, çözeltide fazla ısınmaya yol açmayan, ucuz ve etkin bir tuz olan amonyum sülfat [(NH 4 ) 2 SO 4 ] kullanılır. Çözeltinin istenilen konsantrasyona ( % doygunluğa ) ulaşması için eklenmesi gereken tuz miktarı hesap yoluyla ya da bu amaçla hazırlanmış bir Tablodan yararlanılarak kolaylıkla bulunabilir. Birçok protein % 55 amonyum sülfat doygunluğundaçöker.

X = 505(S 2 -S 1 ) 1 0.28S 2 X = 1 litreye eklenecek amonyum sülfat miktarı (gram), S 1 = Amonyum sülfatın başlangıç konsantrasyonu (%), S 2 = Amonyum sülfatın başlangıç konsantrasyonu (%)

veya g = 533 ( S 2 S 1 ) 100 0.3S 2 g = 1 litreye eklenecek amonyum sülfat miktarı (gram), S 1 = Amonyum sülfatın başlangıç konsantrasyonu (%), S 2 = Amonyum sülfatın başlangıç konsantrasyonu (%)

Polietilen Glikol (PEG) ile Çöktürme PEG iyonik olmayan ve suda çözünebilen bir polimerdir. % 20-30 PEG konsantrasyonunda maksimum protein çökmesi gerçekleşir.