Ġ.Ü. MÜHENDĠSLĠK FAKÜLTESĠ ÇEVRE MÜHENDĠSLĠĞĠ BÖLÜMÜ Çevre Mikrobiyolojisi Dersi Laboratuvar Uygulama 4 MĠKROORGANĠZMALARIN ASEPTĠK TRANSFERĠ VE ÇĠZGĠ EKĠM 1. ASEPTĠK TEKNĠKLER Mikroorganizmalar, teneffüs ettiğimiz havada, yiyecek ve içeceklerde, etrafımızda, üzerimizde ve hatta içimizde mevcut olduklarından, çalışmalar esnasında, istenmeyen organizmaların kültürümüze karışması için aseptik tekniklerin uygulanması gerekir. Saf kültürlerimizin saf olarak kalması ve kendimizi herhangi bir enfeksiyondan korumamız için aşırı derecede dikkatli olmak zorundayız. İstenmeyen mikroorganizmaların çalışma ortamlarına bulaşmaları genellikle elimizle veya steril olmayan herhangi bir objenin besiyerine veya tüplerin içerisine dokundurulmasıyla olur. Aynı zamanda bakteriler hava içerisinde mevcut olduklarından, hava akımıyla da malzemelerin içerisine girebilirler. İstenmeyen mikroorganizmaları çalışma ortamından uzak tutmak için uygulanması zorunlu metotlar aseptik teknikler olarak adlandırılırlar. Aseptik teknikler kültürümüzü istenmeyen mikroorganizmalardan korumanın yanında, zararlı mikroorganizmaların laboratuvara yayılmasını da önler. Böylece, hem bizim hem de başkalarının tehlikeli olabilecek enfeksiyonlardan korunması sağlanır. Eğer aseptik teknikler kurallarına göre uygulanırsa, büyük tehlikelere yol açabilecek pek çok kaza da önlenmiş olur. Bakterilerle nasıl çalışılacağı doğru bir şekilde öğrenilip uygulanılırsa, kültürlerde sadece arzu edilen mikroorganizmaların büyümesi sağlanmış olur. Sadece arzu edilen organizmayı ihtiva eden bir kültür saf kültür olarak adlandırılır. Bu laboratuvar çalışmanızda saf kültür transferini nasıl yapabileceğinizi öğreneceksiniz. Dolayısıyla kendinizi, saf kültürünüzü, laboratuvarınızı ve aynı yerde çalışan diğer arkadaşlarınızı herhangi bir bakteri kontaminasyonundan korumuş olacaksanız. 7
2.ÇĠZGĠ EKĠM Çizgi ekim, birbiriyle karışmış organizmalardan saf kültür elde edebilmek için steril agar besiyerleri (ör: TSA, BHI, NA gibi) ihtiva eden steril petri kaplarına öze kullanılarak yapılan inokülasyondur. Bu, herhangi bir ortamdaki mikroorganizmaların izolasyonu ve karakterizasyonu için ilk yapılan işlemdir. Karışık mikroorganizmaları ihtiva eden sıvı veya katı kültürlerden itina ile özel bir şekilde petri kaplarına ekim yapılır. Bunun neticesinde tek bir organizma mekanik olarak besiyeri üzerine ekilmiş olur. İnkübasyon neticesinde ekimi yapılmış her bakteriden bir koloni gelişir. Eğer, bir koloni sadece bir tek bakterinin çoğalmasından oluşmuş ise üretilen bu hücre topluluğu saf kültür veya klon olarak bilinir. DENEYLER Deney 1 - Mikroorganizmaların aseptik transferi Materyaller EMB agar LSB İnokülasyon özesi Bek alev, tüplük Gece kültürleri Escherichia coli Metot: 1- Mikroorganizmayı bir tüpten diğer tüpe transfer etmek için, kültür ihtiva eden ve kültürü inoküle edeceğiniz tüpleri teker teker sol eliniz ile tutunuz. Bileğinizi oynatarak tüplerin 45 de olmasını sağlayınız. 2- İnokülasyon özesini sağ elinizle bir kalem gibi tutunuz ve tel kısmı kırmızı oluncaya kadar alevde bekletiniz. (şekil 1) 3- Sol elinizdeki tüpün kapağını sağ elinizle açınız. Bunu sağ elinizin özeyi tutmayan parmakları ile yapınız. Kapağın açık kısımlarına parmağınızı dokunmayınız.(şekil 2) 4- Kapaksız olan bu tüpün ağzını alevin üzerinden birkaç defa geçerek ısıtınız. Tüpleri yaklaşık 45 lik bir açıda tutarak bu işlemi yapınız. 5- İnokülasyon özesini saf kültüre dokundurup geri çekiniz (şekil 3). Bu esnada öze üzerine bulaşmış olan inokülümü (az miktarda bakteri) diğer tüpte bulunan slant besiyeri üzerine zig zag yaparak inoküle ediniz. 6- Tüplerin ağızlarını alev üzerinden birkaç defa geçirerek tekrar ısıtınız ve kapaklarını kapatınız. İnokülasyondan sonra özeyi alevde kızarıncaya kadar tekrar ısıtınız (şekil 1). 8
7- İnoküle ettiğiniz kültürlerin üzerlerine yazmayı unutmayınız. Yazma işlemini cam üzerine yapınız, kapaklara kesinlikle yazmayınız ve tüpleri muhafazalığına yerleştiriniz. 8- Kültürlerinizi eğer özel bir sıcaklık ve süre belirtilmemiş ise her zaman 37 C de 24 saat bekletmeniz (inkübe) en uygundur. 9- Bu süre sonunda kültürleri 4 C de muhafaza ediniz. Not: Tecrübe kazanmak amacıyla sıvı, petri (çizgi ekim tekniğini okuyarak) kültür transferi tekniklerini de yukarıda izah edildiği şekilde tekrarlayınız. Şekil 1 Şekil 2 Şekil 3 Deney 2- Çizgi ekim Materyaller Metot: EMB plakları İnokülasyon özesi, bek alevi Karışık kültür 1- İnokülasyon özesini kızarıncaya kadar ısıtıp, soğutunuz ve kültürden bir öze dolusu transfer ediniz. 2- EMB ihtiva eden petrinin bir kenarını hafifçe kaldırıp, çizgiler çizerek inokülasyon yapınız.(şekil 5a) 3- İnokülasyon özenizi tekrar alevde kızarıncaya kadar ısıtınız ve soğuduktan sonra, birkaç defa çizgiler çizerek seyreltme yapınız. (şekil 5b) 4- İnokülasyon özenizi tekrar alevde kızarıncaya kadar ısıtınız ve soğuduktan sonra, diğer bölümlerden doğru birkaç defa çizgiler çizerek tekrar seyreltme yapınız. (şekil 5c, 5d) Not: Bölgeden bölgeye geçişlerde çizgilerin üst üste gelmemesine özen gösteriniz. 9
6- Çizgi ekimi bittikten sonra, petri kabınızı kapak alta gelecek şekilde 37 C de 24 saat inkübe ediniz. Not: Böylece, İnkübasyon esnasında oluşacak buhar damlacıkları besiyeri üzerine ekilmiş olan bakterilerin bir yerden bir yere sürüklenmesine engel olduğu için, izole edilmiş koloniler düzgün bir çizgi üzerinde oluşmuş olur. Eğer çizgi üzerinde değil de rastgele koloniler oluşmuş ise bu kontaminasyon olduğunu gösterir. Şekil 4. Çizgi ekimde kolonilerin düzgün çizgilerde oluşmaları Şekil 5. Çizgi Ekim esasları 10
UYGULAMA - 4 1. Şekilde gösterilen malzemeleri tanımlayınız. Yaptığınız ekimdeki ayrıntıları yazınız. 2. İnkubasyon sonrasında oluşabilecek koloni tipleri nelerdir? Sizin besiyerinizde üreyen kolonileri tanımlayınız. 11