Op. Dr. Neslihan Yerebasmaz Etlik Zübeyde Hanım Kadın Hastalıkları Eğitim ve Araştırma HastanesiBAŞLIK: 6. günde yapılan elektif embriyo transferleri 5. gün transferlerine kıyasla implantasyonu azaltır. ORJİNAL BAŞLIK: Elective embryo transfers on Day 6 reduce implantation compared with transfers on Day 5. V. Poulsen, H.J. Ingerslev ve K. Kirkegaard GİRİŞ Başarılı bir IVF programı için optimal embriyo kültürü ve laboratuvar işlemleri temeldir. Kültür medyumundaki gelişmeler, kalite kontrolü ve daha iyi inkübatörler üzerinde odaklanma, kademeli olarak insan embriyolarının blastosist evresine kadar uzun süre kültür ortamında kalmasını sağladı (Lane ve Gardner, 2007; Smithet al., 2012a, 2012b). Embriyo transferinin blastosist evresinde (5-6. Gün) ve yarıklanma evresinde (2-3. Gün) yapılmasının klinik sonuçlarını inceleyen Cochrane derlemesinde taze blastosist evresindeki transfer sonuçları taze yarıklanma evresi transferine göre daha yüksek çıkmıştır (Glujovskyet al., 2016). Sonuç olarak, başlangıçta standart prosedür olan 2. Veya 3. gün embriyosu olan yarıklanma evresi embriyo transferinden 5. Veya 6. gün embriyosu olan blastosist evresi transferine doğru kademeli bir kayma olmuştur. Bununla birlikte, 5. gün ve 6. gün embriyo transferinin benzer gebelik oranları getirip getirmediği araştırılmalıdır. Birçok çalışma 5. gün transferi ile karşılaştırıldığında 6. gün transferinin daha düşük implantasyon oranları (IR) ile sonuçlandığını gösterse de bu çalışmalar embriyo gelişimindeki yetersizlik nedeni ile geciktirilen elektif olmayan 6. gün transferleri ile yapılmıştır (Schoolcraftet al., 1999; Khorramet al., 2000; Shapiroet al., 2001; Barrenetxeaet al., 2005; Dessolleet al., 2011). 6. gün taze sikluslardaki transfer, kliniklerde sınırlı çalışma saatleri veya PGS / PGD sonuçlarını beklemek gibi lojistik nedenlerle yapılmaktadır. Bununla birlikte, 6. gün transferinde gözlenen düşük gebelik oranlarını açıklamak için bir alternatif ve makul açıklama embriyo
gelişimi ve stimule endometrium arasındaki asenkronidir ki bu görüş kriyoprezervasyon öncesi gelişim hızından bağımsız olarak, kriyoprezervasyon blastosistlerin kıyaslanabilir gebelik oranları tarafından desteklenmektedir (Sunkaraet al., 2010). Blastosel genişlemesinin implantasyon ile pozitif yönde ilişkili olması gerçeği ile nispeten daha düşük IR düşük kalitede transfer edilen embriyolar ile açıklanmıştır (Alpha Scientists, 2011). Taze siklusta 6. gün transferi hala sistematik olarak kısıtlı çalışma satleri ya da PGS/PGD sonuçlarının beklenmesi gibi bazı nedenlerle yapılmaktadır. 6. gün transferinden sonra görülen düşük gebelik oranlarını açıklayabilecek olası ve alternatif başka bir açıklama embriyo gelişimi ve stimule endometrium arasındaki asenkronizasyondur. Bu görüş kriyoprezervasyon yapılmadan önceki gelişim hızı ne olursa olsun dondurulmuş blastosist transferi sonrası gebelik oranları ile desteklenmektedir (Sunkaraet al., 2010. Eğer bu şekilde ise 6. gün taze transferden kaçınılmalıdır. 6. günden sonraki transferde azalmış gebelik oranlarının esas sorumlusu endometrial asenkroni ise 5. günden sonraki kriyoprezervasyon doğrultunda değiştirilebilecek standart laboratuvar prosedürleri ile 6. gün transferi güçlendirilmesi başarı oranında majör etkiye sahip olabilir. Bunu yapmak için 5. gün ile benzer kaliteye sahip 6 gün embriyolarının transfer sonuçlarının değerlendirilmesi gerekmektedir. Ancak 5. gün ve 6. gün elektif tek blastosist transferini kıyaslayan büyük çalışmalar bulunmamaktadır. Sunulan çalışmanın amacı taze siklusta normal gelişen blastosistlerin 5. gün ya da 6. gün transferlerinin arasında gebelik oranları açısından fark olup olmadığının araştırılmasıdır. MATERYAL ve METHOD Çalışma dizaynı ve katılımcılar
Çalışma retrospektif gözlemsel takip çalışması olarak planlandı. Çalışmanın amacı klinik ilkelere göre yapılan standart bir tedavinin sonuçlarını değerlendirmek olduğundan data toplanması için herhangi bir kurumsal izin alınmadı. Şubat 2011 den ağustos 2015 e kadar 5. ya da 6. gün transfer yapılan infertil hastaların dataları Aarhus Universitesi Hastanesi fertilite kliniğinden retrospektif olarak alındı. Şubat 2011 den Ağustos 2013 e kadar blastosist transferi Merkez Danimarka Bölgesel Komitesi Biyomedikal Araştırma Etiği ve Danimarka Veri Koruma Kurumu tarafından onaylanan bir çalışmanın parçası olarak hastalara önerilmişti (Kirkegaardet al., 2013, 2014; Sundvall et al., 2013). Protokole göre blastosist transferi 6. günde yapıldı. 6. gün pazara denk geldiyse transfer 5. gün blastosist transferi olarak yapıldı. Ağustos 2013 den sonra 6 ve daha fazla oosit toplanan bütün hastalara blastosist transferi önerildi. Rutinde blastosist transferi 5. günde yapıldı. Ancak 5. gün pazara denk gelen hastalara transfer 6. güne geciktirildi. Böylece hastalara haftanın günlerindeki şanslarına göre 5. ya da 6. gün transferi yapıldı. Datalar 38 yaşından küçük, 8 den fazla oosit toplanan ve endometriozis tanısı almayan hastalardan alındı. Dahası data analizi tek embriyo transferi ile sınırlandı. Hastalar çalışmaya sadece tek siklus sonuçları ile dahil edildi. Preimplantasyon genetik tanı yapılan ve gecikmiş gelişime bağlı elektif olmayan 6. gün transferleri çalışmadan dışlandı. Hastaların yaş, BMI; kümülatif FSH dozu, dondurulan embriyo sayısı tedavi sikluslarının analizinden elde edildi. İnfertilite sebepleri kadın, erkek ve açıklanamayan infertilite olarak kategorize edildi. Elektif 5. gün tek transfer yapılan 336 ve elektif 6. Gün embriyo transferi yapılan 269 olguya ulaşıldı. Klinik sonuçlardaki eksik datalar sebebi ile 3 hasta çalışma dışı bırakıldı: 334 elektif 5. Gün tek transfer ve 268 elektif 6. gün transfer datası analiz edildi. Ovaryan Stimulasyon, Oosit Toplanması, Ivf Ve Embriyo Kültürü
Hastalarda ovaryan stimulasyon klinik guidlinelar doğrultusunda uriner veya recombinant FSH kullanılarak uzun down regülasyon ya da kısa antagonist protokol kullanılarak yapıldı (Kirkegaardet al. 2012) FSH dozları her hastanın ovaryan cevabına göre bireyselleştiridi. En az 3 follikul 17 mm ve üzerinde ölçüldüğünde 10000 IU hcg yapıldı ve 36 saat sonra ultrasonografi eşliğinde oosit toplandı. Inseminasyon tedavi endikasyonlarına göre standart IVF ya da ICSI ile yapıldı. Bütün embriyolar ardışık kültür medyumlarında 37 C, 5% O2 ve 6% CO2 ortamında kültür edildi (Sydney IVF Fertilization/Cleavage/Blastocyst Medium, COOK, Sydney, Australia). Embriyo Transfer Blastosistler, blastosel kavitesindeki genişlemeye göre (1-6), iç hücre kütlesinin (ICM) ve trofoektodermin TE) sayı ve yapışıklığına göre (A-C) olarak Gardner kriterlerine göre derecelendirildi (Gardneret al., 2004). Transfer için 5. ya da 6. günde bu kriterlere göre en yüksek skora sahip embriyo seçildi. Bu çalışmanın amacına göre 5. gün blastosistleri düşük (BS 1, 2 ve <3BB), orta ( 3BB/AB/BA) veya yüksek kalite ( 3AA) olarak gruplandırıldı. Aynı şekilde 6. gün blastosistleri düşük (BS 1, 2 ve <4BB), orta ( 4BB/AB/BA) veya yüksek kalite ( 4AA) olarak gruplandırıldı. Oosit toplanmasından sonraki 16. günde serum β-hcg ölçümü ile biyokimyasal gebelik doğrulandı. Embriyo transferinden sonraki 5. haftada ultrasonografi ile fetal kalp atımının saptanması klinik gebelik olarak kabul edildi. Örneklem Büyüklüğü Hesabı Ve İstatistiksel Analiz Tek embriyo transferinin alındığı çalışmada başlıca sonuç klinik gebelik idi ki bu çalışmada IR ile aynı bulunmuştur.5. gün ve 6. gün transferini kıyaslayan bir çalışmada 6. günde yapılan transferde IR oranının %40 dan %20 e düştüğü bildirilmiştir (Dessolleet al., 2011). Post hoc power analizinde IR de %40 dan %20 ye azalma bulunması için anlamlılık düzeyi 0.05 ve 80
gücünde her 2 grupta 91 embriyoya ihtiyaç olduğu belirlendi. Primer sonuçları etkileyebilecek karıştırıcıları açığa çıkarmak için Tek değişkenli logistik regresyon analizi yapılmıştır. P değeri <0.1 olan faktörler transfer gününün klinik gebelik oranına etkisini araştırmak için çok değişkenli logistik regresyon analizinde değerlendirildi. Bütün istatistiksel analizler STATA istatistik programında yapıldı, Mac, version 14.0 (StataCorp, USA). p<0.05 değeri anlamlı kabul edildi. SONUÇLAR Data analizi için elektif 5. gün tek blastosist transferi yapılan 334 hasta ve elektif 6. gün tek blastosist transferi yapılan 268 hasta incelendi. Beklendiği gibi 6. gün transferi yapılan hastalar ilk dönemde transfer yapılanların 6/7 i iken ikinci dönemde toplam transferlerin 1/7 i idi. Tersine 5. gün transferleri ise ilk dönemdeki transferlerin yaklaşık 1/7 i, son dönemde ise 6/7 i idi, bu da transfer gününün beklenildiği gibi haftanın gününe göre tesadüfen ayrıldığını düşündürmektedir. Gruplar arasında yaş, BMI, toplam FSH dozu, toplanan oosit sayısı ve fertilizasyon metodları açısından fark bulunmadı. 5. gün transfer grubundaki hastalar 6. gün transfer grubuna göre sıklıkla ilk tedavi sikluslarındaydılar. Gruplar arasında transfer günü embriyo skorları ve siklus sonuçları açısından anlamlı fark vardı. 6. gün hastalarının embriyolarından beklenildiği gibi bu grupta 5. gün embriyoları ile kıyaslandığında anlamlı derecede yüksek ekspansiyon saptandı (3.7±0.67 vs. 5.0±0.80) ki bu grup 24 saat fazladan inkubasyonda kaldı. Beklenmedik şekilde 6. gün embriyolarının olduğu grupta 5. gün embriyolarının olduğu gruba kıyasla ICM (7.1 vs. 1.0%) ve TE (8.6 vs. 0.65%) C skoru anlamlı olarak daha yüksek bulundu. Tersine, 5. gün embriyoları olan hastalarda ICM (76.8 vs. 59.0%) ve TE (71.6 vs. 62.0%) A skorları 6. gün embriyoları olanlardan anlamlı şekilde yüksek bulundu. Siklus
sonucu olarak 5. gün grubundaki hastalarda 6. gün grubuna kıyasla anlamlı olarak daha iyi klinik sonuçlar elde edildi: daha fazla embriyo donduruldu, biokimyasal ve klinik gebelik oranları daha yüksek idi. Tek değişkenli logistik regresyon analizine göre maternal yaş, BMI, toplam FSH dozu, dondurulan embriyo sayısı, 5. gün ve transfer günü blastosist kalitesi (BQ) klinik gebelik için prediktörler olarak bulundu. 5. gün ve transfer günündeki BQ bağımlı değişken olarak bulundu, bu nedenle sadece transfer günündeki BQ çoklu değişken analizi için seçildi. 5. gün ve 6. gün grupları arasında düzeltilmemiş odds oranı 0.35 (0.25 0.49) idi. Yaş, BMI, toplam FSH dozu, dondurulmuş embriyo sayısı, transfer günü BQ a göre düzeltilme sonrası yapılan çoklu değişken logistik regresyon analizi sonrası sadece transfer günü anlamlı olarak kaldı. Ayrıca, 6. gün transferinde implantasyonun düzeltilmiş odds oranı 5. gün transferine göre anlamlı olarak düşük bulundu (OR 0.34; 95% CI 0.22 0.52). TARTIŞMA Sunulan çalışma normal, tek gelişen blastosistin 5. gün ya da 6. gün transferinde implantasyon şansının blastosist transferi 6. güne geciktirilirse 1/3 oranında azalacağını güçlü şekilde önermektedir. Çalışmada 6. gün transferinde azalmış IR i açıklayacak özel bir sebep bulunamamasına rağmen bu azalma nedeni ile 6. gün taze transfer yapmak yerine 5. günden sonra kriyoprezervasyonun düşünülmesi açısından klinik ile ilgilidir. Normal gelişen embriyolarda birçok klinik çalışma saatleri, PGS/PGD sonuçlarının kliniğe ulaşma vakti gibi lojistik sebeplerden dolayı 6. gün transferini tercih etse de gebelik sonuçlarının artırılması açısından sistematik kriyoprezervasyonun lehine stratejilerin değiştirilmesi daha iyi olacaktır. Önceki çalışmalarda normal gelişen blastosistlerde 5. gün transferi ile gecikmiş gelişmeye bağlı geciktirilmiş 6. gün transferi kıyaslandığında 5. gün transferlerinde yüksek IR bildirilmiştir (Khorramet al.,2000; Shapiroet al., 2001; Barrenetxeaet al., 2005). Bu
çalışmalarda 6. günden sonraki transferlerde düşük IR gözlenmesi yetersiz embriyo kalitesi ile açıklanmış, gelişiminde yavaşlama olan embriyolarda kromozomal anormallikler bildirilmiştir (Taylor et al., 2014). Ne olursa olsun normal gelişen blastosist ve gecikmiş gelişmesi olan blastosistlerin klinik sonuçları kıyaslandığında birçok karıştırıcı faktorün gruplar arasında farklı olduğu görülmektedir. Özellikle 6. günde potansiyel olarak daha az reseptif olan endometriumun katkısı değerlendirilmemiştir. Bu çalışmada transferin 5. ya da 6 günde yapılması tamamen lojistik duruma göre kararlaştırılmıştır. Tasarım gereği her 2 gruptaki hastalar arasındaki major değişkenler uzamış kültür ve endometrial resptivitedir. Bizim sonuçlarımız açıkça göstermiştir ki 5. gün blastosist transfer şansına sahip hastalarda 6. gün blastosist transferine göre anlamlı ve klinik olarak yüksek gebelik şansı olmaktadır. Tersine elektif 6. gün transferi sonuçları ile ilgili çok az data vardır. Elgindy ve Elsedeek (2012) bizimkine benzer çalışma dizaynı ile soruyu değerlendirmişler (Elgindy and Elsedeek, 2012). Genişlemiş blastosistler 5. gün ve 6. gün transferi olarak ayrılmış, ayrıca 3. grup olarak gecikmiş genişlemesi olan grup 6. gün transferi olarak planlanmış. Bizim çalışmamızın tersine IR normal gelişen blastosist transferi yapılan 2 grupta da benzer bulunmuş: 5. gün transferinde 174 hasta, %40, 6. gün transferinde 25 vaka, %40. Bu sonuçlarla yazarlar elektif 5. gün ve 6. gün transferlerinin sonuçlarının aynı olduğunu belirtmişler. Ancak 2. gruptaki hasta sayısının az olması çalışmanın bu sonuca ulaşmak için yeterli güçte olmadığını göstermektedir. Çalışmamız, azalmış implantasyon potansiyelinin uzun süreli kültürden mi, yoksa endometrial reseptivitenin azalmasından kaynaklanıp kaynaklanmadığına karar vermemize izin vermese de, dondurulmuş blastosistler üzerine yapılan çalışmalar, embriyo-endometriyum etkileşiminden büyük bir katkı olduğunu düşündürmektedir. Bu çalışmalar, bir sonraki siklusta 5. günde ve 6. günde genişleyen ve dondurulan blastokistlerin kullanımı ile benzer gebelik oranlarını rapor etmiştir; (Behret al., 2002; Richteret al., 2006), IR için transfer
gününün ekspansiyongününden daha önemli olduğunu bildirmişlerdir. Dondurulmuş blastosistlerle ilgili yapılan büyük bir metaanalizde 6. gün transferindeki düşük IR sonuçlarından embriyonun kalite düşüklüğü değil azalmış endometrial reseptvite sorumlu tutulmuştur (Sunkaraet al., 2010). Diğer yandan azalmış IR e katkıda bulunan genişletilmiş kültürün normal gelişen embriyo üzerine negatif etkisinin olduğunu dışlayamadık. Klinik sonuçları ile ilişki primer olarak 5. gün datalarından değerlendirilmesine rağmen genişleme derecesi ile TE ve ICM skorları implantasyon için önemli prediktörlerdir (Kovacicet al., 2004; Ahlstrom et al., 2011; Alpha Scientists, 2011; Basileet al., 2015). Açıkcası, 24 saat daha uzun inkube edilen 6.gün embriyoları için genişleme derecesi doğrudan 5. gün ve 6. gün embriyoları kıyaslanarak yapılamaz. Bununla birlikte, 6. günde yüksek bir kalite puanı elde etmek için embriyoları yüksek, orta ve düşük kalitede kategorize ederken (4'e 3'e karşı daha yüksek derecede) inkubasyon süresinin uzatılması gerekebilir. Her şeye rağmen tek değişkenli lojistik regresyon analizinde 5.gün grubunda 6. gün grubundaki embriyolara kıyasla anlamlı olarak yüksek oranda kaliteli embriyo artaya çıktı. 5. gün embriyoları için tariflenen kalite ve implantasyon ile ilgili morfoloji skorları her ne kadar 6. gün embriyoları için de kullanılsa bile embriyolar kültür koşulları altında blastosist aşamasına ulaştıktan sonra transfer edilmezse kültür ortamında in vitro şartlarda daha az gelişirler (Levenset al., 2008; Shahbazi et al., 2016). Biz bu nedenle her 2 grupta da 5. gün blastosist skorlarını kıyasladık. 5. günde gruplar arasında kesin genişleme skoru ve TE ve ICM açısından önemli fark varken ortalama genişleme derecesinde fark bulunmamıştır. 5. gün ve 6. gün embriyo skorları EmbriyoViewer ile elde edilmiş olup embriyolar transfer öncesine kadar inkübatörden çıkarılmadı. Transfer günü skorlama standart ışık mikroskobu altında yapıldı. Ayrıca embriyolar transfer günü skorlarına göre seçildi. Son olarak, 6. gün transferleri çoğunlukla esas olarak blastosist transferlerinin sadece bir çalışmanın parçası olarak sunulduğu ve seçim biasına neden olabilecek şekilde ilk dönemde gerçekleştirildi.
Periyodlara göre yapılan gebelik oranları analizinde 5. gün ve 6. gün transferlerinde benzer gebelik oranları bu potansiyel biasın minör etkisinin olduğunu önermektedir. Bununla birlikte, bulguların gerçek bir farkı temsil ettiğini varsayarsak, 5. günün transferini lehine olan sonuçlar önyargı şeklindedir. Önemlisi, transfer gününde BQ da dahil olmak üzere potansiyel karışıklıkları düzeltirken, transfer gününün klinik sonuç üzerindeki etkisi çok anlamlı kalmıştır. Yukarıda bahsedilen parametrelerin yanı sıra, temel verilerdeki tek fark, 5. günde transfer yapılan kadınlarla karşılaştırıldığında, 6. gün transferi yapılanlarda önceki siklus sayılarının daha yüksek olmasıydı. Tek değişkenli lojistik regresyon analizinde farkın klinik gebelik oranıyla ilişkili olmadığını bulduk ki bu da iki grubun karşılaştırılabilir olduğunu ortaya çıkardı. Bu çalışmada hasta seçimi, laboratuvar metodları, blastosist transfer ortamı ve metodları data topplandığı sürede aynı iken varsayılan transfer günleri iki periyodda farklı idi. 2011 den 2013 e kadar tercih edilen 6. gün transferi idi, 5. gün transferi sadece 6. gün pazara geldiğinde yapılıyordu. Sonradan 2013 den 2015 e kadar tercih edilen transfer günü 5. gün oldu. 6. gün transferi sadece 5. gün pazara geldiği zaman yapıldı. Yapılan tabakalı subanalizde bu iki periyodda 6. gün ya da 5. gün transferlerinin IR arasında fark bulunamadı. Bu nedenle bu farkların datada minor varyasyona neden olacağı sonucuna vardık. İmplantasyon için olasılık kesinlikle 6. günde normal gelişen blastosist transferinde 5. güne kıyasla daha düşük bulundu. Örneklem büyüklüğünü yansıtan geniş CI, çok değişkenli logistic regresyon analizinde gücü arttırıyor, düzeltilmiş OR değerinin büyüklüğüne göre gerçek bir fark olduğunu gösteriyor. Tasarlanmış randomize bir çalışmaya kesin sonuç elde etmek için ihtiyaç duyulsa da klinik olarak sonuçlardaki önemli azalma ile ilgili bulgular 5. gün ve 6. gün transferi arasında sıkı randomizasyon kabulünü etik açıdan zorlaştırabilir.
Sonuç olarak bizim çalışmamız elektif blastosist transferinin 6. günde yapılmasının anlamlı olarak 5. günde yapılana kıyasla daha düşük IR ile seyrettiğini gösterdi. biz normal gelişen blastosistin 5. günde tranfer edilmesini güçlü bir şekilde öneriyoruz. Eğer 5. günde transfer lojistik olarak mümkün değilse kriyoprezervasyon ve sonrasında doğal ya da artifisyal siklusta transfer tercih edilebilir.