Anaerop bakterilerin Matrix Matrix--Assisted Laser Desorption IonizationIonization- Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI Spectrometry (MALDI--TOF) yöntemiyle tanımlanmaları Işın Akyar1, Görkem Yaman1, Serpil Ercis2, Simge Can2 1Acıbadem Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul 2Acıbadem Labmed Klinik Laboratuvarları, İstanbul

Amaç Matriks aracılı lazer dezorpsiyon iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI TOFTOF-MS) bakteri ve mayaların hızlı tanımlanmasında yaygın bir şekilde kullanılmaya başlanmıştır.

1960 lı yılların başlarında 1960 gösterilmiştir. Bu da laser desorption (LD) (LD) ionisation ionisation(lazer (lazer salınımına bağlı iyonizasyon iyonizasyon)) yöntemlerinin kaynağı olmuştur.

Daha sonraki yıllarda, yöntem uçucu olmayan biyopolimerler ve organik makromoleküllerin uçuşunu sağlayacak şekilde geliştirilmiştir. LD nin gerçekten başarılı olması TOF kütle analizörleri LD ile birlikte olması ile sağlanmıştır.

1987 yılında, Michael Karas and Franz Hillenkamp matrix kullanımını devreye sokarak kütle kısıtlamasından kurtulmuşlardır. Bu matriksle birlikte incelenecek olan analit bir prob ya da metal plak üzerinde karıştırıldıktan sonra lazer ışınları atışı uygulanır.

Her bir lazer atımında hemen hemen tam olarak iyonların patlaması sağlanır, böylelikle atımdan atıma verimliliği arttırır. Matrix atrix--assisted laser desorption/ionization (MALDI) (MALDI) bu şekilde bulunmuştur. bulunmuştur.

Daha sonra Koichi Tanaka Tanaka nın yaptığı çalışmalarla biyolojik makromoleküllere de MALDI uygulanabildi. Bu da onun John Fenn ile birlikte 2002 yılında Nobel ödülü kazanmasını sağladı.

MALDI nin mekanizması üç basit basamaktan ibarettir: MALDI 1. Uygun bir solüsyon oluşturmak: oluşturmak: Matriksin birbirinden tümüyle ayrılmış analit moleküllerine erişebilmesi için gereklidir. Bu durum analitin stabil olarak ışınlanması için gerekli olan homojen solüsyonun oluşmasını kolaylaştırmaktadır.

2. Matrix Uyarımı Uyarımı:: Lazer ışını matriksmatriks-analit solüsyonu üzerine odaklanır. Lazer sıklığı ile birlikte matriks hızlı titreşimli uyarılara yol açarak katı solüsyonun parçalanmasına yol açar. Yüzeyden fışkıran demetler içersinde matriks ve tuz iyonlarıyla çevrelenmiş analit moleküllerini içerirler. Matriks molekülleri demetlerden uçarak analiti serbest olarak gaz fazında bırakırlar.

3. Anal Analiit İy İyoni onizzasyonu syonu:: Işıkla uyarılmış matriks molekülleri proton transferi yolu ile analite doğru stabilize olurlar. Bu işlem sırasında analite katyon tutunması da desteklenmektedir. Tipik [M+X]+ (X= H, Na, K etc.) anali analit iy iyon onları ları oluşmaktadır. Bu iyonizasyon reaksiyonları yüzeyin hemen üzerinde parçalanmış matriks--analit reaksiyon bulutunda gerçekleşmektedir. matriks Oluşan iyonlar incelenmesi için kütle spektrometrisine gönderilmektedir.

Anaerop bakterilerin tanımlanmasında MALDI TOFTOF-MS Anaerop bakteri türlerinin tanımlanmaları rutin laboratuvar işlemleri sırasında zor olabilmekte ve uzun sürebilmektedir. Bu çalışmanın amacı, anaerop bakterilerin MALDI TOFTOF-MS yöntemiyle kısa sürede, kolayca ve güvenilir bir şekilde tanımlanmalarının değerlendirilmesidir.

Maldi--tof MS çalışma yöntemi: Maldi MALDI-TOF MS MALDIMS de çalışılan izolat formik asit ekstraksiyon yöntemi ile polish target olarak adlandırılan metal bir plak üzerine : 300 ul steril distile su içine bakteri kolonisi Üzerine 900 ul etanol Eklenir vortekslenir Santrijüj edilir süpernatan atılır, işlem bir kez daha tekrarlanır. 50 ul %70 formik asit solüsyonu pellet üzerine eklenir. 50 ul asetonitril eklenir karıştırılır. Santrifüjlendikten sonra süpernatandan 1ul polish target üzerine konur.

Üzerine 2ul bir matriks solüsyonu eklenerek havada kurutulur. Matriks içerisinde :alfa siyano 4 hidroksi sinnamic acid(hcca) ve solvent olarak da trifluoroasetik asit(tfa) ve asetonitril(acn) bulunmaktadır. Daha sonra polish target cihaza yüklenir. Cihaz içerisinde lazer ışını verilerek izolat iyonize moleküller haline dönüşür. Uçuşan moleküller bir detektör yardımı ile toplanır. Genellikle, tek yükü olan yalnızca tek bir iyonize tür oluşur ve Biotyper Biotyper ile mikroorganizma tiplendirmeleri yapılır. İşlem ortalama 1313-15 dk içerisinde gerçekleşmekte ve otomatize sistemlerle mikroorganizma tanımlanmasına göre çok daha kısa sürede ve doğru bir şekilde sonuçlanır.

Kısaca: İzolatlar metal bir plak üzerine kürdanla sürülür, matriks solüsyonu ile birlikte havada kurutulur. Aygıt içine yerleştirilip lazer ışınları ile vuruşlar yapıldıktan sonra, matriks ışığı emerek ilgilenilen molekül(proteinler) haline dönüştürür. Genellikle, tek yükü olan yalnızca tek bir iyonize tür oluşur ve Biotyper Biotyper ile mikroorganizma tür tanımlamaları yapılır.

Gereç ve yöntem Bu çalışmada Schaedler Agar Agar da üremiş ve aerotolerans ile anaerop bakteri oldukları kanıtlanmış olan bakterilerin tanımlamalarında kütle spektrometrisi yöntemine dayanan MALDIMALDI-TOF MS yöntemi kullanılmıştır.

Çalışmamıza Şubat 20112011-Eylül 2011 arasında kurumumuza başvuran 215 hastadan istenen anaerop kültür örnekleri dahil edilmiştir. Bu örnekler çalışılmadan önce: Rutin kalite kontrol çalışması Bacteroides fragilis ATCC 25285 referans suşu Dış kalite kontrol örneği (Finegoldia (Finegoldia magna) magna) çalışılmıştır.

Schaedler Agar Agar da anaerop olduğunu düşünülerek aerotolerans çalışılan ve anaerop olduğu kesinlik kazanan bakteriler VITEK 2 (Biomerieux, Fransa) otomatize sistemi ve MALDIMALDI-TOF yöntemi ile tanımlanmıştır.

Bu örneklerde VITEKVITEK-2 ve MALDIMALDITOF yöntemleriyle 20 anaerop bakteri saptanmıştır.

Bölüm Sayı Genel Cerrahi 6 Acil 4 Beyin Cerrahi 2 Örnek türü Sayı Püy 12 Kan 3 2 Biyolojik sıvı 2 Kardiyovasküler Cerrahi 1 Ameliyat materyali 1 Kulak Burun Boğaz 1 Bronkoalveoler lavaj 1 Onkoloji 1 Kateter ucu 1 Göz 1 Göğüs Hastalıkları 2 İç Hastalıkları

Tanımlanan Anaerop Bakteri Sayı Bacteroides fragilis 11 Gemella morbillorum 3 Actinomyces spp. 3 Fusobacterium necrophorum 1 Prevotella spp. 1 Peptostreptococcus anaerobius 1

Örneklerin %60 %60 ını oluşturan püy örneklerinde en çok üreyen anaerop bakteri ise %58 ile Bacteroides fragilis olmuştur.

MALDI-TOF sonuçları VITEK 2 otomatize sistemi ile % MALDI100 uyumlu sonuçlar vermiş, referans suş ve dış kalite kontrol örneklerinde de doğru okuma sağlamıştır. Çalışma 20 hasta örneği ve kalite kontrollerle yapılmıştır. Daha güvenilir bir istatistik için çalışılan örnek sayısının arttırılması gerekmektedir. Bu nedenle bu çalışma bir ön hazırlık çalışması olarak kabul edilmelidir.

Bacteroides fragilis

Sonuç Anaerop bakterilerin tanımlanmasında MALDI--TOF MS yöntemi ile VITEK 2 otomatize MALDI sistemi kıyaslanarak MALDIMALDI-TOF MS yönteminin kısa sürede ve doğru sonuç veren maliyet--etkin bir yöntem olduğu gösterilmiştir. maliyet Daha fazla çalışma yapılarak daha geniş bilgi edinilmesi gerekmektedir.

Teşekkürler