PARAZİTOLOJİDE TANI YÖNTEMLERİ
Güvenlik: Dışkı Örneklerİnde Parazİtolojİk Tanı Dışkı örneği ile çalışan laboratuvarlarda potansiyel olarak bulunan tehlikeler şunlardır. Parazit yumurtası veya kistleri (cysts) yutmak, Enfektif larvaların deriden geçişi yada dışkıdaki veya diğer biyolojik sıvılardaki paraziter olmayan enfeksiyöz ajanlarca enfekte olmak. Bu riskin oranı genel laboratuvar temizlik ve çalışma şartları uygulanarak azaltılabilir.
Laboratuvarda çalışırken dikkat edilmesi gereken genel kuralları şu şekilde sıralayabiliriz. 1-Laboratuarda örnek incelerken (çalışırken) laboratuvar önlüğü ve lastik
2-Gerekli durumlarda biyolojik güvenlik kabini kullanılmalı (filtreli özel kabinler).
3-Çalışma ortamında yiyecek yenmemeli, sigara, çay v.b. şeyler içilmemeli, makyaj yapılmamalı, kontak lens takma-çıkarma-düzeltme yapılmamalıdır. 4- Çalışma sahası daima temiz ve düzenli tutulmalıdır. Akan, dökülen yada etrafa sıçrayan her türlü örnek yada maddeler hemen temizlenmelidir. Saha günde bir kez dekontaminasyon (bulaşıklardan uzaklaştırma-
5-Ellerde bulunan kesik, yırtık v.b. yaralar ve ezikler yara bandı veya pansuman malzemeleri ile kapatılmalıdır. 6-Eğer keskin maddeler (bistüri ucu, iğne v.b.) kullanılmış ise bunlar hemen özel atık kutularına yerleştirilmelidir. Ortada bırakmak yada normal çöp kovalarına atmak sakıncalıdır.
7-Eldivenler çıkartılıp uygun biyolojik atık çöp kutularına atılır. Eller temizce yıkanır.
Bu güvenlik kuralları mutlaka uygulanmalıdır. Hatta dışkı örneği belli fiksatifler (tespit ediciler) ve fiksatifler (koruyucular) içinde dahi olsa yukarda ki işlemler yapılmalıdır. Örneğin formalin (formaldehit) içerisinde tespit edilmiş dışkıdaki bazı kalın kabuklu parazit yumurtalarının, kistlerin (cysts) yada oocystslerin (ookists) ölmesi için günlerhaftalar gerekebilir. Ascaris lumbricoides in yumurtası formalin içerisinde gelişmesine devam edebilir ve
DIşkI Örneğİ Toplama: 1.Dışkı kuru ve sızdırmaz kaplar içerisine toplanmalıdır. Bu sırada diğer maddeler (idrar, toprak, saman v.s.) ile kontaminasyonu (bulaşması) engellenmelidir.
2.Dışkının kıvamı içeriği hakkında bilgi verebilir. Şekilli dışkıda parazitlerin daha çok kistik (cysts) formları bulunurken, sıvı (sulu) dışkı kıvamına doğru gidildikçe kistik form azalır ancak trofozoid formları daha çok görülür. İncelemeye başlarken bu durum unutulmamalıdır.
3.Taze dışkı ya hemen incelenmeli yada daha sonra incelenecekse zaman geçirmeden fiksatifler (koruyucular) içerisine konulmalıdır. Eğer fiksatifler hemen kullanılamıyorsa buzdolabında kısa süreli saklama yapılabilir. Ancak bu dışkı sadece antijen testleri için uygun olacaktır.
4.Örnekler mümkün olan en kısa sürede fiksatiflere konulmalıdır. Eğer ticari bir fiksatif kullanılıyor ise bu ürünün kullanım bilgilerine uyulmalıdır. Eğer ticari koruyucular kullanılmıyor ise; örnekler ikiye ayrılmalı ve uygun kaplarda iki ayrı fiksatifl içerisine konulmalıdır. Örneğin: % 10 luk formalin ve PVA (polivinil alkol) kullanılabilir. Bir hacim dışkı üç hacim fiksatif ile karıştırılmalıdır.
5.Toplanan örneğin fiksatifle tam olarak karıştığından emin olunmalıdır. Şekilli dışkılarında iyice dağılıp, parçalandığından emin olunmalıdır. 6. Örnek konulan kapların iyice kapatıldığından emin olunmalıdır. Kapaklar parafilm yada benzeri maddeler ile yeniden sarılmalı ve kaplar plastik torbalara konulmalıdır.
7. Belli ilaçlar dışkı içeriğini değiştirebilir. Bu durumdaki dışkılar muayene için alınmamalıdır. Örnek, herhangi bir ilaç veya madde verilmeden önce alınmalıdır. Yada örnek ilaç etkisi geçtikten sonra toplanabilir. Bu ilaçlara; antiacid, kaolin, mineral yağ veya diğer yağlı maddeler, emilmeyen anti-diyare preperatları, baryum yada bizmut (7-10 gün beklenmeli atılmaları için), antimikrobiyal ilaçlar (2-3 hafta) ve safra kesesi boyaları (3
8.Eğer ilk incelemede sonuç negatif çıkarsa örnek alınması tekrarlanabilir. Mümkünse en az üç örnek üst üste günlerde veya 2-3 gün ara ile alınıp incelenmelidir.
Örneklerİn İncelenmesİ: Dışkı örnekleri taze olarak yada fiksatiflerde korunmuş olarak incelenebilir.
Taze dışkının incelenmesi: Taze dışkı incelemesi hareketli trophozoitlerin görülebilmesi açısından gereklidir. Ancak bu örnek toplandıktan sonraki ilk yarım saat (30 dakika) içerisinde incelenmelidir. Sıvı (ishal-diyare-diarhoic) dışkılar daha fazla trophozoit içerirler. Yumuşak kıvamlı dışkılar hem cysts hemde trophozoit formlarını barındırabilmektedir. Bu nedenle ilk bir saat içerisinde
Daha kıvamlı (şekilli) dışkılar da trophozoit bulunma oranı çok azdır. Bu durumdaki örnekler bir süre saklanabilirler. Eğer gerekirse buzdolabında korunabilirler. Parazitolojik muayenelerde kullanılacak dışkılar kesinlikle dondurulmazlar. Dondurulan dışkılardaki parazit yumurta ve oocystsleri parçalanırlar.
Dışkının parazitolojik yönden incelenmesi denince akla serum fizyolojikle dışkının lam üzerinde emülsiye edilmesi ve 100 ve 400' lük büyütmelerle incelenmesi gelir.
Oysa doğrudan taze bakı tek başına (hele organizma sayısı az olduğunda) kesinlikle yetersiz olup; bu yöntem ile parazit görülememesi durumunda Geçici boyama, Konsantrasyon yöntemleri, Kalıcı boyama, Selofan band ya da Non-mikroskobik yöntemlerin bir ya da birkaçı bir arada uygulanmalıdır.
fiksatifli Dışkının İncelenmesi: Dışkı inceleme hemen veya yapılması gereken süreler içerisinde yapılamayacaksa, örneği fiksatiflerde saklamak gerekir. Protozoa trofozoitleri genellikle sıvı ve diareli dışkılarda bulunur; bu tür dışkılar dışkılamadan sonraki ilk 30 dakika içinde incelenmelidir, şekilli dışkılar alındıkları gün içinde incelenmelidir; bu olanaklı değilse, bir sonraki güne kadar bir fiksatifin içinde ya da dışkı kabının kapağı iyice kapatılarak buzdolabında (3-5 ºC) saklanabilir. Fiksasyonda genellikle
Formalİnde Tespİtlİ Örnekler: Örnekler direk olarak incelemeye alınabilirler yada yoğunlaştırma (konsantre etme) işlemi yapılarak daha sonraki testlerde kullanıma hazır hale getirilebilir.
PVA DA TESPİTLİ ÖRNEKLER PVA' nın en büyük avantajı, boyama için hazırlanacak yaymaların istendiğinde hazırlanabilmesidir. Dışkı örnekleri PVA içeren sıkı kapaklı küçük şişelerde saklanabilir, ayrıca bir lam üstünde bir pirinç büyüklüğündeki dışkıyı birkaç damla PVA ile karıştırıp doğrudan tespit etmekte olanaklıdır.
Mİf ve saf İle tespit edilmiş örnekler MİF dışkı örnekleri için hem koruyucu hemde boya işlevi görür.; özellikle alan çalışmalarında yararlıdır. SAF fiksasyonunun avantajı hem çoklaştırma, hemde kalıcı boya yöntemlerinin uygulanabilmesidir.
Yoğunlaştırma İşlemlerİ: Bu işlem parazit veya yumurtalarını dışkıdan ayırma işlemleridir. Böylece az sayıda bulunan paraziter durumları da teşhis etme şansı artmış olur. Sedimentasyon (çöktürme) ve Flotasyon (yüzdürme) yöntemleri olarak iki kısma ayrılır.
sedimentasyon (Sedimentation) tekniği: Çöktürme işleminde spesifik gravitesi (özgül yoğunluğu) paraziter organizmalardan daha düşük olan solusyonlar kullanılır. Böylece bu organizmalar sedimentin içerisinde yoğunlaştırılmış olurlar. Sedimentasyon tekniği genelde çok kullanılır çünkü kullanımı ve hazırlanışı kolaydır ve teknik hata yapma ihtimali çok azdır. Formalin-etil asetat (formalin- ethyl acetate) ile çöktürme işlemi çok kullanılan bir yöntemdir.
flotasyon (Flotation) tekniği: Bu yöntemde genellikle sofra tuzu (NaCl), şeker yada çinko sülfat (zinc sulfate) solusyonları kullanılır. Bu sıvılar organizmadan daha yüksek spesifik graviteye (özgül yoğunluğu) sahip oldukları için paraziter yapılar yüzüp yukarı çıkarken çoğu dışkı kalıntıları dibe çöker. Bu işlemin asıl avantajı sedimentasyon tekniğine göre daha temiz inceleme maddesi elde edilir.
KalIcI boyali yaymalarin hazirlanişi: Her dışkı örneğinde hazırlanması önerilen kalıcı boyalı yaymaların, Organizmaların morfolojik yapılarının immersiyon objektifi ile ayrıntılı olarak izlelenebilmesi, Seyrek rastlanmaları ya da küçük olmaları nedeni ile gözden kaçabilen parazitlerin daha kolay saptanabilmesi, İncelemenin ertelenebilmesi,
En yaygın kullanılanları Trikrom Demir hemotoksilen boyalarıdır. Demir hematoksilene oranla daha kolay ve daha az zaman alıcı olan
Ancak bu kalıcı boyalar Cryptosporidium enfeksiyonların tanısında değer taşımazlar; bu enfeksiyonun tanısında çeşitli acidfast boyaları yararlı bulunmuştur. En sık kullanılanlardan
Diğer yöntemler: Yumurtaları genellikle dışkıda görülmeyen Enterobius vermicularis' in tanısında kullanılan selofan band yöntemi tuvalet ya da banyodan önce uygulanmalı; hastanın enfekte olmadığını söyleyebilmek için en az 3-4 gün arka arkaya yinelenmelidir. Giardia ve Strongyloides gibi duodenum yakınına tutunan parazitler için duodenal aspirat incelemesi daha iyi sonuç verebilir;
Basİt Yayma Preperat HazIrlanmasI: Bu işlem öncesinde mikroskoplarda kalibrasyon işleminin yapılmış olması tavsiye edilir. Protozoon trofozoitleri, cysts, oocysts ve helmint yumurtaları ve larvalar bu yöntemle görülüp teşhis edilebilir. Bu işlem için bir lam, lamel ve dışkı örneği gereklidir. Az bir miktar dışkı alınıp lam üzerine konur. bir iki damla tuzlu su (serum fizyolojik) ile
Eğer arzu edilirse yapıştırılabilir. lamel, lam üzerine Bu işlem için en ucuz ve kolay elde edilebilen madde tırnak cilalarıdır (oje). İlk olarak lamelin dört köşesi birer damla ile tespit edilir. Daha sonra oje lamel etrafına açık kısım kalmayacak şekilde sürülür ve kurumaya bırakılır. Bu şekilde hazırlanan preperatlar uzun süre
Preperatı sistematik olarak incele. Bu işlem ilk olarak 10 X objektif ile yapılmalıdır. Her hangi bir nesne incelenmek istenirse o zaman büyük büyütme ile 40X veya 100X objektif ile inceleme yapılır. Boyalı preparatlar 100X objektifde immersiyon damlatılarak incelenmelidir.