BİYO 251 SİTOLOJİ LABORATUVARI (1.HAFTA) DENEY NO 1 DENEYİN ADI MİKROSKOP ÇEŞİTLERİ DENEYİN Çıplak gözle görülemeyecek kadar küçük cisimlerin görüntüsünün mercekler AMACI yardımıyla büyütülerek incelenmesini sağlayan optik aletlerin incelenmesi ve öğrenilmesi. GENEL BİLGİ Bir mikroskop üç kısımdan oluşur: Mekanik kısım, aydınlatma kısmı ve optik kısmı. Mikroskobun mekanik kısmında ayak, kol, tabla, maşa, tüp ve ayar vidaları bulunur. Aydınlatma kısmında ayna, diyafram ve kondansatör vardır. Optik kısımda ise objektifler ve okülerler yer alır. Mikroskobun Mekanik Kısımları Mikroskop Ayağı Mikroskobun en alt kısmındaki ağır madensel kısımdır. Mikroskobun devrilmemesini sağlar. Mikroskop Kolu Rahat çalışabilmek için mikroskobun istenilen eğikliğe getirilmesine yarayan kısımdır. Mikroskop Tablası Mikroskop koluna eklenmiştir. İncelenecek preparatın konulmasına yarar. Ortasında ışığın geçmesini sağlayan bir delik vardır. Yandaki vidalar ile ileri geri ve sağa sola hareket ettirilebilir. Hareketi takip edebilmek için özel bir taksimat vardır. Mikroskop Maşaları Tablanın üzerinde, preparatı tespit amacı ile lamı sıkıştırmaya yarayan iki maşa vardır. Mikroskop Tüpü Mikroskop kolunun üst kısmındadır. Optik kısımları taşıyan 160-180mm uzunluğunda bir borudur. Üst kısmında oküler, alt kısmında ise objektiflerin vidalandığı döner levha bulunur. Ayar Vidaları Mikroskop kolunun yan tarafında, dişli kızak üzerinde iki ayar vidası vardır. Büyük-kaba ayarları sağlayan vidalara makro vida denir. Bu vidalar gözle görülebilen bir hareket sağlar. İnce ayar vidalarına mikro vida denir. Bunlar mikron düzeyine, küçük, göz ile görülemeyen bir hareket sağlar.
Revolver Objektifleri üzerinde taşıyan hareketli, kendi ekseni etrafında dönebilen mekanik kısımdır. Mikroskobun Aydınlatma Kısmı Ayna Mikroskop tablasının altında sağa, sola, öne ve arkaya rahat hareket edebilecek şekilde yerleştirilmiş olan bir ayna bulunur. Ayna, ışığı tablanın ortasındaki delikten yukarı doğru yansıtır. Bir tarafı düz, diğer tarafı çukurdur. Düz ayna gelen ışığı mikroskobun optik eksenine paralel olarak yansıtır. Çukur ayna ise, ışığın optik eksen üzerinde bir noktada toplanmasını sağlar. Aydınlatma sistemini bünyesinde bulunduran mikroskoplarda ayna bulunmaz. Diyafram Aynadan yansıyan ışık diyaframdan geçer. Diyafram bir kol ile açılıp kapatılabilir. Böylece ışık miktarı azaltılıp çoğaltılabilir. Kondansatör Mercek sisteminden oluşur. Diyaframın üzerindedir. Aşağı yukarı hareket edebilir. Aynadan gelen ışığı preparat üzerine toplamaya yarar. Mikroskobun Optik Kısmı Mikroskopta görüntü oluşumunu sağlar. Mikroskop tüpünün alt ve üst ucundaki mercekler sisteminden oluşur. İncelenecek cisime yakın olana objektif denir. Göze yakın olana da oküler denir. Objektif Mikroskopta ilk görüntü oluşturulur. Görüntünün netliğinden sorumludur. 2-9 mercekten meydana gelmiştir. Büyütme gücü, mercek sisteminin odak mesafesine bağlıdır. Odak mesafesi ne kadar küçük ise büyütme gücü o kadar fazladır. Oküler Objektifin verdiği görüntüyü büyütürler. Mikroskop tüpünden kolayca çıkarılıp takılabilir ve döndürülebilir. Üzerinde büyütme gücü yazılıdır. Bir veya iki tane olabilir. Tek okülerli monoküler mikroskoplar kısa süreli incelemeler için uygundur. Çift okülerli binoküler mikroskoplarda iki göz ile bakılarak rahat çalışıldığından, araştırma laboratuarlarında sıklıkla kullanılır. Büyütme dereceleri oküler ve objektifte farklı büyüklüklerde olabilir. Mesela, bir ışık mikroskobunda objektif büyütmesi, 100x,40x,10x ve 4x olabildiği gibi,
oküler büyütmesi de 5x, 10x, 20x olabilir (Büyütmeler x işaretiyle belirtilir). Mikroskop büyütmesi = oküler x objektif olarak hesaplanır. Örneğin; objektifi 100x; oküleri 20x büyütme oranına sahip mikroskobun büyütmesi 2000x olarak tarif edilir. Yani materyalin 2000 defa büyütülmüş görüntüsü anlamına gelir. Mikroskop Çeşitleri: 1-Işık Mikroskobu: Görünür dalga boyundaki ışıkla aydınlatılmış cisimlerin büyütülerek incelenmesinde kullanılır. Optik ve mekanik olmak üzere iki kısımdan oluşur. Maksimum büyütme gücü 1000-2000 kadardır. Aynadan veya lambadan yansıyan ışık, kondansatör yardımıyla preparatın bulunduğu mikroskop tablasında toplanır ve preparat aydınlık bir alanda incelenir. Görüntü, cismin farklı bölgelerinden, ışığın farklı fazlarda geçmesi sonucu oluşur. 2-Stereo Mikroskop: Büyük opak materyali inceleyerek diseksiyon imkânı
veren, iki gözle bakılarak üç boyutlu görüntü sağlanan mikroskop tipidir. Bu mikroskoplarda büyütme genellikle 4x ile 40x arasında değişir. 3-Faz Kontrast Mikroskobu: Islak, boyanmamış ve lam- lamel arasına yerleştirilmemiş örnekleri, kontrast yardımıyla gözlemlememizi sağlar. Sabitlemeye ve boyamaya ihtiyaç yoktur. Daha çok mikrobiyoloji ve doku kültürü çalışmalarında canlı ve boyanmamış biyolojik cisimlerin incelenmesi için kullanılır. 4-İnterferens (Girişim) Mikroskobu: Faz kontrast mikroskobunun iyi bir versiyonudur. Aralarında bulunan tek fark ışık demetinin kullanımdan kaynaklanır. Bir ışık demeti örnekten geçerken diğeri ise örnekten geçemeyen ışık demetidir, değişik bölgelerin farklı yoğunlukları sayesinde kırılma indisleri ile farklılıkları ortaya koyar ve renkli bir görüntü oluşumunu sağlar.
5-Karanlık Alan Mikroskobu: Bazı saydam cisimler ve ince yapılı mikroorganizmalar normal ışık mikroskobu ile görülemezler. Bu nedenle bu tip mikroskopta ışık mikroskobundaki kondansatör yerine dış kaynaklı hiçbir ışığı objektife iletmeyen karanlık alan kondansatörü yerleştirilir. Boyanmış ya da canlı örneklerin incelenmesinde kullanılır. Bu mikroskop tıpta, mikrobiyolojide bakterilerin incelenmesi ve sayımında kullanılır. 6-Polarizasyon Mikroskobu: Polarizasyon mikroskobu biyoloji alanında ışığı çift kırıcı yani anizotrop maddelerin incelenmesinde kullanılır. İzotrop yani tek yönlü kırıcı maddeler içinde kırma indisi aynı olduğu için, ışık hangi yönde yayılırsa yayılsın hızı değişmez. Anizotrop yani çift kırıcı maddelerde atom, molekül ve miseller özel şekilde tertiplenir. Bunların içinde ışığın yayılma yönüne göre, kırma indisi maksimum veya minimum olabileceğinden ışık hızı değişir. Canlı incelemeye uygun olan bu mikroskop hücre ve dokuların bazı kısımlarını polarize ışığa gösterdikleri özel tepkilerden hareketle geliştirilmiştir.
7-Floresans (Ultraviyole) Mikroskobu: Aydınlanmasında güçlü kaynaklar kullanan (ultra viyole ışınları yayan, civa veya zenon yakan ark lambaları) bir mikroskop çeşididir. Mikroorganizmaların veya hücrelerin bölümlerini incelemek ve işaretlemek için kullanılır. Normal ışık ile gözlemlenmesi olanaksız olan, organ veya hücre bölümlerini görmemizi sağlar. 8-Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu: Işık kaynağı lazer olan optik mikroskoplarla Scanning (Taramalı) Elektron mikroskop arasında bir mikroskop çeşididir. Fluoresan işaretleyicilerle işaretlenen nükleik asit dizileri bu mikroskopla incelenmektedir. Organellerin, hücre iskeleti elementlerinin ve makro moleküllerin, hücre içindeki konumlarını belirlemek için kullanılır. Fluoresan boyalarıyla işaretlenmiş moleküller lazer tarafından taranır. Taranan imgeler tekrardan işlemden geçirilerek üç boyutlu görüntü elde edilir.
9-Elektron Mikroskobu (EM): Aydınlatma kaynağı olarak, ışık yerine elektronları kullanmaktadır. Elektronların dalga boyu 0.04 nm dir, görünebilen ışığın dalga boyundan yaklaşık 10000 kez daha küçüktür. Cisimden saçılan elektronların görüntülenmesi üzerine kuruludur. Elektron kullanılarak görüntü birkaç milyon defa büyütülebilmektedir. Maddeyle etkileşen elektronların dalga boyu bu görüntülemenin nm boyutlarında yapılmasına olanak sağlar. Bu tip mikroskoplar, elektron enerjisine ve ölçüm aletinin çalışma moduna göre, geçirimli (transmission) elektron mikroskobu (TEM), taramalı (scanning) elektron mikroskobu (SEM), yüksek voltaj elektron mikroskobu (HVEM) gibi farklı sınıflara ayrılır. TEM SEM MİKROSKOP KULLANIRKEN DİKKAT EDİLMESİ GEREKEN KURALLAR Mikroskopta incelenecek obje lam adı verilen dikdörtgen bir cam (76 x 26 mm) üzerine konur. Lam üzerine konan cisim boyalı veya boyasız incelenebilir. Lam üzerine konan obje preparat olarak adlandırılır.
A-MİKROSKOBUN BAKIMI: 1- Mikroskobu her zaman iki elle taşıyın. Bir elinizle kolu sıkıca tutarken diğer elinizle ayağın altından tutun. 2- Mikroskobunuzun elektrikli aydınlatma kısmı varsa kabloların altta kalıp ezilmemesine dikkat edin. 3- Baktığınız preparat sıvı damlası ile hazırlanmışsa mikroskobun gövdesini eğik duruma getirmeyin. 4- Mercekleri yumuşak ve tüysüz bir bez ile silin. 5- Mikroskobu yerine kaldırırken daima en küçük objektifi kullanır duruma getirin. B-MİKROSKOBUN KULLANIMA HAZIRLANMASI 1-En küçük objektifi kullanma durumuna getirin (çıt sesini duyun). 2- Işık, tablanın ortasından geçecek şekilde aynayı ayarlayın. Diyaframı açıp kapatarak en uygun ışığın geçmesini sağlayın. 3- Merceklerin temizliğini kontrol edin. 4- Büyük objektifi kullanırken preparat ile arasında kalan mesafe az olduğundan merceklerin kırılma ihtimali vardır. Dikkatli olunması gerekir. C- MİKROSKOBUN KULLANILMASI 1- İncelenecek objeyi temiz bir lam üzerine koyun. 2- Lameli 45 lik açı yapacak şekilde tutun ve bırakın. Tırnak ucu ile hafifçe lamele vurularak, arada kalmış olan hava kabarcıkları çıkartılabilir. 3- Bakılacak objeyi lam ile lamel arasına yerleştirerek hazırladığınız preparatı mikroskobun tablasına koyun ve maşalarla sabitleyin. 4- Objektifi en küçük ayara getirin. Preparata bakarken, kaba ayar vidasını çevirerek görüntüyü ayarlayın. 5- Okülerden bakın, görüntüyü ayarladıktan sonra kaba ayar vidasını bırakıp, ince ayar vidası ile netlik ayarını yapın. 6- Daha büyük görüntüler elde etmek için objektif değiştirince kaba ayar vidası ile oynamayın (objektifin değiştirilmesi görüntü ayarını bozmaz sadece netliğini değiştirir).
MATERYALLER Işık Mikroskobu, Inverted (Ters) Mikroskop Stereo Mikroskop Doç.Dr. Işık Didem KARAGÖZ