DENEY HAYVANLARI HİSTOLOJİSİ

Transkript

1 DENEY HAYVANLARI HİSTOLOJİSİ Histoloji: Bitkisel ve hayvansal dokuların mikro anatomisini inceleyen bilim dalıdır. Dokuların 2-3 boyutlu mikroskobik ve ultrastrüktürel yapıları hakkında bilgiler sağlar. Dokuların incelenmesinde mikroskoplar kullanılır. Mikroskoplar genel anlamı ile 2 grupta incelenir. a- Işık Mikroskobu b- Elektron Mikroskobu

2 Kullanılan ışık kaynağına göre; A) Gözle görülebilen ışığı kullananlar; a) Basit ışık mikroskobu b) Polarizasyon mikroskobu c) Faz kontrast mikroskobu d) Karanlık saha mikroskobu B) Elektronları ışık kaynağı olarak kullananlar; 1. Floresan mikroskop 2. Konfokal mikroskop 3. Ultraviyole mikroskobu 4. Elektron mikroskobu

3 A) Gözle görülebilen ışığı kullananlar; a) Işık Mikroskobu Gözün görebildiği ışık ışınlarını kullanırlar. Boyalı preparatların arkadan aydınlatılarak incelenmesi esasına dayanır. Işık mikroskopları mekanik ve optik kısımlardan oluşur. Mekanik bölüm Mikroskop Ayağı (Taban) Mikroskop Gövdesi (Kolu) Preparat Tablası Objektiflerin Takıldığı Tabla (Revolver) Tüp Makrometre ve Mikrometre Vidaları Optik bölüm Ayna veya ışık kaynağı Kondansör Objektif Oküler

4 b) Polarizasyon Mikroskobu Işığı çift kırıcı özelliği olan objelerin incelenmesinde kullanılır. Bu mikroskoplar sayesinde ışığı çift kıran anizotrop maddelerin (çizgili kas, kemik matriksi, kolesterol, selüloz, bazı kristaller, mikrotubuller) en ince yapısı rahatlıkla gözlenebilir.

5 c) Faz Kontrast Mikroskop Materyallerin canlı ve hareketli olarak incelenebilmesini sağlar. Işığın farklı kırılma indislerinin hücre ve hücre dışı oluşumlardan geçerken hızının ve yönünün değiştirilmesini sağlama esasına dayanır. Klasik ışık mikroskobundan farklı olarak özel kondansatör ve özel faz objektifleri kullanılır. TH0

6 d) Karanlık Alan Mikroskobu Doku kültürlerinde canlı hücreler, çekirdekçik, çekirdek zarı, mitokondri ve lipid damlacıkları parlak, zemini oluşturan sitoplazma ise karanlık olarak görülür. Şeffaf, boyanmamış veya boyanmış biyolojik örneklerin ve normal aydınlatmada mikroskopta görülemeyen çok küçük objelerin incelenmesinde veya hareketlerinin saptanmasında kullanılır. iy2boizgkq

7 Inverted Mikroskop Biyolojik bilimlerde genellikle hücre ve doku kültürlerindeki canlı hücrelerin incelenmesi için kullanılır. Steromikroskoplar Yansıyan ve geçen ışın kullanılarak embriyolar, bağırsak villusları incelenebilir. Çoğunlukla diseksiyonlarda kullanılır.

8 B) Elektronları ışık kaynağı olarak kullananlar; a) Floresan Mikroskobu Bazı maddeler kısa dalga boyundaki ışığı absorbe ederek uzun dalga boyunda ışığa çevirir. Bu olaya floresan denir. Böylece floresan veren yapılar görünür. Floresans; a- Doğal floresans veren maddeler (VitA, VitB, porfirinler, nükleik asitler) b- Yapay floresans veren maddeler (Flurokrom boyalarla sağlanır/akridin orange) Sarı, yeşil, mavi İmmünofloresans (flurokrom boyalarla işaretlenmiş antikorların kullanılmasıyla hücre ve doku antijenlerinin yeri saptanır)

9 b) Konfokal Mikroskop Floresan mikroskobun gelişmiş modeli Floresan boyama yapılan preparetların incelenmesinde kullanılır. Kesitten daha ince optik kesitler alınmasını sağlayabilir. Floresan veya yansıtıcı problar ile işaretlenmiş kemik, beyin ve diğer benzeri dokuların oldukça kalın kesitleri, gelişmekte olan embriyolar gibi küçük organizmalar ve bütün haldeki hücre örnekleri çalışılır. afaz-asamasinin-gercek-videosu/

10 c) Ultraviyole Mikroskop Kısa dalga boylu ultraviyole ışınları kullanılır. İnsan gözü UV ışınları göremediği için görüntü floresans, fotografi veya elektronik scanning ile görünür hale getirilir. Nükleik asitlerin, proteinlerin incelenmesinde kullanılır.

11 d) Elektron Mikroskobu Bu tip mikroskoplarda görüntü elde etmek için elektron kaynağı olarak ısıtılmış tungsten bir filamadan çıkan ve vakum içinde hızlandırılmış elektron demeti kullanılır. Bu mikroskobun çalışma prensibi vakumlu tüp içinde elektronların yön değiştirmesi esasına dayanır. Cam mercek içermezler. (Elektronlar camı geçemez) Elektrostatik ve elektromanyetik alanlar kullanarak büyütme sağlanır. Yüzbinlerle ifade edilen büyütmelere ulaşılabilir. İki tipi vardır; 1. Scanning (Taramalı) Elektron Mikroskobu (SEM) 2. Transmisyon (Geçirimli) Elektron Mikroskobu (TEM)

12 1) TEM Ultratomla alınan nanometre kalınlığındaki kesitlerin 2 boyutlu olarak hücre iç detayları gözlenir. Cismin görüntüsü bir milyon kez büyütülerek floresans ekranda izlenir. wiobqjew

13 2) SEM İnce kesit alınmasına gerek yoktur ve 3 boyutlu olarak hücre yüzey topografisi hakkında bilgi edinilir. Objeleri ya da daha fazla büyütebilir. n1tcjre5w

14 Ayrıca; X-Işınları Mikroskobu Yakın alan Mikroskobu Elektron probe Mikroanalizer Scanning Prob Mikroskobu Scanning Tunneling Mikroskobu Atomik Kuvvet Mikroskobu

15 Histopatolojik değerlendirme için yapılan laboratuvar işlemleri dokuların mikroskopla görünür hale gelmesi için işlenmesi ve boyanmasını kapsar. Dokunun işlenmesi ve boyanması aşamaları; 1. Doku örneklerinin alınması 2. Tespit aşaması (Gerekiyorsa dekalsifikasyon) 3. Dehidrasyon (Sudan kurutma) 4. Şeffaflandırma 5. Bloklama 6. Kesit alma 7. Boyama 8. Kapatma

16 1) Doku Örneklerinin Alınması Dokular ölümden, biyopsiden ve cerrahi işlemden hemen sonra veya en kısa sürede alınmalıdır. Büyük dokular, dokunun ezilmesini önlemek için çok keskin bistüri veya jiletle daha küçük parçalara ayrılmalıdır. En fazla 2-4 mm 2) Tespit Aşaması Ölü ya da canlıdan alınan doku ya da biyopsi örneklerinin fiziksel ya da kimyasal işlemlerden geçirilmesidir. Tespit işleminin amacı; 1- Örnekleri canlıdaki durumuna en yakın konumda sabitlemek 2- Hücre içi lizozomal enzim faaliyetlerini durdurmak 3- Örnekleri mikrotomda kesilebilecek sertliğe ulaştırmak 4- Örneklerin histokimyasal boyalarla boyanması ve mikroskoplarda görünebilir hale getirilmesini sağlamaktır.

17 İki farklı tespit işlemi yapılabilir; 1) Fiziksel Tespit a. Kurutma ile fiksasyon, kan ve kemik iliği yaymalarda kullanılır. b. Dondurma ile fiksasyon, lipitler, enzimler ve ameliyat dokularının hızlı tespitinde kullanılır. 2) Kimyasal Tespit a. İmmersiyon: Dokunun tespit solüsyonu dolu bir kap içerisinde bekletilmesidir. b. Perfüzyon: Tespit solüsyonunun anestezi altındaki canlıya verilerek solüsyonun hücreler canlı iken etkimesini ve öldükten sonra otolitik aktivitenin minimum düzeyde kalmasını sağlamak için kullanılır. Sıklıkla kullanılan bazı tespit çözeltileri; %10 luk formol, Paraformaldehit, Carnoy fiksatifi, Civa klorür, Alkol, Aseton.. Tespit işlemi sonunda musluk suyu ile saat yıkanır.

18 3)Dehidrasyon Alkolün düşük derecelerinden başlanarak yapılır. %50, 70, 80, 96 ve absol alkol ile muamele edilerek suyu giderilir. 4) Şeffaflandırma Parlatma solüsyonları; Ksilen, Toluen, Benzen, Metil benzoat, Sedir yağı, Karanfik yağı ve Propilen oksit gibi solüsyonlar kullanılır. 5) Bloklama Bloklama materyalleri olarak; Paraplast, Epoksi resin, Poliester resinler, Akrilik resinler

19 Doku takibi prosedürü 1. % 50 lik alkol (60 C etüv 30 dk) 2. % 70 lik etil alkol (60 C etüv 30 dk) 3. % 80 lik etil alkol (60 C etüv 30 dk) 4. % 96 lık etil alkol (60 C etüv 1 saat) 5. % 96 lık etil alkol (60 C etüv 1 saat) 6. % 100 lük etil alkol (60 C etüv 1 saat) 7. Absolü alkol (60 C etüv 1 saat) 8. Absolü alkol (60 C etüv 1 saat) 9. Ksilen (60 C etüv 1 saat) 10. Ksilen (60 C etüv 1 saat) 11. Erimiş parafin (60 C etüv 1 saat) 12. Erimiş parafin (60 C etüv 1 saat) 13. Parafine gömme (60 C etüv 1 saat)

20 6) Kesit Alma Mikrotom ile 5-7µm lik kesitler alınır. Mikrotom: Alınan doku örneklerinin son derece ince bir şekilde kesilerek incelenmesine imkan tanıyan kesme aracı. Alınan kesitler açılmaları için C lik benmariye atılır. (Benmariye biraz jelatin eklenebilir. Kesitler lama alınarak havada ya da etüvde kuruması sağlanır.

21 7) Boyama Farklı boyalar kullanılarak dokular ve hücre bileşenleri ayırt edilebilir. Genellikle dokular asit veya bazik boyalar ile boyanır. Bazik boyalar ile boyanan doku elemanları bazofilik; asit boyalar ile boyanan doku elemanları asidofilik olarak adlandırılır. Bazik boyalar Dokular Mavi-Mor Asidik boyalar Dokular Pembe-Kırmızı

22 Histokimyasal boyaları etkileşime girdikleri organeller açısından; Boyanın etkin olduğu kısım Çekirdek Sitoplazma Bağ doku Elastik iplik Endoplazmik retikulum iplikleri Kollagen iplik Yağ doku Nükleik asit Glikojen Mukopolisakkarit Boya Hematoksilen*/Nötral red Asit fuksin/eozin*/toluidin/azur A Anilin blue/light green/orange G Orcein/Rezorsin-fuksin PAS/Gümüş impregrasyonu Üçlü boyamalar/von gissen gibi Sudan III/Sudan IV/Oil red/sudan black Fuelgen reaksiyonu (DNA-kırmızımenekşe)/Metil green-pyronin (DNAyeşil-mavi, RNA-kırmızı)/Akridin orange (DNA-sarı-yeşil,RNA-kırmızı) Best karmin/pas Nötr:PAS

23 Hematoksilen & Eozin boyama yapıldığında hücre ve dokular aşağıdaki gibi boyanır; Çekirdek Sitoplazma Eritrositler-Kas Fibröz doku Kıkırdak Mukoz salgı Kalsifiye doku Protein çökeltileri Bakteri toplulukları Mavi-siyah-koyu mavi Pembe Kırmızı Açık pembe Açıktan koyu maviye kadar renk tonları Mavimtrak Koyu mavi Pembe Koyu mavi

24 Hematoksilen & Eozin Boyama prosedürü; Ksilol (30 dk), Ksilol (30 dk), Absolü alkol (Çalkalama), %95 lik etil alkol (Çalkalama), %80 lik etil alkol (Çalkalama), %70 lik etil alkol (Çalkalama), %50 lik etil alkol (Çalkalama), %30 luk etil alkol (Çalkalama), Distile su (Çalkalama), Hematoksilen (5-6 dk boyama), Akan su (Çalkalama), Asit-alkol çözeltisi (daldırıp çıkarma), Akansu (Çalkalama), Amonyak (30 sn), Akan su (Çalkalama), Eozin (3-5 dk boyama), Akan su (Çalkalama), %30 luk etil alkol (Çalkalama), %50 lik etil alkol (Çalkalama), %70 lik etil alkol (Çalkalama), %80 lik etil alkol (Çalkalama), %95 likk etil alkol (Çalkalama), Absolü alkol (Çalkalama), Absolü alkol (Çalkalama), Ksilol (30 dk), Ksilol (30 dk/bir gece bekletilirse daha iyi şeffaflaşır) 8) Kapatma Boyanan kesitlere bir damla Kanada balzamı veya Entellan damlatılır. Lamel kapatılır, hava kabarcıkları çıkartılır.