T.C. SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ

T.C. SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ TÜRKĠYE DE YETĠġTĠRĠLEN BAZI KOYUN IRKLARINDA MHC (MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX) GEN BÖLGESĠNDE GENETĠK VARYASYONUN BELĠRLENMESĠ Fatma İLHAN DOKTORA TEZĠ Zootekni Anabilim Dalı Mart-2015 KONYA Her Hakkı Saklıdır

TEZ BĠLDĠRĠMĠ Bu tezdeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edildiğini ve tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. DECLARATION PAGE I hereby declare that all information in this document has been obtained and presented in accordance with academic rules and ethical conduct. I also declare that, as required by these rules and conduct, I have fully cited and referenced all material and results that are not original to this work. Fatma İLHAN 23/03/2015

i ÖZET DOKTORA TEZĠ TÜRKĠYE DE YETĠġTĠRĠLEN BAZI KOYUN IRKLARINDA MHC (MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX) GEN BÖLGESĠNDE GENETĠK VARYASYONUN BELĠRLENMESĠ Fatma ĠLHAN Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Zootekni Anabilim Dalı DanıĢman: Doç. Dr. Ġsmail KESKĠN 2015, 75 Sayfa Jüri Doç. Dr. Ġsmail KESKĠN Prof. Dr. Mehmet Ali YILDIZ Prof. Dr. Birol DAĞ Doç. Dr. Fulya ÖZDĠL Yrd. Doç. Dr. Abdurrahman TOZLUCA Koyunlarda Major Histocompatibility Complex genleri (Ovar-MHC) diğer evcil hayvanlara oranla daha az çalışılmıştır. Ancak MHC nin sınıf 1, sınıf 2 ve sınıf 3 bölgelerinden oluşan temel yapısı diğer memelilerle yüksek oranda benzerlik göstermektedir. Bu çalışmada Türkiye de yetiştirilen sekiz koyun ırkının (Akkaraman, Dağlıç, İvesi, Sakız, Kıvırcık, Karayaka, Malya ve Morkaraman) Ovar- MHC sınıf 2 genlerinden DRB1 ve DRB3 gen bölgeleri, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılmıştır. PCR ürünleri DRB1 gen bölgesinde 5 restriksiyon enzimi (NciI, SacI, SacII Hin1I ve DdeI) ile ve DRB3 gen bölgesinde ise 2 restriksiyon enzimi (NdeII ve BsaI) ile kesilmiştir. DRB1 gen bölgesinin NciI, SacI, SacII, Hin1I enzimleri ile kesimi sonucu 3 genotip ve iki allel belirlenmiştir. DRB3 gen bölgesinde NciI, SacI, SacII ve Hin1I enzimleri ile kesim sonucu yaygın bulunan allel frekansları sırasıyla 0.69,0.65,0.91 ve 0.57 bulunmuştur. DRB1 gen bölgesinin DdeI restriksiyon enzimi ile kesimi sonucunda 4 genotip ve 3 allel belirlenmiş ve allel frekansları 0.62, 0.28 ve 0.10 olarak hesaplanmıştır DRB3 gen bölgesinin NdeII restriksiyon enzimi ile kesimi sonucunda 3 genotip ve 2 allel; BsaI restriksiyon enzimi ile kesimi sonucunda 2 genotip ve 2 allel belirlenmiştir. Her iki enzim için yaygın bulunan allel frekansları ise sırasıyla 0.72 ve 0.96 olarak tespit edilmiştir. Bu tez çalışmasında Türkiye deki yerli koyun ırklarının MHC DRB1 ve DRB3 genlerinin ekzon 2 bölgesindeki genetik profili ortaya konmuş ve yerli koyun ırkları MHC genleri bakımından sınıflandırılmıştır. Anahtar Kelimeler: MHC (Major Histocompatibility Complex), Türk koyun ırkı, ovar- DRB1, Ovar- DRB2

ii ABSTRACT Ph.D THESIS THE IDENTIFICATION OF GENETIC VARIATION IN MHC (MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX) GENE REGION IN SOME TURKISH SHEEP BREEDS Fatma ĠLHAN THE GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE OF SELÇUK UNIVERSITY THE DEGREE OF DOCTOR OF ANIMAL SCIENCE Advisor: Assoc.Prof.Dr. Ġsmail KESKĠN 2015, 75 Pages Jury Assoc. Prof. Dr. Ġsmail KESKĠN Prof. Dr. Mehmet Ali YILDIZ Prof. Dr. Birol DAĞ Assoc. Prof. Dr. Fulya ÖZDĠL Assist. Prof. Dr. Abdurrahman TOZLUCA The major histocompatibility complex (MHC) in sheep, Ovar-Mhc, is poorly characterised, when compared to other domestic animals. However, its basic structure is similar to other mammals, comprising class I, II and III regions. In this study, the Ovine MHC class II DRB1 and DRB3 genes were amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) in eight sheep breeds (White Karaman, Dağlıç, Awassi, Sakız, Kıvırcık, Karayaka, Malya, Morkaraman) that are reared in Turkey. Informative Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) s were obtained with five restriction enzymes (NciI, SacI, SacII Hin1I and DdeI) for DRB1 gene and with two restriction enzymes (NdeII and BsaI) for DRB3 gene. The digestion of exon 2 of DRB1 gene with NciI, SacI, SacII, Hin1I each resulted 3 genotypes, and two alleles viz., a and b with frequency range of 0.69 and 0.31; 0.65 and 0.35; 0.91 and 0.09; 0.57 and 0.43, respectively. The digestion of exon 2 of DRB1 gene with DdeI resulted 4 genotypes, and 3 alleles viz., a, b and c with frequency range 0.62, 0.28 and 0.10 respectively. On the oher hand the digestion of exon 2 of DRB3 gene with NdeII, BsaI each resulted 3 genotypes, and two alleles viz., a and b with frequency range 0.72 and 0.28; 0.96 and 0.04 respectively. This study presents the genetic profile of MHC gene region of exon 2 of DRB1 and DRB3 genes in native sheep breeds in Turkey. Keywords: MHC (Major Histocompatibility Complex), Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Native Turkish Sheep

iii ÖNSÖZ Her konuda bilgi, öneri ve tecrübelerinden faydalandığım danışman hocalarım Sayın Yrd. Doç. Dr. Abdurrahan TOZLUCA ve Doç. Dr. İsmail KESKİN e, tezimin laboratuar ve yazım aşamasında her türlü desteğini gördüğüm Sayın hocam Doç. Dr. Fulya ÖZDİL e, kan örneklerinin temininde yardımcı olan Sayın Prof. Dr. Mehmet Ali YILDIZ hocama teşekkür ederim. Çalışmama ekonomik desteği sağlayan S.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğüne ve çalışmamı gerçekleştirdiğim S.Ü. Ziraat Fakültesi Hayvan Biyoteknolojisi laboratuarının kurulması ve geliştirilmesinde büyük emeği olan Sayın Prof. Dr. Saim BOZTEPE, Doç. Dr. Fulya ÖZDİL ve Dr. İbrahim AYTEKİN e teşekkürü bir borç bilirim. Son olarak bu günlere gelmemde önemli payları olan annem ve babama, doktora çalışmam sırasında sabrını ve desteğini esirgemeyen eşim Uğur İLHAN a, yaşama sevincim canım kızım Melis Berra ya ve bana her zaman manevi olarak destek olan arkadaşım Dr. Rabia GÖÇMEN e teşekkür ediyorum. Fatma İLHAN KONYA-2015

iv ĠÇĠNDEKĠLER ÖZET... i ABSTRACT... ii ÖNSÖZ... iii ĠÇĠNDEKĠLER... iv SĠMGELER VE KISALTMALAR... vi 1. GĠRĠġ... 1 2. KAYNAK ARAġTIRMASI... 3 2.1. İmmün Sistem... 3 2.1.1. Major histocompatibility complex (MHC) nin yapısı... 7 2.2.1. Sınıf 1 genleri ve molekülleri... 8 2.2.2. Sınıf 2 genleri ve molekülleri... 10 2.2.3. Sınıf 3 genleri ve molekülleri... 13 2.3. MHC genlerinin kalıtımı ve allellerin adlandırılması... 13 2.4. MHC gen ürünlerinin işlevleri... 14 2.4. Moleküler Genetik Tanımlama Yöntemleri... 18 2.4.1. PCR (Polimeraz zincir reaksiyonu)... 18 2.4.2. RAPD (Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA Yöntemi)... 19 2.4.3. RFLP (Kesilen Parça Uzunluk Polimorfizmi)... 20 2.4.4. AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi)... 21 2.4.5. Mikrosatelitler... 22 2.4.6. SSCP (Tek Zincir Konformasyon Polimorfizmi)... 22 2.4.7. SNP ler (Tek Nükleotid Polimorfizmleri)... 23 2.5. Türkiye de yerli koyun ırkları ile ilgili yapılmış tez çalışmaları... 24 2.6. MHC ile ilgili yapılmış çalışmalar... 29 2.6.1. DRB1 gen bölgesi... 29 2.6.2. DRB3 gen bölgesi... 32 2.6.3. Diğer MHC gen bölgeleri... 35 3. MATERYAL VE YÖNTEM... 37 3.1. Materyal... 37 3.1.1. Canlı materyal ve örnekleme... 37 3.1.2. Araç ve gereçler... 37 3.1.3. Tampon çözeltiler... 38 3.2.Yöntem... 38 3.2.1.Kan Örneklerinin alınması... 38 3.2.2.Genomik DNA izolasyonu... 39 3.2.3. Genomik DNA miktarının hesaplanması... 40 3.2.4. Çalışılan OLA-DRB Bölgelerinin PCR ile Çoğaltılması ve Restriksiyon Enzimleri ile Kesimi... 41

v 3.2.5. Genetik Analiz... 43 4. ARAġTIRMA SONUÇLARI VE TARTIġMA... 44 4.1. DRB1 ekson 2 gen bölgesi... 44 4.1.1. NciI restriksiyon enzimi ile kesim... 44 4.1.2. SacI restriksiyon enzimi ile kesim... 46 4.1.3. SacII restriksiyon enzimi ile kesim... 47 4.1.4. Hin1I restriksiyon enzimi ile kesim... 49 4.1.5. DdeI restriksiyon enzimi ile kesim... 51 4.2. DRB3 ekson 2 gen bölgesi... 52 4.2.1. NdeII restriksiyon enzimi ile kesim... 53 4.2.2. BsaI restriksiyon enzimi ile kesim... 55 5. SONUÇLAR VE ÖNERĠLER... 57 KAYNAKLAR... 61 ÖZGEÇMĠġ... 73

vi SĠMGELER VE KISALTMALAR MHC Major Histocompatibility Complex QTL Kantitatif karakter lokusu RFLP Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi SNP Tek Zincir Konformasyon Polimorfizmi SSCP Basit Tekrar Dizileri AFLP Çoğaltılmış Fragman Uzunluk Polimorfizmi RAPD Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA PCR Polimeraz zincir reaksiyonu DNA Deoksiribonükleik asit UV Ultraviyole μl Mikro litre ml Mili litre o C Santigrat derece M Molar mm Mili molar nm Nanometre OD Optik Densite dntp s Deoksiribonükleozid trifosfat A Adenin nükleotid T Timin nükleotid G Guanin nükleotid C Sitozin nükleotid bp Baz çifti dk Dakika sn Saniye MgCl 2 Magnezyum klorür TE Tris-EDTA EDTA Ethylendinitrilotetraaceticacid TBE Tris-Borate-EDTA U Ünite (1 μg λ DNA kesimi için gerekli enzim miktarı) χ² Kikare Testi KM Klinik Mastitis HLA Human Leukocyte Antigen OLA Ovine Leukocyte Antigen BoLA Bovine Leukocyte Antigen SCC Somatic hücre sayısı TCR T hücresi antijen reseptörü CD Küme belirleme NK Natural Killer K Killer Ig İmmünoglobulin TAP Transpoter associated with antigen processing protein

1 1. GĠRĠġ Türkiye de 2013 yılı Türkiye İstatistik Kurumu verilerine göre 14.415.257 baş sığır, 29.284.247 baş koyun ve 9.225.548 baş keçi mevcudu vardır. Bu hayvan varlığı ile Türkiye Dünyanın sayılı ülkeleri arasında yer almasına rağmen hayvansal ürünler bakımından hala gerilerde yer almaktadır. Fert başına tüketilen et, süt ve yumurta gibi hayvansal ürün miktarları da yeterli düzeyde değildir (Öztürk, 2000). Bu hayvan varlığı içerisinde büyük bir yer tutan koyun varlığımız ne yazık ki her geçen gün azalmakta, verim yönünden de ileri bir adım atılamamaktadır. Türkiye de koyunculuğun geri kalmasında birçok faktör etkilidir. Bunların en önemlilerinden bir tanesi de ıslah faaliyetlerinin yetersizliğidir. Islah faaliyetlerinin yürütülebilmesi için öncelikle Türkiye koyun varlığının genetik yapısını bilinmesi gerekmektedir. Bu amaçla yapılacak genetik araştırmalar önem kazanmaktadır. Hayvancılıkta verimin düşmesine neden olan en önemli faktör hastalıklardır. Hastalıklar nedeniyle ölümler veya verimde düşmeler işletmeleri önemli ölçüde ekonomik kayba uğratmaktadır. Bu nedenle hastalıkların mümkün olduğunca azaltılması ve minimum düzeye getirilmesi gerekmektedir. Hayvanlar hastalandıktan sonra alınacak tedbirler hem zaman kaybı hem de masraflı olacağından hayvanların genetik olarak bağışıklık sistemlerinin gelişmiş olması istenmektedir. Kısacası bir canlının yaşamını en iyi şekilde sürdürebilmesi için öncelikle hastalıklara karşı dirençli olması gerekmektedir. Bu nedenle immün sistem üzerinde önemli rol oynayan MHC (Major Histocompatibility Complex) genleri hayvancılıkta üzerinde durulması gereken genler arasında yer almaktadır. Bağışıklık sisteminin kendinden olanı ve olmayanı tanıması için gerekli olan doku antijenlerini kodlayan gen bölgesi Büyük Doku Uyum Kompleksi Major Histocompatibility Complex olarak adlandırılmaktadır (Roit ve Delves, 2001). MHC immünolojik ve immünolojik olmayan fonksiyonları olan genlerin bulunduğu bir bölge olup bütün omurgalılarda bulunmaktadır (Tizard, 2004). Evcil ve çiftlik hayvanları arasında sığırda MHC ile ilgili çok sayıda araştırma yapılmıştır (Schmutz ve ark.,1992; Dietz ve ark., 1997; Starkenburg ve ark., 1997; Sharif ve ark., 1998, 2000; Maillard ve ark., 1999; Gilliespie ve ark., 1999; Juliarena ve ark., 2008; Pashmi ve ark., 2009; Yoshida ve ark., 2012;). Koyunlarda ise MHC diğer evcil hayvanlara göre daha az karakterize edilmiştir (Dukkupati ve ark., 2006). Bu nedenle, Türkiye deki hayvan populasyonlarında öncelikle MHC genleri bakımından genotiplerin belirlenmesi önem arz etmektedir. Daha sonraki aşamada belirlenen genotipler ile hayvanların bağışıklık özellikleri arasında ilişki kurmak ve bu şekilde seleksiyon amacıyla bu genotiplerin kullanılması söz konusu olabilecektir. Bu

2 amaçla bu tez çalışması Türkiye deki koyun populasyonlarında MHC genleri bakımından genotiplerin ortaya konması açısından öncü bir çalışma olma niteliği taşımaktadır. Bu tez çalışmasında Türkiyede yetiştirilen 8 koyun ırkının MHC DRB1 ve DRB3 gen bölgelerinin polimorfizmi PCR-RFLP tekniği ile araştırılmıştır. DRB1 gen bölgesi için 5 restriksiyon enzimi, DRB3 gen bölgesi için 2 restriksiyon enzimi kullanılarak ırkların genotip ve allel frekansları hesaplanmıştır.

3 2. KAYNAK ARAġTIRMASI 2.1. Ġmmün Sistem Canlıların doku ve organları, bütün yabancı organizma ve toksinlere karşı direnme yeteneğindedir. Bazı mikroorganizmalara ise hayat boyu yenilmeden kalırlar ki bu yeteneğe bağışıklık (immünite) denir. İmmün sistem bireyi enfeksiyon ve dış etkenlerden korumak üzere gelişmiştir. Latince immunis (vergi vermeyen) sözcüğünden türemiştir (Tekin, 2004). Organizma için yabancı olan ve immun sistemi uyaran elemanlar antijen adını alırlar. Proteinler, karbonhidratlar, nükleik asitler antijenik moleküllerdir. Ayrıca yaşlı eritrositler, polen taneleri, bakteri toksinleri, bakteri ve virüslerin kendileri antijen niteliğinde birçok kimyasal bileşik içerirler (Başaran, 2002, Roitt ve ark., 2001). Ağız, burun ve deri gibi organlar bu antijenlerin girebileceği noktalardır. Bu bölgelerde antibakteriyal maddeler salgılanarak korunma sağlanmaktadır. Eğer mikroorganizma vücuda girerse çeşitli seviyelerde immün sistem ile karşılaşacaktır. Bağışıklık sisteminin organları lenfoid dokulu organlardır. Bu organlar, birincil lenfoid organlar ve ikincil lenfoid organlar olarak iki grup halinde incelenseler de birbirleriyle sürekli ilişki halindedirler. Birincil lenfoid organlarda, lenfositlerin üretim işleri yapılırken; ikincil organlarda lenfositler ilk defa antijenlerle yüzleşirler (Erganiş ve İstanbulluoğlu, 1993). Birincil Lenfoid organlar: Lenfositlerin üretimi ve farklılaşması bu organlarda düzenlenir (Tizard, 2004). Timus: Memelilerde timus toraksta yerleşmiş iki loblu, kalbin ve büyük kan damarlarının üzerini örten, fibroz ve yağlı bir dokudur (Erganiş ve İstanbulluoğlu, 1993). Antijene bağımlı olmaksızın timusta türeyen T lenfositlerin oluşmasını ve olgunlaşmasını, timus hormonları salgılayarak immun fonksiyonları düzenler ve oto antijenlere karşı lenfositleri uyararak otoimmun hastalıklardan koruyucu etki sağlar. Timus yokluğunda T lenfositler oluşmayarak Di George sendromu denilen ağır immun yetmezlikler ortaya çıkabilir (Baban ve Siyahhan, 1998). Kemik iliği: Yetişkin kemik iliği, B lenfosit oluşma bölgesi bulundurmaktadır. Ayrıca antikor üreten plazma hücreleri ve T lenfositlerini de barındırdığından önemli bir birincil lenfoid organdır (Erganiş ve İstanbulluoğlu, 1993).

4 Ġkincil Lenfoid organlar: Lenfositler birincil lenfoid organlarda olgunlaştıktan sonra ikincil lenfoid organlara göç ederler (Erganiş ve İstanbulluoğlu, 1993). Dalak: Karın boşluğunun sol üst tarafında bulunan ve eski kırmızı kan hücrelerinin yıkımından sorumlu bir organdır. İki pulpadan oluşmaktadır. Beyaz pulpa B ve T lenfositlerin yerleşim bölgesidir. Kırmızı pulpa, eritrosit, makrofaj ve çevrelerinde dentrik hücreleri içerir. Yaşlanmış ya da yıpranmış kan şekilli elemanları (eritrositler, lökositler, trombositler) dolaşımdan uzaklaştırır, kanı yabancı maddelerden temizler, hemoglobini bilirubine çevirir (Özbal, 1999). Lenf düğümleri: B ve T hücrelerinin bulunduğu merkezlerdir. Lenf veya doku sıvılarında bulunan antijenlerin filtre edildiği vücudun her tarafını ağ gibi saran bir sistemin parçasıdır. Vücuda girmiş antijenlere T ve B lenfositleri tarafından bağışıklık tepkileri burada verilir (Erganiş ve İstanbulluoğlu, 1993). İmmün Sistem Hücreleri: İmmün cevap oluşumunda ana görevi lenfositler ile makrofajlar yapar. Granülositler ise katkıda bulunurlar. Bu hücrelerin hepsi lökositler olarak bilinirler (Erganiş ve İstanbulluoğlu, 1993). Bu hücrelerin bir kısmı konağa giren antijen özelliğindeki molekülleri fagozite eder. Diğer bir kısmı, antijen uyarımı ile farklılaşarak onlara karşı immün cevap ürünleri çıkartmakta ve antijenleri yok etmektedir (Özbal, 1999). Lenfositler: Yerleşim bölgeleri ve fonksiyonlarına göre lenfositler üç gruba ayrılmaktadır. Bunlardan ilk ikisi, yüzeylerinde antijen tanıyan reseptörleri bulunan ve immün cevap ürünlerinin yapımından sorumlu olan B ve T lenfositlerdir. T lenfositler timus kontrolünde, B lenfositler kemik iliği kontrolünde olgunlaşmaktadırlar. Üçüncü grup lenfositler ise killer (K) ve natural killer (NK) hücreleridir (Özbal, 1999). T lenfositler, kemik iliğinde yapılırlar ve timusa geçerler. Bu hücreler gelişimleri sırasında çeşitli ve bir kısmı T hücresinin tipine özel CD antijenleri taşırlar. CD (Cluster designation=küme belirleme) terimi insan lökosit antijenine (HLA) karşı çeşitli laboratuarlarda elde edilmiş monoklonal antikorların bilgisayar analizleri sonucunda türetilmiştir. Benzer özellikteki spesifik monoklonal antikorlara belirli bir CD numarası verilir. CD moleküllerinden ayrı olarak T hücrelerinin T hücresi antijen reseptörü (TCR) adı verilen bir markeri daha vardır. T hücrelerinin yüzeyinde bulunan spesifik markerlere göre T

5 lenfosit türleri ayırt edilir. T 4, T 8 gibi. Bununla ilgili olarak farklı MHC antijenleri, farklı T lenfositleri tarafından tanınmaktadır (Baban ve Siyahhan, 1998). T lenfositleri; yardımcı T h, sitotoksik T c, baskılayıcı T, bellek T, geç tip aşırı duyarlılıkta etkili T lenfositleri gibi alt tiplere sahiptirler. Yardımcı T h lenfositleri genellikle B lenfositlerini uyararak daha fazla sayıda antikor yapmalarını sağlarlar. Baskılayıcı T lenfositleri çoğunlukla immün sistemin herhangi bir antijene verdiği cevabın durdurulmasında görevlidirler. Sitotoksik T c lenfositleri makrofaj yada B lenfositleri gibi arada herhangi bir hücre olmadan antijenlere öldürücü etki gösterirler. Geç tip aşırı duyarlılıkta etkili T lenfositler alerjenlere lenfokinler salgılayarak etkileyen lenfositlerdir. Bellek T lenfositler antijenlerin ikinci kez vücuda girmesinde kısa sürede tepkinin oluşturulmasında önemli olan hücrelerdir (Erganiş ve İstanbulluoğlu, 1993). B lenfositlerin diğer lenfositlerden en önemli farkları, B lenfositlerin membranında immünoglobulin reseptörleri taşımalarıdır. Bu özelliklerinden yararlanılarak, immünofloresan yöntemi ile B lenfositlerin tanımı yapılmaktadır. Periferik kanda bulunan B lenfositlerin membranında çoğunlukla monomer formda IgM ve IgD olmak üzere takriben hücre başına 150000 kadar Ig reseptörü bulunmaktadır (Özbal, 1999). Lenfoid hücreler arasında yabancı hücrelere karşı sitotoksik etki gösteren T c lenfositlerinden farklı K ve NK hücreleri vardır. K hücreleri, yüzeylerindeki antijenlere karşı oluşmuş kendi antikorlarıyla kaplanmış hedef hücrelerini eritirler. Yüzeylere yapışma ve fagositoz özelliklerinden yoksun olmalarıyla makrofajlardan, hücre zarında yüzeysel immünoglobulinlerin bulunmamasıyla B lenfositlerden, rozet oluşturamamalarıyla da T lenfositlerden ayrılmaktadırlar. Konakta oluşabilecek neoplastik hücreleri yok etmekle görevli olan NK hücreleri K ve T c lenfositlerden farklı bir gruptur. Tümör hücrelerinin yanı sıra, virüsle enfekte hücreler ve IgG1 ve IgG3 antikorlarıyla kaplı hedef hücreler üzerinde öldürücü etkisi vardır. NK hücrelerinin öldürücülük etkisi interferon bulunması halinde görülmektedir (Özbal, 1999). Makrofajlar: Kemik iliğinden köken alan monositler dolaşıma katılarak birkaç saat dolaşımda kaldıktan sonra bir daha geri dönmemek üzere dokulara yerleşir ve burada makrofajlara dönüşürler. Makrofajların lenfositlerden farkları antikor sentezlememeleridir. Ancak lenfokinlere benzer etkilerde bulunan monokinleri sentezlerler. En önemli görevleri ise fagositozdur (Erganiş ve İstanbulluoğlu, 1993). Makrofajların fagositozdan başka, antijeni lenfositlere sunma (tanıtma) görevleri vardır. İnsanda aktif makrofajlarda, MHC sınıf II yönetimindeki HLA-DR, HLA-DQ ve HLA-DP antijenleri oluşmaktadır. Antijenle

6 uyarılmış makrofajların MHC-II yönetimindeki antijenleri, B ve T lenfositlerin membranında bulunan CD 4 reseptörleri ile bağlanarak lenfositler uyarılmaktadır (Özbal, 1999). Granülositler İçerdikleri granüllerin boyanmalarına göre nötrofil, eozinofil ve bazofil olarak gruplandırılmaktadırlar. Enfeksiyonlarda sayısal olarak artan bu hücrelerin asıl görevi mikrorganizmaları fagosite etmektir (Özbal, 1999). Antikor ve antijenler Antikorlar immünoglobulinler olarak bilinen proteinlerdir. Plazma proteinlerinin % 20 sini oluştururlar (Baban ve Siyahhan, 1998). İmmünoglobulinler her biri özel fonksiyon için gelişmiş 5 ana gruptan oluşurlar. Bunlar IgG, IgM, IgA, IgD ve IgE dir. Bütün antikor molekülleri 2 hafif ve 2 de ağır zincir olmak üzere 4 polipeptid zincir yapısından oluşmaktadır. Farklı antikor moleküllerinde bu hafif ve ağır zincirlerin her ikisi de farklıdır (Coleman ve ark, 1989). Bir B hücresinde 100000 kadar immünoglobulin bulunmaktadır. Bu immünoglobulin molekülleri antijenler için reseptör görevi görürler. Bir antijen ancak kendisi ile yüzeyinde en iyi uyumu gösterebilen Ig reseptörü taşıyan B lenfositi ile reaksiyona girmektedir. Bir organizma yaklaşık 10 7-10 8 farklı antikor molekülü yapabildiğinden, B hücreleri üzerinde hemen hemen tüm antijenlere uyan bir reseptör çeşidi bulunur (Erganiş ve İstanbulluoğlu, 1993). Canlı bir organizmaya verildiği zaman antikor oluşmasına neden olan maddeler antijen adını alır. Antijenlerin büyük bir kısmını proteinler oluşturmaktadır. Proteinlerin yanı sıra polisakkaritler, nüleik asitler ve kompleks yapılı lipitler de antijen özelliği taşırlar (Baban ve Siyahhan, 1998). Aynı türün/ırkın bireyleri arasında bile antijen bakımından farklılıklar bulunmaktadır. Bireyler arasındaki bu antijenik farklılığına alloantijenler adı verilmektedir. Alloantijenler nakledilen bir organın reddedilmesine neden olduklarında histocompatibility antijenlerden söz edilir. Nakledilen organın hücrelerinin yüzeylerindeki alloantijenler, organın nakledildiği bireyde immün cevabın başlamasına yol açabilirler. Bu alloantijenler, MHC genlerinin ürünleri olup genomun bu bölgesinin dışında kalan kısmının tümü birçok zayıf histocompatibility antijenleri içermektedir. Bu antijenlere ise Minor histocompatibility antijenleri denmektedir (Baban ve Siyahhan, 1998).

7 2.1.1. Major histocompatibility complex (MHC) nin yapısı Büyük Doku Uyum Kompleksi (MHC, Major Histocompatibility Complex) in keşfi bilim adamlarının doku ve organ nakli çalışmaları sırasında gerçekleşmiştir. 1930 lu yıllarda R.A. Gorer ve G.D. Snell farelerde doku nakli çalışmaları sırasında doku antijenlerinin varlığını belirlemiş ve bunların gen bölgelerine doku uyum kompleksi adını vermişlerdir (Uçar ve ark, 2001). MHC nin ilk bilinen rolü doku uyuşmasıdır. MHC nin bağışıklık sistemindeki önemi bu lokusun keşfinden ancak 20 yıl sonra ortaya çıkmıştır. Daha sonra diğer birkaç fonksiyonu daha keşfedilmiştir. MHC nin başlıca fonksiyonu özel antijen koruma reseptörü olan ve doku uygunluk molekülleri veya MHC molekülleri olarak bilinen glikoproteinleri kodlamaktır (Roitt ve Delves, 2001). Son 30 yıl içerisinde MHC molekülleri kristalize edilmiş, rekombinant DNA yöntemleri kullanılarak MHC kompleksi genlerinin baz dizilimi ve bu genlerin sentezini sağladığı MHC antijenlerinin aminoasit dizileri ortaya konmuştur (Roitt ve Delves, 2001). İnsan ve fare MHC si diğer memelilere oranla daha detaylı incelenmiştir. İnsan MHC si insan lökosit antijeni (Human leukocyte antigen-hla) olarak isimlendirilmiştir. Eksprese olan HLA genlerinin % 40 civarı bağışıklık sistemi içerisinde fonksiyon yapmaktadır. MHC gen bölgesi kodlanan proteinlerin özelliklerine göre 3 farklı bölgeye ayrılmaktadır. Telomerik sınıf 1, sentromerik sınıf 2 ve sentral sınıf 3 (Klein, 1976). MHC nin farklı fonksiyonel rolleri olan, 3 ana bölge içeren bu genel yapısı, memeli türleri arasında homoloji göstererek, ortak nükleotid dizilimine sahip olacak şekilde korunmuştur (Amills ve ark., 1998). Ancak farklı memeli MHC leri arasında bazı bölgelerin yüksek oranda homoloji göstermeleri yanında büyük farklılıkların da olduğu tespit edilmiştir (Kelley ve ark., 2005). Sentromerik uç Telomerik uç Şekil 2.1: Koyun MHC sinin şematik gösterimi (Dukkipati ve ark., 2006)

8 MHC koyunda 20. kromozomda, keçide ve sığırda ise 23. kromozom üzerinde bulunmaktadır (Bozkaya ve ark., 2007). Her tür için MHC, farklı isimlendirilmiş; koyun MHC si OLA (Ovine leukocyte antigen) veya ovar MHC, keçi MHC si CLA (caprine leukocyte antigen) ve sığır MHC si BOLA (bovine leukocyte antigen) olarak ifade edilmiştir. MHC ruminantlarda da diğer memelilerde olduğu gibi 3 gen bölgesinden oluşmaktadır (Dukkipati ve ark., 2006). MHC bilinen en polimorfik gen bölgelerinden biridir. MHC gen bölgesinden kodlanan MHC sınıf 1 molekülleri, vücuttaki tüm çekirdekli hücrelerde bulunurken, sınıf 2 molekülleri ise makrofajlar ve B-lenfositler gibi bazı özel hücre gruplarında bulunmaktadır. Sınıf 3 molekülleri olarak adlandırılan diğer bir grup ise C2, C4 kompleman proteinleri, p 450 sitokrom 21-hidroksilaz, faktör B, non-mhc genlerini içeren ayrı bir kategori içinde değerlendirilmektedirler (Ikuta ve ark., 2002; Dissanayake ve ark., 2004). MHC genlerinin hastalıklar üzerindeki etkisinin T-lenfositlerin antijen tanımadaki fonksiyonları ile ilgili olduğu öngörülmektedir (Yakut, 2004). İnsanlarda yapılan çalışmalar sonucunda bağışıklık hastalıklarının çoğunun MHC ile ilişkisi olduğu düşünülmektedir, diğer bir ifadeyle belli hastalıklar belli allelleri taşıyan bireylerde daha sık görülür. MHC ye bağlı hastalıklardan en önemlileri Romatoid Artrit ve İnsüline Bağımlı Diyabet hastalığıdır (Dalva, 2004). Hastalıklarla ilişkili bulunan alleller daha çok sınıf 2 genlerinde bulunur. 2.2.1. Sınıf 1 genleri ve molekülleri Polimorfik sınıf 1 genleri, T lenfositlere peptit-antijen sunumuna aracılık etmekten sorumlu transmembran glikoproteinleri kodlarlar. Sınıf 1 genleri DNA molekülünün yaklaşık 4.5 kb lık bir bölümünü oluşturur ve 6 veya 8 ekzondan oluşmaktadır (Mak ve Simard, 1998). Sınıf 1 lokusu hem klasik hem de klasik olmayan genleri içerir. Klasik sınıf 1 genleri immünoglobulin gen familyasının üyeleridir. Bu familya genellikle intraseluler protein ve parazitlerden türemiş peptidlerden korunmayı içerir. Aynı zamanda doğal öldürücü (NK, natural killer) hücre ölümünden korunmak için NK ile birbirlerini etkilemek için bulunurlar (Reyburn ve ark., 1997). Klasik olmayan sınıf 1 genleri evrimsel olarak ilişkilidir ve immün cevap ile ilişkili farklı fonksiyonlara sahiptirler. İnsanlarda MHC, üç klasik (MHC A, B ve C) ve üç de klasik olmayan (MHC E, F ve G) sınıf 1 genleri

9 içermektedir. Ruminantlarda ise sınıf 1 bölgesi çok az çalışıldığından gen sayısı konusunda farklı görüşler bulunmaktadır. Koyunda yapılan son çalışmalarda 4 farklı polimorfik ve klasik sınıf 1 genleri olduğu bildirilmektedir (Miltiadou ve ark., 2005). HLA sınıf 1 molekülleri, kovalent olmayan bağlarla bir arada tutulan, iki polipeptid zincirinden oluşmuş heterodimerlerdir. Bunlardan ağır olan α zinciri MHC bölgesinden kodlanır, hücre membranı boyunca ilerleyen bu molekülün amino ucu membranın dışında yer alır. Membran dışındaki α zinciri, α1, α2 ve α3 altbirimlerinden (domain) oluşmaktadır. Zincirin membranı geçen kısmını takiben sitoplazmik kısa bir uzantısı vardır. Molekülde bulunan hafif zincir ise β2 mikroglobulin MHC dışındaki polimorfik olmayan bir lokus tarafından kodlanır (Hughes ve Yeager, 1998). Molekülün üç boyutlu yapısına bakıldığında membran dışında homoloji gösteren bölgelerin karşılıklı gelmesi ile iki çift alt birim bölgesi oluştuğu görülür; α1 ve α2 membrana en uzak, α3 ve β2 de membrana yakın bölgede karşılıklı yer alırlar (Şekil 2.2). Karşılıklı yerleşen α1 ve α2 zincirleri, antijenlere ait 8-10 amino asit büyüklüğünde peptidlerin yerleşebileceği kovuğa benzer bir yapı oluştururlar (Şekil 2.2). β2 mikroglobulin, molekülün üç boyutlu yapısının korunmasında rol almaktadır. Sınıf 1 molekül genleri, kodlama yapan 8 exon ve kodlama yapmayan 7 introndan oluşur. Polimorfik bir yapı gösteren α1 ve α2 bölgeleri, ekson 2-3 tarafından kodlanır. Altıncı kromozom üzerinde sınıf 1 molekülleri kodlayan genlerden önce sınıf 1 genleri düzenleyen genlerin kodlandığı bir bölge yer almaktadır. Bu kontrol bölgesi, farklı sınıf 1 genleri, hatta farklı aleller için de farklı olabilmektedir (Klein ve Sato, 2000). Sınıf 1 moleküllerinin yapı-fonksiyon ilişkisi, HLA-A2 molekülünün kristal yapısının açığa çıkmasıyla daha da açıklığa kavuşmuştur. α veya ağır zincir (44-47 kd ağırlığında) ve non-kovalent bağlı hafif β2 mikroglobulin zinciri (12 kd ağırlığında) içeren bir heterodimerdir. α zincirleri MHC içerisindeki polimorfik sınıf 1 lokusu tarafından kodlanır. β2 mikroglobulin MHC dışındaki polimorfik olmayan bir lokus tarafından kodlanır (Hughes ve Yeager, 1998). 338 aminoasitten oluşan α zinciri, 3 bölgeye ayrılmaktadır; ekstrasellüler hidrofilik bölge (1-281 aminoasit), transmembran hidrofobik bölge (282-306 aminoasit), ve intrasellüler hidrofilik (307-338 aminoasit) bölgelerdir. Ekstrasellüler bölge 3 altbirime ayrılır; 1-90 aminoasitten oluşan α1, 91-180 aminoasitten oluşan α2, ve 181-271 aminoasit dizilimli α3 bölgeleridir. β 2 mikroglobülin ve α3 bölgeleri, molekülün alt bölümünü oluşturan ve immünglobilin etki alanına benzer bir β kıvrımlı yaprak yapısına sahiptir. α1 ve α2 bölgelerinin her biri 4 β iplikçiği ve bir α heliksten ibarettir ve bunlar molekülün üst kısmını oluştururlar. Bu iki etki alanının 8 β ipliği iki α heliksi destekleyen

10 bir platform olarak görev yapan bir β kıvrımlı yaprağı oluştururlar. Bu iki α heliks büyük bir antijenden elde edilen bir peptid fragmanı ile birleşecek, bir antijen bağlanma bölgesi olarak görev yapan oyuk bir alan oluşturur (Abbas ve ark, 1994). Sınıf 1 moleküllerinin gösterdiği polimorfizmin önemli bir kısmı bu α helikslerde ve oyuk bölgenin tabanını oluşturan β kıvrımlı yaprak platformunda oluşmaktadır. Böylece, antijen bağlama bölge alanları, bir sınıf 1 molekülünden diğerine çeşitlilik gösterir ve belirli bir sınıf 1 molekülü yalnızca sınırlı sayıdaki peptid fragmanlarını bağlayabilir. Sınıf 1 moleküllerinin antijen bağlama bölgeleri her ne kadar bağladıkları peptid fragmaları bakımından bir seçicilik gösterseler de bunlar immünoglobülünlerin çok özel olan özgünlüğü bakımından antijen bağlama bölgelerinden oldukça farklıdırlar. İki α heliksi (α1 ve α2) bağlı antijenik bölge ile birlikte sadece sınıf 1 moleküllerini taşıyan CD8T hücreleri üzerindeki T hücre reseptörü tarafından tanınan bir bağlanma meydana getirirler (Stites ve Terr, 1991). Şekil 2.2: MHC Sınıf I molekülünün şematik gösterimi 2.2.2. Sınıf 2 genleri ve molekülleri Sınıf 2 genleri, DNA molekülünün 500 kb lık bir kısmını oluşturmaktadır (Mak ve Simard, 1998). Sınıf 2 genleri; CD4+ deki TCR ye yardımcı T hücreleri, parazitlerin ve ekstraselüler proteinlerden türemiş antijenik peptitlerin sunumunda fonksiyonel olarak ayrılmış genlerin immünoglobulin süper familya üyeleridir. α ve β zincirli genler çok sıkı bir

11 şekilde lokalize olmuşlardır. Bu şekilleri ile iki genli duplikasyon ünitesine benzerler. Bütün setler her iki zincirde de gen içermezler çoğu pseodogendir (Tizard, 2004). MHC genleri içerisinde en polimorfik lokus sınıf 2 de bulunan DRB lokusudur. DRB genlerinin bir kısmı fonksiyonel bir kısmı fonksiyonel olmayan çoklu kopyasının bulunduğu bildirilmiştir (Andersson and Rask,1988). HLA sınıf 2 moleküller, kovalent olmayan bağlarla bir arada tutulan α ve β olmak üzere iki adet transmembran glikoprotein zincirinden oluşan heterodimerlerdir. Her iki zincirin de hücre zarı dışında sırasıyla C1, α2 ve β1, β2 olmak üzere 2 domainleri bulunur (Şekil 2.3). Membranın distalinde yerleşen ve polimorfik bir yapı gösteren α1 ve β1 zincirleri sınıf 1 moleküllerde olduğu gibi antijenlere ait peptidlerin yerleşebileceği kovuğa benzer bir yapı oluştururlar. Buraya yerleşenler, hücre dışından kaynaklanan (eksojen), daha büyük peptidlerdir. α1 ve α2 bölgeleri, sınıf 1 moleküllerdeki gibi Ig benzeri yapılar oluştururlar. α zinciri A, β zinciri ise B genleri tarafından kodlanır. Bu nedenle sınıf 2 bölgesinde yer alan DR, DQ ve DP bölgeleri sırasıyla DRA ve DRB, DQA ve DQB, DPA ve DPB olarak ikiye ayrılırlar. DR bölgesinde α zinciri kodlayan tek gen varken, β zinciri için 9 farklı bölge vardır. Bunların bir kısmı kodlama yapmayan genler olup; sadece DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 kodlayıcı genlerdir ve farklı beta zincirlerini kodlarlar. DRB1, 1-18 arasında değişen büyük HLA DR antijenleri için kodlama yaparken; DRB3, DRB4, DRB5, DRB1 antijenlerine bağlı olarak eksprese edilen sırasıyla DR53, DR54, DR51 antijenleri için kodlama yaparlar. HLA DQ ve DP bölgelerinde DR dekinden daha az sayıda alt bölge bulunur. DR bölgesinden farklı olarak DQ ve DP bölgelerinde a genleri de çeşitlilik gösterir. DRB genlerinin ancak %6 sı kodlama yapar. Kodlama yapan 6 eksondan ekson 2, polimorfik olan β1 domainini, ekson 3 ise β2 domainini kodlar (Klein ve Sato, 2000). Her bir sınıf 2 molekülü bir 34 kd 'lik α zinciri ve diğeri 29 kd 'llik β zinciri olan iki glikoprotein zincirinin oluşturduğu bir heterodimer yapıdadır ve bu zincirler non kovalent bağlanmışlardır. α zinciri 229, β zinciri 237 amino asitten oluşur. Sınıf 1 moleküllerinin ağır zinciri gibi sınıf 2, α ve β zincirlerinin her biri bir ekstraselüler hidrofilik, bir transmembran hidrofobik bölge ve intraselüler hidrofilik bölgeden ibarettir. Bunların son ikisi hücre membranı içine tutunmuşlardır. Ekstraselüler hidrofilik bölgedeki α zinciri α1 ve α2, β zinciri de β1 ve β2 olarak iki ayrı bölgeyi oluştururlar. α lar (l-84 ve 85-188), β 'lar (1-91 ve 92-192) aminoasit sırasındadırlar. α2 ve β2 bölgeleri immünoglobilin sabit bölgelerine benzeme açısından önemli bir homoloji gösterirler. DQ ve DP moleküllerinin yapısal özellikleri DR ile benzer şekildedir. DQ α zinciri 234, DQ β 229 aminoasit içerirken DP'nin her α ve β zincirleri 229 amino asit içerir. Sınıf 2 moleküllerinin kristalize yapısı henüz tam

12 bilinmemekle birlikte sınıf 2 molekülleri arasındaki benzerlik, sınıf 2 moleküllerinin yapısının bilgisayar ile varsayımlı şekilde tanımlanmasına olanak verir. Sınıf 2 α2 ve β2 bölgelerinin molekülün hücre membranı üzerindeki proximal bölgeyi oluşturduğu ve α1 ve β1 bölgelerinin distal alt bölgesini desteklediği düşünülmektedir. Bu son bölge (α1 ve α2) 8 β iplikçiği ve iki α heliks içeren aktif bir yapıdır ve sınıf 2 moleküllerindeki α1 ve α2 bölgeleriyle yakın bir benzerlik göstermektedir. Sınıf 2 molekülünün iki α heliksi ve β kıvrımlı yaprağın bir kısmı yarık veya oyuk bölgeyi oluşturulan sınıf 2 moleküllerinin polimorfizmi bu oyuk alanda lokalizedir ve her bir sınıf 2 moleküllü için farklı antijen bağlama bölgesi olmasını sağlar. Böylece belirli bir sınıf 2 molekülü sadece sınırlı sayıda antijenik peptid fragmanı bağlayabilir (Morimoto ve ark, 2004). Sınıf 2 moleküllerinin bu antijen bağlama alanları böylece antijenler için seçicilik gösterir. Ancak bu seçicilik immünglobilin antijen bağlama bölgesi hassaslığından yoksundur. Bu aktif antijenik peptid fragmanı iki α heliksi ve alt platformunca oluşturulan bu bölgedeki antijen bağlama oyuğu tarafından yakalanır. Bu α heliksleri ve antijenik peptid fragmanı CD4 T lenfositlleri üzerindeki reseptörlerce tanınan bir ligand oluştururlar. CD4 T lenfositlerce sınıf 2 molekülleri üzerindeki tanıma olayı CD8 T lenfositlerce sınıf 1 molekülleri üzerindeki tanıma olayı ile benzerlik gösterir (Yakut, 2004). Şekil 2.3: MHC sınıf 2 molekülünün şematik gösterimi

13 2.2.3. Sınıf 3 genleri ve molekülleri Bunlar diğer MHC parçaları ile ilişkilidir. Bu bölge yüksek gen yoğunluğuna sahiptir ve en az pseodogene sahiptir (Kulski ve ark., 2002). Bu bölgede lokalize olmuş genlerin bazıları immün sistemi içermez. İmmünobiyolojide açık rolü olan sınıf 3 genleri kademeli bileşenlerin üyelerini (C4A, C4B, C2 ve BF), TNF α, LTA ve LTB gibi genleri içerir (Campbell ve ark., 1986). Pek çok kompleman kompanenti için gereken yapısal genler, glikokortiokoidlerin biyosentezi için kritik bir enzim olan 21-Hidroksilaz için gereken genlerde burada kodlanır. Bu bölge 60 gen içermektedir (Roitt ve Delves, 2001). Sınıf 3 bölgesi çok az karakterize edilmiştir (Schwaiger ve ark., 1996). Sınıf 3 bölgesindeki koplement lokusu tarafından belirlenen kompleman bileşenleri de polimorfizm gösterirler. Elektroforetik hareketlilikleri ile ayırt edilebilen Properdin faktör B (BF) nin 4 alternatif formunu belirleyen 4 allel vardır. C2 nin iki yaygın formunu (C2 C) ve (C2 A) belirleyen C2 allelleri ve nadir görülen yetersiz (C2' QO) alleli bulunmaktadır. C4 lokusu, C4 genetik lokusunun iki ayrı mesafesinde iki ayrı bölgeye dublike olmuştur. C4 A, C4 komplemetinin elektroforetik olarak daha asidik grup içeren bölümü olarak belirlenir. C4 B, C4 komplementinin elektroforetik olarak daha fazla bazik grubunu içeren bölümü olarak belirlenir. C4 A lokusunda 7 yaygın yapısal allel ve bir yetersiz allel C4 B lokusunda ise 3 yaygın yapısal allel ile bir yetersiz allel bulunmaktadır (Abbas ve ark., 1994). Bu bölgeden kodlanan moleküller serumda serbest halde bulunurlar. Tranplantasyon immünolojisinde rol oynamadıkları gibi, T hücrelerine de antijen sunmamaktadırlar (Stites ve Terr, 1991). 2.3. MHC genlerinin kalıtımı ve allellerin adlandırılması MHC genleri mendel kalıtımı ve eş-baskın (co-dominant) özellik gösterirler. Kalıtım haplotipler olarak birbirine bağlı gen blokları halindedir. Her birey bir paternal ve bir maternal haplotip alarak her ikisinide eksprese eder (Rodney, 2000; Warrens ve Lechler, 2000). Rekombinasyon görülme sıkılığı %1-3 tür. Her bölgede yer alan allellerin sayısı göz önüne alındığında, populasyonlarda beklenenden daha az sayıda haplotip olduğu görülür. Bu durum bağlantı dengesizliği olarak ifade edilir ve bazı haplotiplerin korunma çabası ile açıklanmaktadır (Blasczyk, 1998; Klein ve Sato, 2000).

14 MHC genlerinde benzersiz bir genetik çeşitliliğin bulunduğu bilinmektedir. Bu genetik çeşitlilik farklı mekanizmalarla sağlanmaktadır. Sınıf 1 genlerinde polimorfizmi çok sayıda psödogen ve fizyolojik rolleri henüz bilinmeyen klasik olmayan genler sağlar. Sınıf 2 genlerinde ise DR alt bölgesindeki genlerin yapısı ve psödogenler etkilidir. MHC genleri içinde farklı allellerin oluşmasına sebep olacak şekilde dizi farklılıkları vardır. Bu çeşitlilik özellikle antijen sunulması sırasında T hücre reseptörü (TCR) ile ilişkiye giren zincirleri kodlayan genlerde dikkat çekicidir ( sınıf 1 genleri için ekson 2-3, sınıf 2 genleri için ekson 2). Alleller arasındaki farklar, peptidin taşındığı kovuğun üç boyutlu yapısı üzerinde etkili olduğundan; taşınabilecek peptitlerin seçilmesinde de önem kazanmaktadır(klein ve Sato, 2000). MHC bölgelerindeki bu çoklu allelik formlar pek çok çeşit mekanizma ile sağlanabilir; nokta mutasyonu, rekombinasyon ve gen değişimi gibi (Roitt ve Delves, 2001). Terminolojik olarak HLA-DRB1*0401 gibi bir örnek verildiğinde anlatılmak istenen şudur; moleküler tiplendirme sonucunda (* bunu göstermektedir) sınıf 2 nin R ailesinde β1 zincir geninde 0401 allelik varyantı saptanmıştır. Bu allele karşılık gelen serolojik antijen HLA-DR 04 tür. Saptanan allelin serolojik karşılığı olan numara ilk iki rakamı oluştururken bunu takip eden iki basamakta moleküler tiplendirme ile ulaşılan yüksek çözünürlükteki allel tipi verilir. Eğer düşük çözünürlükte bir analiz yapıldı ve 3. ve 4. Basamak karşılıkları bilinmiyorsa XX koyulacaktır. Örneğin HLADRB1*04XX (Dalva, 2004). 2.4. MHC gen ürünlerinin iģlevleri İmmün sistemin en önemli özelliği, daha önce belirtildiği gibi kendinden olanla olmayanı ayırt ederek infeksiyöz ajanlara karşı cevap verebilme yeteneğidir. Yüzeylerinde antijene spesifik reseptörler bulunan T ve B lenfositleri tarafından antijen tanınır, bir dizi immünolojik olaylarla sitotoksik T lenfositler ve antijene spesifik antikorlar oluşur. İnfeksiyöz ajanlara karşı immün cevabın başlaması ve düzen içinde devamı için birçok hücre dizileri arasında işbirliğinin olması gereklidir. Patojen ajanların çoğunun bu dizide yer alan hücre tarafından tanınabilmesi için önce antijenin tutulup işlenmesi ve dizide bir sonraki hücreye tanıtılması ve hücredeki spesifik reseptör tarafından fark edilmesi gereklidir. Antijenin spesifik reseptör tarafından fark edilmesine ilave olarak lenfositlerin çözünmüş poliklonal nonspesifik faktörlerce farklılaşması gerekir. Monosit ve makrofaj serisi hücrelerce yapılan monokinler ve Th (helper) lenfosit serisi hücrelerce yapılan lenfokinler, poliklonal farklılaşma faktörlerini sağlarlar. Sonuçta B lenfosit dizilerince antikor yapımı ve/veya T lenfosit dizilerince sitotoksik T hücre yapımı oluşur. Kompleman sisteminin

15 devreye girerek hızlandırmasıyla sitoliz, doğrudan T lenfositle sitotoksisite veya antikora bağlı hücresel sitotoksisite oluşur( Erdoğdu, 2007). a. T-hücre ve TCR Repertuvarlarının Oluşturulması: T hücrelerinin çoğu α ve β zincirinden oluşan reseptörleri eksprese ederler (Roitt ve Delves, 2001). T hücre reseptörleri, antijenleri MHC sınıf 1 ve ya 2 molekülleriyle ilişkili olan hücrelerin yüzeylerinde saptarlar (Germain, 1999). T-hücrelerinin timustaki olgunlaşma sürecinde seleksiyon işlevi bu kapsamda önemlidir. Bu süreç, T-hücre reseptörü (TCR) self MHC afinitesi düzeyinde kontrol edilen, pozitif ve negatif seleksiyon (apoptozis) işlemleri sonucunda yaklaşık % 2-5 T-hücresinin sağ kalabildiği bir seçimdir. Normal bir T hücresinden beklenen, sonuçta yalnızca kendi MHC molekülleri üzerinde sunulan yabancı peptidleri tanıyıp yanıt vermesidir. Bir başka anlatımla T hücrelerinden "self-mhc restricted" ve "self tolerant" olmaları beklenir. Bu uygunluk kendi MHC moleküllerine afinitesinin düzeyi ile yakın ilişki gösterir (Yiğitbaş, 2006). b. T-hücrelerine Antijen Sunumu: T-hücrelerinin peptidleri tanıyabilmeleri için, öncelikle antijenlerin antijen sunum hücreleri içinde işlenerek MHC molekülleri üzerinde T- hücrelerine sunulması gereklidir. Antijenlerin sınıf 1 ve sınıf 2 MHC molekülleri ile sunumları bazı benzerlikler gösterse de temelde farklılıklar vardır. Sitoplazmadaki yabancı proteinler (örneğin virus ile enfekte hücreler) endojen antijen yolunda işlenerek, endoplazmik retikulumda TAP (transporter associated with antigen processing proteins) aracılığı ile ağır zincir-β2 mikroglobulinden oluşan sınıf 1 moleküllerine bağlanır, hücre yüzeyinde CD8+ T-hücrelerine sunulur ve bu hücrenin eliminasyonu sağlanır. Sınıf 2 sunumunda ise; hücre içine alınan ekstraselüler moleküller enzimatik parçalanma işleminden geçirilerek, MHC-DM aracılığıyla sınıf 2 molekülleri üzerine bağlanarak hücre yüzeyinde CD4+ T-hücrelerine sunulur ve ekstraselüler antijenlerin eliminasyonuna giden mekanizmaların aktivasyonu sağlanır. MHC ye bağlı sunum sayesinde organizmadaki hücrelerin büyük bir çoğunluğu yabancı antijenler yönünden taranmış olur (Yiğitbaş, 2006). Böylece genel olarak, endojen protein antijenleri sınıf 2 sunumu için işlenirken, ekzojen protein antijenleri sınıf 2 sunumu için işlenir. Bu iki antijen sunumu şekillerle aşağıda açıklanmıştır.

16 Şekil 2.4: Endojen antijen sunumu Endojen antijen sunumununda MHC sınıf 1 molekülleri rol alır. Viral protein önce hücresel proteozom tarafından parçalanır (1)(Şekil 2.4). Parçalanan ürünler TAP aracılığı ile Endoplazmik Retikulum içine taşınır (2)(Şekil 2.4). Endoplazmik Retikulumda viral peptitler şaperonların yardımıyla aşama aşama MHC molekülleri ile birleşirler (3)(Şekil 2.4). MHC 1 molekülü daha sonra vesiküller ile Golgi aygıtına hareket eder. Golgi aygıtındaki modifikasyonlardan sonra MHC I kompleksi viral antijeni CD8 T hücrelerine sunacağı hücre membranına hareket ederler (4)(Şekil 2.4). MHC glikoproteinlerinin bazıları bakteri ve viruslara ait proteinlere bağlanarak onları işaretler ve immun sistemin diğer hücrelerini de uyarır. Bu süreç immun cevabın ilk aşaması olan Antijen işlenmesi (antigen processing) olarak adlandırılır.

17 Şekil 2.5: Eksojen antijen sunumu Eksojen antijen sunulumunda ise MHC sınıf 2 molekülleri rol alır. Patojen (eksojen bir antijen, örn viral protein) içeren bir fagozom bir lizozomla birleşir (1)(Şekil 2.5). Viral proteinler lizozomlarda proteazlar tarafından parçalanır (ph düşük) (2)(Şekil 2.5). Endoplazmik retikulum lümenindeki bir protein (invariant protein) MHC sınıf 2 ye diğer peptidlerin bağlanmasını engeller. Sınıf 2 MHC proteinler antijenin parçalandığı ve invariant proteinin uzaklaştırıldığı fagozomlara göç eder (3)(Şekil 2.5). Sınıf 2 molekülleri hücre membranına göç eder ve CD4 hücreleri için antijeni sunar (4)(Şekil 2.5). c. Natural Killer (NK) Hücre Aktivasyonunun Düzenlenmesi: NK hücreleri, T- hücreleri ile aynı progenitörden gelen öldürücü (killer) hücreler olmakla birlikte, doğal immün sistemin hücreleridir. NK hücreleri TCR gibi duyarlı sistemler kullanmazlar ve daha az seçicidirler. NK hücrelerinin yanıtı iki temel şekilde kontrol edilir. Birincisi, self-mhc nin bulunmadığı durumda aktivasyon, ikincisi ise, self-mhc nin bulunduğu durumda oluşan inhibisyondur. NK hücrelerinin kuvvetli aktivatörlerinden biri de MHC sınıf 1 bölgesinden eksprese edilen MICA molekülleridir MICA ve MICB, MHC sınıf 1 benzeri moleküllerdir. MICA genleri Isı-şok proteinleri (Heat-Shock Proteins, Hsp) promotor dizileri taşıdığından stres ile indüklenirler ve normalde NK hücrelerini inhibe eden MHC moleküllerinin varlığında bile kuvvetli aktivasyon yapabilirler. NK hücreleri bu özellikleri sayesinde Sitotoksik T lenfositlerin yedeklenmesi görevini yaparlar. Sitotoksik T-hücrelerin atağından kurtulan hücreler NK lar tarafından elimine edilirler (Yiğitbaş, 2006).

18 d. Gebelik: Fetüsün maternal immün ataktan korunabilmesi, steroidler ve korionik gonadotropinler gibi immünsupresan plasental hormonlar dışında iki önemli mekanizmayla sağlanmaktadır. Plasental trofoblastlar MHC-A, B, C gibi sınıf 1 moleküllerini eksprese etmezler, dolayısıyla Sitotoksik T-hücrelerin saldırısından korunurlar. Diğer yandan yüksek oranda eksprese olan MHC-G ve MHC-E ise NK hücrelerinin inhibisyonunu sağlamaktadır (Yiğitbaş, 2006). e. Eşleşme Tercihi: Eşlenme tercihindeki içgüdüsel mantık, kendisinden farklı MHC repertuvarı taşıyan organizmayı tercih ederek, yeni kuşağı daha geniş çeşitlilikteki antijenlere karşı koruyabilmektir. Tümü de olfaktör reseptörlere dayalı üç hipotez fare ve insan deneyleriyle doğrulanmıştır. HLA Sınıf 1 bölgesinde olfaktör reseptörleri kodlayan genlerin gösterilmesi de bu görüşleri destekler niteliktedir (Roitt ve ark., 2001; Klein ve Sato, 2000). 2.4. Moleküler Genetik Tanımlama Yöntemleri Son 30 yıl içinde DNA molekülü temelinde ve moleküler genetik işaretleyiciler (marker) olarak tanımlanan çeşitli teknolojiler geliştirilmiştir. Bu teknolojiler hayvancılıkta; populasyonların tanımlanmasında, gen fonksiyonlarının belirlenmesinde, evrim hakkındaki bilgilerin geliştirilmesinde, genom haritalarının çıkarılmasında, ebeveyn tayini çalışmalarında ve seleksiyonda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu teknikler ile ırklar içi/arası genetik varyasyonlar belirlenebilmektedir. Hayvancılıkta son yıllarda yaygın olarak kullanılan moleküler yöntemlerlerin büyük bir kısmı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tepkimesine dayanmaktadır. PCR a dayalı en yaygın kullanılan moleküler marker teknikleri; RAPD (Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA Yöntemi), RFLP (Kesilen Parça Uzunluk Polimorfizmi), AFLP (Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi), Mikrosatelitler, SSCP (Tek Zincir Konformasyon Polimorfizmi) ve SNP (Tek Nükleotid Polimorfizmleri) markerleridir. Bu tekniklerin klasik ıslah yöntemleri ile birlikte kullanımı ve ıslah çalışmalarına katkıları gün geçtikçe artmaktadır (Avise, 2004). 2.4.1. PCR (Polimeraz zincir reaksiyonu) PCR doğal DNA replikasyon işleminin temel bileşenleri kullanılarak DNA molekülünün laboratuar (in vitro) koşullarında çoğaltılması ya da kopyalanmasıdır. PCR, üzerinde durulan bir gen yada DNA bölgesinin belirli primerler kullanılarak in vitro ortamda

19 çoğaltılmasını sağlayan bir yöntemdir. PCR yöntemininin temel prensipleri ilk defa 1985 de Kary Mullis tarafından ortaya konmuş, ancak daha sonra bu teknik Saiki et al. (1985) tarafından değiştirilmiştir. PCR yönteminin geliştirilmesi moleküler biyoloji alanında çok önemli bir dönüm noktası olarak kabul edilmektedir (Saiki ve ark., 1988). PCR yöntemi genel olarak üç basamaklık bir döngünün defalarca tekrarlanmasına dayanan bir teknik olup üç aşamadan oluşmaktadır. Bu aşamalar; a) DNA eksenlerinin birbirinden ayrılması (denaturation), b) Primerlerin komplementer DNA bölgesiyle hibrit oluşturması (annealing) ve c) Yeni eksenlerin sentezinin yapılması (extension) aşamalarıdır. Kalıp DNA nın iki ekseni, yaklaşık 94-95 o C lık sıcaklık uygulamasıyla birbirinden ayrılmaktadır. PCR ın ilk aşaması olan bu işlem DNA eksenlerinin birbirinden ayrılması olarak bilinmektedir. Eksenlerin ayrılması, 15 saniyeden birkaç dakikaya kadar olabilmektedir. İkinci aşama oligonükleotid primerlerinin (6-30 bazlık) kalıp DNA üzerindeki tamamlayıcı (complementary) sıralara eşlenmeleri ve hibritlenme olayının olmasıdır. Bunun için denatürasyon sıcaklığından daha düşük hibritlenme sıcaklığına reaksiyon soğutulmaktadır. Primerlerin doğru bir biçimde hibritlenmesi için sıcaklığın 40-72 o C (optimum 55 o C) arasında olması gerekmektedir. Reaksiyon bu sıcaklıklara soğutulduğunda primerlerin tamamlayıcı DNA ile hibritlenmesi sağlanmış olur. Primerlerin bağlanması için 55 o C de 1-2 dk tutmak yeterlidir. En son aşama olarak optimum sentez sıcaklığında (72 o C), sıcaklığa dayanıklı özgün bir DNA polimeraz enzimi, primerlerin 3 OH uçlarına deoksiribonükleotidleri ekleyerek yeni eksenleri kalıp sıraya komplementer olacak şekilde sentezlemektedir. Bu son aşama yeni DNA eksenlerinin sentezinin yapılması olarak bilinmektedir. Uzama aşamasının 1-3 dk kadar olması önerilmektedir (Mullis, 1990; McPherson ve Møller, 2001). PCR yöntemi geliştirildikten sonra hedeflenen gen bölgesinin çoğaltılması çok daha kolay olmuş ve PCR temelli çok sayıda marker (işaretleyici) tekniği geliştirilmiştir. Bu tekniklerin bir kısmı aşağıda özetlenmiştir. 2.4.2. RAPD (Rasgele ÇoğaltılmıĢ Polimorfik DNA Yöntemi) DNA işaretleyicileri geliştirmek için en fazla kullanılan yöntemlerden biri RAPD tekniği olmuştur. İki ayrı araştırmacı grubu 1990 yılında (Welsh ve McClelland, 1990; Williams ve ark.,1990) özgül nükleotid dizisi bilgisine gereksinim olmadan PCR yöntemi ile

20 polimorfizmin tek bir primer kullanılarak ortaya konabileceğini göstermişlerdir. Bu yöntem ile DNA düzeyindeki çeşitlilik diğer yöntemlere göre daha çabuk ve kolay bir şekilde ve daha ucuza saptanabilmektedir (Cushwa ve Medrano, 1996). PCR yöntemine (Mullis, 1990) dayalı olan bu teknikle, sentetik olarak oluşturulan rasgele nükleotid dizisine sahip primerler (örneğin ACGGTCACTG), genomik DNA nın çeşitli bölgelerinin çoğaltımında kullanılmaktadır (Cushwa ve Medrano, 1996). Aynı PCR reaksiyonu esnasında her bir RAPD primeri farklı lokuslardan bir dizi DNA bölgesini (1 ile 10 arası veya daha fazla) çoğaltma kapasitesine sahiptir. RAPD analizlerinde, yaygın olarak 10 bazlık uzunluğa sahip primerler kullanılmaktadır (Cushwa ve Medrano, 1996). Daha kısa veya uzun baz dizisine sahip primerleri düzenleyip kullanmak da olasıdır. Ancak primerin boyutunun uzun veya kısa olması genomda karşılık gelen bölge sayısını doğrudan etkilemektedir (Binbaş, 2006). Diğer yöntemlere göre ucuz olması, çabuk sonuç vermesi ve DNA baz dizisine yönelik ön bilgi gerektirmemesi gibi nedenlerden dolayı türlerin belirlenmesi, populasyon içi veya populasyonlar arası genetik benzerlik ve farklılıkların belirlenmesi için RAPD tekniği 90 lar ve 2000 li yılların başında sıklıkla kullanılmıştır (Bardakçı, 2000). Bunun yanında, babalık testleri ve genetik kaynakların korunmasına yönelik strateji belirleme gibi amaçlar için nadir de olsa kullanılmaktadır (Cushwa ve Medrano, 1996). Yöntemin en büyük dezavantajları ise dominant kalıtım göstermesi ve tekrarlanabilirliğinin düşük olmasıdır (Frankham ve ark., 2005). RAPD yöntemi başlangıçta bitki ve mikroorganizmalara yönelik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmasına karşın daha sonraki dönemlerde çiftlik hayvanlarında da etkin bir şekilde kullanılmaya başlanmıştır. Koyunlara yönelik olarak farklı yurt dışı çalışmalarda RAPD yöntemi gerçekleştirilmiştir (Cargill ve ark., 1995; Cushwa ve ark., 1996; Ali, 2003). Ülkemizde ise sığır ve tavuklarda yapılan kimi çalışmalar (Güneren, 1999; Ivgin ve Bilgen, 2002) yanında yerli koyun genotiplerimizin tanımlanmasına yönelik çok sayıda çalışmaya rastlanmıştır (Budak, 2003; Mercan, 2004; Arıca ve ark., 2006; Aytekin, 2006; Binbaş, 2006; Saygılı, 2007; Budak ve Arıca, 2009). 2.4.3. RFLP (Kesilen Parça Uzunluk Polimorfizmi) Restriksiyon parçacık uzunluk polimorfizmi (RFLP) yöntemi, restriksiyon endonükleazlar kullanılarak DNA molekülünün özgün noktalardan kesilmesi işlemine dayanmaktadır. Linn ve Arber (1968) ile Meselson ve Yuan (1968) yaptıkları çalışmalarda DNA üzerindeki bazı özel dizileri tanıyan ve DNA molekülünü bu dizilerden kesen restriksiyon endonükleaz bakteri enzimlerini elde etmişlerdir. Restriksiyon endonükleaz

21 enzimleri, çift iplikçikli DNA üzerindeki özgül bölgeleri tanımakta ve DNA daki iki ekseni de keserek bir bölgeyi ya da bir bölgedeki DNA parçasının ortaya çıkarılmasında görev almaktadırlar. Değişik bakteri suşlarından baz sayıları ve tanıma dizileri farklı olan kesim enzimleri oluşturulabilmektedir. DNA üzerindeki restriksiyon tanıma dizilerinde oluşan herhangi bir SNP ve mutasyonda, restriksiyon enziminin o bölgeyi tanıyamaması sonucu, kesim gerçekleşmeyebilmektedir. RFLP kesim ürünlerinin analizi, genellikle agaroz jel elektroforezinde etidyum bromür ile ultraviyole (UV) ışıkta görünür duruma getirilerek yapılmaktadır. Jel görüntüsünde elde edilen bantlar arasındaki farklılıklar, tanıma bölgelerindeki nükleotid polimorfizmlerinin varlığını göstermektedir. Bir bölgedeki DNA dizisinde gözlenen insersiyon ve delesyonlar değişikliklere neden olabilmektedir. Bu değişiklikler her birey için karakteristik olan nükleotid değişimlerinin varlığını göstermektedir ve bireyler arasındaki genetik polimorfizmlerin değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. PCR ile çoğaltılmış belirli bir gen bölgesi, RFLP yöntemi kullanılarak, tanımlanmış özel mutasyonlara karşı uyumlu restriksiyon enzimi ile taranabilmektedir. Analiz edilen gen bölgesinin, agaroz jel görüntüsündeki bantların sayılarına, büyüklüklerine bakılarak allel polimorfizmleri tespit edilebilmekte, lokusa ait homozigot ve heterozigot genotip frekansları saptanabilmektedir (Klug ve Cummings, 2003). Moleküler biyoloji alanında elde edilen büyük buluşların çoğu restriksiyon enzimlerinin keşfinden sonra gerçekleşmiştir. Moleküler genetik laboratuvarlarında, restriksiyon enzimleri, restriksiyon uzunluk polimorfzmini analiz etmede geniş uygulama alanına sahiptir. Bütün RFLP uygulamaları bir veya daha fazla restriksiyon enzimi ile DNA kesimini içerir ve jel elektroforezi ile meydana gelen DNA parçaları birbirinden ayrılır. Daha sonra çeşitli boyuttaki DNA parçaları ya manüel ya da otoradyografi yöntemi ile gözlenir (Başıbüyük, 2000). 2.4.4. AFLP (ÇoğaltılmıĢ Parça Uzunluk Polimorfizmi) AFLP tekniği, RAPD ve RFLP tekniklerinin kombinasyonu olan bir uygulamadır. AFLP tekniğinin polimorfizm oranı çok yüksektir. Çok sayıda lokusu aynı anda ve etkili bir şekilde tarar. Bu teknik tür, ırk ve çeşitlere ait genetik ilişkilerin ortaya çıkarılması, ekotip ve klonal polimorfizmin belirlenmesi ve genetik haritalama çalışmalarında yaygın bir şekilde kullanılmaktadır (Vos ve ark., 1995). AFLP yönteminin kullanılmasındaki esas amaç, iki restriksiyon endonükleaz enzimiyle muamele edilerek kesilmiş çok sayıda genomik DNA parçacığının bulunduğu bir

22 karışımda yer alan restriksiyon parçacıklarının özel bir alt grubunun çoğaltılmasıdır (Avise, 2004). AFLP tekniği ile polimorfizm elde etme olasılığı oldukça yüksektir ve genom hakkında herhangi bir ön bilgi olmadan bu teknik uygulanabilmektedir. Elde edilen her bir marker oldukça güvenilir ve bilgi sağlayıcıdır. AFLP tekniğinin en önemli eksikliği dominant markerler vermesidir. Ayrıca bu teknikte 50-100 gibi çok sayıda çoğaltılmış parçacık elde edildiği için bunların analizlerinin otomatik olarak bilgisayar kontrolünde yapılması gerekmektedir. Genetik haritalamada AFLP markerleri genellikle kromozomların sentromer ve telomer (uç bölgeleri) bölgelerinde toplanmaktadır. Bu durum kromozomların diğer bölgelerinin analizlerini güçleştirmektedir (Zabeau ve Vos, 1993; Vos ve ark., 1995). 2.4.5. Mikrosatelitler Mikrosatellitler genom içerisinde mono, di, tri yada tetra nükleotid permutasyonların herhangi biri şeklinde tandem olarak tekrarlanan kısa DNA sekanslarıdır (Ellegren, 1993) Mikrosatellitlerin en önemli özellikleri polimorfik olmalarıdır. Mikrosatellitler genom içerisinde rastgele dağılmışlardır. Mikrosatellitler temel olarak tüm populasyon içerisinde benzer özellikler göstermesine rağmen bireyden bireye tekrar sayıları bakımından farklılıklar göstermektedirler. Bu nedenle mikrosatellitler, genom analizi ve gen kartlarının çıkarılması, ebeveyn analizleri gibi alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Bir çok omurgalı hayvanda bulunan mikrosatellitlerin temel motifi (CA)n dir (Hearne ve ark., 1992). Eşbaskın (ko-dominant) kalıtım gösteren mikrosatellitler, 2-6 nükleotid uzunluğunda kısa, tekrarlanan DNA dizilerini içermektedirler (Avise, 2004; Freeland, 2005). Polimorfik bir lokusta tekrarların sayısı bireyden bireye 5 ten 100 e kadar değişebilmektedir. PCR ürünleri her bir lokusa göre değişen ve genel olarak 75 ile 300 baz çifti uzunluğu arasında olabilmektedir (Allendorf ve Luikart, 2007). Mikrosatellitler, eşbaskın kalıtım özellikleri lokusa özgü olmaları, genom içinde düzgün ve geniş yayılımları, yüksek mutasyon oranı ve informatif değerleri yanında PCR ye dayalı bir teknik olmasından dolayı birçok türde yaygın olarak kullanılmaktadır (Van-Zeveran ve ark., 1995; Canon ve ark., 2006). 2.4.6. SSCP (Tek Zincir Konformasyon Polimorfizmi) Tek zincir konformasyon polimorfizmi (SSCP), bilinmeyen mutasyonların saptanması için PCR a dayalı ucuz, kolay, duyarlı ve güvenilir bir tarama yöntemidir (Jordan ve ark., 1997, Kukita ve ark., 1997). Bu yöntem genellikle küçük insersiyon ve

23 delesyon mutasyonları ile nokta mutasyonlarının saptanması için tercih edilmektedir. Özellikle gen dizisi büyük olan gen bölgelerinde dizi analizi yapılacak bölgeyi önceden saptamak için en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Bu yöntem ile mutasyon saptama oranı % 80 ile % 90 arasında değişmektedir (Sheffied ve ark., 1993). Metodun temeli, nükleotid dizisindeki değişikliklerin DNA tek eksenlerinin konformasyonunu etkilemesi sonucu elektrik hareketiyle farklı bantlar vermesidir. SSCP analizleri güvenirliği ve hassaslığı nedeniyle doğal mutasyonların ve DNA fragmentlerinin incelenmesi için uygundur. Çevresel değişkenlik DNA konformasyonu üzerinde doğrudan etkilidir. Böylece sıcaklık, iyonik güç, ph ve jelde denatürasyon ve parametreler elektroforetik hareketliliği etkiler. SSCP analizi, tek zincirli DNA molekülündeki bir veya birden fazla nükleotid değişiklerinin, elektroforetik mobiliteyi değiştirme etkisine dayanarak mutasyonları saptayabilen bir yöntemdir. SSCP, dizi analizine alternatif olan bir yöntemdir ve tek bir nükleotid farklılığı dahi belirlenebilmektedir (Orita ve ark., 1989). Nokta mutasyonları, DNA dizi analizi ile kesin teşhis edilebilmesine rağmen aranacak DNA parçası büyüdükçe, teşhis süresi ve analiz maliyeti artmaktadır. Bunu önlemek amacıyla; mutasyon içeren gen, kısa DNA parçacıkları halinde çoğaltılıp SSCP yöntemiyle taranarak mutasyonun bulunduğu fragment belirlenir. Böylece, büyük bir genin tümünü analiz etmek yerine sadece mutasyon içeren parçanın incelenmesi, süreci kısaltmasıyla maliyeti de azaltmaktadır. Burada asıl amaç mutasyonun bulunduğu bölgeyi belirlemektir. Yöntem, mutasyonu aranacak olan genin, primerler ile parçalar halinde çoğaltılması ve baz dizisinin veri tabanındaki diziden farklı olup olmadığının araştırılması ilkesine dayanmaktadır (Orita ve ark., 1989). 2.4.7. SNP ler (Tek Nükleotid Polimorfizmleri) SNP en basit tanımla ile iki birey arasındaki belli bir DNA parçasındaki tek nükleotid farklılığıdır. Bir populasyondaki bireyler arasında yüksek yer değiştirme (substitüsyon) oranı gösteren, bir nükleotid olarak da tanımlanabilir (Wang ve ark., 1998). Brookes (1999) tarafından yapılan farklı bir tanımlamaya göre SNPler, (allel sıklığı en az % 1 veya daha fazla olan) bazı populasyonlardaki normal bireylerde bulunan farklı sekans alternatifli genomik DNA lardaki tek baz değişimidir. Sıklıkla ortaya çıkan bu durum SNP leri nadir nokta mutasyonlarından ayırır ve genetik marker olarak kullanımını daha uygun hale getirmektedir. Bazı araştırmacılar SNP tanımı içine tek nükleotid substitüsyonlarını ilave etse de, SNP markerleri biçimsel olarak tek nükleotid ekleme veya çıkarımlarını içermez (Cho ve ark.,1999). SNP ler transisyonlar (bir

24 pürin bazın A/G diğer bir pürin bazıyla veya bir pirimidin bazın C/T diğer pirimidin bazıyla değişmesi) ve transversiyonlar (bir pürin bazının bir pirimidin bazına değişimi veya tersi) gibi baz değişimlerini içermektedir. Genomda transversiyon olma ihtimali transisyonlardan daha yüksek olmasına rağmen transisyon sıklığı transversiyon sıklığından daha yüksektir. G>A ve C>T transisyonları, insan genomundaki SNP lerin % 25 ini oluşturmaktadır (Brookes, 1999). Bir populasyondaki tek bir baz değişiminin frekansı % 1 den büyük ise bu değişim SNP, % 1 den küçük ise mutasyon olarak adlandırılmaktadır. Çok yakın akraba bireylerde SNP gibi markerlerin potansiyeli oldukça büyüktür. İnsan genomu yaklaşık 2.91 milyar baz çiftine ve 25.000 gene sahiptir. Tüm insanların baz diziliminin % 99.9 u birbirinin aynıdır. Gen dizilimindeki % 0.1 lik varyasyon insanlar arasındaki çeşitliliğin genetik kökenini açıklamaktadır. Bu değişiklikler; zararsız (fenotipteki değişiklikler), zararlı (diyabet, kanser, kalp hastalığı, kansızlık) ya da gizli olabilir (kodlanan ve düzenleyici bölgelerde bulunmayan değişiklikler). Genetik olarak uzak İki birey arasındaki 1250 bp deki 1 farklılık toplam 2.3 milyon farklılık demektir ki insan genomunda 10-30 milyon arasında SNP olduğu bildirilmektedir (Sönmezoğlu ve ark., 2010). 2.5. Türkiye de yerli koyun ırkları ile ilgili yapılmıģ tez çalıģmaları Türkiye yerli koyun ırklarının tanımlanması amacıyla öncelikli olarak morfolojik karakterler bakımından sınıflandırmalar yapılmış, daha sonraki çalışmalarda ise yerli koyun ırklarımızın genetik olarak tanımlanmasında biyokimyasal markerler ele alınmıştır. Son yıllarda ise DNA düzeyinde yürütülen genetik tanımlama çalışmaları hızla artmış ve Türkiye yerli koyun ırklarının tanımlanması amacıyla farklı DNA marker yöntemleri kullanılarak çok tez çalışması ve makaleye rastlanılmıştır. Türkiye yağlı kuyruklu koyun ırklarından, Akkaraman, Morkaraman, Güney Karaman, İvesi ve Dağlıçta genetik varyasyonu ortaya koymak amacıyla Balcıoğlu (1995) nun yaptığı doktora tezinde, potasyum (K), hemoglobin (Hb), transferrin (Tf) ve arilesteraz (EsA, E. C. 3. 1.1. 2) polimorfizmi üzerinde çalışılmıştır. Akkaramanda Hb, İveside EsA lokusları hariç, çalışılan bütün lokuslarda polimorfizm gözlenmiştir. En yüksek ortalama heterozigotluk 0.231 ile iveside, en düşük ise 0.1532 ile Akkaramanda gözlenmiştir. Populasyonlar arasındaki genetik ilişkilerin tahmin edilmesi için hesaplanan Nei'in genetik uzaklık değerleri 0.004 ile 0.144 arasında değişmiştir, çizilen dendograma göre yapılan sınıflandırmada Güney Karaman, Dağlıç aynı sınıfı, Akkaraman, Morkaraman ve İvesi diğer sınıfı meydana getirmiştir.

25 Budak (2003) ın yaptığı tez çalışmasında Türkiye'nin üç yerli koyun ırkından Sakız, Karayaka ve Bafra'nın genetik ayırımında RAPD markerleri kullanılmıştır. Bu çalışmada daha önceki bir çalışmada kullanılan on sekiz ve rasgele olarak seçilen iki tane primer olmak üzere toplam 20 primer, 160 bireyde taranmıştır. Bu primerlerden 6'sından toplam 67 polimorfik bant elde edilmiştir. Polimorfizm oranı, Karayaka ırkında % 22.39 ve Bafra ırkında % 53.73 değerleri arasında bulunmuştur. Nei'nin genetik mesafesi 0.0432-0.4709 arasında değişirken, populasyon içi farklılaşma Hs = 0.30 olarak bulunmuştur. Karayaka koyun ırkında genetik benzerliğin değerlendirilmesi ve mevcut genetik varyasyonun ortaya konulması amacıyla Mercan (2004) ın yaptığı tez çalışmasında RAPD yöntemi uygulanmış ve OP-AI ile OP-D serisi 10 mer'lik 40 RAPD primeri kullanılmıştır. Çalışma sonucunda en fazla bant sayısı Bafra II populasyonunda (24) ve en düşük bant sayısı Ladik I (14) populasyonunda gözlenmiştir. Populasyonlara ait genetik benzerlik oranları 0,25 ile 0.6677 arasında varyasyon göstermiştir. Ladik I ve Ladik II populasyonları % 66.67 oranıyla birbirlerine en fazla benzeyen populasyonlar olarak ortaya çıkmıştır. En düşük benzerlik katsayısının ise % 25 ile Kampus ve Ladik II populasyonları arasında olduğu belirtilmiştir. Benzer şekilde RAPD yöntemini kullanarak Güney Karaman koyunlarında genetik polimorfizmi belirlemek amacıyla, Aytekin (2006) in yaptığı tez çalışmasında 8 erkek ve 8 dişi toplam 16 bireyde rasgele seçilmiş oligonükleotid primerler ile PCR yapılmıştır. Taranan primerlerden çoğaltılabilir ve skorlanabilir olan en uygun 10 primer seçilerek toplam 1451 DNA bantı elde edilmiştir. Bütün RAPD bantları 600-3000 bç aralığında tespit edilmiştir. Toplam 147 bantın 133 ü polimorfik (% 90.48), 14 ü monomorfik (% 9.52) bulunmuştur. Populasyon içi ortalama genetik benzerlik (bant paylaşım frekansı, Fxy) ve genetik uzaklık oranları sırasıyla 0.7009 ve 0.2991 olarak hesaplanmıştır. Ortalama heterozigotluk oranı 0.3273±0.1697 olarak tahmin edilmiştir. Soyları tükenmekte olan yerli gen kaynağı Çine Çaparı koyun ırkında ırk içi çeşitliliğe ait mevcut durumun RAPD yöntemi ile ortaya konulduğu bir tez çalışmasında üç Çine Çaparı sürüsünden seçilen 72 adet bireyde (Adnan Menderes Üniversitesi Çine Çaparı Koruma Programı (ADÜ-ÇÇKP) sürüsünden 26 adet, Tatarmemişler köyündeki Erdoğan Aktürk e ait sürüden (EA) 32 adet ve Dereköy köyündeki Mustafa Vural a ait sürüden (MV) 14 adet) toplam 24 primer kullanılarak genotiplendirme yapılmıştır. Sonuçta sürü içi bireyler arası genetik benzerlikler; ADÜ-ÇÇKP sürüsünde 0.4468 ile 0.8511 arasında, EA sürüsünde 0.4894 ile 0.8723 arasında ve MV sürüsünde 0.5745 ile 0.8723 arasında bulunmuştur. Sürü

26 içi bireyler arası genetik uzaklıklar ise, ADÜ-ÇÇKP sürüsünde 0.1613 ile 0.8056, EA sürüsünde 0.1366 ile 0.7147 arasında ve MV sürüsünde 0.1366 ile 0.5543 arasında değişmiştir. Sürüler arası genetik benzerlikler 0.8439 ile 0.9037 arasında, genetik farklılık ise 0.0902 ile 0.1698 arasında bulunmuştur. Bu sonuçlara göre ADÜ-ÇÇKP sürüsü ile EA sürüsündeki hayvanlar genetik benzerlik bakımından MV sürüsüne oranla birbirlerine daha yakın bulunmuşlardır. Bu sonucun elde edilmesinde ADÜ-ÇÇKP sürüsü ile EA sürüsü arasında Çine Çaparı koç alışverişinin olması büyük önem taşıdığı çalışmada vurgulanmıştır (Binbaş, 2006). Türk Merinosu ve Morkaraman ırklarının genetik tanımlanmasında RAPD yönteminin kullanıldığı bir tez çalışmasında ırklar arası genetik mesafe ve polimorfizm araştırılmış ve çalışmada rasgele 10 adet RAPD primeri taranmıştır. Bu 10 RAPD primerinden 5 tanesi ile toplam 24 adet bant elde edilmiştir. Bu bantlar 225-750 bp arasında değişen uzunluklarda bulunmuştur. Polimorfik lokus oranı Türk Merinos unda % 58.33, Morkaraman da % 66.67 olarak bulunmuştur. Irklar arasındaki genetik farklılık 0.2548 iken, ırk içi genetik farklılık 0.2135 ve populasyonlar arasındaki farklılaşmanın oranı ise 0.1813 olarak tespit edilmiştir. Heterozigotluk oranı Türk Merinos unda 0.1792, Morkaraman da ise 0.2489 olarak hesaplanmıştır (Saygılı, 2007). Meydan (2008) ın yaptığı tez çalışmasında, Türkiye deki Sakız, İmroz, Kıvırcık, İvesi koyun ırklarındaki genetik farklılıklar araştırılmıştır. Çalışılan tüm hayvanların genotiplendirilmesi, FAO tarafından önerilen 7 mikrosatellit markeri kullanılarak yapılmıştır. 180 hayvanda toplam 7 mikrosatellit lokusu PCR ile çoğaltılmış ve allel büyüklükleri tespit edilmiştir. En yüksek heterozigotluk oranı Kvırcık ırkında OarFCB128 lokusunda 1.000 olarak bulunmuştur. En düşük değerler ise İmroz ırkı için OarHH41 ve OarHH35 lokuslarında 0.200 olarak bulunmuştur. Sakız ırkı için de en düşük değer 0.200 olarak, OarHH47 lokusunda ve İvesi ırkı içinde 0.200 olarak OarHH64 lokusunda tespit edilmiştir. Sakız ve İvesi ırkları arasında genetik uzaklık 0.673 olarak bulunurken, Kıvırcık ile Sakız ırkı arasında genetik uzaklık 0.028 olarak tespit edilmiştir.. En düşük heterozigotluk değeri OarHH35 ve OarHH41 lokuslarında 0.200 olarak görülmüştür. OarAE129 ve OarFCB48 lokusları Sakız ırkında; OarHH47 lokusu ise İvesi ırkında polimorfizm göstermemiştir. Yıldıran (2009) ın yaptığı tez çalışmasında, yerli koyun ırklarından Bafra, İvesi, Karayaka, Morkaraman, Sakız ve Türk Merinosu ile çalışılmış ve ırk içi ve ırklar arasındaki genetik polimorfizm mikrosatellit analizleri ile belirlenmiştir. Çalışmada JMP29 ve JMP58 mikrosatellit lokuslarında gümüş nitrat boyama ile otoradyografi yöntemi kullanılırken,

27 diğer lokuslar; MAF209, MAF65, OarCP34, DYMS1 lokusları için otomatik DNA dizi analiz cihazı kullanılmıştır. En yüksek heterozigotluk değerlerinin (0.596-0.961) MAF209 lokusunda, en düşük heterozigotluk değerlerinin (0.178-0.256) ise OarCP34 lokusunda olduğu gözlenmiştir. Tüm ırklar içinde en yüksek heterozigotluğa sahip ırkın Türk Merinosu olduğu belirlenmiştir. MAF209, MAF65, OarCP34, DYMS1 lokusları için ırklar arasında genetik mesafe 0.0347 ile 0.3021 değerleri arasında bulunmuştur. Bu değerlere göre genetik olarak en yakın ırklar, Sakız ve Morkaraman iken; en uzak olanlar ise Türk Merinosu ve İvesi ırkları olarak bulunmuştur. Tüm lokuslar için 9 özgün allelin 6 sının Türk Merinosu nda, 3 ünün ise Bafra ırkında olduğu gözlenmiştir. Ancak bu allellerin frekansı 0.2 den küçük bulunmuştur. Çine Çaparı koyunlarda süt verim özelliklerinin tanımlanması ve süt protein genlerinden biri olan β-laktoglobulin (β-lgb) geni bakımından var olan polimorfizmin belirlenmesi amacıyla PCR-RFLP metodu kullanılmıştır. Süt verim denetimleri, bir sürüde bulunan 40 baş koyunda, β-lgb genotiplendirmesi ise, Çine Çaparı populasyonunun tümünü oluşturan üç sürüde bulunan toplam 128 baş koyunda belirlenmiştir. İncelenen populasyonda β-lgb geninin sadece A ve B alellerine rastlanmış, C aleline ise rastlanılmamıştır. Olası üç genotip olan AA, AB ve BB için gözlenen genotip frekansları sırasıyla 0.078, 0.453 ve 0.469 olarak bulunurken, A ve B allel frekansları sırasıyla 0.3047 ve 0.6953 olarak hesaplanmıştır. Yapılan ki-kare analizi sonucunda Mustafa VURAL a ait sürü dışındaki tüm sürülerin Hardy-Weinberg genetik dengesinde olduğu anlaşılmıştır. Günlük ortalama süt verimi, laktasyon süresi ve laktasyon süt verimi için en küçük kareler ortalamaları sırasıyla 0.521 kg, 159.5 gün ve 81.78 kg olarak tespit edilmiştir. Ele alınan tüm özellikler bakımından koyun yaşı ve doğum tipi istatistiki olarak önemli bir varyasyon yaratmamıştır (P>0.05). β-lgb genotiplerinin (AA, AB, BB) laktasyon süresi ve laktasyon süt verimi üzerinde istatistiki olarak önemli (P<0.05), günlük ortalama süt verimi üzerinde ise önemsiz (P>0.05) etki yaratmıştır. Çalışma sonucunda, Çine Çaparı koyun ırkının korunmasına yönelik aktivitelere yönelik kimi öneriler sunulmuştur (Erdoğan 2010). İran ve Türkiye de yetiştirilen yerli koyun ırklarından Lori-Bakhtiari, Shal, Zandi, İvesi ve Morkaraman koyun örneklerinin prion protein hastalığı bakımından değerlendirilmesi ve risk gruplarının bulunması amacıyla yapılan bir tez çalışmasında, PrP alelleri bakımından genotipleri belirlemek amacıyla PCR ve DNA dizi analizi yapılmıştır. Çalışmada dokuz farklı polimorfik allel elde edilmiştir. Bunlar; ARQ, ARK, ARH, ARL, ARR, SRQ, TRQ, VRR ve VRQ alelleridir. İzlenilen genotipler ise, ARQ/ARQ, ARQ/ARK, ARQ/ARH, ARQ/ARL, ARQ/ARR, ARQ/TRQ, ARH/ARH, ARH/ARR, ARH/VRR,

28 ARR/VRQ, TRQ/SRQ, TRQ/TRQ ve VRQ/VRQ şeklindedir. Ayrıca PrP geninde M112T, G127S, G127V, H143R, G145V ve N146S ilave polimorfizmler tanımlanmıştır. Analiz sonucunda elde edilen veriler ile her iki ülkenin yerli koyunlarının dirençlilik açısından 2, 3, 4 ve 5 risk gruplarına dahil oldukları gösterilmiştir (Frootan, 2009). Bir başka tez çalışmasında önemli gen kaynaklarımızdan Sakız koyununda bulunan bone morfogenetik protein reseptör-1b geni üzerinde tek nükleotit değişimi ile ortaya çıkan mutasyon araştırılmıştır. Sakız koyununun 6. kromozomu üzerinde bulunan BMPR-1B geni, 8 ekzondan oluşup FecB alleli 4. ekzon üzerinde bulunan yaklaşık 190 bç uzunluğunda bir bölgedir. Çoklu doğum özelliği olan Sakız koyununun bu özelliğinin, BMPR-1B genindeki FecB allelinin etkisi ile mi gerçekleştiği bu çalışmanın temel hedefini oluşturmuştur. Bursa da yetiştirilen 67 adet sakız koyun yapağı örneklerinde FecB alleli araştırılmış ancak çalışılan 67 baş koyunda BMPR-1B geninde FecB alleline rastlanmamıştır (Yücel, 2010). Türkiye yerli koyun ırklarından Sakız, Akkaraman ve İvesi ırklarında prolaktin reseptör (PRLR) geni polimorfizminin incelendiği bir tez çalışmasında, her ırktan 50 baş olmak üzere toplam 150 baş koyundan kan örnekleri alınmış ve DNA dizi analizi, primer A (intron 1) için 100, primer 3 (ekzon 10) için ise 100 örnek olmak üzere toplam 200 örneğe uygulanmıştır. Primer A ile örneklerin tamamında 6 farklı haplotip belirlenmiş olup, Akkaraman ırkı için haplotip 2 en yüksek oranda gözlenirken, İvesi ırkında haplotip 4 en yaygın olarak bulunmuştur. Sakız ırkı için ise en fazla gözlenen haplotip 6 olmuştur. Primer 3 için ise referans dizi hariç 7 farklı haplotip tespit edilmiştir. Bu haplotiplerden; Sakız ırkında en yaygın haplotip 5, Akkaraman ve İvesi Irkları için en yaygın olarak haplotip 3 bulunmuştur. Akkaraman ve İvesi ırkında ise haplotip 4-8 saptanmamıştır. Primer 3 için tespit edilen varyasyonlar; A14T Gln --> Leu; G160A Asp -->Asn; G166A Glu-->Lys; A167T Glu-->Val; A176T His--> Leu; G206A Ser --> Asn ; G208A Gly-->Arg; amino asit değişimine yol açarken; A2T, A81G, A138G, C186T, T207C ise herhangi bir amino asit değişimi yapmamıştır. Sonuç olarak, araştırmada Sakız, Akkaraman ve İvesi ırkı koyunlarda PRLR geninin primer A ve primer 3 için hem ırklar arası hem de ırk içinde polimorfik olduğu ortaya konulmuştur. Özellikle tespit edilen haplotipler bakımından hem primer A, hem de primer 3 için Akkaraman ve İvesi ırkının birbirlerine benzediği, Sakız ırkının ise daha farklı bir genetik çeşitliliğe sahip olduğu ifade edilmiştir (Özmen, 2010).,

29 2.6. MHC ile ilgili yapılmıģ çalıģmalar Ruminantlarda MHC genleri ile ilgili bu güne kadar yapılan çalışmalarda genellikle MHC genleri içerisinde en polimorfik lokus olan DRB lokusu ile çalışılmıştır. Bu lokusta çoğunlukla PCR-RFLP, SSCP ve mikrosatallit markerleri kullanılarak olası genetik varyasyonun belirlemesine çalışılmıştır. 2.6.1. DRB1 gen bölgesi Nagaoka ve ark. (1999) yaptığı bir araştırmada OLA-DRB1 polimorfizmi ile koyun lemfomasına neden olan Bovine Leukemia virüsü (BLV) ile enfeksiyondan sonra hayvanlarda tümör gelişmesi arasındaki ilişki araştırılmıştır. BLV ile enfekte edilmiş ve sağlıklı hayvanlarda EcoR1, SalI, RsaI, HindIII ve SacI kesim enzimleri ile PCR-RFLP analizi ve aynı zamanda DNA dizi analizi yapılmıştır. Dizi analizi sonucunda Arg-Lys amino asitlerinin kodlandığı DRB1 allelleri sağlıklı hayvanlarda % 83.3 oranında lemfomalı hayvanlarda % 37.5 oranında bulunmuştur. Bu allellerin BLV enfeksiyonundan sonra tümör oluşumuna karşı dirençli olabileceği sonucuna varılmıştır. Ser-Arg aminoasitlerini kodlayan DRB1 allelleri ise lemfomalı koyunlarda daha yüksek frekansta bulunmuştur. Sonuç olarak MHC sınıf 2 allellerindeki varyasyonun immun cevaptaki farklılığı yansıttığı sonucuna varılmıştır. Laxza ve Karrantzar koyunlarında yapılan bir çalışmada SSCP ve DNA dizi analizi yöntemi kullanılarak MHC-DRB bölgesinin 2. ekzonundaki varyasyon incelenmiştir. Sekans analizi sonucunda 6 yeni allel belirlenmiştir. İki ırkta da DRB1*0702 allel frekansının yüksek olduğu bildirilmiştir (Jugo ve Vicario, 2000). Gutierrez-Espeleta ve ark. (2000) nın yaptığı bir çalışmada 11 farklı yerden alınan 206 Kanada koyunu kullanılmış ve SSCP analizi ile MHC polimorfizmi incelenmiştir. Antijen bağlama bölgeleri olan 16 aminoasit pozisyonu için ortalama heterozigotluk 0.389 bulunmuştur. Antijen bağlama bölgesi içermeyen 67 amino asit pozisyonu için heterozigotluk 0.076 bulunmuştur. Bu bulgular bu gende bulunan farklılıkların fonksiyonel faydasının olduğunu göstermiştir. Konnai ve ark. (2003a) nın, Japonya da Suffolk ırkı koyunlarda yaptıkları bir araştırmada, bir yaşlı 52 adet koyunda DRB1 lokusunun 2. ekzonunda RsaI, HaeIII, SacI, SacII, DdeI, NciI, Hin1I, EcoRI ve BstNI kesim enzimleri kullanılarak 16 adet ovar DRB1

30 PCR-RFLP alleli tanımlanmıştır. PCR-RFLP metodunun koyunlarda allel frekanslarını belirlemek için kullanışlı bir metod olduğu belirtilmiştir. Konnai ve ark. (2003b), Suffolk, Cheviot ve Corriedale ırklarından 97 baş koyunda Ovar-DRB1 gen bölgesinde yaptıkları DNA dizi analizi çalışmasında 18 önceden yayınlanmış allel ve 17 yeni allel tanımlanmıştır. Bu yeni alleller nükleotid ve aminoasit seviyesi bakımından Ovar-DRB1*0101 alleline büyük oranda benzerlik göstermektedir. Yeni allellerin 6 sı Cheviot ırkında, 11 i Suffolk ırkında bulunmuştur. Aynı zamanda Suffolk ırkında 15, Cheviot ırkında 6 ve Corriedale ırkında 1 allel bu güne kadar sadece o ırkta tespit edilmiştir. Ovar-DRB1*0702 alleli Suffolk ırkında (%23.9), Ovar-DRB1*0203 alleli Cheviot ırkında (%27.5) ve Ovar-DRB1*0201 alleli ise Corriedale ırkında (%25) en yaygın alleller olarak bulunmuştur. Gruszczynska ve ark. (2005a), 101 Polonya yabani koyunu ve 99 Polonya evcil koyununda Ovar-DRB1 gen bölgesinde PCR-RFLP analizi yapmışlardır. RsaI enzimi kesimi sonucunda 8 farklı kesim modeli, BsuRI kesimi sonunda 6 farklı kesim modeli ve BstYI kesimi sonrasında 2 farklı kesim modeli elde etmişlerdir. Sonuç olarak Polonya yabani koyunlarında 65 ve evcil koyunlarında 68 farklı haplotip bulmuşlardır. Bunlardan sadece 20 haplotip, iki ırkta da bulunmaktadır. Yine Gruszczynska ve ark. (2005b) başka bir çalışmada aynı hayvanlarda DRB1 gen bölgesinde SSCP analizi yapmışlar ve 27 si Polonya yabani koyununda 13 ü evcil koyunda olmak üzere toplamda 33 SSCP modeli bulmuşlardır. Swiderek ve ark. (2006), Ovar-DRB1 gen bölgesi ile sütte somatik hücre sayısı arasındaki ilişkiyi incelemek amacıyla yaptıkları çalışmada, 24 haftalık Polonya koyunlarında ilk laktasyon süt somatik hücre sayıları kaydedilmiş ve somatik hücre sayısına göre hayvanlar 1 litre sütte 300000 den daha az olanlar sağlıklı, 300000 den fazla olanlar mastitisli olarak gruplandırılmıştır. DRB1 gen bölgesinde mikrosatallit yöntemi ile 8 allel belirlenmiştir. En yüksek somatik hücre sayısı 488 bp ve 508 bp lik mikrosatallit alleline sahip olan koyunların sütlerinde tespit edilmiştir. En düşük somatik hücre sayısı ise 516 bp ve 526 bp lik mikrosatallit alleline sahip olan koyunların sütlerinde tespit edilmiştir. 526 bp allelinin varlığının kanda CD2+, CD8+ ve CD9+ lenfositlerinin miktarının artması ile ilişkili olduğu sonucuna varılmıştır. Arrieta-Aguirre ve ark. (2006), 187 Latxa ırkı koyunda ovar DRB1 in 2. ekzonundaki polimorfizmi araştırmak amaçlı PCR-SSCP çalışması yapmışlar ve 19 allel elde etmişlerdir. Bu allellerden 8 tanesi daha önce belirlenmemiş allellerdir. Heterozigotluğun % 91-95 lere

31 ulaştığı gözlenmiştir. Yeni allel tiplerinden DRB1*14 ün evcil koyunun atasına ışık tuttuğunu öngörülmüştür. Merinos ırkı 7 koç, 249 koyun ve onların 381 kuzusunda DRB1 intron 2 bölgesinde yapılan bir mikrosatallit çalışmasında 394-857 bp arasında bulunan 16 DRB alleli bulunmuştur. Fertilite özellikleri 411 bp lik allellere sahip hayvanlarda diğer allellere sahip hayvanlara oranla daha yüksek bulunmuştur. 394 ve 857 bp lik allellere sahip hayvanların kuzularının doğum ağırlığı diğer allellere sahip hayvanlara göre 400 g daha yüksek çıkmıştır. Bunun nedeninin bireysel üreme ve büyüme performansını etkileyebilen çeşitli MHC haplotiplerinin farklılığından dolayı olabileceği belirtilmiştir (Gelderman ve ark., 2006). Kolombiya, Polypay ve Ramboillet ırkından 383 koyunun DRB1 gen bölgesinde yapılan bir DNA dizi çalışmasında DRB*0403 veya DRB1*07012 allellerine sahip hayvanların önemli ölçüde düşük provirüs seviyesi ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Fakat çalışılan sürüde bu allellerin yalnızca % 11 seviyesinde bulunduğu gözlenmiştir. Ramboillet koyunlarının 5 ve 6 yaşlı Kolombiya ve Polypay koyunlarına göre muhtemelen daha az provirüs seviyesine sahip oldukları belirtilmiştir (Hermann-Hoesing ve ark., 2008). Ballingall ve ark. (2008) yaptıkları bir araştırmada, koyunlarda Ovar-DRB1 ekzon 2 gen bölgesinin tüm sekansını belirlemişlerdir. Bu sayede kodlanan, kodlanmayan ve promotor gen bölgelerini analiz etmişler ve 9 yeni allel tanımlanmıştır. Ovar-DRB1*0302 ve Ovar-DRB1*0401 allellerinin koyun türünün evrimleşmesini anlamak için önemli bilgiler sağladığı belirtilmiştir. Benzer şekilde Ballingall ve Tassi (2010) tarafından yapılan bir başka çalışmada 15 farklı ırk ve melezi 214 baş koyunun ovar DRB1 gen bölgesinin 2. ezonunda sekans analizi yapılmıştır. Bu çalışmada 38 Ovar-DRB1 alleli tanımlanmış vehomozigotluk düşük oranda (%7.48) bulunmuştur. Nikbakht Brujeni ve ark. (2009), 82 İran Shaul koyununun Ovar-DRB1 gen bölgesinde yaptıkları PCR-RFLP analizinde RsaI ve MspI kesim enzimlerini kullanmışlardır. RsaI enzim kesimi sonucunda 8 farklı genotip ve 5 farklı allel ve MspI enzim kesimi sonucunda 5 farklı allel tanımlanmıştır. PCR-RFLP analizi Ovar-DRB1 tiplerinin hızlı tanımlanmasında, heterozigot ve homozigotların hızlı bir şekilde ayrımında kullanılabileceği sonucuna ulaşmışlardır. Üç farklı yağlı kuyruklu koyun ırkından (Lori-Bakhtiari, Shaul ve Zandi) 179 baş koyunda RsaI kesim enzimi kullanılarak yapılan bir PCR-RFLP çalışmasında Lori-Bakhtiari ırkında 17, Shaul ırkında 12 ve Zandi ırkında 11 farklı genotip tanımlanmıştır. Daha sonra

32 aynı gen bölgesinde yapılan sekans analizi sonucunda aynı hayvanlarda 7 yeni allel tespit edilmiştir (Nikbakht ve ark., 2011). İran da Arap koyunlarının Ovar-DRB1 gen bölgesinde yapılan bir PCR-RFLP çalışmasında, 111 baş koyunun DNA örnekleri kullanılmıştır. RsaI restriksiyon enzimi kesimi sonucunda 18 farklı kesim modeli ve 8 farklı allel tespit edilmiştir. Yapılan analiz sonucunda incelenen populasyonun Hardy-Weinberg genetik dengesinde olduğu tespit edilmiştir (Lotfi ve ark., 2012). 2.6.2. DRB3 gen bölgesi DRB3 gen bölgesi ile ilgili sığırlarda çok sayıda araştırma ve literatür bulunurken, söz konusu bölge ile koyunlarda çok az sayıda bilgi temin edilmiştir. Bu nedenle DRB3 gen bölgesi ile ilgili sığırlarda (BoLA) yapılmış çalışmalar öncelikli olarak özetlenmiştir. 1100 adet laktasyondaki siyah alaca sığırlarında yapılan bir çalışmada MHC-DRB3.2 lokusu PCR-RFLP yöntemi ile genotiplendirilmiştir. Daha önce tanımlanan 24 allele ilaveten 5 farklı allel tesbit edilmiştir. Sütte somatik hücre sayısı ile ilişkilendirmek için yapılan çalışma sonucunda DRB3.2*16 allelinin akut meme içi enfeksiyonu için potansiyel risk faktörü olduğu belirlenmiştir. DRB3.2*22 allelinin ise yüksek somatik hücre sayısı için düşük risk oluşturduğu görülmüştür. DRB3.2*8 allelinin ilk laktasyon döneminde yüksek somatik hücre sayısı ile ilişkili bulunmuştur. DRB3.2*23 alleli ise 3 veya daha sonraki laktasyon dönemleri için yüksek somatik hücre sayısı ile ilişkili bulunmuştur (Dietz ve ark., 1997). 186 sığırın DRB3.2 gen bölgesinde yapılan bir PCR-RFLP çalışmasında 19 allel tanımlanmıştır. 7 numaralı allel birinci ve ikinci laktasyonda sütte protein artışı ve ikinci laktasyonda yüksek somatik hücre sayısı ile önemli ölçüde ilişkili bulunmuştur (Starkenburg ve ark., 1997). 106 Holstein ineğinde yapılan bir çalışmada Staphlococcus Aureus mastitis e karşı koruma ile BoLA-DRB gen yapısının ilişkili olduğu bulunmuştur (Schmutz ve ark., 1992). Sharif ve ark. (1998) tarafından BoLA ve hastalık varlığı arasındaki ilişkiyi incelemek amacıyla yapılan 835 siyah alaca ve 66 adet jersey ırkı ineğin verileri kullanılmıştır. Jersey ırkı ineklerde BoLA allelleri somatik hücre sayısı ile ilişkili bulunmazken siyah alaca ırkı ineklerde BoLA-DRB3.2*16 alleli düşük somatik hücre sayısı ile ilişkili bulunmuştur. Şiddetli mastitis varlığı ve BoLA-DRB3.2*23 alleli arasında önemli bir ilişki olduğu, BoLA- DRB3.2*3 allelini taşıyan süt ineklerinde plesentanın tutulması rahatsızlığında ve BoLA- DRB3.2*16 ve BoLA-DRB3.2*22 allellerini taşıyan ineklerde kistik ovaryum hastalığında düşük risk bulunduğu belirlenmiştir. Yine Sharif ve ark. (2000), tarafından yapılan bir

33 araştırmada BoLA-DRB3.2*22, *23 ve *24 alleli ile Staphylacoccus spp. tarafından meydana gelen mastitis ve BoLA-DRB3.2*23 ve *8 alleli ile aynı bakterinin yol açtığı klinik mastitisin yüksek riski arasında bir ilişki olduğu bulunmuştur. 568 Brahman sığırında sınıf II bölgesinde BoLA-DRB3 lokusunda yapılan bir PCR- RFLP çalışmasında RsaI, BstYI ve HaeIII kesim enzimlerini kullanarak exon 2 bölgesinde tanımlanan 63 DRB3 alleline ilaveten 18 yeni allel belirlemişlerdir. RsaI enzimi ile belirlenen 4 yeni allel v, w, x ve y olarak adlandırılmıştır (Maillard ve ark., 1999). Sender ve ark. (2008), tarafından yapılan bir araştırmada sığırlarda özellikle erken laktasyon dönemindeki enfeksiyoz hastalıklarla BoLA genleri arasında önemli ilişkiler bulunmuştur. Özellikle DRB3 geni allelleri potansiyel mastitis markeri olarak düşünülmektedir. 172 Jersey sığırında BoLA-DRB3 lokusunda RsaI, BstYI ve HaeIII kesim enzimlerini kullanarak yapılan PCR-RFLP çalışmasında 24 allel belirlenmiştir. Bu allellerden 13 tanesi daha önceden belirlenen 30 dan fazla BoLA-DRB3.2 alleller arasında bulunmuştur. Bu çalışmada 11 yeni allel belirlenmiştir (Gilliespie ve ark., 1999). Bovine Leukaemia virus (BLV) ile enfekte edilmiş 230 Holstein ineği enfeksiyonun seyrine göre düşük ve ya yüksek proviral sıkıntı (LPL, HPL) şeklinde gruplandırılmış ve BoLA -DRB3.2 lokusları bakımında karşılaştırılmıştır. Bu lokusta tesbit edilen BoLA- DRB3.2*11 alleli heterozigot ve ya homozigot oluşuna göre sınıflandırılmış ve RR ve RN genotiplerinin LPL profili ile ilişkili, SS ve NS genotiplerinin ise HPL profili ile ilişkili olduğu tesbit edilmiştir. RS genotipi ise hiçbir profille ilişkili bulunmamıştır. Sonuç olarak BoLA-DRB3.2*11 alleli Holstein ineklerinde BLV koruması için marker olarak gösterilebileceği belirlenmiştir (Juliarena ve ark., 2008). 262 siyah alaca süt sığırından 5119 gün süt somatik hücre sayısı ve performans özellikleri kaydedilmiş ve bu özelliklerin MHC nin DRB bölgesi allellerinin ilişkisi araştırılmıştır. DRB3.2 gen bölgesi PCR-RFLP yöntemi ile karakterize edilmiş ve 28 allel belirlenmiştir. Bu allellerden bir tanesi farklı bir allel olarak bulunmuştur. Somatik hücre sayısı ile DRB3.2*8 alleli arasında önemli bir ilişki bulunmuştur. Bunun yanı sıra DRB3.2*22 ve DRB3.2*11 allelleri ile süt yağ oranı arasında ve DRB3.2*24 ve DRB3.2*22 allelleri ile protein oranı arasında pozitif korelasyon bulunmuştur (Pashmi ve ark., 2009). Yoshida ve ark. (2012) nın 26 sürüden 714 süt sığırının DNA örneklerinde yaptıkları bir araştırmada sütte somatik hücre sayısı göz önüne alınarak mastitisli ve sağlıklı olmak üzere iki gruba ayrılmıştır. BoLA-DRB3 allelleri DNA dizi analizi ile tanımlanmıştır. Sonuç olarak DRB3.2*8 (DRB3*1201) ve DRB3.2*16 (DRB3*1501) allelleri mastitise karşı hassas

34 ve DRB3.2*22 (DRB3*1101), allelleri mastitise karşı dayanıklı olarak bulunmuştur. DRB3.2*23 (DRB3*2703) ve DRB3.2*24 (DRB3*0101) Sığırlarda DRB3.2 gen bölgesinde yapılan birçok araştırmada bu gen bölgesinin mastitis ile ilişkisi incelenmiştir. Çizelge 2.1 de bu araştırmalar ve mastitisle ilişkili Bola- DRB3.2 allelleri verilmiştir. Çizelge2.1: Bola-DRB3.2 allelleri ve mastitis arasındaki ilişki ile ilgili çalışmalar (Sender ve ark., 2008) Kaynak Bola-DRB3.2 alleli Etki * Dietz ve ark., 1997 *16, *18, *23 *8 Yüksek SCC(-) Düşük SCC (+) Kelm ve ark., 1997 *16 *8 *11, *23 *24*3 Yüksek SCC nın EBVsi (-) Daha fazla KM (-) Daha az KM (+) Major patojenlerle daha fazla MİE(-) Starkenburg ve ark., 1997 *3, *16 *7, *22, *24 *24 *8 Sharif ve ark., 1998 *16 Minor patojenlerle daha fazla MİE(-) Düşük SCC (+) Yüksek SCC(-) Daha fazla KM (-) Daha az KM (+) Düşük SCC (+) Coli form yüzünden daha fazla KM (-) *23 Sharif ve ark., 2000 *8, *22, *23, *24 Staphylococcus türleri yüzünden daha fazla KM (-) * KM- klinik mastitis, SCC- somatik hücre sayısı, MİE-meme içi enfeksiyon, EBV Keçilerde yapılan bir çalışmada MHC geninin DRB3 lokusu PCR-RFLP ile incelenmiştir. RsaI, BsaI, AccI, NdeII, HaeIII ve HpaII restriksiyon enzimleri kullanılarak 22 keçi DRB3 alleli belirlenmiştir. Sonuçta DRB3 geni antijen bağlama yapısı ile elde edilen RFLP allelleri arasında ilişki bulunmuştur (Amills, 1996). Tibet keçilerinde 459 baş hayvanda yapılan bir çalışmada MHC geninin DRB3 bölgesinin 2. exonunda PCR-RFLP araştırması sonucunda, bu bölgede tespit edilen 6 allelin çok yakın bağlantı (linkage) halinde olduğu gösterilmiştir (Li ve ark., 2006). Mongolian koyunları, Mongolian keçileri, Kazak koyunları ve Kazak keçilerinin DRB3 gen bölgesinde yapılan bir PCR-RFLP çalışmasında 18 genotip ve 7 allel belirlenmiştir. Çalışmada HaeIII kesim enzimi kullanılmış ve bir yeni allel tesbit edilmiştir. İstatistik analiz sonucunda hem Mongolian ve Kazak koyunları arasında hem de Mongolian ve Kazak keçilerinin allelik ve genotipik frekansları aralarında önemli farklılıklar bulunmuştur. Bunun nedenide bu iki ırkın yetiştikleri bölgelerin coğrafi ve iklimsel koşullarının farklılığına bağlanmıştır (Dongxiao ve Yuan, 2004).

35 2.6.3. Diğer MHC gen bölgeleri Merinos koyunlarında sınıf 3 bölgesinde 5 lokusta (OHCC1, DYMS, DRB1, DQA1 ve BfMS) yapılan mikrosatallit ve SSCP çalışması sonucunda elde edilen veriler ile QTL analizi yapılarak, ürün özellikleri ve MHC arasındaki ilişki incelenmiştir. Merinos koyunlarında yapağı ağırlığının artması ile MHC sınıf 3 bölgesinde mikrosatallit allelleri arasındaki ilişki ortaya konmuş ve artışının potansiyel bir markere bağlı olabileceği ifade edilmiştir (Bot ve ark., 2004). Yeni Zelanda Merinos ırkı koyunlarda MHC sınıf 2 DQA1 geninin ikinci ekzonunda yapılan bir çalışmada daha önce tespit edilmeyen 3 yeni allel tesbit edilmiş ve bilinen allellerle beraber DQA1 geninde allel sayısı 11 e yükselmiştir (Zhou ve Hickford, 2001). Orta Anadolu, Güneydoğu Anadolu ve Almanya dan elde edilen koyun, keçi ve sığır ırklarında MHC bölgesinde mikrosatallit çalışması yapılmış ve sonuçta Türkiye koyun ve sığır ırklarında allel sayısının diğer ırklara göre çok daha fazla olduğu gösterilmiştir (Bozkaya ve ark., 2007). Akkaraman, İvesi ve Merinolandschaf koyun ırklarında MHC ile bileşik olan ve olmayan mikrosatallit lokusları açısından bileşik dengesizliği olup olmadığı araştırılmıştır. 108 karşılaştırma sonucunda araştırmaya konu olan populasyonların incelenen lokuslar açısından büyük oranda denge durumunda bulunduğu tesbit edilmiştir ( Bozkaya ve Kurar, 2005). Üç nehir mandası ve bir bataklık mandası ırkından 65 mandada MHC DRB (Bubu- DRB) ve DRA (Bubu-DRA) lokusları üzerinde yapılan bir başka araştırmada 8 Bubu DRB alleli bu ırkların tamamında tesbit edilmiştir. DRA lokusunda ise bu ırklarda 2 allel bulunmuştur (Sena ve ark, 2003). Polonya yabani ve Polonya evcil koyun ırklarından 100 er adet koyunun OMHC1 (MHC sınıf 1) gen bölgesinde yapılan bir mikrosatallit çalışmasında Polonya yabani koyunda 12 allel, evcil koyunda ise 9 allel belirlenmiştir. Heterozigotluk ve PIC değeri yabani koyunda sırasıyla 0.79 ve 0.77; evcil koyunda ise 0.82 ve 0.80 olarak bulunmuştur (Gruszczynska ve ark. 2002). Türkiye de çeşitli türlerde MHC gen bölgesindeki genetik varyasyonun DNA seviyesinde çalışılmasıyla ilgili olarak sınırlı sayıda araştırmaya rastlanmıştır. Bu araştırmaların çoğu da insanlar üzerinde yapılmış olup, çiftlik hayvanlarını konu alan yalnızca Bozkaya ve ark. (2007) tarafından yapılan çalışmadır. Koyunlarda yapılan birçok MHC ile ilgili çalışmalarda bu gen bölgesinin koyun hastalıklarına dirençlilikle ile ilişkisi ortaya konmuştur. Çizelge 2.2 de bu çalışmalar ve dirençlilikle olan ilişkileri özetlenmiştir.

36 Çizelge2.2: Ovine Major Histocompatibility Complex (OMHC) ile hastalıklara olan direncin ilişkisi (Dukkupati ve ark., 2011) Sınıf Gen/Marker İlişki Referans Gastrointestinal nematod I Sınıf I antijenleri Var Windon ve Dineen (1984); Luffau ve ark. (1990); Stear ve ark. (1996) I Sınıf I antijenleri Yok Riffkin ve Yong (1984); Cooper ve ark. (1989) I OMHC I Var Charon ve ark. (2001) II DRB1 Yok Hulme ve ark. (1991); Blattman ve ark. (1993); McCririe ve ark. (1997) II DRB1 Var Buitkamp ve ark. (1994); Schwaiger ve ark. (1995); Stear ve ark. (1996,2005); Charon ve ark. (2002); Sayers ve ark. (2005); II DY Var Buitkamp ve ark. (1996) III C4 Var Wetherall ve ark. (1991) Bakteriyal ayak çürüklüğü I Sınıf I antijenleri Var Outteridge ve ark. (1989) II DQA, DRB Var Litchfield ve ark. (1993) II DQA1, DQA2, DQB, DRA Var Escayg ve ark. (1997) Paratuberküloz (Johne hastalığı) I CSRD226 Var Reddacliff ve ark. (2005) BLV-uyarılmış koyun lemfoması II DRB1 Var Yoshiko ve ark. (1999); Aida (2001); Konnai ve ark. (2003c) III TNFα Var Kabeya ve ark. (2001)

37 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal 3.1.1. Canlı materyal ve örnekleme Türkiye nin çeşitli illerindeki araştırma çiftliklerinde yetiştirilen koyun ırklarından elde edilen kanlar araştırmanın materyalini oluşturmuştur. Her ırktan en az 15 hayvan olmasına dikkat edilmiştir (Çizelge 3.1.). Çizelge 3.1: Çalışmanın materyalini oluşturan koyun ırklarının kanlarının alındığı bölgeler Irk Malya Akkaraman Dağlıç İvesi Sakız Kıvırcık Karayaka Morkaraman YetiĢtirilen çiftlik S.Ü. Z.F. Orhan Düzgüneş Çiftliği Gözlü TİGEM Afyon Ceylanpınar TİGEM Marmara Hay. Ar. Ens. Karacabey Bursa GOP Ün. Z.F. Tokat Kars 3.1.2. Araç ve gereçler Bu çalışmada kullanılan araç ve gereçler çizelge 3.2. de verilmiştir. Çizelge 3.2: Çalışmada kullanılan araç ve gereçlerin listesi Adı (Modeli) Ultra Saf Su Cihazı (Human up 900) ph metre (selecta) Otoklav (selecta) Nano Drop Spectrofotometre (ND 1000) Çalkalayıcılı Su Banyosu (Şimşek) ÇalıĢmada Kullanım Amacı DNA izolasyonu ve PCR reaksiyonları için kullanılan tampon çözeltilerin hazırlanması Tampon çözeltilerin hazırlanması için gerekli ph nın belirlenmesi Kullanılan malzemelerin sterilizasyonu İzole edilen DNA örneklerinin yoğunluk ve saflık derecelerinin belirlenmesi DNA izolasyonu Çalkalayıcı-Vortex (Velp scientifica Rx 3 ) Tampon çözeltilerin hazırlanması ve DNA izolasyonu Mikro Santrifüj (Labnet, 14.000 rpm) DNA izolasyonu ve PCR aşamalarında örneklerin kısa süreli santrifüj edilerekçöktürülmesi Dijital Hassas Terazi (Precisa 925M 202A) Tampon çözeltilerin hazırlanmasında sarf malzemelerinin tartılması Gradient Thermal Cycler 96 Örneklik (Techne TC- PCR ile lokusların çoğaltılması 512) Agaroz Jel Elektroforez Takımları (Thermo) DNA izolasyonu ve PCR ürünlerinintespit edilmesi, restriksiyon sonucu elde edilen bant

38 Güç Kaynakları (Termo EC 300XL) UV Transilluminatör (Vilber Lourmat) Termal Yazıcı (Sony Digital Graphic Printer Up-D897) Mikro Dalga Fırını (Arçelik MD 554) Derin Dondurucu (Reypa, -25) Derin Donduruculu Buzdolabı (Arçelik, -25) modellerinin jelde belirlenmesi Elektroforez sistemlerinin elektrik ortamlarının sağlanması DNA izolasyonu, PCR ürünleri ile RFLP lokusların jelde görüntülenmesi ve bilgisayar ortamına aktarılması DNA izolasyonu, PCR ürünleri ile RFLP lokusların arşivlenmesi için baskı yapılması Agaroz jellerin hazırlanması Örnek ve çeşitli sarf malzemelerin saklanması 3.1.3. Tampon çözeltiler Üzerinde durulan farklı lokusların belirlenebilmesi için agaroz jel elektroforezinden yararlanılmıştır. Agaroz jel elektroforezinde kullanılan tampon çözeltilerin bileşimleri Çizelge 3.3 de verilmiştir. Çizelge 3.3 Elektroforez ve agaroz jellerinin hazırlanmasında kullanılan stok ve tampon çözeltilerin bileşimleri Çözelti Konsantrasyon BileĢimi Elektroforez/stok jel tampon çözeltisi 50 X TBE 242.0 g 57.1 ml 100.0 ml 1 L Elektroforez/jel tamponu ve yürütme çözeltisi Örnek yükleme tampon çözeltisi Tris Glasiyal asetik asit 0.5 M EDTA, ph 8.0 ye tamamlanır 1 X TBE 1/50 100 X TBE den seyreltme yapılır. 10 X DNA 5.0 ml Gliserol 2.0 ml Bromofenol mavisi (%5) 1.5 ml 0.5 M EDTA 1.5 ml Steril bdh2o 3.2.Yöntem 3.2.1.Kan Örneklerinin alınması DNA izolasyonu amacıyla kullanılacak kan örnekleri, antikoagulantlı 10 ml lik vakumlu tüplere steril ve tek kullanımlık iğneler ile vena jugularis ten alınmıştır. Hayvanlardan alınan kanlar soğuk zincirde laboratuara getirilmiştir.

39 3.2.2.Genomik DNA izolasyonu Genomik DNA molekülünün izolasyonunda Miller ve ark. (1988) tarafından bildirilen DNA izolasyon protokolü laboratuar ortamında optimize edilmiş ve aşağıdaki şekilde uygulanmıştır. 1. +4 ºC de muhafaza edilen kan örnekleri oda sıcaklığında (23 25 ºC) bekletilmiştir. 2. Her bir kan örneğinden 500 μl alınarak 1.5 ml lik ependorf tüp içine konulmuştur. 3. Örneklerin üzerine 1.000 μl Eritrosit Lisis Tampon Çözeltisi (Çizelge 3.4) ilave edilmiş, kısa bir süre vorteksle karıştırılarak 10 dk oda sıcaklığında bekletilmiştir. 4. Bekletme süresinin sonunda örnekler 3.000 rpm de 10 dk santrifüj edilmiştir. 5. Ependorf tüplerin üst kısmında toplanan sıvı kısım (süpernatant) dikkatli bir şekilde uzaklaştırılmıştır. Dipte kalan peletlerin (hücre kısmı) rengi gözlenerek peletlerin rengi beyaz olana kadar Eritrosit Lisis Tampon Çözeltisi ile tekrar muamele edilmiştir. 6. Peletlerin üzerine 1.000 μl Fizyolojik Tampon Çözeltisi (Çizelge 3.4) eklenmiş ve kısa bir süre karıştırılmıştır. 7. Örnekler 3.000 rpm de 10 dk santrifüj edilmiş ve santrifüj sonunda sıvı kısım dikkatli bir şekilde tekrar uzaklaştırılmıştır. 8. Peletlerin üzerine 600 μl Lisis TE Tampon Çözeltisi (Çizelge 3.4) eklenmiş vepeletlerin iyice çözünmesi sağlanmıştır. 9. Çözülen peletlere 100 μl % 10 luk SDS solüsyonu (Çizelge 3.4) ve 5 μl proteinaz K (10 mg/ml) eklenerek hafifçe karıştırılmış ve 65 ºC de 1,5 saat su banyosunda tutulmuştur. İnkübasyon süresince her 15 dk bir elle hafifçe karıştırılmıştır. 10. İnkübasyondan çıkarılan örneklerin üzerine 200 μl 6M NaCl Çözeltisi (Çizelge 3.4) eklenmiş ve 15 dk vorteksle iyice karıştırılmıştır. 11. Örnekler 11.000 rpm de 10 dk santrifüj edilmiştir. 12. Santrifüj sonunda üstte kalan ve DNA moleküllerini içeren sıvı kısım yeni bir ependorf tüp içine konmuştur. 13. Örnekler 10.000 rpm de 5 dk tekrar santrifüj edilmiş ve yine üstte kalan sıvı kısım yeni bir ependorf tüp içine alınmıştır. 14. Örnekler üzerine örnek hacminin iki katı hacimde (yaklaşık 1.000 μl) % 99,9 luk etil alkolden (-20 ºC de muhafaza edilen) ilave edilmiştir. 15. Etil alkol ilave edildikten sonra ependorf tüpü DNA iplikçikleri kümeleşinceye kadar 4 5 kez hafifçe elle çalkalanmıştır.

40 16. Kümeleşen DNA iplikçiklerinin tüpün dibine çökmesi için tüp 10.000 rpm de 5 dk santrifüj edilmiştir. 17. Santrifüj sonunda etil alkol uzaklaştırılarak tüpün dibine çökmüş olan DNA peletinin üzerine 1.000 μl % 70 lik etil alkol ilave edilerek 10.000 rpm de 5 dk santrifüj edilmiştir. 18. Santrifüj işleminden sonra tüpün üstünde yer alan alkol uzaklaştırılmıştır. 19. Tüp içindeki alkolün tamamen uzaklaşmasını sağlamak amacıyla örnekler çeker ocak içinde kurumaya bırakılmıştır. 20. Tamamen kuruyan örnekler üzerine 100 μl TE Tampon Çözeltisi (Çizelge 3.4) ilave edilmiş olup, DNA peletinin çözülmesi için bir gece buzdolabında +4 ºC de bekletilmiştir. Çizelge 3.4. DNA izolasyonunda kullanılan tampon çözeltilerin molaritesi / miktarı ve içerikleri Tampon Çözeltisi Molarite/Miktar Ġçerik Eritrosit Lisis Tampon Çözeltisi 0.32 M 10 mm Sukroz EDTA 5 mm MgCl 2 Fizyolojik Tampon Çözeltisi Lisis TE Tampon Çözeltisi TE Tampon Çözeltisi 6M NaCl Çözeltisi 75 mm 25 mm 500 mm 20 mm 10 mm 10 mm 1 mm 35.064 g 100 ml ye tamamlanır NaCl EDTA Tris-HCI EDTA NaCI Tris EDTA NaCI bdh 2 O 3.2.3. Genomik DNA miktarının hesaplanması İzole edilen DNA nın miktarı ve saflığı spektrofotometre cihazı ile ölçülmüştür. DNA nın ışığı absorbe etme miktarına Optik Density (OD) denilmektedir. Bir OD yoğunlukta 50 µg/ml DNA olduğu kabul edilmektedir. DNA molekülünde bulunan bütün bazlar 260 nm de ultraviyole ışığını absorbe etmektedirler. Bu nedenle spektrofotometre ile DNA miktarının hesaplanması 260 nm dalga boyunda yapılmaktadır. 260 nm de elde edilen değerler örnekte bulunan nükleik asit konsantrasyonunun miktarının belirlenmesini sağlamaktadır. Bununla birlikte ayrıca spektrofotometre cihazında elde edilen DNA da bulunan nükleik asitlerin saflığını belirlemek için 260 nm ve 280 nm deki OD ler (OD 260 /OD 280) ölçülmektedir. OD 260 /OD 280 değerlerinin 1.8-2.0 arasında olması istenmektedir (Seğmen 2005, Arıca ve ark. 2006).

41 Çalışmada 100 µl steril 1X TE tampon çözeltisinde çözülen DNA ların konsantrasyonları 260 ve 280 nm dalga boylarında (OD 260 /OD 280 ) NanoDrop spektrofotometre ile okunmuş ve konsantrasyonları steril saf su ile 50 ng/µl olacak şekilde eşitlenmiştir. Bu örnekler eşit miktarlarda % 1 lik agaroz jelinde (1X TE tamponunda) yürütülerek konsantrasyonlarının eşitliği gözle de gözlenmiş ve DNA ların parçalanmamış olduğu belirlenmiştir. 3.2.4. ÇalıĢılan OLA-DRB Bölgelerinin PCR ile Çoğaltılması ve Restriksiyon Enzimleri ile Kesimi OLA-DRB1 bölgesinin PCR ile çoğaltılması amacıyla Konnai ve ark. (2003a) tarafından bildirilen yöntem araştırmanın yürütüldüğü laboratuar koşullarına adapte edilmiştir. Bu çalışmada iki aşamalı PCR kullanılmıştır. Bunun nedeni; tek PCR ile amplifikasyonun zor olmasıdır. OLA-DRB1 gen bölgesinin çoğaltılmasında birinci PCR döngüsü için aşağıda verilen primerler kullanılmıştır. İleri (forward) primer : OLA-ERB1 5 -CCGGAATTCCCGTCTCTGCAGCACATTTCTT-3 Ters (reverse) primer : HL031 5 -TTTAAATTCGCGCTCACCTCGCCGCT-3 Çizelge 3.5: OLA-DRB1 gen bölgesinin çoğaltılması için hazırlanan PCR reaksiyonu ile programları PCR reaksiyonu 2 μl 10 X PCR tamponu 1.5 mm MgCl2 1.2 mm her bir dntp 20.0 μm her bir primer 2.5 U Taq DNA polimeraz enzimi PCR programı 94 o C 5 dk. ön denaturasyon 94 o C 30 sn. 50 o C 30 sn. 15 döngü 72 o C 1 dk. 72 o C 10 dk. Son uzama PCR nin ikinci aşamasında kullanılan primerler aşağıda verilmiştir. İleri (forward) primer : OLA-ERB1 5 -CCGGAATTCCCGTCTCTGCAGCACATTTCTT-3 Ters (reverse) primer : OLA-XRB15 -AGCTCGAGCGCTGCACAGTGAAACTC-3

42 Çizelge 3.6:OLA-DRB1 bölgesi için kullanılan ikinci PCR reaksiyonu ve PCR programı aşağıdaki çizelgede verilmiştir. PCR reaksiyonu 2.5 μl 10 X PCR tamponu 1.5 mm MgCl2 2.0 mm her bir dntp 10.0 μm her bir primer 1.5 U Taq DNA polimeraz enzimi PCR programı 94 o C 5 dk. ön denaturasyon 94 o C 30 sn. 60 o C 30 sn. 30 döngü 72 o C 1 dk. 72 o C 10 dk. Son uzama OLA-DRB3 bölgesinin PCR ile çoğaltılması amacıyla Amills ve ark., 1996 tarafından bildirilen yöntem araştırmanın yürütüldüğü laboratuar koşullarına adapte edilmiştir (Çizelge 3.7). OLA-DRB3 çoğaltılması için aşağıda verilen primerler kullanılmıştır. İleri (forward) primer : DRB1.1 5 -TATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3 Ters (reverse) primer : DRB1.2 5 -TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3 Çizelge 3.7:OLA-DRB3 bölgesi için kullanılan ikinci PCR reaksiyonu ve PCR programı aşağıdaki çizelgede verilmiştir. PCR reaksiyonu 2.5 μl 10 X PCR tamponu 1.5 mm MgCl2 1.0 mm her bir dntp 10.0 μm her bir primer 1.5 U Taq DNA polimeraz enzimi PCR programı 94 o C 5 dk. ön denaturasyon 94 o C 1 dk. 60 o C 30 sn. 30 döngü 72 o C 1 dk. 72 o C 10 dk. Son uzama PCR analizleri tamamlandıktan sonra 10 μl PCR ürünü, Çizelge 3.8 de belirtilen restriksiyon enzimleriyle kesim işlemine tabi tutulmuştur. Bu amaçla 2 4 U restriksiyon enzimi içeren 10 μl steril deiyonize H 2 O ya PCR ürünü ilave edilmiş ve bu karışım 37 o C de gece boyu inkübe edilmiştir. PCR ürünleri % 1 lik ve restriksiyon parçacıkları % 2 lik agaroz (Prona, 091602PR) jelde analiz edilmiştir. Agaroz jel hazırlamak amacıyla kullanılan tampon çözeltiler ve bileşimleri Çizelge 3.3 te verilmiştir. % 2.0 lik agaroz jel hazırlamak için; 2 g agaroz tartılıp, 100 ml 1XTE tampon çözeltisi (Çizelge 3.3) ile karıştırılmıştır. Agarozun 1XTE tampon çözeltisi içinde çözünmesi için 2-5 dk mikrodalga fırında yüksek devirde kaynatılmıştır. Kaynayan çözelti, 50-60 o C ye kadar soğutulduktan sonra 2-5 μl etidyum bromür (10mg/mL) ilave edilmiştir. Bu çözelti jel tablasına dökülmüş, jel donduktan sonra tarak çıkartılarak jelin olduğu çerçeve, 1XTE jel tampon çözeltisi ile dolu olan yatay elektroforez ünitesine yerleştirilmiştir. Örnek yükleme tampon çözeltisi (Çizelge 3.3) ile

43 karıştırılan PCR ürünleri ve restriksiyon parçacıkları kuyulara yüklenip 85 V/cm de yaklaşık 2-3 saat elektroforez işlemine tabi tutulmuştur. Daha sonra görüntüleme sisteminde jeldeki örneklerin genotipleri belirlenerek fotoğrafları çekilmiştir. Elde edilen bantların moleküler büyüklükleri, standart olarak kullanılacak olan DNA ladder lara göre görüntüleme programında belirlenmiş, uzunlukları baz çifti (bp) olarak kaydedilerek ve kesim noktası temelinde populasyon içi ve populasyonlar arasındaki varyasyonlar belirlenmiştir. Bu çalışmada kullanılan restriksiyon enzimleri, saflaştırıldıkları organizmalar ve restriksiyon yaptıkları özgün tanıma dizileri Çizelge 3.8 de verilmiştir (Griffiths ve ark. 1996, http://www.neb.com/nebecomm/products/category1.asp#2, 2006). Çizelge 3.8: Kullanılan enzimler, saflaştırıldıkları organizmalar ve restriksiyon yaptıkları özgün tanıma dizileri Enzim Saflaştırıldıkları organizma Özgün tanıma dizisi (5' 3') NciI Neisseria cinerea SacI SacII Hin1I (BsaHI) DdeI NdeII BsaI Streptomyces achromogenes Streptomyces albus Bacillus stearothermophilus Desulfovibrio desulfuricans Neisseria denitrificans Bacillus stearothermophilus 3.2.5. Genetik Analiz Elde edilen değerler bakımından koyun ırklarının Hardy Weinberg dengesinde olup olmadığının belirlenmesinde Ki-kare (χ²) testi yapılmıştır. Ele alınan lokuslarda Ki-kare serbestlik derecesi 1 olduğu için χ² testinde Yates düzeltmesi yapılmıştır (Düzgüneş ve ark., 1983).

44 4. ARAġTIRMA SONUÇLARI VE TARTIġMA Araştırmada PCR çoğaltımına dayalı olarak OLA-DRB1 ve OLA-DRB3 gen bölgeleri farklı restriksiyon enzimleri kullanılarak PCR-RFLP analizi sonucunda elde edilen restrsiksiyon modelleri üzerinde durulmuştur. 4.1. DRB1 ekson 2 gen bölgesi DRB1 lokusu yaklaşık 11.979 bç lik bir lokustur. Bu lokusun yaklaşık 296 bç lik ekson 2 bölgesi PCR ile çoğaltılmış ve 5 farklı restriksiyon enzimi ile kesilmiştir. Irklar arasında kesim noktası bakımından farklılıklar belirlenmiştir. DRB1 ekson 2 gen bölgesi PCR ürünü % 1 lik agaroz jelde gösterilmiştir (Şekil 4.1) vardır. Şekil 4.1:DRB1 ekson 2 gen bölgesi PCR ürünü Not: M, Invitrogen 100 bp DNA Ladder (15628-019); 1.-4. kuyularda koyun ırklarının örnekleri 4.1.1. NciI restriksiyon enzimi ile kesim DRB1 ekson 2 gen bölgesi NciI restriksiyon enzimi kesim sonuçları Çizelge 4.1 de verilmiştir. NciI kesim profili Konnai ve ark., (2003a) tarafından bildirilen NciI kesim profili ile benzerdir. 296 bp lik DRB1 ekson 2 gen bölgesi NciI enzimi kesimi sonucunda 296 bp lik tek bant veya 150, 146 ve 296 bp lik 3 bant ve ya 150 ve 146 bp lik 2 bant şeklinde

45 bant modelleri belirlenmiştir. Restriksiyon ürünleri % 2 lik agaroz jelde gösterilmiştir (Şekil 4.2). NciI aa bb ab a NciI b 296 150 146 150 146 Şekil 4.2: DRB1 ekson 2 gen bölgesi NciI restriksiyon enzimi kesimi Not: M, Invitrogen 50 bp DNA Ladder (15628-019); 1.kuyuda bb; 2. kuyuda ab ve 3-4. kuyularda aa genotipli örnekler bulunmaktadır.

46 Çizelge 4.1:Ovar DRB1 NciI enzimi kesim sonuçları Irk Hayvan Genotip frekansı Allel frekansı Kikare sayısı aa ab bb a(%) b(%) χ 2 H b (%) (%) (%) Akkaraman 27 37.04 59.26 3.70 0.67 0.33 3.63 0.44 Dağlıç 29 55.17 37.93 6.90 0.74 0.26 0.15 0.38 İvesi 24 50.00 50.00 0.00 0.75 0.25 3.66 0.38 Sakız 21 19.05 76.19 4.76 0.57 0.43 7.21 * 0.49 Kıvırcık 20 65.00 25.00 10.00 0.78 0.23 1.13 0.35 Karayaka 20 45.00 40.00 15.00 0.65 0.35 0.28 0.46 Malya 20 70.00 15.00 15.00 0.78 0.23 5.24 * 0.35 Morkaraman 19 36.84 47.37 5.26 0.61 0.39 0.14 0.48 * p<0.05; H b : Beklenen heterozigotluk NciI enzimi kesimi sonucunda bütün ırklarda a alleli frekansı en yüksektir. Homozigotluk oranı Akkaraman ve Sakız ırklarında daha düşük diğer ırklarda daha yüksek çıkmıştır. İvesi ırkında b alleli bakımında homozigot birey bulunmamaktadır. Irkların NciI enzimi kesimi sonucunda beklenen heterozigotluk değerleri biribirine yakın bulunmuştur. Ki-kare (χ 2 ) testi sonucuna göre, Sakız ve Malya ırkları dışındaki ırkların tümü Hardy-Weinberg dengesindedir (p<0.05). 4.1.2. SacI restriksiyon enzimi ile kesim DRB1 ekson 2 gen bölgesi SacI restriksiyon enzimi kesim sonuçları Çizelge 4.2 de verilmiştir. SacI kesim profili Konnai ve ark. (2003a) tarafından bildirilen SacI kesim profili ile benzerdir. 296 bp lik DRB1 ekson 2 gen bölgesi SacI enzimi kesimi sonucunda 296 bp lik tek bant veya 208, 88 ve 296 bp lik 3 bant ve ya 208 ve 88 bp lik 2 bant şeklinde bant modelleri belirlenmiştir. Restriksiyon ürünleri % 2 lik agaroz jelde gösterilmiştir (Şekil 4.3). SacI a b 296 208 88 296 208 SacI aa bb ab 88

47 Şekil 4.3: DRB1 ekson 2 gen bölgesi SacI enzimi kesim modeli Not: M, Invitrogen 50 bp DNA Ladder (15628-019); 1-3. kuyuda ab ve 2-4. kuyuda aa genotipli örnekler bulunmaktadır. Çizelge 4.2:Ovar DRB1 SacI kesim sonuçları Irk Hayvan Genotip frekansı Allel frekansı sayısı aa(%) ab(%) bb(%) a b Ki-kare χ 2 H b Akkaraman 30 40 56.67 3.33 0.68 0.32 3.49 0.43 Dağlıç 23 39.13 42.86 14.28 0.61 0.39 0.19 0.48 İvesi 20 40.00 55.00 5.00 0.68 0.33 1. 86 0.44 Sakız 20 50.00 40.00 10.00 0.70 0.30 0.16 0.42 Kıvırcık 18 50.00 50.00 0.00 0.75 0.25 3.06 0.38 Karayaka 17 41.18 47.06 11.76 0.65 0.35 0.24 0.46 Malya 29 27.59 51.72 20.69 0.53 0.47 0.17 0.50 Morkaraman 18 50.00 33.33 16.67 0.67 0.33 0.94 0.44 * p<0.05; H b : Heterozigotluk değeri SacI enzimi kesimi sonucunda bütün ırklarda a alleli frekansı en yüksektir. Homozigotluk oranı Dağlıç, Sakız ve Morkaraman ırklarında daha düşük diğer ırklarda daha yüksek çıkmıştır. Kıvırcık ırkında b alleli bakımında homozigot birey bulunmamaktadır. Irkların SacI enzimi kesimi sonucunda beklenen heterozigotluk değerleri biribirine yakın bulunmuştur. Ki kare( χ 2 ) testi sonucuna göre tüm ırklar Hardy-Weinberg dengesindedir (p<0.05). 4.1.3. SacII restriksiyon enzimi ile kesim DRB1 ekson 2 gen bölgesi SacII restriksiyon enzimi kesim sonuçları Çizelge 4.3 de verilmiştir. SacII kesim profili Konnai ve ark. (2003a) tarafından bildirilen SacII kesim

48 profili ile benzerdir. 296 bp lik DRB1 ekson 2 gen bölgesi SacII enzimi kesimi sonucunda 296 bp lik tek bant veya 229, 67 ve 296 bp lik 3 bant ve ya 229 ve 67 bp lik 2 bant şeklinde bant modelleri belirlenmiştir. Restriksiyon ürünleri % 2 lik agaroz jelde gösterilmiştir (Şekil 4.4). 296 SacII a 229 67 b 296 SacII 229 aa bb ab 67 Şekil 4.4: DRB1 ekson 2 gen bölgesi SacII enzimi kesim modeli Not: M, Invitrogen 50 bp DNA Ladder (15628-019); 1-2-3. kuyularda aa ve 3. kuyuda ab genotipli örnekler bulunmaktadır. Çizelge 4.3:Ovar DRB1 SacII kesim sonuçları Irk Hayvan Genotip frekansı Allel frekansı Ki-kare sayısı aa(%) ab(%) bb(%) a b χ 2 H b Akkaraman 18 77.78 22.22 0.00 0.89 0.11 2.38 0.20 Dağlıç 18 44.44 55.56 0.00 0.72 0.28 3.67 0.40 İvesi 17 76.47 23.53 0.00 0.88 0.12 2.34 0.21 Sakız 18 100.00 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 Kıvırcık 19 84.21 15.79 0.00 0.92 0.08 3.28 0.15 Karayaka 20 85.00 15.00 0.00 0.93 0.08 3.38 0.14 Malya 17 100.00 0.00 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 Morkaraman 20 85.00 15.00 0.00 0.93 0.08 3.38 0.14 * p<0.05; H b : Beklenen heterozigotluk SacII enzimi kesimi sonucunda bütün ırklarda a alleli frekansı en yüksektir. Homozigotluk oranı bütün ırklarda yüksek çıkmıştır. Çalışmada kullanılan hiçbir ırkta b alleli bakımında

49 homozigot birey bulunmamaktadır. Sakız ve Malya ırklarında b alleli bulunmamıştır. Irkların SacII enzimi kesimi sonucunda beklenen heterozigotluk değerleri düşük bulunmuştur. Ki-kare (χ 2 ) testi sonucuna göre ırkların tümü Hardy-Weinberg dengesindedir (p<0.05). 4.1.4. Hin1I restriksiyon enzimi ile kesim DRB1 ekson 2 gen bölgesi Hin1I restriksiyon enzimi kesim sonuçları Çizelge 4.4 de verilmiştir. Hin1I kesim profili Konnai ve ark. (2003a) tarafından bildirilen Hin1I kesim profili ile benzerdir. 296 bp lik DRB1 ekson 2 gen bölgesi Hin1I enzimi kesimi sonucunda 296 bp lik tek bant veya 178, 118 ve 296 bp lik 3 bant ve ya 178 ve 118 bp lik 2 bant şeklinde bant modelleri belirlenmiştir. Restriksiyon ürünleri % 2 lik agaroz jelde gösterilmiştir (Şekil 4.5). Hin1I aa bb ab 296 296 a Hin1I b 178 118 178 118

50 Şekil 4.5: DRB1 ekson 2 gen bölgesi Hin1I enzimi kesim modeli Not: M, Invitrogen 50 bp DNA Ladder (15628-019); 1.kuyuda aa; 2-3-5. kuyuda ab ve 3. kuyuda bb genotipli örnekler bulunmaktadır. Çizelge 4. 4:Ovar DRB1 Hin1I kesim sonuçları Irk Hayvan Genotip frekansı Allel frekansı Ki-kare H b sayısı aa(%) ab(%) bb(%) a b χ 2 Akkaraman 20 0.00 65.00 35.00 0.33 0.68 5.56 * 0.44 Dağlıç 19 21.05 68.42 10.53 0.55 0.45 3.33 0.49 İvesi 18 27.78 66.67 5.56 0.61 0.39 3.56 0.48 Sakız 19 26.32 73.68 0.00 0.63 0.37 7.38 * 0.47 Kıvırcık 20 25.00 40.00 35.00 0.45 0.55 0.67 0.50 Karayaka 17 29.41 70.59 0.00 0.65 0.35 6.00 * 0.46 Malya 26 50.00 50.00 0.00 0.75 0.25 3.86 * 0.38 Morkaraman 19 36.84 42.11 21.05 0.58 0.42 0.34 0.49 * p<0.05; H b : Beklenen heterozigotluk Hin1I enzimi kesimi sonucunda akkaraman ve kıvırcık ırklarında b allel frekansı yüksekken diğer ırklarda ırklarda a alleli frekansı yüksektir. Homozigotluk oranı kıvırcık ve morkaraman ırklarında daha düşük diğer ırklarda daha yüksek çıkmıştır. Karayaka, Malya ve Sakız ırklarında b alleli bakımında homozigot birey bulunmazken Akkaraman ırkında a alleli bakımından homozigot birey bulunmamıştır. Irkların Hin1I enzimi kesimi sonucunda beklenen heterozigotluk değerleri birbirine yakın bulunmuştur. Ki kare (χ 2 ) testi sonucuna göre Akkaraman, Sakız, Karayaka ve Malya ırkları dışındaki ırklar Hardy-Weinberg dengesindedir (p<0.05).

51 4.1.5. DdeI restriksiyon enzimi ile kesim Dde I DRB1 ekson 2 gen bölgesi DdeI restriksiyon enzimi kesim sonuçları Çizelge 4.1 de verilmiştir. DdeI kesim profili Konnai ve ark. (2003a) tarafından bildirilen DdeI kesim profili ile benzerdir. 296 bp lik DRB1 ekson 2 gen bölgesi DdeI enzimi kesimi sonucunda 296 bp lik tek bant veya 181, 115 ve 296 bp lik 3 bant ve ya 40, 256 ve 296 bp lik 3 bant 181 ve 115 bp lik 2 bant şeklinde bant modelleri belirlenmiştir. Restriksiyon ürünleri % 2 lik agaroz jelde gösterilmiştir (Şekil 4.2). a b c 40 296 181 256 115 Dde I 296 256 181 aa bb ab ac 115 40 Şekil 4.6: DRB1 ekson 2 gen bölgesi DdeI enzimi kesim modeli Not: M, Invitrogen 50 bp DNA Ladder (15628-019); 1-6.kuyuda ac, 2-4-5. kuyularda aave 3. kuyuda ab genotipli örnekler bulunmaktadır.

52 Çizelge 4.5:Ovar DRB1 DdeI kesim sonuçları Irk Hayvan Genotip frekansı Allel frekansı sayısı aa(%) ab(%) ac(%) bb a b c Ki-kare χ 2 H b Akkaraman 22 31.82 45.45 0.00 22.07 0.55 0.45 0.00 0.00 0.50 Dağlıç 23 39.13 26.09 8.70 26.09 0.57 0.39 0.04 5.323 0.53 İvesi 18 38.89 16.67 22.22 22.22 0.58 0.31 0.11 7.780* 0.55 Sakız 24 41.67 50.00 8.33 0.00 0.71 0.25 0.04 4.069 0.50 Kıvırcık 15 80.00 0.00 0.00 20.00 0.80 0.20 0.00 0.00 0.32 Karayaka 15 20.00 0.00 80.00 0.00 0.60 0.00 0.40 0.00 0.48 Malya 17 35.29 0.00 35.29 29.41 0.53 0.29 0.18 18.889 * 0.60 Morkaraman 16 43.75 31.25 18.75 6.25 0.69 0.22 0.09 1.344 0.51 * p<0.05; H b : Beklenen heterozigotluk DdeI enzimi kesimi sonucunda bütün ırklarda ırklarda a alleli frekansı yüksektir. Homozigotluk oranı bütün ırklarda yüksek çıkmıştır. Çalışmada kullanılan ırklarda bc ve cc genotipli birey bulunmamaktadır. Kıvırcık, Karayaka ve Malya ırklarında ab genotipli birey, akkaraman ve kıvırcık ırkalarında ac genotipli birey, Sakız ve Karayaka ırklarında bb genotipli birey bulunmamaktadır. Karayaka, Malya ve Sakız ırklarında b alleli bakımında homozigot birey bulunmazken Akkaraman ırkında a alleli bakımından homozigot birey bulunmamıştır. Irkların DdeI enzimi kesimi sonucunda Kıvırcık ırkında diğer ırklara göre beklenen heterozigotluk değeri diğer ırklara göre daha düşük, Malya ırkında daha yüksek bulunmuştur. Ki-kare (χ 2 ) testi sonucuna göre İvesi ve Malya ırkları dışındaki ırklar Hardy- Weinberg dengesindedir (p<0.05). 4.2. DRB3 ekson 2 gen bölgesi DRB3 lokusunun yaklaşık 285 bç lik ekson 2 bölgesi PCR ile çoğaltılmış ve 2 farklı restriksiyon enzimi ile kesilmiştir. Irklar arasında kesim noktası temelinde farklılıklar belirlenmiştir. DRB3 ekson 2 gen bölgesi PCR ürünü % 1 lik agaroz jelde gösterilmiştir (Şekil 4.7)

53 vardır. Şekil 4.7:DRB3 ekson 2 gen bölgesi PCR ürünü Not: M, Invitrogen 100 bp DNA Ladder (15628-019); 1.-3. kuyularda koyun ırklarının örnekleri 4.2.1. NdeII restriksiyon enzimi ile kesim DRB3 ekson 2 gen bölgesi NdeI restriksiyon enzimi kesim sonuçları Çizelge 4.6 de verilmiştir. NdeII kesim profili Amills ve ark. (1996) tarafından bildirilen NdeII kesim profilinden farklı olarak bu çalışmada Amills ve ark. (1996) tarafından bildirilen c alleli bulunmamıştır. 285 bp lik DRB3 ekson 2 gen bölgesi NdeII enzimi kesimi sonucunda 285 bp lik tek bant veya 200, 85 ve 85 bp lik 3 bant ve ya 200 ve 85 bp lik 2 bant şeklinde bant modelleri belirlenmiştir. Restriksiyon ürünleri % 2 lik agaroz jelde gösterilmiştir (Şekil 4.7). NdeII 285 aa bb ab NdeII a b 285 200 85 200 85

54 Şekil 4.7: DRB3 ekson 2 gen bölgesi NdeII enzimi kesim modeli Not: M, Invitrogen 100 bp DNA Ladder (15628-019); 1.kuyuda aa ve 2-3-4. kuyuda ab genotipli örnekler bulunmaktadır. Çizelge 4.6: Ovar DRB3 NdeII kesim sonuçları Irk Hayvan Genotip frekansı Allel frekansı sayısı aa(%) ab(%) bb(%) a b Ki-kare χ 2 H b Akkaraman 19 73.68 26.32 0.00 0.87 0.13 2.14 0.23 Dağlıç 20 65.00 35.00 0.00 0.83 0.18 2.20 0.29 İvesi 15 0.00 100.00 0.00 0.50 0.50 16.17* 0.50 Sakız 16 0.00 100.00 0.00 0.50 0.50 17.16* 0.50 Kıvırcık 20 60.00 30.00 10.00 0.75 0.25 0.59 0.38 Karayaka 18 38.89 44.44 16.67 0.61 0.39 0.16 0.48 Malya 20 80.00 20.00 0.00 0.90 0.10 2.48 0.18 Morkaraman 24 45.83 54.17 0.00 0.73 0.27 4.27 * 0.39 * p<0.05; H b : Beklenen heterozigotluk NdeII enzimi kesimi sonucunda İvesi ve Sakız ırklarındaki bireylerin tamamı heterozigot bulunmuş diğer ırklarda homozigotluk oranı yüksektir. İvesi ve Sakız ırklarında allel frekansları eşit; diğer ırklarda a alleli frekansı yüksektir. Irkların NdeII enzimi kesimi sonucunda Akkaraman, Dağlıç ve Malya ırklarında beklenen heterozigotluk değerleri düşük bulunmuştur. Ki-kare (χ 2 ) testi sonucuna göre İvesi, Sakız ve Malya ırkları dışındaki ırkların tümü Hardy-Weinberg dengesindedir (p<0.05).

55 4.2.2. BsaI restriksiyon enzimi ile kesim DRB3 ekson 2 gen bölgesi BsaI restriksiyon enzimi kesim sonuçları Çizelge 4.7 de verilmiştir. BsaI kesim profili Amills ve ark. (1996) tarafından bildirilen BsaI kesim profili ile benzerdir. 285 bp lik DRB3 ekson 2 gen bölgesi BsaI enzimi kesimi sonucunda 285 bp lik tek bant veya 103, 182 ve 285 bp lik 3 bant ve ya 103 ve 182 bp lik 2 bant şeklinde bant modelleri belirlenmiştir. Restriksiyon ürünleri % 2 lik agaroz jelde gösterilmiştir (Şekil 4.8). BsaI a b 285 103 182 285 BsaI aa bb ab 182 103 Şekil 4.8: DRB3 ekson 2 gen bölgesi BsaI enzimi kesim modeli Not: M, Invitrogen 100 bp DNA Ladder (15628-019); 1-2-3.kuyularda aa ve 4. kuyuda ab genotipli örnekler bulunmaktadır.