flora K Lİ NİK Ç A L IŞ M A / R E S E A R C H A R T I C L E Akut Menenjit Kliniği ile Başvuran Hastaların BOS Örneklerinde Viral Etkenlerin Erken Tanısı Early Diagnosis of Viral Pathogens in Cerebrospinal Fluid from Patients with Acute Meningitis Candan ÇİÇEK 1, Hüsnü PULLUKÇU 2, Hale KALFAOĞLU 3, Hasip KAHRAMAN 4, Eylem ULAŞ SAZ 5 1 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye 2 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye 3 İzmir Buca Seyfi Demirsoy Devlet Hastanesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Kliniği, İzmir, Türkiye 4 Amasya Sabuncuoğlu Şerefeddin Devlet Hastanesi, İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği, Amasya, Türkiye 5 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Acil Tıp Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye ÖZET Giriş: Akut menenjit ve ensefalit kliniğine neden olan etkenler arasında virüsler birinci sırada yer almaktadır. Bu çalışmada, akut menenjit bulguları ile başvuran hastalarda viral etkenlerin sıklığının araştırılması amaçlanmıştır. Materyal ve Metod: Nisan 2012-Şubat 2014 tarihleri arasında, santral sinir sistemi infeksiyonu olan hastalardan 111 beyin omurilik sıvısı (BOS) örneği toplandı. Hastaların yaş aralığı 1-88 yaş (median 35.5 yaş) arasındaydı. Toplam 111 hastanın 22 (%19.8) si çocuk (median 5 yaş), 89 (%80.1) u erişkin (median 37 yaş) yaş grubunda yer almaktaydı. Örneklerin tümüne multipleks polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) [herpes simpleks virüsü (HSV) 1-2, varisella zoster virüsü (VZV), human herpes virüs (HHV)-6, Epstein-Barr virüsü (EBV), sitomegalovirüs (CMV), enterovirüs] (Seegene, Güney Kore) ve real time PCR [Batı Nil virüsü (BNV)] (Lanciotti RS, 2000) yöntemi uygulandı. Ayrıca, BOS miktarı yeterli olan 39 hastanın klinik örneklerine multipleks PCR ile eş zamanlı olarak shell-vial hücre kültürü yöntemi uygulandı. HSV 1-2 ve enterovirüslerin izolasyonunda Vero hücre dizisi ve her etkene özgül FITC ile işaretlenmiş poliklonal antikorlar (HSV 1-2, Panenetrovirus, Light Diagnostic, Millipore, ABD) kullanıldı. Klinik örneklerden nükleik asitler ekstrakte edildikten sonra cdna lar sentezlendi. Nükleik asitlerin multipleks amplifikasyonu, DPO primerler ve Meningitis ACE Detection V1-2 kitleri kullanılarak yapıldı. PCR ürünü, Screen Tape çoklu tanımlama sistemi kullanılarak otomatize poliakrilamid jel elektroforezi ile saptandı. Sonuçlar Meningitis ACE Detection yazılımıyla tanımlandı. BNV nin saptanmasında FAM ve TAMRA ile işaretli özgül primer ve problar kullanılarak BioRad cihazında realtime PCR yöntemi uygulandı. Bulgular: Toplam 111 örneğin, 36 (%32.4) sında HSV 1-2, VZV, HHV-6, EBV, CMV, enterovirüs ve BNV pozitif, 75 (%67.6) inde negatif bulundu. Pozitif örneklerin 30 (%83.3) u erişkin (median 39 yaş), 6 (%16.7) sı çocuk yaş grubunda (median 7.5 yaş) (p= 0.564) yer almaktaydı. Pozitif örneklerin 25 (%69.4) inde enterovirüs [çocuk (6), erişkin (19) (tek etken: 20, çoklu etken: 5), 11 (%30.5) inde herpes virüsler EBV (6), HSV (3), VZV (2), HHV-6 (1) (çocuk: 1, erişkin: 10) (tek etken: 5, çoklu etken: 6)], 9 (%25) unda BNV [(çocuk: 1, erişkin: 8), (tek etken: 3, çoklu etken: 6)] etken olarak saptandı. Hiçbir hastada akut menenjit etkeni olarak CMV saptanmadı. Hastaların 8 (%7.2) inde çoklu etken infeksiyonu görüldü (çocuk: 1, erişkin: 7). Shell-vial hücre kültürü yöntemi ile hastaların birinde enterovirüs saptanırken, hiçbirinde HSV 1-2 saptanmadı. Sonuç: Akut menenjit tanısı alan hastaların yaklaşık %33 ünde virüsler etken olarak saptanmıştır. Erişkin ve çocuk grubunda pozitiflik oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır. Çocuklarda ve erişkinlerde ilk sırayı enterovirüsler (%22.5) almıştır. Bunu yaklaşık %10 oranıyla herpes virüsler izlemiştir. Herpes virüslerin en sık erişkinlerde etken olarak saptandığı görülmüştür. Olguların %7.2 sinde çoklu etken infeksiyonu saptanmış ve bunların çoğunluğunun erişkin grupta olduğu görülmüştür. BNV nin çoğunluğu erişkinlerde ve çoklu infeksiyonlarda saptanmıştır. Hiçbir hastada akut menenjit etkeni olarak CMV saptanmamıştır. PCR ile hücre kültürü sonuçları uyumlu bulunmuştur. Anahtar Kelimeler: Akut menenjit; Multipleks PCR; Shell-vial hücre kültürü; Virüs 174 Geliş Tarihi/Received: 26/02/2016 - Kabul Ediliş Tarihi/Accepted: 16/03/2016
Çiçek C, Pullukçu H, Kalfaoğlu H, Kahraman H. SUMMARY Early Diagnosis of Viral Pathogens in Cerebrospinal Fluid from Patients with Acute Meningitis Candan ÇİÇEK 1, Hüsnü PULLUKÇU 2, Hale KALFAOĞLU 3, Hasip KAHRAMAN 4, Eylem ULAŞ SAZ 5 1 Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, University of Ege, Izmir, Turkey 2 Department of Infectious Diseases and Clinical Microbiology, Faculty of Medicine, University of Ege, Izmir, Turkey 3 Clinic of Medical Microbiology, Izmir Buca Seyfi Demirsoy State Hospital, Izmir, Turkey 4 Clinic of Infectious Diseases and Clinical Microbiology, Amasya Sabuncuoglu Serefeddin State Hospital, Amasya, Turkey 5 Department of Emergency Medicine, Faculty of Medicine, University of Ege, Izmir, Turkey Introduction: Viruses are the major causes of acute meningitis and encephalitis. The aim of this study was to establish the prevalence of viruses in patients with acute meningitis. Materials and Methods: Cerebrospinal fluid specimens were collected from 111 patients [41 (37%) female, 70 (63%) male] with central nervous system infections between April 2012 and February 2014. The age range of patients was between 1 to 88 years (median: 35.5 years). Of the 111 patients, 22 (19.8%) were pediatric patients (median: 5), and 89 (80.2%) were adult patients (median: 37). Multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay [herpes simplex virus (HSV) 1-2, Varicella zoster virus (VZV), human herpes virus (HHV)-6, Epstein-Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) enterovirus)] (Seegene Inc., Seoul Korea) and real time PCR [West Nile virus (WNV)] (Lanciotti RS, 2000) methods were performed on all clinical specimens. In addition, to the 39 specimens which had sufficient amount of CSF; shell-vial cell culture method was performed simultaneously with multiplex PCR. In order to isolate HSV 1-2 and enteroviruses; Vero cell line and fluorescein isothiocynate labelled each virus specific polyclonal antibodies were used (HSV 1-2, Panenetrovirus, Light Diagnostic, Millipore, ABD). After nucleic acid extraction and complementary DNA (cdna) synthesis from clinical specimens, multiplex amplification of nucleic acids were done by Dual Priming Oligonucleotide (DPO) primers and Seeplex Meningitides V1-2 ACE Detection kit (Seegene Inc., South Korea). Results: Out of 111 patients, 36 (32.4%) were positive and 75 (67.6%) were negative for HSV 1-2, VZV, HHV-6, EBV, CMV, enterovirus and WNV. Of the positive patients, 30 were adults (median: 39 years) and 6 (median: 7.5 years) were pediatric patients (p= 0.564). Of the positive specimens, 25 (69.4%) were enterovirus (pediatric: 6, adult: 19), (single: 20, multiple: 5), 11 (30.5%) were herpes viruses (pediatric: 1, adult: 10), (single: 6, multiple: 5), 9 (25%) were WNV (pediatric: 1, adult: 8), (single: 3, multiple: 6). CMV was not identified in any patient. Multiple viruses were identified in 8 (7.2%) of the patients (pediatric: 1, adult: 7). We didn t detect HSV 1-2 in any of the patients; however, in only one patient, enterovirus was detected with shell vial cell culture method. Conclusion: Viruses were detected in approximately 33% of the patients with acute meningitis. There was no statistically significant difference between positivity rates in adults and children. Most commonly detected viruses were enteroviruses (22.5%) in children and adults. This rate was followed by herpes viruses approximately at the percentage of 10%. Herpes viruses were most frequently identified in adults. Multiple virus infections were detected in 7.2% of patients and it was observed that the majority of these were in the adult group. The WNV was often accompanied with multiple viral infections and was seen in the majority of the adult group. CMV was not identified in any patient. Shell-vial cell culture methods were compatible with the multiplex PCR results. Key Words: Acute meningitis; Multiplex PCR, Shell-vial cell culture; Virus GİRİŞ Akut menenjit olgularında enterovirüsler, herpes virüsler, kabakulak, kızamık, insan immünyetmezlik virüsü (HIV) ve flavivirüsler en sık etken olarak saptanan virüslerdir. Bu infeksiyonlar, yılda yaklaşık %0.005 ile %0.0015 oranları arasında görülmektedir [1]. Enterovirüs, aseptik menenjit olgularında ilk sırayı alır ve bu olguların %80- %95 inde saptanır [2]. Enterovirüs menenjiti açısından en duyarlı grup süt çocukları ile küçük çocuklardır ve artan yaşla birlikte görülme oranı azalmaktadır [2,3]. Herpes virüs ailesinde yer alan herpes simpleks virüsü (HSV) tip 1 ve tip 2, Epstein-Barr virüsü (EBV), varisella-zoster virüsü (VZV), sitomegalovirüs (CMV) ve insan herpes virüsü-6 (HHV-6) infeksiyonlarının seyrinde santral sinir sistemi (SSS) tutulumları gelişebilir [2]. Herpes virüsler içinde HSV menenjiti diğerlerine göre daha sık görülür. HSV ye bağlı aseptik menenjitler genellikle HSV-2 ye bağlı olarak gelişen primer genital infeksiyonla ilişkili olup, primer infeksiyonu olan kadınların %36 sında, erkeklerin ise %13 ünde eş zamanlı olarak görülebilir [3]. Batı Nil virüsü (BNV) infeksiyonlarına bağlı Amerika Birle- 175
Akut Menenjit Kliniği ile Başvuran Hastaların Bos Örneklerinde Viral Etkenlerin Erken Tanısı şik Devletleri (ABD), Rusya, Romanya ve İsrail de salgınlar görülmüş ve %5-14 arasında değişen oranlarda mortalite ile seyretmiştir [4]. Ülkemizde ilk doğrulanmış BNV infeksiyonu olgusu 2009 yılında bildirildikten sonra, Ağustos-Ekim 2010 tarihleri arasında Ege, Marmara, İç Anadolu, Akdeniz ve Güneydoğu Anadolu dan toplam 44 olguda BNV infeksiyonu doğrulanmış ve bunların 7 (%15.9) si ölümle sonuçlanmıştır [5]. Birçok olguda, BNV nin neden olduğu ensefalitler, diğer arboviral ensefalitlerden ayrılamamaktadır. Bunun yanında ayırıcı tanıda, enterovirüsler, HSV-2, HIV nedenli menenjitler de göz önüne alınmalıdır [6]. Olguların %32-75 inde ileri tanı yöntemlerine rağmen etyolojik ajan belirlenememektedir [2]. SSS infeksiyonlarının kliniği akut seyirli ve hızlı ilerleyen tipte olup, yüksek oranda ölüm ve kalıcı sekellerle sonuçlanabilir [3]. Dolayısıyla doğru ve hızlı tanı büyük önem taşımaktadır. Son yıllarda, klinik örneklerde SSS patojenlerinin hızlı tanısında kullanılan nükleik asit saptama teknikleri geliştirilmiştir. Multipleks polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yönteminde, bir klinik örnek kullanılarak, aynı reaksiyonda birden fazla virüs aynı anda saptanabilmektedir. Bu etkenlerin; duyarlılığı yüksek, kısa sürede sonuçlanan ve tüm etkenlerin aynı anda belirlenebildiği multipleks PCR tanı testiyle saptanması, hastaların erken dönemde daha iyi klinik bakım almalarını, morbidite ve mortalite hızlarının da azalmasını sağlayabilir. Bu çalışmada, akut menenjit infeksiyonu olan hastalarda viral etkenlerin araştırılmasında, multipleks PCR tanı yöntemiyle kısa sürede ve tek bir reaksiyonda etkenlerin saptanması amaçlanmıştır. MATERYAL ve METOD Hasta Popülasyonu ve Örneklerin Saklanması Nisan 2012-Şubat 2014 tarihleri arasında SSS infeksiyonu bulguları ile başvuran ve klinik, fizik muayene, radyolojik ve laboratuvar bulgularıyla SSS infeksiyonu olduğu düşünülen ve yatırılarak takip veya tedavi kararı verilen toplam 111 hasta çalışmaya alındı. Yaşları 1-88 arasında değişen (median 35.5) 22 (%19.8) çocuk (median 5), 89 (%80.1) erişkin (median 37) hastanın; 41 (%37) i kadın, 70 (%63) i erkekti. Hastalardan lomber ponksiyon ile beyin omurilik sıvısı (BOS) alındı ve çalışma gününe kadar örnekler -80 C de saklandı. Etik Kurul onayı Ege Üniversitesi Klinik Araştırmalar Etik Kurulu ndan (11.01.2010, sayı: 09-10.1/3) alındı. Örneklerin Multipleks ve Gerçek Zamanlı PCR Yöntemiyle Çalışılması Örnekler, ekstraksiyon işlemine başlamadan önce vortesklendi ve 1 ml örnek uygun tüpe pipetlenip 13.000 rpm de 5 dakika santrifüjlendi. Santrifüj sonrası 500 μl süpernatant başlangıç materyali olarak kullanıldı. Nükleik asitlerin ekstraksiyonu, viral DNA/RNA Extraction Kit (intron, Güney Kore) ile yapıldı. Ekstraksiyon işleminden itibaren reaksiyona internal kontroller ilave edildi. Ekstraksiyon işleminden sonra, revers transkripsiyon ile cdna lar sentezlendi (RevertAid First Strand cdna Synthesis Kits, Fermentas, USA). Multipleks PCR İçeriğinde; HSV 1-2, VZV, CMV, EBV, HHV- 6 ve enterovirüse özgül DPO primerleri, DNA polimeraz enzimi ve dntps içeren mastermix, 8-MOP solüsyonu içeren Meningitis V 1-2 ACE Detection (Seegene, Güney Kore) kiti kullanılarak ısı döngü cihazında üretici firmanın önerileri doğrultusunda 40 döngü yapılarak cdna lar çoklu amplifiye edildi. Karışım, 94 C de 15 dakika inkübe edildikten sonra, 0.5 dakika 94 C de, 1.5 dakika 63 C de, 1.5 dakika 72 C de olmak üzere 40 döngü yapıldı. Son olarak 72 C de 10 dakika inkübe edildikten sonra reaksiyon sonlandırıldı. Amplifiye ürün tam otomatize Screen Tape çoklu tanımlama cihazına yüklendi. Bu cihazda, PCR ürününe otomatize poliakrilamid jel elektroforezi uygulandı ve sonuçlar Meningitis V 1-2 ACE Detection Screening Software i kullanılarak belirlendi. Batı Nil Virüsü Gerçek Zamanlı PCR Yukarıda belirtildiği gibi ekstraksiyon ve cdna sentezi yapıldıktan sonra hedefe yönelik primer dizileri (FLI-WNF5-Forward: GGGCCTT- CTGGTCGTGTTC, FLI-WNF6-Reverse: GATCT- TGGCYGTCCACCTC), prob (FLI-WNF-Probe: FAM-CCACCCAGGAGGTCCTTCGCAA-TAMRA), master mix ve distile su ile hazırlanan karışım, BIORAD CFX 96 gerçek zamanlı PCR cihazına yüklendi. Cihazda ışımayı sağlamak için FAM boyası seçildi. Isı döngü cihazında, 95 C de 15 dakika, sonrasında ise 95 C de 30 saniye, 55 C de 176
Çiçek C, Pullukçu H, Kalfaoğlu H, Kahraman H. 30 saniye, 72 C de 30 saniye olacak şekilde 42 döngü yapıldı. Çalışma sonunda amplifikasyon eğrileri görülen örneklerin sonuçları pozitif olarak değerlendirildi. Shell-Vial Hücre Kültürü (SVHK) Örneklerden multipleks PCR çalışmasından sonra hücre kültürü için yeterli miktarda kalan 39 örnekte SVHK yöntemiyle HSV 1-2 ve enterovirüsler araştırıldı. Her örnek için Vero hücre dizisinden (DSMZ, Almanya) oluşan iki adet shell-vial tüpü hazırlandı. BOS örneğinden her hücre dizisine 0.2 ml inoküle edildikten sonra tüpler 3200 xg de, 35 C de 30 dakika santrifüj edildi. Tüpler, 37 C de bir saat bekletildi ve daha sonra hücre dizileri üstündeki sıvı atılarak yerine 1 ml hacminde izolasyon besiyeri (Biochrom GmbH, Germany) ilave edildi. Tüpler, 37 C de %5 CO 2 li ve nemli ortamda 48 saat inkübe edildi. İnkübasyon süresi sonunda tüplerden kültür sıvısı uzaklaştırıldı ve shell-vialler -20 C de 10 dakika asetonda fikse edildi. Vero hücre dizilerinin biri enterovirüs, diğeri HSV 1-2 ye özgül FITC ile işaretlenmiş monoklonal antikor (Millipore, Light Diagnostic, ABD) ile üretici firmanın önerileri doğrultusunda boyandı ve elma yeşili rengi floresan ışıma görülen hücreler pozitif olarak değerlendirildi [7]. Oranların belirlenmesi ve Ki-kare testinde (Pearson Chi-Square) SPSS (v21) kullanıldı. İstatistiksel anlamlılık için p değerinin < 0.05 olması kabul edildi. BULGULAR BOS örneklerinin 36 (%32.4) sı pozitif, 75 (%67.6) i negatif bulundu. Toplam 36 pozitif örneğin 12 (%33.3) si kadın, 24 (%66.6) ü erkek (p= 0.586), 6 (%16.7) sı çocuk, 30 (%83.3) u erişkin grupta (p= 0.564) idi ve yaş ortalamaları 35.5 yıldı. Pozitif örneklerin 25 (%69.4) inde enterovirüs, 11 (%30.5) inde herpes virüsler [EBV (n= 6, %54.5), HSV (n= 3, %27.2), VZV (n= 2, %18.1), HHV-6 (n= 1, %9)], 9 (%25) unda BNV etken olarak saptandı. Hiçbir hastada akut menenjit etkeni olarak CMV saptanmadı. BNV saptanan hastaların 8 (%88.8) i erişkindi ve 2 (%22.2) si ölümle sonuçlandı. Olguların 6 (%5.4) sında iki virüs, 2 (%1.8) sinde üç virüs birlikte saptandı. Çoklu etken saptananların biri çocuk, yedisi erişkin grupta yer almaktaydı. EBV pozitif hastaların 4 (%66.7) ünde çoklu, 2 (%33.3) sinde tekli, BNV pozitif hastaların 6 (%66.7) sında çoklu, 3 (%33.3) ünde tekli, HSV pozitiflerin 2 (%66.7) sinde çoklu, 1 (%33.3) inde tekli etken infeksiyon görüldü (Tablo 1). Hastalığın başlangı- Tablo 1. Akut menenjit olgularında saptanan etkenlerin dağılımı Grup Virüsler Çocuk n (%)* Erişkin n (%)* Toplam n (%)* Tek virüs infeksiyonları Enterovirüs 5 (22.7) 15 (16.8) 20 (18.0) Batı Nil virüsü 0 3 (3.4) 3 (2.7) HSV 1-2 0 1 (1.1) 1 (0.9) VZV 0 2 (2.2) 2 (1.8) EBV 0 2 (2.2) 2 (1.8) İkili etken infeksiyonları Enterovirüs + Batı Nil virüsü 0 2 (2.2) 2 (1.8) EBV + Batı Nil virüsü 0 1 (1.1) 1 (0.9) EBV + HSV 1-2 0 1 (1.1) 1 (0.9) Enterovirüs + HSV 1-2 0 1 (1.1) 1 (0.9) HHV-6 + Batı Nil virüsü 0 1 (1.1) 1 (0.9) Üçlü etken infeksiyonları EBV + Enterovirüs + Batı Nil virüsü 1 (4.5) 1 (1.1) 2 (1.8) Pozitif 6 (27.2) 30 (33.7) 36 (32.4) Negatif 16 (72.7) 59 (66.3) 75 (67.6) Toplam 22 89 111 * Sütun yüzdesidir. HSV: Herpes simpleks virüsü, VZV: Varisella zoster virüsü, EBV: Epstein-Barr virüsü, HHV: Human herpes virüsü. 177
Akut Menenjit Kliniği ile Başvuran Hastaların Bos Örneklerinde Viral Etkenlerin Erken Tanısı Tablo 2. Çoklu ve tekli etken infeksiyonlarında hastaların klinik durumlarına göre dağılımları Grup Çoklu etken infeksiyonu saptanan hasta (%) Tekli etken infeksiyonu saptanan hasta (%) İlk beş günde serum lökosit değerlerinde normalleşme görülen 3 (37.5) 24 (85.7) Serum CRP düzeyinde normalleşme görülen 3 (37.5) 16 (57.1) Ateş yanıtı alınan 4 (50) 26 (92.9) Yatış süresi iki haftadan az olan 3 (37.5) 18 (64.2) Glasgow koma skalasında sekiz ve daha az puan alan 2 (25) 2 (7.1) CRP: C-reaktif protein. cından sonraki ilk beş günde serum lökosit değerlerinde normalleşme görülen 3 (%37.5) hastada çoklu etken infeksiyonu, 24 (%85.7) hastada tekli etken infeksiyonu saptandı. Serum CRP düzeyinde normalleşme görülenlerin 3 (%37.5) ünde çoklu etken infeksiyonu, 16 (%57.1) sında tekli etken infeksiyonu saptandı. Ateş yanıtı alınan olguların 4 (%50) ünde çoklu etken infeksiyonu, 26 (%92.9) sında tekli etken infeksiyonu görüldü. Hastanede yatış süresi en fazla iki hafta olan 3 (%37.5) olguda çoklu etken infeksiyonu, 18 (%64.2) olguda tekli etken infeksiyonu saptandı. Glasgow koma skalasında 8 ve daha az puan alan olguların 2 (%25) sinde çoklu etken infeksiyonu, 2 (%7.1) sinde tekli etken infeksiyonu olduğu görüldü. Çoklu ve tekli etken infeksiyonlarında hastaların sırasıyla ortalama BOS taki hücre sayıları 500 hücre/mm 3, 500-1000 hücre/mm 3, BOS protein miktarları 115 mg/dl, 130 mg/dl ve BOS/kan glukoz oranları her ikisinde de 0.5 olarak saptandı. SVHK yapılan 39 hastanın birinde enterovirüs saptanırken, hiçbirinde HSV 1-2 saptanmadı. TARTIŞMA Mortalite ve morbiditesi yüksek olan menenjitte, hastaların acil olarak değerlendirilmesi ve tedavisinin düzenlenmesi hayat kurtarıcıdır. Son yıllarda, çok sayıda SSS infeksiyonu etkenini aynı anda saptayabilen multipleks bazlı nükleik asit testleri geliştirilmiştir. Multipleks PCR yöntemi ile SSS patojenlerinin kısa sürede tanımlanması; klinik kararların erken alınmasını sağlayarak hasta yönetimini daha etkin hale getirmekte ve antibiyotik kullanımını azaltmaktadır. Bunun yanında bu yöntemler, hücre kültürü ve DFA ile saptanamayan diğer SSS virüslerini de saptayabilmektedir. BOS ta virüslerin saptanmasında altın standart PCR yönetimidir. Sadece enterovirüslerin hem hücre kültürü hem de PCR yöntemi ile saptanması önerilmektedir [8]. Real-time PCR yönteminin duyarlılığı ve özgüllüğü %91-100 arasında değişmekle beraber etkeni hızla saptayabilmesi avantajları arasındadır. Ancak maliyetinin yüksek olması ve her merkezde uygulanamaması kullanımını sınırlandırmaktadır. Günümüzde, SSS de etken olan virüslerin tek örnekte çoklu saptanmasına yönelik tanı testleri geliştirilmiştir. Multipleks PCR yöntemi ile kıymetli bir klinik örnek olan BOS tan hem çok az bir volüm kullanılmakta hem de tek test ile birden fazla virüs saptanabilmektedir [8]. Epidemiyolojik ve mikrobiyolojik araştırmalar akut menenjitte etken olarak %70 e yakın oranlarda virüsleri göstermektedir [3]. Bu çalışmadaki tüm olguların 36 (%41) sında viral etken saptanmıştır. Bu oran Pişkin ve arkadaşlarının 244 hastada, Oktar ve arkadaşlarının ise 171 hastada yaptıkları çalışmalarda saptanan sırasıyla %33.2 ve %41 oranlarıyla benzerdir [9,10]. Viral menenjitlerde daha önce yapılan çalışmalara göre cinsiyet oranları; %54.3-75 erkek, %25-46.9 kadın olarak bildirilmiştir [9,11,12]. Bu çalışmada da benzer olarak pozitif saptanan hastaların 12 (%33.3) si kadın, 24 (%66.6) ü erkek olarak bulunmuştur. Viral menenjitler çocuklarda ve genç erişkinlerde daha sık görülmektedir. Sünbül ve arkadaşlarının yaptıkları araştırmada viral menenjit olgularının %50 sinin 16-25 yaş arasında olduğu, Pişkin ve arkadaşlarının yapmış olduğu araştırmada viral menenjitlerde yaş ortalamasının 36.8, Çelik ve arkadaşlarının yapmış olduğu araştırmada ise 29.8 olduğu bildirilmiştir [9,11,12]. Bu çalışmada da ben- 178
Çiçek C, Pullukçu H, Kalfaoğlu H, Kahraman H. zer olarak viral menenjit olgularının yaş ortalaması 35.5 yıl olarak bulunmuştur. Tanımlanmış viral menenjit infeksiyonlarında etken %80-95 oranında enterovirüslerdir [2]. Bu çalışmada, tüm menenjit olgularının 25 (%22.5) inde enterovirüsler pozitif bulunmuştur. Bu oran Sayıner ve arkadaşlarının 31 hastada yaptıkları çalışmada saptanan %38.7 oranıyla benzerdir [13]. Herpes virüs ailesinde yer alan HSV 1-2, EBV, VZV, CMV ve HHV-6 infeksiyonlarının seyrinde çeşitli SSS tutulumları gelişebilir [2]. Tüm aseptik menenjitli olguların %0.5-3 ünün etkeni herpes virüslerdir [14]. HSV ye bağlı SSS infeksiyonuyla ilgili Türkiye de yapılan çalışmalarda oranın %9.7-19 arasında saptandığı gözlenmektedir [13,15]. Bu çalışmada da benzer olarak tüm olguların %9.9 unda herpes virüsler saptanmıştır. En sık EBV (%5.4) saptanırken, bunu sırasıyla HSV (%2.7) ve VZV (%1.8) takip etmiştir. Hiçbir hastada akut menenjit etkeni olarak CMV saptanmamıştır. HHV-6 nın immünsüpresif kişilerde ensefalite neden olabileceği bildirilmiştir. Ancak sağlıklı erişkinlerde klinik önemi henüz bilinmemektedir. HHV-6 için PCR nin duyarlılığı %95 in üzerinde olmakla birlikte, sağlıklı erişkinlerde ensefalit tanısı açısından pozitif prediktif değerinin %30 olduğu bildirilmiştir [2]. Bu çalışmada immünsüpresyonu olmayan bir olguda HHV-6 ve BNV birlikte etken olarak saptanmıştır. Türkiye de çeşitli bölgelerde farklı araştırmacılar tarafından yapılan çalışmalarda, BNV ye karşı seropozitiflik oranları %0.6-57 arasında bildirilmiştir [16,17]. Ülkemizde 2009 yılında retrospektif olarak incelenen 87 aseptik/viral menenjit/ensefalit olgusunun sadece 1 (%1.1) inde BNV saptanmıştır [18]. Ağustos-Ekim 2010 tarihleri arasında toplam 44 olguda BNV infeksiyonu doğrulanmış ve bunların 7 (%15.9) si ölümle sonuçlanmıştır [5]. Bu gelişmeleri takiben ülkemizde, 2 Nisan 2011 tarihinden itibaren BNV infeksiyonu bildirimi zorunlu hastalıklar arasına alınmıştır [16]. BNV infeksiyonlarına bağlı ABD, Rusya, Romanya ve İsrail deki salgınlarda saptanan nörolojik semptomlara, %5-14 arasında değişen yüksek oranda mortalite eşlik etmiştir [4]. Bu çalışmada literatürle uyumlu olarak 9 (%8.1) hastada BNV pozitif saptanmış ve 2 (%22.2) si ölümle sonuçlanmıştır. Tang ve arkadaşları 60 BOS örneğinin 2 (%3.3) sinde ikili etken (HSV ve HHV-6, HSV ve EBV), Minjolle ve arkadaşları 142 BOS örneğinin 3 (%2.1) ünde etken (CMV, VZV ve HSV-2, VZV ve HSV-2, CMV ve HHV-6), Shin ve arkadaşları 78 akut menenjit olgusunun 1 (%1.2) inde ikili viral etken (HSV 1-2 ve EBV) infeksiyonu bildirmişlerdir [19-21]. Bu çalışmada da literatürle yaklaşık aynı oranlarda (%7.2) çoklu etken infeksiyonu saptanmıştır. En sık birlikte saptanan etkenler BNV ve enterovirüs (%66.7) olup, EBV, BNV ve HSV nin tekli yerine çoklu etken infeksiyonuna daha çok sebep olduğu görülmüştür. Bu çalışmada çoklu etken infeksiyonlarında tekli etken infeksiyonlarına göre; hastalığın başlangıcından sonraki ilk beş günde serum lökosit ve C-reaktif protein (CRP) değerlerinde normalleşme görülenlerin, ateş yanıtı alınanların, hastanede yatış süresi en fazla iki hafta olanların ve Glasgow koma skalasında sekiz ve daha fazla puan alanların oranının daha düşük olduğu görülmüştür. Bu bulgular bize çoklu etken infeksiyonlarının hastalığın kliniğini kötüleştirebildiğini göstermektedir. Bununla birlikte, çoklu ve tekli etken infeksiyonlarında hastaların BOS biyokimya sonuçları benzer bulunmuştur. Akut menenjit etkeni olan pek çok virüste hücre kültürü altın standart olmakla birlikte etkenlerin geç üremeleri, çoğalma yetersizliği, örnekte yüksek miktarda canlı virüs gereksinimi bu yöntemin dezavantajlarıdır. Bu nedenle tek yöntemle etken araştırılması yanlış pozitiflik ve yanlış negatiflik riskini taşımaktadır. Hücre kültürü yöntemiyle birlikte PCR yönteminin kullanılması verilen sonuçların doğruluğu açısından önemlidir. Günümüzde kullanılan PCR teknikleri yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir. Ayrıca, moleküler yöntemlerde kısıtlı miktarda alınabilen BOS örneğinin az miktarda kullanılması da bir diğer avantajdır [3,22]. Ülkemizde yapılan çalışmalar incelendiğinde, Güney ve arkadaşlarının 68 aseptik menenjitli yenidoğan hastanın BOS örneklerinde yaptığı çalışmada, 36 (%53) örnek geleneksel hücre kültürü ile (EcV 30, CxV B), 43 (%63) örnek in house RT-PCR ile enterovirüs pozitif bulunmuştur [23]. Kılıç ve arkadaşlarının çalışmasında, 66 BOS örneğinin 3 (%4.5) ü hücre kültürü ile pozitif, biri RT-PCR ile pozitif, 2 (%3) si ara değer olarak saptanmıştır [24]. Bu çalışmada az 179
Akut Menenjit Kliniği ile Başvuran Hastaların Bos Örneklerinde Viral Etkenlerin Erken Tanısı miktarda olan BOS örneklerinden shell-vial yöntemi için toplamda 400 μl BOS örneği gereksiniminin test tekrarlarını ve farklı yöntemlerle çalışma imkanını kısıtladığı görülmüştür. Bu çalışmada sadece 39 örneğe SVHK yapılabilmiştir ve multipleks PCR ile uyumlu olarak hastaların birinde entenovirüs saptanırken, hiçbirinde HSV 1-2 saptanmamıştır. Bu çalışmayla bölgemizde akut menenjit tanısı olan hastaların %33 ünde virüslerin etken olduğu, bunların %22.5 nin enterovirüs, %9.9 unun herpes virüsler ve %8.1 nin BNV olduğu görülmüştür. Erişkin, çocuk grubunda ve cinsiyete göre pozitiflik oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır. Herpes virüslerin en sık erişkinlerde etken olarak saptandığı görülmüştür. Olguların %7.2 sinde çoklu etken infeksiyonu saptanmış ve bunların çoğunluğunun erişkin grupta olduğu görülmüştür. En sık birlikte saptanan etkenler BNV ve enterovirüs (%66.7) tür. BNV ve herpes virüslerin tekli yerine çoklu etken infeksiyonuna daha çok sebep olduğu görülmüştür. Bir olguda HHV-6 ve BNV birlikte etken olarak saptanmıştır. Hiçbir hastada akut menenjit etkeni olarak CMV saptanmamıştır. Hastaların klinik muayene ve laboratuvar bulguları göz önüne alındığında, çoklu etkenle oluşan infeksiyonların hasta kliniği kötüleştirdiği gösterilmiştir. PCR ile hücre kültürü sonuçları uyumlu bulunmuştur. Kullanılan multipleks PCR yönteminin, tek reaksiyon tüpünde aynı anda birden fazla etkeni saptaması, düşük miktarda örnek ve sarf malzemesi gerektirmesi ve kısa sürede sonuç vermesi gibi avantajları olduğu görülmüştür. KAYNAKLAR 1. Chadwick DR. Viral meningitis. Br Med Bulle 2005;75-76:1-14. DOI: 10.1093/bmb/ldh057. 2. Rotbart HA. Aseptic and viral meningitis. In: Long SS, Pickering LK, Prober CG (eds). Principles and Practice of Pediatric Infectious Diseases. 2 nd ed. New York: Churchill Livingstone, 2003:284-91. 3. Tunkel AR, Van de Beek D, Scheld WM. Acute meningitis. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds). Principles and Practice of Infectious Diseases. 7 th ed. Philadelphia: Elsevier Churchill Livingstone, 2009:chap 84. 4. McMinn CP. The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses. J Gen Virol 1997;78:2711-22. 5. Kalaycıoğlu H. Türkiye de görülen West Nile vakalarının epidemiyolojisi. III. Türkiye Zoonotik Hastalıklar Sempozyumu. 1-2 Kasım 2010, Ankara: Sempozyum Kitabı, 2010;174-83. 6. Sampathkumar P. West Nile virus: epidemiology, clinical presentation, diagnosis and prevention. Mayo Clin Proc 2003;78:1137-44. 7. Van Doornum GJ, De Jong JC. Rapid shell vial culture tecnique for detection enteroviruses and adenoviruses in fecal specimens: comparison with convantional virus isolation method. J Clin Microbiol 1998;36:2865-8. 8. Karakadıoğlu S. Aseptik menenjit ve kardit etyolojisinde enteroviruslerin chip tekniği (microarray) ile araştırılması (tez). Celal Bayar Üniversitesi, Manisa; 2007. 9. Pişkin N, Yalçın A, Aydemir H, Gürbüz Y, Tütüncü E, Türkyılmaz R. İki yüz kırk dört erişkin santral sinir sistemi infeksiyonu olgusunun değerlendirilmesi. FLORA 2005;10:119-24. 10. Oktar MA. Kliniğimizde son altı yıldır izlenen menenjit olgularının değerlendirilmesi (tez). Şişli Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi; 2007. 11. Sünbül M, Esen Ş, Eroğlu C, Barut Ş, Pekbay A, Leblebicioğlu H. Menenjitli 130 olgunun retrospektif değerlendirilmesi. İnfeksiyon Dergisi 1999;3:303-8. 12. Çelik İ, Özden M, Kılıçoğlu A, Demirdağ K, Kılıç SS. Yüz yirmi bir menenjit olgusunun retrospektif olarak değerlendirilmesi. Klimik Dergisi 2003;16:11-4. 13. Sayıner AA, Oktem IMA, Ergani A, Ergon C, Kurul S, Abacioglu YH, et al. Detection of herpes simplex virus DNA and enterovirus RNA in cerebrospinal fluid using PCR and microplate or strip hybridization assay. Clin Microbiol Infect 2003;9(Suppl 1):410. 14. Corey L, Spear PG. Infections with herpes simplex viruses (2). N Engl J Med 1986;314:749-57. 15. Altuglu I, Zeytinoglu A, Sirin H, Yuceyar N, Erensoy S. Comparison of different polymerase chain reaction methods for detection of herpes simplex virus types 1 and 2 encephalitis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2006;25:669-71. 16. Azap A, Meço O. Batı Nil virüsü ansefaliti. Klinik Gelişim 2010;51-5. 17. Paz S, Semenza JC. Environmental drivers of West Nile fever epidemiology in Europe and Western Asia-a review. Int J Environ Res Public Health 2013;10: 3543-62. doi:10.3390/ ijerph10083543 18. Ergünay K, Özkul A. Ankara bölgesinde nedeni bilinmeyen santral sinir sistemi enfeksiyonu olgularında saptanan Batı Nil virusu seropozitifliğinin doğrulanması. Mikrobiyol Bul 2011;45:381-3. 19. Tang YW, Espy MJ, Persing DH, Smith TF. 1997. Molecular evidence and clinical significance of herpesvirus coinfection in the central nervous system. J Clin Microbiol 35:2869-72. 20. Minjolle S, Michelet C, Jusselin I, Joannes M, Cartier F, Colimon R. 1999. Amplification of the six major human herpesviruses from cerebrospinal fluid by a single PCR. J Clin Microbiol 37:950-3. 21. Shin SY, Kwon KC, Park JW, Kim JM, Shin SY, Koo SH. Evaluation of the Seeplex Meningitis ACE Detection Kit for the Detection of 12 Common Bacterial and Viral Pathogens of Acute Meningitis. Ann Lab Med 2012;32:44-9. 180
Çiçek C, Pullukçu H, Kalfaoğlu H, Kahraman H. 22. Landry ML, Garner R, Ferguson D. Comparison of the Nuclisens Basic Kit (nucleic acid sequence based amplification) and the Argene Biosoft Enterovirus Consensus reverse transcription- PCR assays for rapid detection of enterovirus RNA in clinical specimens. J Clin Microbiol 2003;41:5006-10. 23. Guney C, Ozkaya E, Yapar M, Gumus I, Kubar A, Doğanci L. Laboratory diagnosis of enteroviral infections of the central nervous system by using a nested RT-polymerase chain reaction (PCR) assay. Diagn Microbiol Infect Dis 2003;47:557-62. 24. Kılıç İ, Altuğlu İ, Çiçek C ve ark. Santral sinir sistemi enfeksiyonu etkeni enterovirusların RT-PCR ve hücre kültür yöntemleri ile saptanması. Mikrobiyol Bul 2011;45:468-77. Yazışma Adresi/Address for Correspondence Uzm. Dr. Hale KALFAOĞLU Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Bornova, İzmir-Türkiye E-posta: hale.kalfaoglu@hotmail.com 181