GĐRĐŞ Gıda ve biyolojik örneklerde alkol tayini için Etanol Tayin Kiti üretilmiştir. Etanol derişiminin saptanmasına üretim aşamasında ve son üründe alkol miktarını saptamasında gereksinim duyulabilmektedir. Ayrıca alkol tayini üreticiler için önemli olmakla birlikte, tüketiciler ve ürün denetiminde görev yapanlar için de önem arzetmektedir. Özellikle düşük oranda alkol içeren ve/veya alkol içermemesi gereken ürünlerde, üretim ve üretim sonrası istenmeyen mikrobiyal gelişmeler sonucu alkol üretilebilmektedir. Alkollü, düşük alkollü ve alkolsüz içeçeklerde; çikolata, bal, reçel, sirke, süt ürünleri v.b. gıda örneklerinde; kozmetik ürünlerinde ve ilaçlarda Etanol Tayin Kiti yüksek doğrulukta, hassasiyette ve kısa sürede alkol derişiminin saptanması amacıyla kullanılabilmektir. Etanol miktarı; etanolun alkol dehidrogenaz enzimi varlığında nikotinamid adenin dinükleotid (NAD + ) ile vermiş olduğu spesifik reaksiyon takip edilerek yüksek hassasiyette ve doğrulukta saptanabilmektedir. Analiz sürecinde alkol dehidrogenazin katalizlediği reaksiyon ürünü (asitaldehid) aldehid dehidrogenaz enzimi ile ortamdan uzaklaştırılmaktadır. Bu durum analizin hassasiyetini ve doğruluğunu arttırmaktadır. Biyozim Etanol Analiz Kiti nde yüksek saflıkta alkol dehigrogenaz, aldehid dehidrogenaz ve nikotinamid adenin dinükleotid kullanılmış olup bu sayede örnek içerisindeki alkol derişimi doğru ve hassas bir şekilde saptanması sağlanmıştır. Yöntem mümkün olduğunca basitleştirilmiş ve her aşamasında kullanıcı kolaylığı ön planda tutulmuştur. ANALĐZ PRENSĐBĐ Đlk aşamada etanol ve NAD substrat olarak kullanılarak alkol dehidrogenaz katalizörlüğünde aşağıdaki reaksiyon gerçekleşmektedir. Etanol + NAD Alkol dehidrogenaz Asitaldehid + NADH + H + - 1-
Bu reaksiyon sonucu oluşan asitaldehid, aldehid dehidrogenaz enzimi katalizörlüğünde ve NAD + varlığında asetik aside dönüştürülmektedir. Asitaldehid + NAD +H 2 O Aldehid dehidrogenaz Asetik asit + NADH + H + Birinci ve ikinci reaksiyon sonucunda NADH üretilmekte olup üretilen NADH nın toplam mol sayısı reaksiyona giren alkol miktarının iki katıdır. NADH 340 nm de absorbans yapmaktadır ve 340 nm de absorbans artışı takip edilerek örnek içerisindeki etanol derişimi saptanmaktadır. ANALĐZ ĐÇĐN GEREKLĐ EKĐPMANLAR Mikro pipet (1000 µl) Mikro pipet (20-200 µl) Balon joje (100-250 ml) Makro küvet (3 ml) 1 Vorteks Su banyosu (37ºC) Spektrofotometre (340 nm) ANALĐZ KĐTĐ ĐÇERĐĞĐ Etanol analiz kiti; etanol analiz reaktifi, etanol analiz tamponu ve etanol standardından oluşmaktadır. 1 nolu şişe (#08-080-1): Analiz reaktifi-i (80 analiz/şişe) Alkol dehidrogenaz 200 IU/şişe, 2.1 ml 2 nolu şişe (#08-80-2): Analiz reaktifi-ii (80 analiz/şişe) Aldehid dehidrogenaz 10 IU/mL, 2.1 ml 3 nolu şişe (#08-80-3): Analiz reaktifi-iii NAD 300 mg 1 Tek kullanımlık plastik küvetlerin kullanılması tavsiye edilir. - 2-
4 nolu şişe (#08-80-4): Etanol analiz tamponu (Derişik, 50 ml) 1.0 M Fosfat tamponu (ph 9) %0.02 (a/h)na-azid 5 nolu şişe (#08-001-5): Etanol standardı Etanol (5 g/l) 4 ml ÇÖZELTĐLERĐN HAZIRLANMASI Etanol tayini ile ilgili tüm kimyasallar kullanıma hazır olarak sunulmuştur. Aşağıdaki prosedür gerçekleştirilerek çok kısa bir sürede ölçüme başlanabilir. 1 ve 2 nolu analiz reaktifleri kullanıma hazır halde sunulmuştur. Kullanılmadan önce kuvvetli bir şekilde çalkalanması gerekmektedir. I nolu analiz reaktifini 4 C de de II. Nolu analiz reaktifini -20 C de muhafaza edilmelidir. Etanol analiz reaktiflerinin hazırlanması: 3 nolu şişe içeriğini 22 ml saf su içerisinde çözülmesiyle çözelti hazır hale gelecektir. Çözeltinin ihtiyacınızdan fazla olması durumunda uygun hacimlerde plastik tüpler içerisinde -20 C de saklayınız. Çözelti belirtilen sıcaklıkta minimum 1 yıl muhafaza edilebilmektedir. Etanol analiz tamponu: Etanol analiz tamponu kullanıma hazır halde sunulmuştur. 4 C de muhafaza edilmesi durumunda 1 yıl saklanabilir. Etanol standart çözeltisinin hazırlanması: 5 nolu şişe içerisinde bulunan etanol standardı kullanılarak 0.05 g/l, 0.10 g/l, 0.20 g/l, 0.30 g/l, 0.40 g/l ve 0.50 g/l derişimlerindeki etanol çözeltilerini saf su kullanarak hazırlayınız. Farklı derişimdeki etanol çözeltileri sadece analiz ortamından kaynaklanan girişimler veya inhibisyonlar olması ihtimalinde kullanılacaktır. Etanol derişimi NADH nın uyarım katsayısı kullanılarak hesaplanacaktır. ÖRNEK HAZIRLAMA Örneğin berrak ve homojen olması gerekmektedir. Katı veya bulanık örneklerde etanol analizi gerçekleştirilmesi durumunda EK1 de verilen berrak örnek hazırlama yöntemlerinden yararlanılmalıdır. Örneğin 0.1-3-
g/l den fazla etanol içermesi durumunda seyreltilmesi gerekmektedir. Seyreltme işlemi, aşağıdaki tabloya uygun olarak gerçekleştirilir. Etanol derişimi (g/l) Örnek + Saf Su Miktarı Seyreltme Faktörü < 0.1-1 0.1-1.0 1 + 9 10 1.0-10.0 1 + 99 100 >10.0 1 + 999 1000 Örneğinizde etanol derişiminiz çok düşük olması durumunda analiz kitinde önerilen 0.1 ml örnek hacmi kademeli olarak arttırılabilir. Örnek hacminin arttırılması durumunda toplam hacmin değişmemesine dikkat edilmelidir. ANALĐZ BĐLGĐLERĐ Spekrofotometre dalga boyu : 340 nm Küvet Ölçüm sıcaklığı : 1 cm standart (Plastik veya cam) : 20-25ºC Mikropipet : 20 µl-100 ml-1000 ml Anlitik terazi Vorteks karıştırıcı Whatman No. 1 (9 cm) filtre kağıdı ANALĐZ PROSEDÜRÜ 1. Çözeltileri prosedüre göre hazırlayınız. 2. Test tüplerini numaralandırınız (kör, standart ve örnekler). 3. Tüplerin ve analiz çözeltilerinin analiz sıcaklığında olmasını sağlayınız. 4. Test tüplerine 0.10 ml örnek veya standart çözelti koyunuz. 5. Kör içerisine 1.90 ml, örnek içerisine 1.80 ml saf su ilave ediniz. 6. 0.40 ml tampon ilave ediniz. 7. 0.20 ml etanol analiz reaktifi-iii ilave ediniz. - 4-
8. 0.02 ml Etanol analiz reaktifi-ii ilave ediniz. 9. Saf su kullanarak spektrofotometreyi sıfırlayınız. 10. Karıştırınız, oda sıcaklığında 2 dk inkübe ediniz ve sonrasında çözeltinin absorbans değerini (A 1 ) 340 nm de saptayınız. 11. 0.02 ml etanol analiz reaktifi-i ilave ediniz. 12. Karıştırınız, oda sıcaklığında 5 dk inkübe ediniz ve sonrasında çözeltinin absorbans değerini (A 2 ) 340 nm de okuyunuz. Analizin kolay takip edilebilmesi için aşamalar tabloda özetlenmiştir. KÖR ÖRNEK Örnek veya standart - 0.10 ml Tüplerin, analiz çözeltisinin ve saf suyun analiz sıcaklığında olmasını sağlayınız. Saf su 1.90 ml 1.80 ml Etanol analiz tamponu 0.40 ml 0.40 ml Etanol analiz reaktifi-iii 0.20 ml 0.20 ml Etanol analiz reaktifi-ii 0.02 ml 0.02 ml Karıştırınız, 2 dk oda sıcaklığında inkübe ettikten sonra çözeltinin absorbansını (A 1 ) 340 nm de okuyunuz Etanol analiz reaktifi-i 0.02 ml 0.02 ml Karıştırınız, 5 dk oda sıcaklığında inkübe ettikten sonra çözeltinin absorbansını (A 2 ) 340 nm de okuyunuz ETANOL DERĐŞĐMĐNĐN HESAPLANMASI Kör ve örnek için ayrı ayrı absorbas farklarını (A 2 -A 1 ) hesaplayınız. Örneğin absorbans farkından körün absorbans farkını çıkartarak A değerini hesaplayınız. Ölçümünüzün doğru olması için A değerinin en az 0.1 olması gerekmektedir. Ölçümünüzde daha düşük değerler elde etmeniz durumunda örnek miktarını arttırınız. - 5-
Örneğin etanol derişimi ( (g/l) = V x MA x A ε x d x v x 2 V: Analiz toplam hacmi (2.5 ml) MA: Etanolün molekül ağırlığı (46.07 g/gmol) ε : NADH ın uyarım katsayısı (6300) d: Işık yolu (1 cm) v: Örnek miktarı (0.10 ml) 2: 1 mol etanolün reaksiyonu sonucu oluşan NADH ın mol sayısı Kit kapsamında önerilen değerler kullanılması durumunda aşağıda verilen basit eşitlikler kullanılarak etanol derişimi g/l veya % h/h cinsinde hesaplanabilir. Örneğin etanol derişimi (g/l) = 0.09287 x A Örneğin etanol derişimi (% h/h) = 0.01176 x A Örneğinizde seyreltme yaptıysanız seyreltme faktörü ile hesaplanan değeri çarpmayı unutmayınız. DOĞRUSALLIK SINIRI Hazırlanan etanol tayin kitinin 0.1 g/l derişimine kadar doğrusal olduğu saptanmıştır. Daha yüksek etanol içeren örneklerin seyreltme tablosu kullanılarak seyreltilmesi gerekmektedir. HASSASĐYET ve ÖLÇÜM SINIRI Etanol tayin kiti ortamda 0.1 g/l etanol varlığında yaklaşık 1.08 Abs üretecek şekilde hazırlanmıştır. 0.1 Abs değerinde değişim olması durumunda etanol derişimde ~9.29 mg/l lik bir değişim ölçülebilecektir. Ölçüm sınırı spekrofotometre gürültü seviyesinin 3 katı absorbans değerine eşdeğer etanol derişimi olarak hesaplanmıştır. - 6-
Ölçüm sınırı kullanılan spekrofotometreye bağlı olarak değişmekle birlikte üretim ve kalite kontrol sürecinde kullanılan Agilent UV/Vis Spekrofotometre için ölçüm sınırı 9.29 mg/l olarak saptanmıştır. DOĞRULUK Etanol tayin kitinin ölçüm doğruluğunu saptamak için iki farklı etanol derişiminde beş tekrarlı ölçüm alınmış ve ölçümler arasındaki standart sapma değerleri hesaplanmıştır. Standart sapma (ss) değerleri kullanılarak yüzde değişim katsayısı (%DK=ss/ortalama X 100) hesaplanmıştır. Her iki etanol değeri için de %DK değeri % 5 deneysel hata sınırlarının altında kaldığı saptanmıştır. Etanol derişimi (g/l) Standart Sapma % DK 0.50 ± 0.011 2.20 1.90 ± 0.043 2.26 Biyozim tayin kiti kullanılarak tekrarlanabilir doğru sonuçlar üretilebilmektedir. Aynı örnek için gerçekleştirdiğiniz ölçümlerde % 5 in üzerinde farklılığın olması durumunda analiz sürecinde gerçekleştirdiğiniz aşamaların gözden geçirilmesi gerekmektedir. Muhtemel hata kaynakları aşağıda verilmiştir. 1. Yanlış mikro pipet kullanımı, 2. Analiz sıcaklığının kontrolsüz olması, 3. Çözeltilerin iyi karıştırılmaması, homojen olmaması, 4. Örneğin homojen olmaması, bulanık veya renkli olması, 5. Reaksiyon ortamının temiz olmaması. GÜVENLĐK Etanol analiz kitinde koruyucu olarak Na-Azid (%0.02) kullanılmıştır. Tüm kimyasal maddelerin tehlikeli olabileceği unutulamamalıdır. Analiz çözeltilerin koklanmaması, içilmemesi ve vücuda temas ettirilmemesi gerekmektedir. Vücuda temas etmesi durumunda temas eden bölge bol su ile yıkanmalıdır. - 7-
ÖNEMLĐ UYARILAR Etanol ucuçu bir bileşik olması nedeniyle analiz öncesinde örnekler ve standartlar mutlaka kapağı sızdırmaz bir şeklide kapalı şişelerde muhafaza edilmelidir. Özellikle yüksek sıcaklıklara maruz kalmış şişelerin kapağı hemen açılmamalı, soğutulduktan sonra açılmalıdır. Analiz sürecinde kullanılan malzemelerin alkol ile temizlenmemesi gerekmektedir. Alkol bulaşısından şüpheleniliyorsa mutlaka bir kaç defa saf su ile durulanması gerekmektedir. Analiz kitinde yer alan enzimlerin çalışmasını kısmen ve tamamen inhibe eden bileşikler örneğinizde bulunabilir. Böyle bir durumun olup olmasının test etmek için örneğinizin içersine belirli miktarda etanol ilave edin ve analizini tekrarlayın. Đlave ettiğiniz örnek derişimine bağlı olarak oluşan absorbans değerini kullanarak etanol derişimini hesaplayınız ve gerçek değer ile karşılaştırınız. - 8-
EK 1. ÖRNEK HAZIRLAMA Örneğin bulanık olmaması, herhangi bir partikül içermemesi, renksiz olması gerekmektedir. Örneğinizin renkli olması durumunda analize başlamadan önce her bir örnek için örnek miktarı kadar hacim analiz tamponu ile karıştırılmalı ve analiz tamponuna karşı okunarak örneğin neden olmuş olduğu absorbans artışı saptanmalıdır. Bu absorbans değeri örnek-analiz reaktifi varlığında saptanan absorbans değerinden çıkartıldıktan sonra saptanan absorbans değeri hesaplamalarda kullanılmalıdır. Absorbans değerinin çok yüksek olması durumunda örnek seyreltilerek ölçüm gerçekleştirilmelidir. Örneğin seyreltilmesi durumunda örneğin etanol derişimi etanol tayin kiti ölçüm sınırının altına iniyorsa seyreltme işlemi yapılmaksızın renk giderici maddeler ile muamele edilmelidir. Örneğin ph değerinin analiz tamponu ph değerine yakın olması tercih edilmelidir. Seyreltik asit veya baz içeren örneklerde bu ph değeri aranmamaktadır. Fakat derişik asit veya baz içeren örneklerin ph değerleri ph 9.0 olacak şekilde sodyum hidroksit veya sülfürik asit ilave edilerek ayarlanmalıdır. ph nın ayarlaması esnasında meydana gelecek hacim artışı hesaplamalarda kullanılmak üzere kaydedilmelidir. Katı örnekler öğütülmeli homojenize edilmeli ve su kullanılarak çözünür maddeler ekstrakte edilmelidir. Bulanık çözeltiler filtre edilmelidir. Bulanık, renkli veya protein içeriği yüksek örnekler Carrez çözeltileri kullanılarak berraklaştırılmalıdır. Yağ içeren örneklerde eksraksiyon işlemi yüksek sıcaklıkta gerçekleştirilmeli, su-yağ karışımı soğutularak veya santrifüj edilerek yağ fazının ayrılması sağlanmalıdır. Berrak su fazında etanol ölçümü gerçekleştirilmelidir. Örneğinizde herhangi bir şekilde etanolu substrat olarak kullanan enzimin bulunması durumunda, bu enzimin çalışma koşullarının dışında analizin gerçekleştirildiğinden emin olunmalı, mümkünse enzimler inhibe edilmelidir. Ayrıca mikrobiyal gelişme ihtimali ortadan kaldırılmalı, örnekler bekletilmeden analizlenmeli veya uygun koşullarda saklamalıdır. - 9-
Yüksek miktarda renk maddesi içeren örneklerde polivinilpoliprolidon veya poliamid çözeltileri kullanılarak renk giderme işlemi gerçekleştirilmelidir (1g/100 ml). Etanolun buhar basıncı düşük olması nedeniyli örnekler kapaklı şişelerde muhafaza edilmeli, ısıl işlem uygulanması gerekiyorsa çok yüksek sıcaklıklara çıkılmamalı, şişenin kapağı sıkı bir şekilde kapatılmalı ve şişe kapağı örnek sıcaklığı düşürülmeden açılmamalıdır. Carrez Çözeltileri ile Çöktürme Đşlemi 100 ml lik balon joje içerisine sıvı örneğinizi pipet yardımıyla veya katı örneğinizi tartarak aktarınız (Örnek miktarına örneğin tahmini etanol içeriğine göre karar verilmelidir.). Örnek üzerine 60 ml saf su ve sonrasında 5 ml Carrez-I çözeltisinden ilave ediniz ve kuvvetli bir şekilde çalkalayınız. Daha sonra 5 ml Carrez-II çözeltisinden ilave ediniz ve kuvvetli bir şekilde çalkalayınız. Çözeltinin ph değeri 7.6 olacak şekilde sodyum hidroksit kullanarak ayarlayınız, 100 ml ye saf su kullanarak tamamlayınız ve filtre ediniz. Filtratı analizinizde kullanınız ve bu işlemde gerçekleşen seyreltme faktörünü örneğinizin Etanol içeriğinin saptanmasında kullanınız. Carrez-I çözeltisi: 21.95 g çinko asetat dihidrat [Zn(CH 3 COO) 2.2H 2 O] veya 24 g çinko asetat trihidrat [Zn(CH 3 COO) 2.3H 2 O] suda çözülür, 3 ml glasiyal asetik asit katılır, damıtık su ile 100 ml'ye tamamlanır. Carrez-II çözeltisi: 10.6 g potasyum demir-ii siyanür trihidrat [K 4 Fe(CN) 6.3H 2 O] suda çözülür, 100 ml ye tamamlanır [6]. - 10-
EK 2 ÖRNEK HAZIRLAMA UYGULAMALARI Meyve suyu ve benzeri örneklerde etanol tayini: Bulanıklık etmenlerini örneği filtre ederek uzaklaştırınız. Gerekli olması durumunda Carrez çözeltilerini kullanarak berraklaştırınız. Örneğinizi yaklaşık etanol içeriği 0.1 g/l nin altında olacak şekilde seyreltiniz. Renkli örnekleri seyrelterek rengin analiz üzerindeki olumsuz etkisini ortadan kaldırınız gerekiyorsa kimyasallar kullanarak renk giderme işlemi gerçekleştiriniz. Kimyasal renk giderme amacıyla 10 ml örnek üzerine 0.1 g poliamid veya polivinilpoliprolidon ilave ediniz, kuvvetlice karıştırınız ve sonrasında filtre ederek berrak çözeltide etanol tayini yapınız. Şarapta etanol tayini: Beyaz ve renkli (kırmızı, pembe v.d.) şaraplarda herhanği bir öne işlem yapılmaksızın Biyozim Etanol Tayin Kiti kullanılarak etanol tayini gerçekleştirilebilmektedir. Şaraplarda yaklaşık alkol içeriği %10-16 (h/h) aralığında olması nedeniyle örneklerde 1:1000 oranında setreltme yapılması gerekmektedir. Örneğinizin farklı oranlarda alkol içermesi durumunda yüksek doğrulukta analiz yapmak için seyreltme tablosunu kullanınız. Gazlı alkollü ve alkolsüz içeceklerde etanol tayini: Karbonik asidin örneğin yapısından ayrılması için 2 N NaOH kullanarak örnek ph sını 9 a yükseltiniz ve kuvvetli bir şekilde karıştırınız, sonrasında örneğinizde etanol tayinini yapınız. Bira ve alkollü meyve sularında etanol tayini: Bu tür örneklerde karbon dioksit uzaklaştırma işlemi 2 N NaOH kullanarak yapıldıktan sonra gerekli seyreltme işlemi yapılarak etanol tayinini gerçekleştiriniz. Sirkede etanol tayini: Filtrasyon ve sonrasında seyreltme yapılarak örneğinizde etanol tayini yapabilirsiniz (Sirke ve benzeri örneklerde 1:20 oranında seyreltme yapılması önerilmektedir.). Analiz öncesinde derişik NaOH kullanılarak örneğin ph sının analiz ph sına yükseltilmesi tavsiye edilmektedir. Reçel ve benzeri örneklerde etanol tayini: Örneğinizi homojenize ettikten sonra yaklaşık 5 g örneği 100 ml lik balon içerisine tartınız ve saf su ile 100 ml ye tamamlayınız. Yaklaşık 30 dk sürekli olarak çalkalayınız. Asitli örneklerde derişik NaOH kullanarak örnek ph sının 7.6 olmasını sağlayınız, gerekli olması durumunda filtre ediniz, ve berrak filtratta etanol tayinini gerçekleştiriniz. Bal örneklerinde etanol tayini: Spatül yardımıyla balı karıştırınız ve yaklaşık 20 g örneği kapağı iyi bir şekilde kapatılabilir bir erlen içerisine - 11-
tartınız ve üzerine 50 ml saf su ilave ediniz. Örneğinize 15 dk süre ile 60-65ºC de ısı uygulayınız ve bu süre içerisinde örneğinizi karıştırınız, soğumasını bekleyiniz, 100 ml lık balon içerisine transfer ediniz ve son hacmi 100 ml ye tamamlayınız. Örneğinize her hangi bir seyreltme yapmaksızın etanol tayini yapınız. Süt ürünlerinde etanol tayini: Yaklaşık 10 g örneği 100 ml lik erlen içerisine tartınız ve üzerine 50 ml saf su ilave ediniz. Erlenin kapağını kapattıktan sonra ~60ºC de 30 dk karıştırınız ve sonrasında soğumasını sağlayınız. Karışımı 100 ml lik balon joje içerisine transfer ediniz ve son haçmi 100 ml ye tamamlayınız. Gerekli olması durumunda filtre ediniz ve filtratta etanol tayini yapınız. Çikolata, un, ekmek, bisküvi ve benzeri örneklerde etanol tayini: Yaklaşık 10 g örneği 50 ml saf su içerisinde homojenize ediniz ve 250 ml lık erlen içerisine aktarınız. Erlene 150 ml saf su ilave ediniz, erlenin kapağını kapattıkdan sonra yaklaşık 30 dk karıştırınız (gerekli olması durumunda ısıtınız) ve 5 ml Carrez I ilave ediniz, karıştırınız, 5 ml Carrez II ilave ediniz, karıştırınız. Karışımın ph sını 7.6 ya sodyum hidroksit kullanarak ayarlayınız ve sonrasında 250 ml lik balon jojeye transfer ediniz. Son hacim 250 ml olacak şekilde saf su ilave ediniz ve çözeltiyi filtre ederek berrak filtratta etanol tayini yapınız. UYARI Bu kitapçıkta; ulusal ve uluslararası yayımlarda yer alan, doğruluğu kesin olarak kabul edilmiş bilgiler yer almak ve ürünlerimiz bu bilgiler doğrultusunda üretilmektedir. Fakat kullanım koşulları bizim kontrolümüz dışında olduğundan analiz sonuçlarının doğruluğuyla ilgili üretici firma tarafından herhangi bir garanti verilmemektedir. REFERANSLAR 1. Holvey, D.N. ed.: The Merck Manual of Diagnostic and Therapy, Merck and Co., Inc. Rahyway, N.J. (1972). 2. Cooper, G.R., CRC Crit Rev. Clin Lab. Sci. 4:101 (1973). 3. Trinder, P., "Determination of Blood Glucose Using 4- Aminophenazone.".J. Clin. Path., 22:246 (1959). 4. Tietz, N.W., Fundamentals of Clin. Chem., Philadelphia, W.B. Saunders (1970). - 12-