Genişlemiş spektrumlu betalaktamazlar, AmpC ve Karbapenemazların tanımlanması Zeynep Gülay Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD
Beta-laktamaz üretimi Gram negatif bakterilerin beta-laktam direncinde önde gelen mekanizmadır. Beta-laktamaz genleri kromozom, plazmid, transpozon veya integronlarda bulunabilir
Beta-laktamazlara bağlı direnç fenotipi Gen ekspresyonu Hidrolitik etkinlik ve substrat tercihi Beta-laktam direncinde önemli olan diğer mekanizmalara (örneğin, OmpK35 kaybı, aktif pompa sistemleri) bağlıdır. Dolayısıyla direnç düzeyi aynı mekanizmayı taşıyan iki suşta farklı olabilir
Beta-laktamazların sınıflandırılması Moleküler yapılarına göre: A, B, C, D İşlevsel özelliklerine göre: 1,2,3 Bush ve Jacoby Antimicrob Agents Chemother Jan 2010 www.lahey.org/studies
Grup 1, 2, and 3 {beta}-laktamazlarda artış (1970 2009) >890 www.lahey.org/studies GSBL (2be), KPC (2f) OXA (2de, 2df) AmpC (1) MBL (3a) Bush, K. et al. 2010. Antimicrob. Agents Chemother. 54(3):969-976
Genişlemiş spektrumlu betalaktamazlar Penisilinler, 1-4. Kuşak sefalosporinler, monobaktamları hidrolize eden enzimlerdir (sefamisinler ve karbapenemler etkilenmez) ÇOĞU Beta-laktamaz inhibitörleri ile inaktive olurlar (Klavulanat/tazobaktam>sulbaktam)
Genişletilmiş Spektrumlu Betalaktamazlar (GSBL) > 250 Temel gruplar: I. TEM-türevi GSBLler II. SHV-türevi GSBLler III. TEM ve SHV dışı GSBLler I. CTX-M -YENİ GSBL: 101 tipi var II. GES (IBC)(Karbapenemaz) Grup 2be; sınıf A III. OXA GSBL (grup 2de, sınıf D):OXA-10 ve 2 türevleri IV. VEB,PER,BEL, BES-1, TLA1/2, SFO-1
CLSI: Yeni öneriler Sınır değerler düşürüldü GSBL tanımlaması sadece enfeksiyon kontrolü amacıyla öneriliyor. Rutin hizmet için GSBL tanımlamaya gerek yok! deniyor Zaman kaybına gerek yok: MĠK ne kadar düşükse; tedavi olasılığı o kadar yüksektir. Bazı mikroorganizmalarda tanımlama için zaman kaybedilmektedir
Antibiyotik Eski M100-S19 (2009) MİK değerleri mg/l Duyarlı (S) I Dirençli (R) Yeni M100-S20 (2010) MİK değerleri mg/l Duyarlı (S) I Dirençli (R) Sefazolin 8 16 32 1 2 4 Sefotaksim 8 16-32 64 1 2 4 Seftizoksim 8 16-32 64 1 2 4 Seftriakson 8 16-32 64 1 2 4 Seftazidim 8 16 32 4 8 16 Aztreonam 8 16 32 4 8 16
Antibiyotik Eski M100-S19 (2009) Disk difüzyon zon çapları (mm) Duyarlı (S) I Dirençli (R) Yeni M100-S20 (2010) ) Disk difüzyon zon çapları (mm) Duyarlı (S) I Dirençli (R) Sefazolin 18 15-17 14 - - - Sefotaksim 23 15-22 14 26 23-25 22 Seftizoksim 20 15-19 14 25 22-24 21 Seftriakson 21 14-20 13 23 20-22 19 Seftazidim 18 15-17 14 21 18-20 17 Aztreonam 22 16-21 15 21 18-20 17
EUCAST Sefotaksim Seftazidim Sefepim Seftriakson 1 (S) >2 (R) (CTX, CRO) >4 (R) (CAZ,FEP,ATM) Ancak öneriler CLSI gibi uygulanacaktır.
Çekinceler Daha önceki klinik başarısızlık örnekleri Daha önce yorum yapılıyordu: şimdi tüm beta-laktamlar rutinde kullanılacak mı? MĠK değerlerinde + 1 dilüsyon fark zaten normal kabul ediliyor: Kesin ve doğru sonuç verilmesi??? Tedaviye yansıması??? Gerek yok denince laboratuvarlar tanımlama yapacak mı? Enfeksiyon kontrolü yönü!!! CLSI notu. 2010 kriterleri lab.a girene kadar M100-S19 kriterleri uygulanabilir
GSBL saptama problemleri: İnokulum etkisi MĠK g/ml: SHV-3 üreten Citrobacter freundii CFU/ml Sefotaksim Seftazidim Aztreonam Sefepim 5 x 2 1 0.5 0.5 10 5 5 x 256 32 32 512 10 7 (CLSI duyarlılık sınırı 8 g/ml) KS Thomson and ES Moland, Creighton University
GSBL Tanımlanması Ġki basamaklıdır: 1- Tarama: Ġndikatör sefalosporinlerle (oksimino sefalosporinler; seftazidim, sefotaksim, sefpodoksim) duyarlılık testi 2- Doğrulama: Taramada şüpheli olanlara uygulanır Beta-laktamaz inhibitörlerine duyarlılık temellidir
GSBL saptanması/clsi önerileri Antibiyotik* Disk tarama (mm) MĠK tarama (mg/l) Sefpodoksim 17 8 (2)** Seftazidim 22 2 Sefotaksim 27 2 Seftriakson 25 (NA)** 2 (NA)** Aztreonam 27 (NA)** 2 (NA)** *: Disk içeriği 30 g ( )**: Proteus mirabilis için özel CLSI M100 S19, 2009
Doğrulama testleri Disk içeriği Yorum MĠK dağılımı (mg/l) CAZ 30 g -- 0.25-128 -- CAZ +klav 30 g+ 10 g 5mm= GSBL 0.25/4-128/4 CTX 30 g -- 0.25-128 -- Yorum 3 log 2 dil= GSBL CTX+klav 30 g+ 10 g 5mm= GSBL 0.25/4-128/4 3 dil= GSBL =8 kat azalma
Kombinasyon diskleri: CAZ+ klav CTX+ Klav (Ticari olarak bulunuyor) = 32 mm Genişleme > 5mm = 22 mm Genişleme herhangi birinde olabilir
Çift disk sinerji (Jarlier V, 1988)
GSBL için ETest TM Sefotaksim CT/CTL TZ/TZL PM/PML MİK değerinde >8 kat azalma Sefotaksim + Klavulanik A.
Fantom zon = GSBL
GSBL Raporlanması Görülen antibiyogram: Sefepim (S), sefotaksim(s) aztreonamr, seftazidimr, sefoksitins Sonuç: GSBL pozitif E.coli Verilen antibiyogram: Sefepim, sefotaksim, aztreonam, seftazidim, diğer 3.kuşak vb (R), sefoksitin: raporlanmaz Karbapenemler dışındaki tüm betalaktamlar dirençli olarak bildirilir
GSBL doğrulama testleri (fenotipik) Avantaj Dezavantaj Çift Disk Sinerji (ÇDS) Kombine Disk ETest Ucuz, kolay uygulanır, rutin antibiyograma alınır Ucuz, duyarlı, özgül; kantitatif sonuç Duyarlı, kolay, kantitatif -Diskler arası uzaklık ayarlanması -Değerlendirenin deneyimi Kontroller doğru uygulanmalı Pahalı, K1 ile yalancı pozitiflik
GSBL saptanması: Manuel ve otomatize sistemler Yöntem Duyarlılık Özgüllük PPV NPV Microscan 83.4 72.9 81.6 75.5 Phoenix 98.8 52.2 75.0 96.6 Vitek 2 85.9 78.0 84.9 79.3 ÇDS 94.1 81.4 87.9 90.6 Kombine 92.9 96.6 97.5 90.5 Disk ETest 94.1 84.7 89.9 90.9 Wiengand JCM 2007;45:1167
CLSI Kombine disk yöntemi Plazmid Kökenli AmpC aşırı üreten bir bakteri: GSBL de yapıyor mu? Zon genişlemesi= 2 mm
EVET Kloksasilin AmpC yi inhibe eder. Sonuçlar görülür
AmpC yapan türlerde GSBL AmpC den etkilenmeyen substratların kullanılması Sefepim (ÇDS veya ETestTM) AmpC inhibitörlerinin kullanılması Kloksasilin ( MHA 200 mg/ml veya 100/500 g/disk ile ÇDS) Boronik asit ve türevleri (300-500-600 g/disk): Kombine disk veya ÇDS
Kombine disklere boronik asit eklenmesi
Duyarlılık %98- Enterobacter spp %100 Özgüllük % 60 ( K. oxytoca K1 i atlamış)
Enterobacter cloacae; AmpC dereprese + GSBL üretiyor MHA- Belirsiz sonuç MHA + kloksasilin (200 mg/l)
AmpC ile beraber GSBL saptandığında Enterobacter cloacae üredi- İzolat GSBL üretmektedir. Temas izolasyonu önerilir Amikacin S Cefazolin R Ampicillin R Ceftazidime I R Cefepime S R Ceftriaxone S R Gentamicin S Levofloxacin S
AmpC Beta Laktamazlar Karbapenemler ve sefepim dışındaki tüm beta-laktamları hidrolize eden Sefalosporinazlar, Klavulanat ve tazobaktamdan etkilenmezler Kromozomal ve plazmid kökenli olabilir Bazısı indüklenebilirdir: Normalde düşük düzey yapılırken, bazı betalaktamlarla miktarı artar: Kromozomal olanlar; bazı plazmid kökenliler (DHA, ACC)
İndüklenebilir Beta-laktamazı olan türler Enterobacter spp. Hafnia alvei Citrobacter freundii Serratia marcescens Morganella morganii Providencia spp Pseudomonas aeruginosa Aeromonas spp Ayrı test yapılmasına gerek yoktur: Bazı türlerde bulunduğu bilinmelidir
CTX Sefoksitin CAZ
Bush Grup 1 veya AmpC İndüklenebilir Beta-Laktamazlar Laboratuvar rapor notu Duyarlılık sonuçları değiştirilmez ama Ġndüklenebilir Beta-laktamaz uyarısı yapılır: Örnek uyarı: Bu bakteri indüklenebilir betalaktamaz üretmektedir. Tedavi sırasında 2-3. kuşak sefalosporinler, aztreonam, üreidopenisilinlere direnç gelişebilir. B-laktam inhibitörlerinden kaçınmak gereklidir.
Sorun nedir? Ġndüklenme sorun değil: Biliyoruz Ġlaç varsa indükleniyor; ortadan kalkınca geri dönüşüyor 3. -4.kuşak sefalosporinler zayıf indükleyiciler Karbapenemler iyi indükleyici ama etkilenmiyor Sorun: Bu türlerde bulunan dereprese mutantların seçilmesi Sürekli yüksek miktarda enzim sentezi 3. kuşak sefalosporin tedavisi sırasında seçilirler Tedavi Başarısızlığı
E. cloacae İBL İndüksiyon değil derepresyon sorundur.
E. cloacae dereprese mutant
Yüksek düzey AmpC üretimi varsa Enterobacter cloacae üredi Amikasin S Ampisilin R Sefazolin R Seftazidim R Sefepim S Seftriakson R Gentamisin S Levofloksasin S
Plazmid kökenli Amp C tipi enzimler En sık K.pneumoniae, E.coli, Salmonella spp. Proteus mirabilis gibi ĠBL özelliği bulunmayan türlerde görülür. Salgınlar yapabilir. >100: CMY (1-59), FOX (1-8),LAT-1, MOX (1-8), DHA (1-7), ACT (1-8), ACC (1-4), MIR (1-5),CFE-1 Çoğu sürekli olarak yüksek düzey Amp C yapımına neden olur. DHA, ACT ve ACC indüklenebilir enzimlerdir.
Plazmid kökenli AmpC tipi enzim tanımlanması Ġndüklenebilir AmpC tipi beta-laktamazı olmayan türlerde sefoksitin ve beta-laktamaz inhibitörü direnci Seftazidim, sefotaksim I/R, sefepim S. CAZ, CTX I/R ama GSBL negatif düşündürmelidir Porin mutasyonları ile karışabilir. GSBL lerle beraber olabilir: Kloksasilin ve Boronik asit türevleri ile ayırım sağlanabilir.
AmpC saptanması için Etest CN/CNI Sefotetan (0.5-32 mg/l) + kloksasilin stripleri MHA, 0.5 McFarland, 16-20 st; MİKde > 8 kat azalma
%91 duyarlı; %93 özgül Bolstrom A et al, ICAAC 2006; D-0451
Altın standart:moleküler yöntemler Perez-Perez, Hanson. JCM 2002; 40: 2153
Kan Kültürlerinden üretilen Klebsiella pneumoniae izolatlarındakarbapenem Direnç Oranları (DEÜ 2004-2010) 40 37 30 % Direnç 20 Karbapenem Direnci 10 0 6,8 4,9 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Yıllar
Karbapenemazlar Sınıf Enzim En sık görülen tür Sınıf A KPC, SME, IMI, NMC, GES Enterobacteriaceae (P. aeruginosa da nadir) Sınıf B (metallo-blaktamaz) IMP, VIM, GIM, SPM, IND, NDM- 1 P. aeruginosa Enterobacteriacea Acinetobacter spp. Sınıf D OXA Acinetobacter spp. Enterobacteriaceae (OXA-48)
Karbapenem direnç mekanizmaları Ayrıca Sınıf A GSBL ler (CTX-M) + geçirgenlikte azalma Sınıf C (Yüksek düzey AmpC) + geçirgenlikte azalma Bu mekanizmalar ertapenem >> meropenem veya imipenem
KARBAPENEMAZLAR Saptanmaları çok önemli çünkü GSBL (+) se ilk tedavi seçeneği Bu direnç mekanizmalarını edinen bakteriler tüm karbapenemlere dirençli olacaktır fakat testlerde duyarlı gözükebilirler. Plazmid ve integron kökenliler kolayca yayılmakta infeksiyon kontrolü için saptanmaları gereklidir GSBL (+) lerde atlanmamalı!
Metallo-beta-laktamazlar Karbapenemleri ve aztreonam hariç tüm betalaktam ajanları parçalayabilen enzimlerdir. Stenotrophomonas maltophilia, Aeromonas, Chryseobacterium: tür özelliğidir P. aeruginosa, A. baumannii, S. marcescens de plazmid ve integron kökenliler bildirilmiştir: IMP-1-IMP-28; VIM-1- VIM-26, SPM-1, NDM- 1, IND 1-7 Enterobacteriaceae de daha nadir ama var
Metalloenzim tanımlanması Tanımlanmalarında aktif bölgedeki Zn iyonuna bağlanarak enzimi inaktive eden EDTA, DPA, tiyol gibi bileşikler kullanılır.
MBL Etest İmipenem /EDTA ile MİK de >8 veya >3 log2 dilüsyon azalma Sonuçlar türe, gen ekspresyon düzeyine, klona göre değişebilir. www.ijmm.org
MBL Etest TM Yalancı pozitiflik=edta Membran geçirgenliğini arttırır Diğer metalloenzimleri inhibe eder OprD ekspresyonunu azaltan Zn yi bağlar OXA tipi enzimlerle çapraz reaksiyon- Acinetobacter OXA-48,KPC, ESBL ile Yalancı Pozitiflik Segal, Elisha JAC 2005; Giske CMI 2010; ChuYW IJAA 2005 Yalancı negatiflik Besiyerindeki çinko düzeyi etkiler. Gen ekspresyonuna bağlı olarak karbapenem MĠKleri stripin dışında kalabilir: Enterobacteriaceae: DPA, MEM/EDTA A.baumannii atlıyor: Tiyol bileşikleri Ikonmidis JCM 2008; Loli A AAC 2008
IP 4-256 mg/l; IPI 1-64 mg/l Duyarlılık Özgüllük PPV NPV 1 94 95 - - 2(Çin) 85.7 100 100 98.8 3(Belçika) 100 86.4 86.9 100 1- Walsh T JCM 2002; suş koll. ; 2-Qu TT: Çin 21 VIM-2 ve IMP-9 P.a 3-Berges L JAC 2007: Belçika 2004-2005 587 P.aeruginosa (42 MBL pozitif- çoğu VIM);
Besiyerinin etkisi- Zn +2 etkisi Acinetobacter spp. CI 17-9-45 (IMP-1 pozitif) Isosensitest agar (%9-Çok büyük hata) Etest ÇDS KD MBL (27) MHA 4 12 3 MHA+Zn 27 18 26 Belirsiz Pozitif Zn 2+ Zn 2+ uygun VIM-2 içeren P.aeruginosa izolatlarında, besiyerine Zn +2 eklenmesinin etkisi Giakkoupi P et al JCM 2008;46:1568 55 Mueller Hinton Agar
OXA-tipi karbapenemazlar Serin beta-laktamazlardır Klavulanik asit ile inhibe olmazlar Ġn vitro olarak NaCl ile inhibe olurlar Karbapenemleri genellikle düşük düzeyde etkilerler 3. Kuşak sefalosporinleri etkilemezler* En sık Acinetobacter spp. Fakat Enterobacteriaceae de de yayılmaya başladı.
Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase (KPC) Sınıf A beta-laktamazlar (KPC 2-11) Karbapenemler ve 3. Kuşak sefalosporinler dahil olmak üzere TÜM beta-laktamlara dirence yol açar Özellikle ABD de Enterobacteriaceae üyelerinde bildirilmiş---- Tüm dünya Saptanması güç: imipenem ve meropenem (S) olabilir; ertapenem daha iyi bir göstergedir. Boronik asit ile inhibe olur (Amp C tipi enzimlere DĠKKAT!: kloksasilin/oksasilin inhibisyonu*
No. of Isolates KPC üreten izolatların ertapenem duyarlılığı 60 S I R 50 40 30 20 10 0 2 4 8 16 >16 MIC ( g/ml) İzolatların hepsi ertapeneme dirençli
Karbapenemaz saptanması 1. Karbapenem duyarlılığının saptanması Arama kriteri karbapenemlerden herhangi birine (ertapenem, imipenem, meropenem, doripenem) azalmış duyarlılık (I/R) olmalıdır. 2. Karbapenem duyarlılığı azalmış izolatlarda Modifiye Hodge Testi yapılması. 3. Modifiye Hodge Testi pozitif ise bakteri karbapenemaz üretmektedir. Bazı karbapenemlere duyarlı gözükse de klinik tedavi sırasında direnç gelişebilir notu ile raporlama 4. İlgili klinik ve enfeksiyon kontrol hemşiresi uyarılır CLSI M100-S19/S20
Karbapenemazlar: Ne zaman şüphelenelim? Karbapenemlere duyarlılığı azalmış (inhibisyon zonu I/R; ERT 21 mm ve altı), Klebsiella pneumoniae (ve diğer Enterobacteriaceae) Sıklıkla çoklu direnç görülmektedir Disk difüzyon ve E testi
Modifiye Hodge Testi ATCC 25922 E.coli Klinik izolat Klinik izolat Pozitif kontrol Negatif kontrol
Karbapenemazların doğrulanması Beta-laktamazlara özgü inhibitörler teste eklenerek duyarlılık düzeyinin değişimi incelenir. Karbapenemazlar için disk dif ve mikrodilüsyon yöntemleri en iyi yöntemler MBL EDTA ve dipikolinik asit, KPC için boronik asit, Amp C için kloksasilin veya oksasilin Moleküler testler ve dizi analizi Ticari testler Thomson K AAC 2010; 48:1019 Miriagou V CMI 2010;16:112
MHT CTX-M /AmpC aşırı üretimi + ilacın hücre içinde birikmesini engelleyen bir mekanizma (porin/pompa): yalancı pozitiflik (ertapenemde de): Enterobacter spp.dġkkat! Bazı MBL(Enterobacteriaceae) yalancı negatiflik olabilir.
Otomatize sistemlerde saptama sorunu var
KPC(+) imipenem dirençli izolatların ticari sistemlerce tanınması sorun: %6.7-%87 oranında atlanıyor
Otomatize sistemler (2010) Karbapenem direnç mekanizması belirli izolat sayısı Sistem/panel Karbape nemaz uyarısı Karbapen emaz (n=39) Karbapene maz değil (n=16) Duyarlılık (%) Özgüllük (%) Phoenix NMIC/id-76 Evet Hayır 39 0 16 0 100 0 MicroScan NM36 Evet Hayır 33 6 15 1 85 6 MicroScan NBC39 Evet Hayır 32 7 13 3 82 19 Vitek 2AST- N054 Evet Hayır 29 10 10 6 74 38 Woodford et al JCM 2010; 48: 2999
Phoenix MicroScan NM36 MicroScan NBC39 Vitek 2 Positi ve Negati ve Positi ve Negat ive Positi ve Negati ve Positi ve Negati ve KPC (n=8) 8 0 8 0 8 0 8 0 MBL (IMP,VIM,or NDM; n=20) 20 0 19 1 b 20 0 16 4 b OXA-48 (n=11) 11 0 6 5 4 7 5 6 E.coli/Klebsiella spp.,esbl,porin loss (n=10) Enterobacter spp.,ampc/esbl,porin loss (n=6) 10 0 10 0 8 2 8 2 6 0 5 1 5 1 2 4
2010 yılı CLSI karbapenem sınır değerleri -M 100- S20-U (Haziran 2010) Karbapene m Önceki sınır değerleri Yeni sınır değerleri (2010) MİK mg/l Disk (mm) MİK Disk Ertapenem 2-8 19-15 0.25-1 23-19 İmipenem 4-16 16-13 1-4 23-19 Meropenem 4 16 16-13 1-4 23-19 Doripenem - - 1-4 23-19 MHT uygulanmasına gerek yoktur
Özgüllük düşmüş, MHT uygulanmaması da sorun!
Yönteme göre karbapenem MİK leri değişiyor. Etest mikrodil uyumu %33 (imipenem)- %84 (ertapenem): Aynı inokulum kullanılsa bile! Yönteme göre meropenem MİK leri değişiyor. Etest BMD uyumu %82; Vitek 2 %30.4 (çok büyük hata %24)