Yrd. Doç. Dr. Fatih TÖRNÜK

Giriş ve Tanımlar Tarihçe Tek Hücre Proteininin (THP) Avantaj ve Dezavantajları THP Üretiminde Kullanılan Mikroorganizmalar THP nin Besin Değeri THP nin Güvenliği 2

Dünyada hızla artan nüfusun protein açığının azaltılmasında sıra dışı 2 besin kaynağı araştırma konusu olmuştur: 1. Sindirilemeyen proteinlerin sindirilebilir forma dönüştürülmesi 2. Bazı mikroorganizmaların çoğaltılıp biyokütle olarak tüketimde kullanılması 3

İlk mikroorganizmanın keşfinden bu yana insanlar tek hücreli canlıları ekmek, şarap, ilaç yapımı vb. nedenlerle kullanılmışsa da bilinçli olarak bunun besin ve yem olarak kullanılması ve bu amaçla mikroorganizmaların üretimi yakın zamanlarda olmuştur. Besin amaçlı olarak mikroorganizmalardan elde edilen proteinlere önceleri "Mikrop Proteini (mikrobiyal protein)" daha sonra bu ismin beğenilmemesi üzerine de "Tek Hücre Proteini" (Single Cell Protein) ismi verilmiştir. Bu isim ilk olarak Massachusetts Institute of Technology (M.I.T.) profesörü Carroll Wilson tarafından 1966 yılında kullanılmıştır. 4

Tek hücreli canlılar olan maya, küf, bakteri ve alglerin çeşitli karbon kaynaklarında fermentasyon yoluyla çoğaltılmasından sonra besin ortamından ayrılıp kurutulması suretiyle elde edilen üründür. Adından anlaşıldığı gibi sadece proteinden ibaret değildir. Bu ismin verilmesinin sebebi, mikroorganizmaların bileşiminde %80-90 a varan oranda protein bulunmasıdır. Bu ismin yanında "Mikrobiyal Besin", "Yem Mayası", "Maya Proteini" gibi isimler ve ticarette ise "Toprina", "Nar Protein" vb. patent isimler kullanılmaktadır. 5

THP üretiminde bakteriler, küfler, mayalar ve algler kullanılır. Madde (% Kuru madde) KÜF ALG MAYA BAKTERİ PROTEİN 30-45 % 40-60 % 45-55 % 50-80 % YAĞ 2-8 % 7-20 % 2-6 % 1,5-3 % NÜKLEİK ASİT 7-10 % 3-8 % 6-12 % 8-12 % KÜL 9-14 % 8-10 % 5-9,5 % 3-7 % NOT: Soya fasulyesi yaklaşık % 40 protein içermektedir. 6

Çok eski dönemlerden beri diyetin bir parçasıdır. 1910: Alman Max Delbrück ve ark. bira mayasının hayvan yemi olarak değerli olduğunu ortaya koydular. "Fodder Yeast 1914: Voltz ve Basdrexel kuru mayanın % 90 oranında hazmedilebilir protein ihtiva ettiğini bildirmiştir. 1914-1918: 1. Dünya Savaşı sırasında Almanlar tarafından maya kaynaklı THP, besin kıtlığının önüne geçmek amacıyla kullanıldı. 1920 ler: Mayalar inek, tavuk vb. hayvanları beslemede kullanıldı. 1940 lar: 2. Dünya Savaşında askerlerin çorbalarına ilave edilmiştir. 1960: FDA, dünya nüfusunun % 25 inde açlık ve yetersiz protein alımı olduğunu deklare etmiştir. 7

1963: British Petroleum, rafineri yan ürünü olan vakslı n-parafin ile mayaların çoğaltılabileceği bir THP teknolojisi geliştirdiğini duyurdu. («petrol prosesinden protein» - «protein-from-oil-process») 1966: M.I.T. profesörü Carroll Wilson tarafından ilk kez THP terimi kullanılmıştır. 1970 ler: «Petrolden gıda» fikri popülerleşti ve 1976 da Champagnat Unesco Bilim Ödülü aldı. Parafin ile beslenen mayalar üzerine bazı ülkelerde işletmeler kuruldu. (Hayvan yemi amaçlı kullanım) 1977: Bakteri ve filamentli funguslar (S. cerevisiae, C. utilis vb.), THP üretiminde kullanılmaya başlanmıştır. 8

1. Üretilmeleri kolay, hızlı ve ucuzdur. Atıkların fermentasyonu yoluyla elde edilir (Atıkların değerlendirilmesini sağlar). 2. Yüksek oranlarda protein içerirler. Bu proteinler (esansiyel) aminoasitler bakımından zengin olup, biyolojik değerleri bitkisel proteinlerden yüksektir. 3. Bu amaçla farklı metotlar, hammaddeler ve mikroorganizmalar kullanılır. 4. Üretim, çevre ve iklim koşullarından etkilenmez. 5. Laboratuvar şartlarında yüksek kalitede ve verimde THP ürettiği belirlenen mikroorganizmalar büyük ölçekte üretilebilirler. 9

1. Çeşitli mikroorganizmalar insanlar için toksik son ürünler üretebilirler. 2. Diyet desteği olarak kullanıldıklarında bazen sindirim güçlüğüne yol açabilirler. 3. Bazen alerjik reaksiyonlara yol açabilirler. 4. Çeşitli MO ların yüksek nükleik asit içeriği insanlar için uygun değildir. Çünkü bu durum böbrek taşı oluşumu ya da gut hastalığının sebebi olabilir. 5. Yüksek nükleik asit içeriği ayrıca deri problemleri, sindirim güçlüğü ve gastrointestinal problemlere neden olabilir. 6. Yüksek sterilite kontrol ihtiyacı, maliyetin artmasına neden olur. 10

THP ler hayvan beslemede sığır besiciliği, kanatlı ve balık yemi üretiminde; Gıda teknolojisinde aroma taşıyıcı, vitamin taşıyıcı, emülsifiyer yardımcısı, çorba, fırın ürünleri, servise hazır yiyecekler gibi ürünlerin besin değerlerinin geliştirilmesi Diğer alanlar: kağıt işleme, deri işleme, köpük stabilizatörü 11

THP üretimi; seçilen bir mikroorganizma suşunun belirli koşullar altında uygun besiyerleri kullanılarak çoğaltılması ve daha sonra besi ortamından ayrılması işlemlerinden meydana gelir. Mikroorganizma seçimi -> Fermentasyon -> Saflaştırma 12

THP nin toplam maliyeti; Kullanılan substrat birimi başına biyokütle verimi Verimlilik Substrat maliyeti Prosesin yönetimi ve diğer işlemler İş gücü Yatırım masrafları gibi birçok faktöre bağlı olarak değişir. Ticari THP üretiminde, toplam üretim maliyetinin yaklaşık % 50-60 ını C kaynakları oluşturur. 13

THP üretiminde birçok proseste düşük maliyetli ve hazır substratlarda gelişen kemoheterotroflar kullanılmaktadır. Substrat olarak genellikle; mono- ve disakkaritleri içeren tarımsal atıklar, süt endüstrisi atıkları ve ağaç işlemede açığa çıkan atıkların kullanımı arzu edilmektedir. Çünkü glukoz, diğer heksoz ve pentozlar ile disakkaritler neredeyse tüm MO lar tarafından metabolize edilebilmektedir. En çok kullanılan substratlar: hidrokarbonlar, küspe, turunçgil atıkları, melas, hayvan gübresi, peynir altı suyu, nişasta, atık su, ahşap vs. 14

Yüksek enerjili kaynaklar: Gaz yağı, metan, etanol, metanol ve n-alkanlar (Candida lipolytica, C. tropicalis, Methylomonas methanica, Pseudomonas methylotrophus). Etanol, insan tüketimi için THP üretiminde kullanılan en önemli hidrokarbondur. 15

Selüloz, THP üretiminde dikkate değer bir substrattır (Trichoderma viride). Bununla birlikte selüloz; doğada genel olarak lignin, hemiselüloz, nişasta vs. ile bağlı formda bulunur. Eğer selüloz THP üretiminde kullanılacaksa, öncelikle asit veya enzim ile muamele edilerek fermente olabilir forma dönüştürülmelidir. 16

Peynir altı suyu (PAS); laktalbumin ve laktoglobulin gibi proteinlerin yanı sıra ana bileşen olarak laktoz (% 4-6) içerir. Kluyveromyces marxianus ile PAS tan THP üretilmiştir. Melas THP üretiminde kullanılacaksa fosfor ve uygun bir N kaynağıyla takviye edilmelidir. Fusarium graminearum, N kaynağı olarak NH 3 içeren melasta gelişerek THP üretmektedir. 17

Algler Spirulina sp. Chlorella pyrenoidosa Chondrus crispus Bakteriler Pseudomonas fluroescens Lactobacillus Bacillus megaterium Rhodobacter capsulatus Küfler Aspergillus oryzae Fusarium venetatum Aspergillus niger Rhizopus cyclopium Trichoderma Polyporus Mayalar Saccharomyces cerevisae Candida tropicalis Candida utilis Pichia pastoris Torulopsis Geotrichum candidum 21

AVANTAJLARI Spesifik gelişme hız ve oranları diğer MO lardan daha yüksektir. Bakteri ile THP üretiminde biyokütle oranı 20-120 dk içinde 2 katına ulaşabilir. Protein oranı, KM nin %80 ine ulaşabilir. Proteinin amino asit profili dengelidir. Kükürt içeren AA ve lisin içerikleri nispeten yüksektir. 22

DEZAVANTAJLARI Nükleik asit içerikleri mayalara göre daha yüksektir. Küçük hücre yapısına ve yoğunluğa sahip oldukları için besin ortamından ayrılmaları zordur ve maliyet gerektirir. Henüz insan gıdası olarak kullanılmamaktadır. Toplum algısı kötüdür. 23

Algleri THP olarak adlandırmak uygun değildir. Çünkü mikroalg kütlesi, proteinden çok daha fazlasını ifade etmektedir. Toplam alg biyokültesi (TAB) demek daha uygundur. 25

Tatlı su algleri, insan gıdası ve hayvan yemi olarak kullanılmaktadır. Yıllık 10.000 ton civarı üretim vardır. Biyokütle doğal sulardan, yapay göletlerden veya fotobiyoreaktörlerden hasat edilir ve besi ortamından ayırt edilerek kurutulur. Üretimin yaklaşık %75 i toz, kapsül veya tablet olarak elde edilir. 26

2 temel mikroalg türü söz konusudur: 1. Tek hücreli yeşil alg: Chlorella ssp. 2. Filamentli mavi-yeşil alg (Cyanobacterium): Spirulina ssp.) 27

AVANTAJLARI Düşük nükleik asit içeriği Protein kalitesi bitkisel proteinlerinkine yakındır. Basit besiyerlerinde kolayca üreyebilirler. Fotosentez yetenekleri DEZAVANTAJLARI İnsanlar tarafından sindirilemeyen selülozik hücre duvarı vardır (%10 KM). Hücre duvarının parçalanarak içeriğin sindirim enzimlerine muhatap olması için bazı işlemlere ihtiyaç vardır. Yavaş çoğalırlar. Ağır metal biriktirebilirler. Üretim maliyetleri yüksektir. 28

AVANTAJLARI Bakteriler ve mayalara göre daha az nükleik asit içerirler. Miselyumlar nedeniyle proteinler besi ortamından rahatça ayrılır. Selüloz atıkları, nişasta, sülfit likörü gibi kaynaklarda gelişebilirler. Fiziksel olarak tüketiciler tarafından kabul edilebilir özelliktedir. 29

DEZAVANTAJLARI Bakteriler ve mayalara göre nispeten düşük protein içerirler. Jenerasyon süreleri uzundur (5-12 saat). Kükürtlü AA içermezler. 30

Mayalar geleneksel olarak binlerce yıldır gıda fermentasyonunda kullanılmaktadır. Torula mayası (Candida utilis), 1. Dünya Savaşı sırasında Almanya da üretilmiş ve çorba ve sosislere katılmıştır. Vejeteryan diyetinde yer alan iyi bir çeşni maddesidir. Balık, kedi ve köpek gibi hayvanların yemine ilave edilerek lezzet artırıcı görev icra etmektedir. 31

AVANTAJLARI Büyük hücre yapısı (bakteriye göre - hasat kolay) Düşük nükleik asit içeriği Yüksek lisin içeriği (%6-9) Yüksek B vitamini içeriği Yüksek tüketici kabulü Asidik ph da gelişebilmesi Yüksek malik asit içeriği DEZAVANTAJLARI Yavaş gelişme hızı (2-5 saat) Nispeten düşük protein oranı Bakterilere göre düşük metiyonin ve sistein oranı 32

Mayanın kalın ve kompleks bir hücre zarı yapısına sahip olması diğer bir problemdir. Maya hücre zarının en dış kısmında yer alan «mannoprotein», sindirimin önündeki en önemli engeldir. Deniz kaynaklı mayalar; fermentörde kolay kültivasyonları, yüksek hücre yoğunluğu ve yüksek esansiyel amino asit içeriği gibi avantajlarıyla en iyi THP adaylarıdır. 33

Parametre Alg Bakteri Maya Küf Gelişme hızı Düşük En yüksek Oldukça yüksek Bakteri ve mayadan düşük Substrat Işık, CO2, inorganik kaynaklar Hemen her türlü substrat CO2 hariç birçok substrat ph 11 e kadar 5-7 5-7 3-8 Kültivasyon Kontaminasyon riski Nükleik asit uzaklaştırma Biyoreaktör, göletler Yüksek ve ciddi Lignoselülozik substrat Biyoreaktör Biyoreaktör Biyoreaktör Önlemlerin alınması gerekli Düşük - Gerekli Gerekli Gerekli Toksin - Gram negatif endotoksinleri ph 5 ten düşükse çok düşük - Mikotoksin 34

THP üretiminde; son 30-40 yıl içerisinde farklı substratlardan ve mikroorganizmalardan faydalanılarak çok sayıda pilot tesis kurulmuştur. Ticari üretime geçiş ise ekonomik nedenlerden dolayı nispeten sınırlı kalmıştır. THP üretimi; kullanılan substrat ve mikroorganizmaya bağlı olmaksızın benzer temel aşamaları içerir: 1. Mikroorganizma seçimi ve fermentasyon ortamının hazırlanması 2. Fermentasyon 3. Fermentasyon sonrası işlemler ve ayırma 35

THP üretiminde kullanılacak mikroorganizmanın seçimi, en kritik aşamadır. Mikroorganizma, biyokütlede toksik madde biriktirmemelidir. Tüketime uygun olmalıdır. Yüksek miktarda biyokütle üretebilmelidir. Ucuz substratlarda hızlı bir şekilde gelişebilmelidir. 36

1. BEL PROSESİ Peynir altı suyu atığının değerlendirilmesi için ve çevre kirliliğine yol açmasının önlenmesi amacıyla Fransa da geliştirilmiştir. Protibel isimli THP üretiminde peyniraltı suyundaki laktozu fermente edebilen Kluyeromyces lactis ve K. marxianus (eski ismi K. fragilis) kullanılmaktadır. 37

Besi ortamı Laktoz konsantrasyonu 34 g/l Mineral tuzları ilaveli peynir altı suyu Fermentasyon 38 C sıcaklık, 3,5 ph 25 g/l biyokütle verimi Kluyveromyces lactis veya K.marxianus Ayırma saflaştırma Santrifüj ile hücreler ayrılır Sonra tekrar sulandırılır, tekrar santrifüj edilir % 95 KM ye kurutulur 38

2. SYMBA PROSESİ İsveç te patates işleyen fabrika atıklarının THP üretiminde kullanılması amacıyla geliştirilmiştir. Atıktaki C kaynağı, birçok mikroorganizmanın doğrudan kullanamayacağı nişastadan oluştuğu ve fazla kuru madde birikimi olmadığı için ekonomik değildir. Nişasta kullanılarak problemin giderilmesi için birbiriyle simbiyotik ilişkideki 2 MO dan faydalanılmaktadır: Nişastayı hidrolize eden Saccharomyces fibuligens ve diğeri Candida utilis. 39

1. Fermentasyon S. fibuligens, N kaynağı ve fosfat ilave edilmiş küçük bir biyoreaktörde geliştirilir. Nişasta hidrolize edilir. 2. Fermentasyon Sıvı ortam, 2 MO nın da bulunduğu 2. fermentöre alınır. C. utilis daha baskın olur ve toplam hücre sayısının % 90 ını teşkil eder. Ayırma saflaştırma % 45 protein içeren biyokütle santrifüj ile ayrılır. Sprey ya da silindir kurutucularda kurutulur. 40

3. PEKİLO PROSESİ 1975 yılında faaliyete geçen ve küflerin THP üretiminde ilk kez kullanıldığı prosestir. Ağaç ürünlerinin işlenmesinden ortaya çıkan ve asetik asit ile monosakkaritler içeren sülfit likörünün değerlendirilmesi amacıyla Finlandiya da geliştirilmiştir. Paecilomyces variotii ile gerçekleştirilir. Hayvan yemi üretiminde kullanılır. 42

Besi ortamı Sülfit likörü Melas, peyniraltı suyu, hidrolize bitki atığı vs. ilavesi Fermentasyon Derin (submerged) fermentasyon Sürekli işlem Ayırma saflaştırma Santrifüj ile hücreler ayrılır. Kurutulur. Son ürün % 59 saf protein içerir. 43

4. BİYOPROTEİN PROSESİ 1990 larda Norveç te Norferm tarafından metanca zengin doğalgazın substrat olarak kullanılabilmesi amacıyla geliştirilmiştir. Biyoprotein prosesinde Methylococcus capsulatus kullanılsa da proses stabilizasyonu için heterotrofik bakteri grubu da ilave edilmektedir. İşlem yüksek aerobik sürekli bir sistem olup yılda 10.000 ton üzerinde kapasiteye sahiptir. Biyokütle, santrifüj ve ultrafiltrasyon ile ortamdan ayrılmakta ve ardından ısıl inaktivasyon ve püskürtme ile kurutulmaktadır. Son ürün % 70 protein içermekte ve pronin adıyla piyasaya sürülmektedir. AB tarafından hayvan ve balık yemi olarak kullanımı onaylanmıştır. 44

5. PRUTEEN PROSESİ 1980 yılında İngiltere de metanol kullanımına yönelik geliştirilmiş bir prosestir. Metilotrofik bir bakteri olan Methylococcus methylotrophus kullanılmıştır. Ürün; tavuk ve buzağı yemi olarak kullanıma sunulmuştur. Üretim; metanol fiyatlarının artması ve soya fiyatının düşmesi ile 1987 yılında durdurulmuştur. Ancak, o zamana kadarki en büyük sürekli aerobik biyoproses sistemi idi ve yıllık 50.000 ton üzerinde pruteen üretimi geçekleştiriliyordu. 45

34-37 C sıcaklık, 6,5-6,9 ph ~ % 16 nükleik asit ve % 70 protein içeren son ürün 46

6. QUORN ÜRETİMİ 1964 yılında fungal misellerin (mikoprotein) üretimi üzerine yapılan çalışmalar sonucunda 1985 yılında Quorn isimli RNA içeriği düşürülmüş ürün, İngiltere Gıda ve Tarım Bakanlığı tarafından insan gıdası olarak tüketim izni almıştır. Fusarium venenatum (eski ismi F. graminearum) kullanılmaktadır. Yıllık 1000 ton üretim gerçekleştirilmektedir. Substrat olarak sadece food grade maddeler kullanılmaktadır. 47

Besi ortamı Mısır, patates veya buğday nişastasından elde edilen glukoz şurubu Amonyak ve biyotin takviyesi Fermentasyon 30 C sıcaklık, 6,5 ph da sürekli fermentasyon Steril O 2 takviyesi Her 4-5 saatte biyokütle 2 katına çıkar (15-20 g/l) Ayırma saflaştırma %10 RNA içeren ürüne 64 C de 30 dk ısıl şok uygulanır ve RNA düşürülür, RNA nükleotitlere parçalanır. Miseller vakum filtrasyon ile ortamdan hasat edilir. 48

THP nin besin değerini etkileyen faktörler arasında; 1. Proteinlerin sindirilebilirliği 2. Besin bileşimi 3. Amino asit kompozisyonu 4. Nükleik asit içeriği 5. Alerjen varlığı 6. Gastrointestinal etkileri gibi faktörler dikkate alınır. 49

1. Proteinin sindirilebilirliği: Maya proteinlerinin sindirilebilirliği (%88-96) bakteri ve alglerden (%83-88) yüksektir. 2. Amino asit kompozisyonu: Mikrobiyal proteinler genellikle sülfür içeren amino asitler sistein ve metiyonin açısından fakirdirler ya da hiç bulundurmazlar. Bununla birlikte lisin içerikleri makul düzeydedir. Aspergillus niger in amino asit kompozisyonunun dengeli ve FAO standardına uyumlu olduğu ifade edilmektedir. Mayalar tiamin, riboflavin, biyotin, niasin, pantotenik asit, folik asit, prodoksin, kolin içerirler. 50

Algler protein, yağ ve A, B, C, D, E vitamini kaynağıdırlar. Planktonik algler A ve D vitamininin orijinal kaynaklarıdır. Algler ayrıca % 40-60 protein, % 7 mineral, klorofil ve safra pigmenti içerirler. Algler genel olarak tüm vitaminlerce, küfler ise özellikle B kompleksi vitaminler bakımından zengin kaynaklardır. Bakteriyel hücreler de nispeten yeterli düzeyde B vitamini içerirler. 54

Bakteriler protein ve belli amino asitler bakımından zenginlerdir. Ham protein, kuru ağırlığın % 80 ine ulaşabilir. Bakteriyel THP metiyonince (% 2,2-3) alg ve fungilerden daha zengindir. Bakteriyel hücreler de nispeten yeterli düzeyde B vitamini içerirler. 55

1. Yüksek nükleik asit içeriği: Nükleik asidin kendisi toksik bir madde değildir. Bununla birlikte yüksek pürin ve pirimidin alımı, ürik asit presipitasyonuna neden olur. Bu durumda gut hastalığı ya da böbrek taşı oluşumu gibi problemler baş gösterir. İnsan THP sinde nükleik asit içeriği % 2 nin altında tutulmalıdır. 57

2. Sindirilebilirlik: Hücre duvarının sindirilebilirliği, THP açısından 2. problemdir. 59

3. Toksinler: Toksinler çeşitli küf ve bakteriler tarafından üretilen sekonder metabolitlerdir. Algler genellikle toksin üretmezler. Hayvan yemi olarak kullanılacak THP lerin toksisite değerleri genellikle insan gıdalarınınkinden daha yüksektir. Mikotoksinler ile bakteriyel endo- ve ekzotoksinler değerlendirmeye alınırlar. 60

Kısa ve uzun dönemli akut toksisite THP tüketiminin fizyolojik ve sosyolojik etkilerinin belirlenmesi ve inanç yönünden ele alınması 61

HÜCRE DUVARININ PARÇALANMASI Mekanik olmayan yöntemler - Kimyasal uygulama: asit, baz, solvent vs. - Enzim uygulama: litik enzimler, otoliz vs. - Fiziksel uygulama: Dondurma-eritme, ozmotik şok, ısıtma ve kurutma Mekanik yöntemler - Yüksek basınçlı homojenizasyon - Yaş öğütme - Sonikasyon - Ekstrüzyon 62

Nükleik Asidin Uzaklaştırılması Kimyasal yöntemler - Asidifiye alkol, tuz, asit muamelesi - Maya nükleoproteinlerinin kimyasal modifikasyonu 63