T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI HASTANE ENFEKSİYONU ETKENİ PSEUDOMONAS AERUGINOSA SUŞLARI ARASINDAKİ KLONAL İLİŞKİNİN ARAŞTIRILMASI DOKTORA TEZİ Ayşe Bilge SİPAHİ Tez Danışmanı Prof.Dr. Kayhan ÇAĞLAR ANKARA Temmuz 2013
I
İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Şekiller, Resimler, Grafikler Tablolar Semboller, Kısaltmalar Teşekkür I II V VI VII X 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Tarihçe ve taksonomi 4 2.2. Pseudomonas aeruginosa 6 2.2.1. Görünüm ve boyanma özellikleri 6 2.2.2. Üreme ve biyokimyasal özellikleri 6 2.2.3. Virülans faktörleri ve patojenite 7 2.2.4. Yaptığı hastalıklar 11 2.3. Tedavi 15 2.4. Epidemiyoloji 16 2.5. Epidemiyolojik tiplendirme yöntemleri 18 2.5.1. Moleküler epidemiyoloji ve genotipik tipleme yöntemleri 20 2.5.2. Genotiplendirmenin gerekli olduğu durumlar 21 II
2.5.3. Genotiplendirme yöntemleri 22 2.6.Moleküler tiplendirme yöntemlerinde sonuçların 27 değerlendirilmesi 3. GEREÇ ve YÖNTEM 29 3.1. Gereçler 29 3.1.1. Besiyerleri 29 3.1.2. Kimyasal bileşikler 29 3.1.3. Cihazlar 30 3.2. Yöntem 31 3.2.1. Örneklerin Toplanması 31 3.2.2. Bakterilerin tanımlanması ve antibiyotik duyarlılık testleri 32 3.2.3. Rep-PZR yöntemi ile klonal ilişkinin saptanması 33 4. BULGULAR 40 4.1. Epidemiyolojik bilgiler 40 4.2. Antibiyotik duyarlılık testleri sonuçları 42 4.3. Rep-PZR sonuçları ve kümeleşme analizi 45 4.3.1. Küme içinde yer alan suşların epidemiyolojik ilişkileri 48 5. TARTIŞMA 55 6. SONUÇ 69 7. ÖZET 71 III
8. SUMMARY 73 9. KAYNAKLAR 75 10. ÖZGEÇMİŞ 91 IV
Şekil ve Resim Listesi Sayfa No Şekil 1. Rep-PZR şeması 27 Şekil 2. Çevresel sürüntü örneklerinin alındığı bölgeler 32 Şekil 3. P.aeruginosa suslarının izole edildikleri bölümler ve 41 oranları Şekil 4. Rep-PZR ile tiplendirilen 52 suşa ait dendogram 46 Şekil 5. Rep-PZR ile tiplendirilen 52 suşa ait kümeleşme analizi 47 sonuçları Resim 1. P.aeruginosa suşlarının Rep-PZR jel Görüntüsü 45 V
Tablo Listesi Sayfa No Tablo 1. Tıbbi önemi olan bazı Pseudomonad ların 5 sınıflandırılması Tablo 2. P.aeruginosa nın hastane ortamındaki rezervuarları 17 Tablo 3. Sık kullanılan epidemiyolojik tiplendirme yöntemler 18 Tablo 4. PZR amplifikasyon reaksiyon karışımı 36 Tablo 5. P.aeruginosa suşlarının izole edildikleri bölüm ve örnek 40 tiplerine göre dağılımı Tablo 6. Çevresel örneklerin toplandıkları yoğun bakım üniteleri 42 ve alındıkları yüzeylere göre dağılımı Tablo 7. Klinik suşların antibiyotik duyarlılık oranları 43 Tablo 8. Çevresel suşların antibiyotik duyarlılık oranları 44 Tablo 9 : Çalışmaya alınan P.aeruginosa suşlarının 53 mikrobiyolojik ve epidemiyolojik özellikleri VI
Semboller, Kısaltmalar AP-PZR: Arbitrarily Primed-PZR ARYB: Anestezi ve Reanimasyon Yoğun Bakım ATCC: American Type Culture Collection BAL: Bronkoalveolar Lavaj Bp: Baz çifti BCYB: Beyin Cerrahisi Yoğun Bakım CDC: Center for Disease Control CLSI: Clinical and Laboratory Standarts Institute ÇHYB: Çocuk Hastalıkları Yoğun Bakım DNA: Deoksiribonükleik Asit dntp: Deoksinükleotid Trifosfat EDTA: Etilen Diamin Tetra Asetik Asit EMB: Eosine-Methylen Blue ERIC: Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus VII
ETA: Endotrakeal Aspirat GCYB: Genel Cerrahi Yoğun Bakım GHYB: Göğüs Hastalıkları Yoğun Bakım IHYB: İç Hastalıkları Yoğun Bakım KİT: Kemik İliği Transplantasyon MDR: Multiple Drug Resistance MHA: Mueller Hinton Agar NLYB: Nöroloji Yoğun Bakım NNIS: National Nosocomial Infections Surveillance System PFGE: Pulsed Field Jel Elektroforez ph: Hidrojen iyonu PZR: Polimeraz Zincir Reaksiyonu RAPD: Rastgele çoğaltılmıs polimorfik DNA RE: Restriksiyon Enzimi Rep-PZR: Repetitive-Sequence-Based Polimeraz Zincir Reaksiyonu VIII
RFLP: Restriksiyon Fragmenti Uzunluk Polimorfizmi rrna: Ribozomal Ribonükleik Asit TBE: Tris-Borik Asit-EDTA TE: Tris-EDTA UPGMA: Unweighted Pair Group Method With Mathematical Averaging YDYB: Yenidoğan Yoğun Bakım IX
TEŞEKKÜR Doktora öğrenciliğim süresince eğitimime katkıda bulunan, tez çalışmalarımda bilgi ve görüşleriyle beni yönlendiren hocam, Prof. Dr. Kayhan Çağlar'a, Doktora eğitimime katkılarından ve tez çalışmam sırasında sağladığı imkanlardan dolayı Tıbbi Mikrobiyoloji AD. Başkanı Prof. Dr. Meltem Yalınay Çırak'a, Doktora eğitimime katkılarından dolayı bölüm hocalarım Prof.Dr.Semra Kuştimur, Prof.Dr.Seyyal Rota, Prof.Dr.Ayşe Kalkancı, Doç.Dr. Gülendam Bozdayı, Doç.Dr.Işıl Fidan, Doç.Dr.Funda Doğruman Al ve Yrd.Doç.Dr. Nuray Büyükberber'e, Hem uzmanlık hem de doktora eğitimim süresince beni destekleyen hocam, Prof. Dr. Nedim Sultan'a Tez izleme komitesi öğretim üyesi Prof. Dr. Devran Gerçeker'e Tez çalışmamın sonuçlarının değerlendirilmesindeki değerli katkılarından dolayı Doç. Dr. Barış Otlu'ya Tez çalışmalarımda her türlü teknik konuda bilgi ve deneyimlerini paylaşan Araş.Gr. Dr. Sinem Solmaz, biyolog Yasemin Işık Koç ve Berrin Öztürk'e Eğitimim ve çalışmalarım süresince gösterdikleri dostlukları için asistan arkadaşlarıma ve tüm Mikrobiyoloji personeline, Eğitimim süresince sonsuz özveri ve hoşgörü gösteren sevgili aileme, anlayışı ve desteği için özellikle kız kardeşime, Teşekkür Ederim X
1. GİRİŞ Pseudomonas aeruginosa, üremek için minimal koşulları yeterli bulan, değişik çevresel koşullara adapte olup kolonizasyon yeteneğine sahip olmasının yanı sıra bir çok antimikrobiyal ajana karşı intrinsik direnç gösterebilen bir patojendir. Sahip olduğu bu özellikleri sayesinde hastanede dezenfektan ve antiseptikler dahil nemli pek çok ortamda saptanabilen bir mikroorganizmadır 1,2,3. Özellikle yoğun bakıma ihtiyacı olan, nötropenik veya yanıklı hastalar gibi enfeksiyona duyarlı kişilerde sepsis, menenjit, pnömoni, üriner sistem ve yanık enfeksiyonları gibi ciddi enfeksiyonlara yol açabilmektedir 4. P.aeruginosa tüm hastane kaynaklı enfeksiyonların %10-25 inden sorumlu tutulmaktadır 4,5. Ülkemizde yapılan çalışmalarda yoğun bakımda yatan hastalardaki enfeksiyonların %20-42 sinden Pseudomonas aeruginosa nın sorumlu olduğu saptanmıştır 6,7. Yoğun bakım ünitesinde tedavi olan hastalarda P.aeruginosa enfeksiyonlarına bağlı olarak morbidite ve mortalite yüksek olabilmektedir 6. Pseudomonas aeruginosa da çoklu antimikrobiyal direncinin de sık görülmesi tedaviyi güçleştirmekte veya olanaksız hale getirmektedir. Bu nedenle hastanede yatan hastalara bu bakterinin geçişi ve kolonize olmasının önlenmesi enfeksiyonun önlenmesinde büyük önem kazanmaktadır 3. Yapılan çalışmalarda hastane ortamındaki P. aeruginosa rezervuarlarının sıklıkla musluk suları, musluklar, lavabolar, solunum ekipmanları gibi cansız objeler ve yüzeyler ile nadiren hastane personeli olduğu saptanmıştır 3,8-10. Pseudomonas aeruginosa nın hastanedeki rezervuarlarından hastalara geçişiyle meydana gelen salgınlar ve sporadik enfeksiyonlar bildirilmektedir 2,10-12. Salgınlar sırasında bakterinin 1
kaynağının bulunması mümkünse de sporadik vakalarda bu daha zor olmaktadır. Enfeksiyon ve bakteri kaynağının bulunmasında çevresel ve klinik izolatlar arasındaki klonal ilişkinin saptanması en önemli basamaktır. Suşlar arasındaki klonal ilişkinin saptanmasıyla epidemik izolatlar, sporadik veya endemik olanlardan ayırt edilebilmekte, salgınla ilişkili suşlar belirlenmekte, salgının kapsamı, kaynak ve rezervuarı hakkında bilgi sağlanabilmektedir. Ayrıca salgınlara ait bilgi bankaları hazırlanıp herhangi bir yer ve zaman içindeki enfeksiyonun özellikleri tanımlanabilmektedir 13. Pseudomonas aeruginosa infeksiyonlarının kaynağının anlaşılması, hastalara geçiş yolunun bulunması ve engellenmesi için epidemiyolojik çalışmalar için gerekli olan tiplendirmede çoğunlukla kesin ayrım için moleküler yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. RFLP (Restriction fragment length polymorphism), PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis), RAPD-PZR (Randomly Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ve Rep-PZR (Repetitive-Sequence- Based Polimeraz Zincir Reaksiyonu) gibi moleküler yöntemler epidemiyolojide kullanılmaktadır. P.aeruginosa gibi fenotipik farklılıkları çok olan bir bakterinin biyotiplendirme, antibiyotiplendirme ve piyosin tiplendirilmesi özgün klonal toplulukların ayırt edilmesinde yeterli olmamaktadır. P.aeruginosa nın moleküler tiplendirilmesinde sıklıkla RFLP ve PFGE yöntemleri kullanılmaktadır. Ancak bu yöntemlerin iş gücü yükünün fazla olması rutinde ve geniş taramalarda kullanılmasını zorlaştırmaktadır. Son yıllarda salgınların ve sporadik enfeksiyon olgularının epidemiyolojik tiplendirmesinde hızlı ve ayırt edici PZR temelli DNA parmak izi yöntemleri sıklıkla kullanılmaya başlanmıştır 2,14,15. Rep-PZR yöntemi, epidemiyolojik olarak bağlantılı suşlar arasındaki benzerliği ortaya koymak için kullanılan PZR temelli tiplendirme yöntemlerinden biridir. Rep-PZR bakterinin genomu boyunca dağılım 2
gösteren, tekrarlayan ve palindromik DNA dizilimlerine tamamlayıcı olan primerler kullanılarak yapılan bakteri parmak izi tekniğidir. Amplifikasyon ürününün agaroz jel elektroforezini takiben, oluşan bant profillerini karşılaştırılarak suşlar arasındaki klonal ilişki değerlendirilir 16,17. Özellikle çoklu antibiyotiklere dirençli P.aeruginosa enfeksiyonlarında hastane ortamında ki rezervuar rolünün anlaşılması, tedavisinde güçlükle karşılaşılan dirençli bakterilerin hastalara geçişinin önlenmesinde kontrol önlemlerinin alınmasını sağlayacak, var olan bilgilerin yeniden gözden geçirilmesine ve yeni stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır 13. Bu çalışmada Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Yoğun Bakım ünitelerinde yatan hastaların enfeksiyon materyallerinden ve çevresel örneklerden izole edilen P.aeruginosa suşlarının arasındaki klonal ilişkinin Rep-PZR yöntemi ile araştırılması amaçlanmıştır. 3
2. GENEL BİLGİLER 2.1. Tarihçe ve taksonomi Pseudomonas cinsi 1894 yılında botanik bilimci Migula tarafından tanımlandığından beri bakteriyoloji biliminin bir parçası olmuştur. Pseudomonas cinsi bakteriler doğada yaygın olarak bulunan, bitkiler, hayvanlar ve insanlarda hastalık oluşturabilen mikroorganizmalardır 18,19. Pseudomonas lar keşfedildikleri tarihten itibaren çok sayıda taksonomik değişikliğe uğramışlardır. Günümüz sınıflandırmasında Pseudomonadaceae rrna:dna hibridizasyon analizi ve 16S rrna sekansına göre 5 rrna grubuna ayrılır. Pseudomonas cinsi rrna grup I ile sınırlıdır ve Proteobacteria gama alt sınıfında bulunur. rrna grup II Pseudomonadlar Burkholderia ve Ralstonia cinsinde ve rrna grup III ise Comamonadaceae ailesinde sınıflandırılmaktadır. rrna grup IV ve V ise sırasıyla Brevundimonas ve Stenotrophomonas cinsinde yer almaktadır Pseudomonas ların sınıflandırılması tablo 1 de sunulmuştur 18,19,20. 4
Tablo 1 :Tıbbi önemi olan bazı Pseudomonad ların sınıflandırılması RNA homoloji grup ve subgrupları Cins ve türler I II III IV V Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri Pseudomonas mendocina Burkholderia pseudomallei Burkholderia mallei Burkholderia cepacia Ralstonia pickettii Comamonas türleri Acidovarax türleri Brevundimonas türleri Stenotrophomonas maltophilia Pseudomonas cinsi bakteriler Gram negatif, spor oluşturmayan, düz veya hafif eğri, yaklaşık 0.5-1x1-5 µm boyutlarında, bir veya daha fazla sayıdaki kamçıları ile hareketli basillerdir. Zorunlu aeroblardır ancak bazıları nitrat varlığında anaerop şartlarda üreyebilir. Katalaz olumlu, şekerleri oksidasyon yoluya metabolize eden fermentasyon yapmayan mikroorganizmalardır 19. Pseudomonas türlerinin doğada toprak, su, bitki ve hayvanlarda geniş yayılım göstermeleri güçlü genetik ve fizyolojik adaptasyon mekanizmalarına bağlıdır. İnsanlarda, kistik fibrozisli hastaların akciğerlerinde, göz ve yanık yarası enfeksiyonlarında ve AIDS hastalarında fırsatçı patojen olarak bulunurlar. Patojeniteleri konağın bağışıklık sisteminden kaçan veya bağışıklık sistemini zayıflatan çok sayıda salgılanan toksinlere bağlıdır. Bitkilerde yaprak ve köklerde hasara 5
sebep olurlar. Toprakta çevreye zararlı aromatik bileşikler, halojen deriveleri ve organik bileşikleri zararsızlaştırırlar 21. 2.2. Pseudomonas aeruginosa 2.2.1. Görünüm ve boyanma özellikleri Pseudomonas aeruginosa 1.4-3 µm uzunluğunda ve 0.5 µm genişliğindedir. Tek tek, bazen çift çift ve bazen de kısa zincirler halinde görülen sporsuz, kapsülsüz basillerdir. Tek kutuplarında bulunan bir veya birden fazla kirpikle çok hareketlidirler. Kolay boyanırlar ve Gram olumsuzlardır. G+C'nin DNA'daki oranı %67.2 dir 21. 2.2.2. Üreme ve biyokimyasal özellikleri Mikrobiyoloji laboratuvarında sık kullanılan genel besiyerlerinde kolaylıkla 30-37 0 C'lerde ve hafif alkali ortamda ürerler. Ayrıca 42 0 C'de üreyebilmesi de diğer Pseudomonas türlerinden ayırt edici bir özelliğidir 21. Zorunlu aeropturlar. Sıvı besiyerlerinde yüzeyde zar oluşturarak ürerler ve zarın hemen altında yeşil mavi pigment oluştururlar. Daha çok klinik örneklerden elde edilen bakteriler katı besiyerlerinde yuvarlak, yumuşak, yassı ortası kabarık Tip 1 koloniler oluştururlar. Karşıdan bakılınca floresans özelliği olan ve besiyerine yayılmış olan mavi yeşil pigment göze çarpar. Ayrıca küçük ve koliform tip 2 ve R tipi (tip 3) koloniler oluştururlar. Mukoid tip koloniler de oluştururlar. Mukoid tip üreme gösterenler özellikle başta kistik fibrozlu hastalar olmak üzere üst solunum yolları örneklerinde rastlanır ve bol miktarda ekstrasellüler polisakkarit 6
yapısında bir madde üretirler. Kültürlerinde tatlımsı, üzüm kokusuna benzer bir koku vardır. Kanlı agarda hemoliz yaparlar 20,21. Pseudomonas lar laktoz ve sakkaroza etki etmezler. Oksidaz oluşturmaları ile bağırsak bakterilerinden ayrılırlar. İndol ve H 2 S yapmazlar. Metil kırmızısı ve Voges-Proskauer olumsuzdurlar. Nitratları nitritlere çevirirler 21,22. Pseudomonas aeruginosa'nın dört çeşit pigment oluşturduğu saptanmıştır. Bunlar piyosiyanin, piyoverdin (flurosein), piyorubin (koyu kırmızı pigment) ve piyomelanin (kahverengi-siyah pigment) dir. Piyosiyanin floresans vermeyen, mavi-yeşil ve besiyerine difüz olarak yayılan bir pigmenttir. Piyosiyanin bir fenazin boyasıdır. Suda ve kloroformda erir. Piyoverdin floresans özelliktedir ve besiyerinde sarı yeşil pigment oluşturur. Kloroformda erimemesi sadece suda erimesiyle piyosiyaninden ayrılır 20-22. 2.2.3. Virülans faktörleri ve patojenite Doğada toprakta, suda ve memelilerin bağırsağında yaygın olarak bulunan P.aeruginosa fırsatçı bir patojendir. Bu bakterinin hastalık oluşturmasında ki yardımcı faktörleri başlıca salgıladığı enzimler ve bazı yapısal özellikleridir. Virülans faktörleri bakterinin kolonizasyonu, canlı kalması ve dokulara invazyonunda önemli rol oynarlar 21,22. Virülans faktörleri akut enfeksiyonlar ve kronik enfeksiyonlarda rol alanlar olarak başlıca iki gruba ayrılabilir. Akut enfeksiyonda rol oynayan virülans faktörleri pili ve diğer adezinler gibi bakteri yüzeyinde bulunan yapılar ve ekzotoksin S, ekzotoksin A, fosfolipaz C, elastaz, kollajenaz, alkalin proteaz ve jelatinaz gibi hücre 7
dışına salgılanan enzimleridir. Kronik enfeksiyonlarda rol oynayan virülans faktörleri ise sidereforlar olan piyoverdin ve piyoselindir 15,21,23,24. Yüzey Adezinleri Pseudomonas aeruginosa nın yüzeyinde pili ve non pili adezinleri olmak üzere epitele tutunmadan sorumlu iki tip protein yapısında adezini bulunmaktadır. Pili, 15-18 kda ağırlığında pilin proteinin polimerlerinden oluşmuş uzun kutupsal iplikçiklerdir ve pila geni tarafından kodlanırlar. P.aeruginosa nın tip IV pilileri bakteriyel tutunmayı başlatmada ve mukozal yüzeylerde kolonizasyonda önemli rol oynar. Pili aynı zamanda bakteriyofajlar için reseptör görevi de görür. Özellikle akciğerlere ve yara bölgesine yerleşmede etkili bir virülans faktörüdür. Non pili adezinler ise müsine bağlanmayı sağlar 19,22-24. Lipopolisakkarit Pseudomonas aeruginosa tarafından sentezlelen lipopolisakkarit (LPS) bakteriyi konak savunmasından koruması ve ökaryotik hücrelere girişi başlatmasıyla virülansta önemli bir rol oynar. LPS iç ve dış olarak iki tabakadan oluşmuştur. Dış tabaka kistik fibrozlu hastalarda CTFR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) reseptörüne bağlanarak bakterinin epitel hücrelerine girmesini sağlar 19. Aljinat Pseudomonas aeruginosa tarafından salgılanan aljinat insan epitel hücrelerinde enfeksiyonun başlamasında önemli bir virülans faktörüdür. Aljinat bakteri tarafından oluşturulan slaym tabakasının ana 8
yapısını oluşturur ve mukoid ekzopolisakkarit olarak tanımlanabilir. Aljinat tekrarlayan yapılarda mannuronik asit ve glukuronik asitten olusur 19. Çok fazla miktarda aljinat üretimi mukoid fenotip oluşumu ve biyofilm yapımıyla ilişkilidir. Kistik fibroz hastalarında sıklıkla izole edilen mukoid suşlar akciğerleri kolonize edip, belirgin hastalığın ortaya çıkmasına neden olur. İlerleyen zamanlarda akciğerlerde kronik enfeksiyon gelişimi ve akciğer fonksiyonlarında ilerleyici azalma ortaya çıkar. Aljinat üretimi bakteriyi bölgesel bağışıklık cevaptan, fagositoz ve antibiyotik tedavisinden korur 19,22. Aljinat ozmolarite, nitrojen ve fosfat düzeyi, dehidratasyon, antibiyotikler ve stres gibi çevresel uyarılara cevap olarak sentezlenir 19,22,24. Sideroforlar Sideroforlar aerobik bakteriler tarafından demir iyonlarının düzeyine cevap olarak salgılanırlar ve ferröz iyonların olmadığı ortamlarda bakterinin çoğalmasını sağlarlar. Piyoverdinler (PVD) floresan Pseudomonas suşları tarafından salgılanan karmaşık sideroforlardır. Ayrıca bazı suşlar piyoselin sideroforları da salgılarlar 19,23. Piyoverdinler virülans faktörlerinin üretimi ve biyofilm oluşumunda önemli rollere sahiptir. P.aeruginosa nın virülans faktörlerinden ekzotoksin A ve proteaz ın üretimini kontrol eder 19. 9
Ekzotoksin A Letal ekzotoksin olarak da adlandırılan ekzotoksin A konak hücre protein sentezini durdurarak doku nekrozuna neden olan hücre dışı enzimdir. Bakteriyel periplazmik aralıkta inaktif olarak bulunur ve proteazlar tarafından parçalanarak aktif hale getirilir. Ekzotoksin A protein yapısındadır ve ısıya dayanıksız olup formalin ile toksoit haline dönüşür 19,21-24. Ekzotoksin S Ekzotoksin S protein yapısında olup Tip 3 hücre sekresyon sistemi tarafından konak hücre temasıyla salgılanır. Hücrelere sitopatik etki göstermesinin yanısıra Ig G ve A yıkımına, aktin filamentlerinin depolarizasyonuna ve makrofajlara karşı dirence neden olur 19,21,22. Hemolizinler Fosfolipaz C ve ramnolipid, P.aeruginosa nın hemolizinleridir. Fosfolipaz C protein yapısında ve ısıya duyarlıdır, ramnolipid ise ısıya dayanaklı bir biyosürfaktan glikolipiddir. Bu hemolizinler sinerjik hareket ederek lipidleri ve lesitini hasara uğratırlar. Nekroz oluşturarak bakterinin doku invazyonuna yardım ederler. Ramnolipidler epitelde hücreler arası bağlantıyı bozarlar 19,22,24. Proteazlar Kanama bozukluklarına ve doku nekrozuna neden olan elastaz, kollajenaz, alkalin proteaz ve jelatinaz gibi proteazlar da akut enfeksiyonlarda rol oynayan virülans faktörleridir 15,20-24. Bu proteazlar 10
pıhtılaşmış serumu, kazeini, fibrini, jelatini, hemoglobini ve elastini eritirler. Elastin, kollajen ve laminin gibi hücre dışı matriks bileşenlerini eriterek konak hücrenin yapısal bütünlüğünün bozulmasına neden olurlar. Ayrıca kompleman sistemi bileşenleri, serum alfa proteinler ve immünglobülinleri parçalarlar 19. 2.2.4. Yaptığı hastalıklar Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonları oldukça geniş bir çeşitlilikte karşımıza çıkmaktadır. Bazı P.aeruginosa enfeksiyonları baskın olarak toplumda görülebiliyorsa da çoğunluğu özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış ve enfeksiyonlara açık hastaların yattığı yoğun bakım ünitelerinin bulunduğu yataklı sağlık kurumlarında ortaya çıkmaktadır. Oluşturduğu enfeksiyonlar mortalite ve morbidite ile ilişkili olmasına rağmen antimikrobiyal direncin gittikçe artmasıyla birlikte tedavi seçenekleri gittikçe kısıtlanmaktadır 3. şunlardır: Pseudomonas aeruginosa nın yaptığı önemli enfeksiyonlar Pnömoni Pseudomonas aeruginosa, nadir olarak toplum kökenli pnömoni etkenidir. P.aeruginosa nın oluşturduğu toplum kökenli alt solunum yolu enfeksiyonları sıklıkla kanser, kistik fibroz, aplastik anemi, kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi altta yatan hastalığı olan ve bağışıklığı baskılanmış bireylerde görülür 25. Kistik fibrozlu hastaların solunum yollarında kolonizasyona ve kronik akciğer enfeksiyonlarına yol açan mikroorganizmalar arasında 11
Pseudomonas aeruginosa ilk sırayı almaktadır. Solunum sekresyonlarındaki anormallikler, yetersiz opsonizasyon, fagositoz ve bakterisidal mekanizmalar sonucunda hastaların yaklaşık %75-90 ında Pseudomonas aeruginosa nın etken olduğu kronik akciğer enfeksiyonları gelişmektedir 22,26. Hastane kaynaklı Pseudomonal pnömoniler ise sıklıkla ventilatörle ilişkilidir. Ventilatör yardımı alan hastalarda pnömoni gelişme riski 20 kat artmıştır ve en sık saptanan etiyolojik ajan ise P.aeruginosa dır 27. Hastane kaynaklı P.aeruginosa suşlarında antibiyotik direncinin yüksekliği nedeniyle tedavi başarısızlığı ve mortalite oranları yüksektir 28,29. Bakteri üst solunum yollarında kolonize olduktan sonra çoğunlukla aspirasyon ile alt solunum yollarına ilerler ve ateş, titreme, pürülan balgam, siyanoz ve mental konfüzyonla kendini gösteren ve sıklıkla ölümle sonuçlanan pnömoniye neden olur 30. Yanık ve yara enfeksiyonları Bir çok yanık merkezinde P.aeruginosa hem hastanın kendi florasından hem de çevreden kaynaklanan enfeksiyonlarda en sık rastlanan etkendir 27. Farklı yollarla bulaşan bakteriler yara ve yanıklarda sıklıkla mavi yeşil iltihabi akıntı ile seyreden enfeksiyonlara neden olur. Yanık dokuda siyah, koyu kahverengi, menekşe renk değişiklikleri görülebilir. Enfeksiyon nedeniyle yanıklarda greft kaybı gözlenebilir. Geniş ve derin yanıklarda cilt altı bölge, lenfatikler boyunca ilerleyip dolaşım sistemine karışarak sepsise neden olabilir. Yanıklı hastalarda Pseudomonas aeruginosa sepsisine bağlı ölümler %78 gibi yüksek bir orandadır 21,30. 12
Bakteriyemi Pseudomonas aeruginosa ya bağlı bakteriyemilerde ölüm oranı %70 e kadar çıkabilmektedir ve hastane kaynaklı Gram negatif bakteriyemiler içinde dördüncü sıradadır. Solunum, gastrointestinal ve üriner sistem, deri ve yumuşak dokular sıklıkla bakteriyeminin primer odaklarıdır. Ancak hematolojik maligniteler, immünglobülin eksiklikleri nötropeni, diabet ve organ transplantasyonuna sahip hastalarda ise enfeksiyon odağı olmadan primer bakteriyemi şeklinde görülebilir. Ektima gangrenozum adı verilen deri lezyonları Pseudomonas bakteriyemisinde önemlidir. Ektima gangrenozum veziküller şeklinde başladıktan sonra hemoraji, nekroz ve ülserasyon gelişir. Bu lezyonlar sıklıkla perinede, kalçalarda, ekstremitelerde ve aksillada görülmekle birlikte vücudun her yerinde görülebilir 30,31. Merkezi sinir sistemi enfeksiyonları Pseudomonas aeruginosa nın neden olduğu menenjit ve beyin apsesi; kulak ve sinüsler gibi odaklardan komşuluk yoluyla, kafa travması, cerrahi gibi invaziv girişimler ile direk inokulasyon ve üriner sistem, solunum sistemi gibi uzak odaklardan gelişen bakteriyemi yoluyla gelişir. P.aeruginosa kanserli hastalarda ikinci sıklıkta menenjit ve apse nedenidir 22,30. Kulak enfeksiyonları Pseudomonas aeruginosa yaralanma, inflamasyon veya nem oluşturan etkenler dışında sağlıklı kişilerde çok nadir olarak dış kulak yoluna yerleşir. Dış kulak yolu enfeksiyonu yüzmeyle çok ilgilidir. Pseudomonas aeruginosa yüzücülerde sıklıkla tekrarlayan yüzücü kulağı 13
denen kaşıntı, akıntı ve ağrı ile karakterize enfeksiyonu oluşturur. Diyabet veya bağışıklık sistemini etkileyen altta yatan hastalığı olan kişilerde Pseudomonas aeruginosa dış kulak yolu enfeksiyonu sonrası epiteli penetre ederek mastoid kemiğe kadar ilerleyebilir. Malign otitis externa adı verilen bu tabloda sıklıkla otalji ve otore vardır. Yedinci sinir felci görülebilir. Trismus görülmesi ise hastalığın temporamandibular bölgeye kadar ilerlediğinin işaretçisidir. P.aeruginosa ayrıca yenidoğanların ilk altı haftasında orta kulak iltihabına neden olabilir 22,30. Endokardit Pseudomonas aeruginosa damar içi ilaç kullanan bağımlılarda doğal kapakta ve yapay kapağa sahip olan bireylerde enfektif endokardite neden olur. En sık triküspid kapak tutulmakla birlikte pulmoner, aortik ve mitral kapaklarda da enfeksiyon görülebilir 22,30. Göz enfeksiyonları Pseudomonas aeruginosa bakteriyel keratite en sık neden olan etkenlerden olmakla birlikte endoftalmit, skleral apse, blefarokonjuktivit de yapmaktadır. Korneada ülser bulunması durumunda göze damlatılan kontamine solüsyonlar, göze sıçrayan yabancı cisimler ile göze bulaşarak enfeksiyona neden olur. Kontak lens kullananlar, komadaki hastalar ve bağışıklığı baskılanmış hastalarda da keratite neden olur. Endoftalmit ise genellikle ağır seyreder ve kısa sürede gözün kaybı ile sonuçlanabilir 21,22,30,32. 14
Kemik ve eklem enfeksiyonları Enfeksiyon kan yoluyla yayılım veya komşuluk yolu ile gelişir. Kan yoluyla yayılım sıklıkla damar içi ilaç bağımlılığı olanlarda üriner ve pelvik sistem enfeksiyonu sonucunda görülür. Komşuluk yoluyla ise delici travma, komşu yumuşak doku enfeksiyonu veya cerrahi sonrası enfeksiyon gelişebilir 22. Üriner sistem enfeksiyonları Üriner sistem enfeksiyonları sıklıkla hastanede yatan hastalarda gözlenir. Enfeksiyon kateterizasyon, sonda veya cerrahi girişimlere ve böbrek nakline bağlı olarak gelişir. Pseudomonas bakteriyemilerinin %40 ı üriner sistem enfeksiyonunun dolaşım sistemine yayılması ile gerçekleşir 20,22,30. 2.3. Tedavi Tüm dünyada P.aeruginosa enfeksiyonlarında antibiyotiklere direnç oranları artmakta, yeni antibiyotiklerin de kullanıma girmesine rağmen etkili antibiyotik sayısı giderek daha da sınırlanmaktadır. Bu nedenle Pseudomonas kaynaklı enfeksiyonların tedavisi gittikçe zorlaşmakta, özellikle yoğun bakım ünitlerinde bulunan bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda morbidite ve mortalite oranları artmaktadır 22,33,34. Pseudomonas aeruginosa nın çok sayıda antibiyotiğe direnç göstermesi aşağıdaki mekanizmalar ile açıklanmaktadır 35 : -Hücre duvar geçirgenliğinin az olması nedeniyle bir çok antimikrobiyal ilaca intrinsik olarak dirençlidir. 15
-Çok sayıda genetik direnç mekanizmasının bulunması -Direnç genlerini düzenleyen kromozomal genlerde mutasyonlar ile direncin ortaya çıkması -Diğer mikroorganizmalardan plazmid,transpozon ve bakteriyofajlar ile yeni direnç genlerini kazanabilmesi -Biyofilm oluşturması Pseudomonas aeruginosa ya karşı etkili beta-laktam antibiyotikler piperasilin, seftazidim, sefepim, sefpirom, imipenem, meropenem ve aztreonamdır. Aminoglikozidler içinde, gentamisine direnç en yüksek, amikasine ise en düşük orandadır ve tobramisinin daha iyi intrinsik aktivitesi vardır. Florokinolonlar içinde ise siprofloksasin en etkili olanıdır. P.aeruginosa enfeksiyonlarında en yaygın kullanılan kombinasyon genellikle sinerjik etki gösteren beta-laktam ve aminoglikozid kombinasyonudur 33,36,37. 2.4. Epidemiyoloji Pseudomonas aeruginosa bitkiler, toprak ve suyla ilişkili ortamlarda, çevre koşullarına en iyi uyum sağlayan vejetatif bakterilerdendir. Nemli ve gün ışığından uzak yerlerde, besleyici maddelerin çok az bulunduğu sularda bile üreyebilme özelliğine sahiptir. Normal koşullarda insan florasının bir elemanı olarak görülmemekle birlikte fekal, oral ve cilt taşıyıcılığına rastlanabilmektedir. İnsanlarda perine, koltuk altı, kulak gibi nemli bölgelere yerleşebilir. Hastanede yatan yanıklı hastaların derilerinde, solunum cihazına bağlı hastalarda solunum 16
yollarında, kemoterapi alan hastaların gastrointestinal sisteminde ve antibiyotik alan hastalarda taşıyıcılık oranı yüksektir 22. Hastane ortamına da uyum sağlayabilen P.aeruginosa bir çok yüzeyden izole edilebilmektedir. P.aeruginosa nın hastane ortamında bulunabileceği ortamlar tablo 2 de sunulmuştur 3. Tablo 2 :P.aeruginosa nın hastane ortamındaki rezervuarları Musluk, lavabo, lavabo boruları Duşlar Dezenfektanlar, antiseptikler Kalıp sabunlar Solunum cihazları Buz yapan cihazlar Çiçek vazoları Tıraş veya diş fırçaları Göz damlaları, ağız gargaraları Paspas başlıkları, kovalar Endoskoplar, endoskop yıkayıcıları Ürometreler Su banyoları Hidroterapi havuzları Banyo küvetleri Temizlik aletler, Musluklar ve duşlar gibi suyun doğrudan temas ettiği bölgeler veya nemin yüksek olduğu solunum cihazı gibi ekipmanlar bakterinin en çok bulunduğu yerlerdir. P.aeruginosa nın bir çok özelliği hastane ortamında kalıcı olmasını sağlamaktadır. Bakteri çoklu ilaç pompaları sayesinde biguanidler ve dörtlü amonyum bileşikleri gibi dezenfektanlara doğal dirençlidir. Hekzoklorfenli sabunlar ve iyotlu solüsyonlar içinde bile üreyebilir. Farklı cansız yüzeylerde biyofilm oluşturması dezenfektanlara dirence neden olur ve fiziksel olarak ortamdan uzaklaştırılmasını zorlaştırmaktadır. Özellikle nemli ortamlarda canlı kalabilmesi ortamda bulunan amebik mikroorganizmaları ve protozoonları öldürebilmesine bağlıdır 3,22. 17
2.5. Epidemiyolojik tiplendirme yöntemleri Bir enfeksiyonla başa çıkabilmek için etkili tedavinin yapılmasında etkenin tür düzeyinde tanımlanması ilk uygulanacak adımdır. Bazı enfeksiyonlarda alt türlerin tiplendirilmesi yeterli olmaktadır. Ancak, özellikle salgınlar sırasında enfeksiyonun kaynağı, bulaş yolları, dirençli suşların saptanması, izole edilen aynı tür içindeki bir çok suşun birbiriyle klonal ilişkisinin olup olmadığının belirlenmesi için tür içinde farklılık gösterebilen varyantların saptanması gerekmektedir. Alt tiplendirme veya suş klasifikasyonu olarak ifade edilen bu tiplendirmede bazı fenotipik ve genotipik özelliklerden yararlanılmaktadır (Tablo 3) 38-40. Tablo 3:Sık kullanılan epidemiyolojik tiplendirme yöntemler Fenotipik yöntemler Antibiyotik duyarlılık testi Biyotiplendirme Serotiplendirme Bakteriyosin tiplendirme Faj tiplendirme Protein temelli yöntemler Genotipik yöntemler Plazmid parmak izi RFLP PFGE AFLP AP-PZR Rep-PZR Genotipik ve fenotipik epidemiyolojik tiplendirme aşağıdaki durumlar için kullanılmaktadır 40 1. Salgın arastırmalarında, salgınların kaynağı ve yayılma yollarının tespit edilmesi 2. Hastaların epidemiyolojik olarak birbiriyle olan ilişkilerinin belirlenmesi 18
3. Vücutta bulunan aktif bir enfeksiyonun reaktivasyonun yeni bulaştan ayırt edilmesi 4. Hastane ve toplum kökenli enfeksiyonların belirlenmesi 5. Laboratuvar kontaminasyonlarının saptanması 6. Antibiyotik direncinden sorumlu genler tiplendirilmesi ile dirençli suşların tanımı ve yaygınlıklarının belirlenmesi 7. Enfekte hastalardaki epidemik klonların dolaşımı ve zaman içindeki sıklığını izleyerek epidemiyolojik sürveyans ve kontrol yöntemlerinin değerlendirilmesine katkıda bulunulması DNA temelli teknikler geliştirilmeden önce genotiplendirme için biyotiplendirme, serotiplendirme, faj tiplendirilmesi ve antibiyotik duyarlılık profilleri en sık kullanılan yöntemlerdi ancak bu yöntemler genetik farklılıklardan çok fenotipik farklılıkların ölçülmesi esasına dayanıyordu. Bu yaklaşımın altında yatan mantık ise fenotipik özelliklerin genotipik özellikleri yansıttığının kabul edilmesiydi böylece belli sayıda ortak fenotipik özelliğin bulunması genetik ilişkinin saptanmasında ölçüt oluşturuyordu. Asimilasyon profilleri, faj tiplendirme, antikor temelli testler gibi biyotiplendirme yöntemleri bakteri ve mantarlarda tür ve cins ayrımının yapılmasında günümüzde de hızlı ve güvenilir tanı yöntemleri olmasına rağmen epidemiyolojik soruları cevaplayacak genetik tiplendirmeyi sağlayamamaktadır. Bazı genlerin ekspresyonunun çevresel etkenlerle değişmesi, antijen yapısının değişken olması, geri dönüşümsüz fenotipik değişiklikler, faj ve plazmidlerin horizontal geçişleri, direnç modellerinin antibiyotik tedavisinden güçlü bir şeklide etkilenmesi fenotipik yöntemlerle değişken sonuçlar elde edilmesine neden olmaktadır. Ayrıca fenotipik yöntemlerin iş yükünün fazla olması ve uzun zaman almaları nedeniyle bakteri türlerinin daha geniş tiplendirilmesinde kullanılabilecek yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu durum araştırmacıları, ayrım gücü daha yüksek olan genotiplendirme yöntemlerini kullanmaya yöneltmiştir 38-41. 19
yöntemleri 2.5.1. Moleküler epidemiyoloji ve genotipik tiplendirme Moleküler epidemiyoloji ilk olarak enfeksiyon etkenlerinin DNA temelli yöntemlerle tiplendirilmesinde kullanılmıştır. Günümüzde ise moleküler epidemiyoloji enfeksiyon etkenlerinin biyokimyasal ve moleküler seviyede tiplendirilmesinin yanısıra enfeksiyon hastalıklarının tanısında etkenlerin saptanması, kaynaklarının belirlenmesi, geçiş yollarının bulunması, patogenezle ilişkili gen bölgelerinin belirlenmesi, ve enfeksiyonların yayılmasının önlenmesinde klinik mikrobiyolojinin yapıtaşlarından birini oluşturmaktadır 40,42,43. Belirli bir etkene bağlı enfeksiyon sıklığında artış olması, bir hasta grubundan aynı tür bakterinin izole edilmesi, benzer antibiyotik direnç profili veya biyotipe sahip izolatların varlığı epidemiyolojik araştırmaları gündeme getirmektedir 38,40,44. Bu gibi durumlarda ayrıntılı epidemiyolojik araştırmalar yapıldıktan sonra moleküler tiplendirmeye başlanır ve tiplendirme metodu klinik ve epidemiyolojik verileri doğrulamak için kullanılır 40,42. Bir çok fenotipik yöntemin aksine genotipik yöntemler ekipmanlar, kimyasal malzemeler ve işlemlerde yapılan çok küçük değişiklikler ile bakteri, mantar, protozoon ve virüslerin tiplendirilmesinde kullanılabilir. DNA temelli yöntemler fenotipik yöntemlere göre tiplendirilebilirlik, tekrarlanabilirlik ve ayırıcı güç yönünden daha üstündür 38,39. 20
2.5.2. Genotiplendirmenin gerekli olduğu durumlar 1. Birçok kişinin hasta veya kolonize olduğu ve ortak bir kaynaktan gelen salgınlar: Ortak kaynaktan gelen salgınlar, sıklıkla solunum yolu gereçleri, kateterler ve endoskoplar gibi tanı ve tedavi amacıyla kullanılan steril olmayan aletlerle ilişkilidir. Sağlık personellerinin kolonize veya kontamine elleriyle ve nadiren direkt temas yoluyla enfeksiyon yayılabilmektedir. Tiplendirme ile salgının özellikleri belirlenerek kimlerin nerede ve ne zaman etkilendiği, bulaş yolları, potansiyel kaynak ve vektörlerin tanımı yapılabilir 39,40. 2. Yüksek riskli birimlerdeki hastaların izlenmesi: Bağışıklık sistemi baskılanmış olan hastalar sıklıkla yoğun bakım ünitelerinde birlikte yatmaktadırlar. Bu hastalardan ve çevreden izole edilen bakterilerin tiplendirilmesi ile belli bir tür mikroorganizmanın kolonizasyonunun olup olmadığı anlaşılabilir 39,40. 3. Antibiyotik tedavisinin başarısız olması: Uygulanan antibiyotik tedavisine yanıt alınmış gibi görünen bir enfeksiyonun, antibiyotik kesildikten sonra yeniden görülmesi durumunda izolatların tiplendirilmesi büyük yarar sağlamaktadır. Moleküler genotipleme yöntemleri bakterilerin genetik altyapılarını ortaya çıkardıkları için, klinisyenlerin dirençli suşların seleksiyonuna izin vermeyen antibiyotik tedavi rejimlerini seçmelerine yardımcı olmaktadır 39,40. 4. Relaps ve reenfeksiyon ayrımının yapılması: Bir hastadaki tekrarlayan enfeksiyonlarda izole edilen suşların genotiplendirmesinde aynı suşun tanımlanması relapsı, farklı suşların tanımlanması ise reenfeksiyonu göstermektedir 39,40. 21
2.5.3. Genotiplendirme yöntemleri Bakteriyel moleküler tiplendirmede kullanılan ilk yöntem plazmit profilinin belirlenmesidir. Ancak bu yöntem yerini kromozomal DNA üzerinde yoğunlaşan; RAPD-PZR (Randomly Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ve Rep-PZR (Repetitive-Sequence-Based Polimeraz Zincir Reaksiyonu) gibi yeni moleküler yöntemlere bırakmıştır 40,45,46. RAPD-PZR Williams ve arkadaşları 1990 yılında rastgele bir primer kullanarak, özgün nükleotid dizisini bilmeden PZR amplifikasyonu yapmışlar ve yönteme RAPD adı verilmiştir 47. Aynı yıl Welsh ve arkadaşları da aynı yöntemi kullandıkları çalışmalarını yayınlamışlardır ve bu yöntem AP-PZR olarak adlandırılmıştır 48. AP-PZR olarak ta adlandırılan bu yöntemin esası; düşük bağlanma sıcaklıklarında kromozomal DNA dizilerine bağlanan 9-10 baz sıralı, G+C oranları yüksek, rastgele primerlerin kullanılmasıdır. Bu rastgele primer bölgeleri yerleşim ve sayıları yönünden bir bakteri türünün değişik suşlarında farklılık gösterir. Sonuçta agaroz jelde elektroforez ile her bir farklı suş için karakteristik bantlar ortaya çıkar 46. Uygulanma kolaylığı ve kısa sürede sonuç verebilme açısından geniş kullanım alanı bulan bu yöntemin en önemli dezavantajı henüz standardizasyonun sağlanamamış olmasıdır. Laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirlik oranı düşüktür 40,45,46. 22
AFLP Genomik DNA nın restriksiyon enzimi ile kesimi sonucu oluşan DNA parçalarının bir grubunun selektif amplifikasyonu esasına dayanan bir genotiplendirme yöntemidir. Amplifiye edilen ürünler işaretlendikten sonra akrilamid jel elektoroforezi ile ayrıştırılır. Bu yöntemle 60-500 kilobazlık DNA segmentleri ayırt edilebilmektedir. RAPD yöntemine göre tekrarlanabilirliği daha yüksektir. Yöntem yüksek ayrım gücüne sahiptir. Radyoaktif madde veya floresans veren maddeler kullanılır ve pahalı olan DNA dizilim cihazı gerektirir. Diğer PZR temelli tipleme yöntemlerinde olduğu gibi çevresel DNA kontaminasyonu ve konak DNA sının amplifikasyon tüpüne karışmasına bağlı olarak zemin kirliliği oluşabilir. Bu durum sonuçların yorumlanmasında sıkıntı oluşturur. Önemli avantajı DNA virüsleri, bütün bakteriler ve ökaryotik hücreler için ortak bir protokol kullanılmasıdır. Hedef organizmanın baz diziliminin bilinmesine gerek yoktur. Ampisiline dirençli enterokoklar, Legionella pneumophila serogroup 1 ve Bacillus anthracis gibi birçok bakterinin tiplendirilmesinde kullanılmaktadır 40,49,50. PFGE Bu yöntem bir çok araştırmacı tarafından yüksek tekrarlanabilirlik özelliğine sahip olduğundan moleküler tiplendirme yöntemlerinin altın standardı olarak kabul edilmektedir. Bu yöntemde, besiyerinde üretilen bakteriler eritilmiş agaroza karıştırılır, bir deterjan enzim ile parçalanması sağlanır ve restriksiyon enzimleri ile kesilir. Daha sonra agaroz jelde belirli aralıklarla yönü değiştirilen elektrik akımına tabii tutulmaktadır. PFGE de bozulmamış DNA gerekli olduğundan, DNA da kırılmalara yol açabilen standart DNA izolasyon yöntemleri uygun değildir. Bu yöntemde 10-800 kilobazlık DNA segmentlerinin ayırt edilmesine 23
imkan sağlamaktadır. Aynı türün farklı alt tiplerindeki genomik farklılıklar, restriksiyon enzimleri ile kesildikleri bölgelerin de farklı olmasına neden olur. Bu şekilde tüm bakteri genomunun restriksiyon enzim modeli ortaya çıkarılır. İncelenen suşlar genotipik yönden benzer bulunduğunda, epidemik ve endemik suşların kesin olarak ayırdedilebilmesi için en az iki enzim ile ek restriksiyon analizi yapılması önerilir 40,51,52. Yöntemin ayrım gücü oldukça yüksek olmasına rağmen oldukça karmaşık bir sistemdir. Bununla beraber diğer yöntemlere göre zaman alıcıdır, sonuçların alınması 3 günü bulabilmektedir. Ayrıca laboratuvarlar arası standardizasyon oranı düşüktür. Yöntemin uygulanmasında güvenlikle ilgili bazı noktalara dikkat edilmelidir. Bakterilerin işlenmesi sırasında kontaminasyonu önlemek için çok dikkat edilmelidir 40,51,52. RFLP RFLP, bakteriyel kromozom ve ekstra-kromozomal DNA nın restriksiyon profillerini belirlemede kullanılmaktadır. Yöntem dört temel aşamada gerçekleştirilmektedir. Bunlar DNA nın izolasyonu, restriksiyon enzimleri ile kesimi, kesilen DNA nın elektroforezi ve son aşama ise jeldeki DNA parçalarının görüntülenmesidir. Bu yöntemde en önemli basamak, DNA'nın hüçre dışına çıkarılması ve saflaştırılmasıdır. Aksi halde enzimler DNA'yı kesemez ya da kısmen keser. RFLP yöntemi kolay uygulanabilen duyarlı bir yöntemdir ancak enzim seçimi önemlidir. Bu yöntemle çok sayıda ya da çok yakın bantları değerlendirmek mümkün olmayabilir. Az sayıda mikroorganizma ile çalışıldığında değerlendirme nispeten kolayken sayı arttıkça kıyaslama güçleşmektedir. Bu zorlukları aşmak için kıyaslanan bantları azaltmak 24
faydalı olabilir. Bu amaçla enzimle kesilen DNA parçaları jelde yürütülür ve bu jel üzerine membran yerleştirilir. Jeldeki DNA'ların membrana geçmesi sağlandıktan sonra hibridizasyon aşamasına geçilir. Sonuçta sadece hibridize olan DNA parçaları görüntüleneceğinden özgüllüğü arttırılmış olur Ancak özgüllüğü arttırmak için kullanılan hibridizasyon basamağı zamanı uzatmaktadır. Bu nedenle örnekteki nükleik asitin amplifikasyonu PZR ile yapılarak alt-tiplendirme daha kısa zamanda ve yüksek güvenilirlikte gerçekleştirilebilmektedir 51-53. RFLP ile antibiyotik direnç mekanizmaları ve suşlar arası çeşitliliği göstermek mümkün olmaktadır. Bu yöntemle stafilokok, streptokok ve enteroklar, enterobakteriler, P.aeruginosa, Brucella spp, M.tuberculosis tiplendirimi yapılabilmiştir 51-53. Rep-PZR Rep-PZR tiplendirme yönteminde; çoğu bakterinin genomu boyunca dağılım gösteren tekrarlayan DNA dizilimlerine komplementer olan kısa primerler kullanılarak tekrarlar arasında kalan bölgeler amplifiye edilir (Şekil 1) 54. Bu genom boyunca bulunan tekrarlayan elementlerinin sayısı ve lokalizasyonlarının her bakteride farklı olması moleküler tiplendirme için gerekli olan tipe özgü bant profilini oluşturmaktadır 35,46,52. Tekrarlayan dizilimlerin üç grubu tanımlanmıştır. Bunlar; REP (Repetetive extragenic palindromic) dizilimler, ERIC (Enterobacterial repetitive intergenic consensus) dizilimler ve S.pneumoniae nın BOX elementidir. Bu dizilimler kullanılarak yapılan DNA parmak izi yöntemleri REP-PZR, ERIC-PZR ve BOX-PZR olarak adlandırılmaktadır 35,52. 25
REP dizileri ilk olarak Escherichia coli and Salmonella genomlarında tespit edilmiştir. REP elementleri genellikle 33-40 baz çifti uzunluğundadır ve her genomda yaklaşık 500-1000 kopya bulunmaktadır. BOX dizileri ise yaklaşık 154 baz çifti uzunluğundadır ve ilk olarak Gram pozitif bakterilerden S.pneumonia da saptanmıştır. ERIC dizilerinin fonksiyonu tam olarak bilinmemekle birlikte kromozomal organizasyonda yer aldıkları düşünülmektedir. ERIC dizileri genellikle 124-127 baz çifti uzunluğundadır ve her genomda yaklaşık 30-150 kopya bulunmaktadır. ERIC dizileri REP dizilerine oranla daha karmaşık profiller oluşturmalarına rağmen kontaminantlara daha duyarlıdırlar. ERIC dizilerinden kaynaklanan primerlerle yapılan PZR kolay uygulanabilmesi, çok sayıda izolat ile çalışılabilmesi, ayırt ediciliğinin yüksek olması nedeniyle en yaygın kullanılan moleküler tiplendirme yöntemlerinden biridir 35,52,55,56. Rep-PZR; kültürden olduğu gibi direkt klinik örneklerden yapılan DNA ekstraksiyon ürünleriyle de çalışılabilir. Tekrarlanan elementlerin dizilimlerin ve kullanılacak primerlerin baz diziliminin bilinmesi zorunlu değildir. Sıklıkla tek bir primer seti kullanılarak Gram-negatif ve Gram-pozitif birçok bakteride tiplendirmeyi sağlayacak yeterlikte bant profili oluşturulmaktadır. Bu üçlü tekrarlayan bölgenin primerleri kombine halde de kullanılmaktadır. Rep-PZR bir çok Enterobacteriaceae üyesi, Burkholderia cepacia, L.pneumophilia, H.pylori, Neisseria spp., ve Pseudomonas aeruginosa suşlarının alt tiplendirilmesinde başarıyla kullanılmıştır 51. Rep-PZR, AFLP gibi moleküler tiplendirme yoluyla suşlar arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmada en sık kullanılan PZR temelli tipleme yöntemlerindendir 35,51,52,57. 26
Şekil 1: Rep-PZR şeması 2.6. Moleküler tiplendirme yöntemlerinde sonuçların değerlendirilmesi Moleküler tiplendirme yöntemlerinin altın standardı olarak kabul edilen PFGE nin sonuçlarının değelendirilmesinde Tenover tarafından önerilenn kriterler araştırmacıların çoğunluğu tarafından kabul görmektedir. Tenover kriterlerine göre aynı sayı ve boyutlardaa bant içeren izolatlar genetik olarak farksız kabul edilir. İki veya üç bant farkı olan izolatlar yakın ilişkili, dört veya altı bant farkı olanlar muhtemel ilişkili ve yedi ve üzeri bant farklılıklarına sahip izolatlar ilişkisiz olarak kabul edilmektedir 44. Bununla birlikte AP-PZR farklılıklarının spesifik genetik olaylarla sıkı ilişkide olmamasından dolayı AP-PZR sonuçlarının yorumlanmasında bazen zorluklar ortaya çıkmaktadır. Bu nedenle 27
araştırmacılar tarafından ortak olarak kullanılan tipik kurallar bulunmamaktadır 2,15,58,59. Eğer tiplendirilen suşlar tıpatıp aynı bant paternlerine sahipse ya da üç veya daha fazla bant faklılığına sahip paternler gözleniyor ise yorumlama daha kolaylaşır ve sırasıyla ya klonal ilişkili ya da ilişkisiz olarak adlandırılır. Fakat tek bir bantın büyüklüğündeki bir değişikliği ya da birkaç bantın yoğunluğundaki farkı yorumlamada bir kriter bulunmamaktadır. Salgın sırasında izole edilen suşlar arasında bir veya iki bant farklılığının olduğu durumlarda testlerin farklı primerlerle yeniden tekrarlanması uygun görülmektedir 60. Yakın geçmişte moleküler biyolojideki gelişmeler, çok sayıda DNA temelli tiplendirme yönteminin enfeksiyon hastalıklarının epidemiyolojisinde kullanıma girmesiyle sonuçlanmıştır. Günümüzde moleküler yöntemleri kullanacak olan araştırmacılar, laboratuvar ve klinik çalışmaların her ikisinin de beklentilerini karşılayacak uygulanabilir yöntemleri seçmek durumundadır. Bu nedenle seçtikleri yöntemin mümkün olduğunca geniş mikroorganizma grubuna uygulanabilecek olması, yüksek ayrım gücüne sahip olması, tekrarlanabilir olması, laboratuvar koşullarında kurulması, uygulanması ve devam ettirilebilirliğinin kolay olması, kullanılan malzeme ve cihazların maliyetinin düşük olmasına dikkat etmelidirler. 28
3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Gereçler 3.1.1. Besiyerleri %5 koyun kanlı agar (OR-BAK, Türkiye) Eosin Metilen Blue Agar (EMB) (Oxoid, İngiltere) Mueller Hinton Agar (MHA) (Oxoid, İngiltere) Stuart taşıyıcı besiyeri ve eküvyon (CITOSWAB, Çin) 3.1.2. Kimyasal bileşikler Tris base (Amresco, ABD) Borik asit (Scharlau, İspanya) Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) (Applichem, Almanya) MgCl 2 (Bioron, Almanya) dntp (Bioron, Almanya) ERIC-1 Primer (BioBasic, Kanada) Tampon (Bioron, Almanya) Taq Polimeraz enzimi (Bioron, Almanya) Agaroz (Sigma, ABD) Etidyum Bromid (Sigma, ABD) 29
Orange G, (Fluka, Almanya) 3.1.3. Cihazlar Microbank system (Pro-Lab, Kanada) Otoklav (Sanyo, Japonya) Etüv (Nüve, Türkiye) (Siemens, Almanya) Otomatik bakteri tanımlayıcı MicroScan autoscan-4 Hassas Terazi (Schimadzu, Japonya) Pastör Fırını (Electro-mag, Türkiye) Vorteks (MS2 Minishaker, IKA) Mikropipetler (Eppendorf Research, Almanya) Biosystems, ABD) Isı döngü aleti (GeneAmp PZR System 9700, Applied Soğutmalı mikrosantrifüj (Hettich, Almanya) Yatay elektroforez Jel Görüntüleme sistemi (Syngene, Ingenius, ABD) -30 0 C derin dondurucu (Uğur, Türkiye) -80 0 C derin dondurucu (Nuaire, Japonya) Kuru Blok Termostat (Biosan, ABD) 30
Spektrofotometre (Nanodrop, USA) 3.2. Yöntem 3.2.1. Örneklerin Toplanması Ocak 2010 Ağustos 2011 tarihleri arasında Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Hastalıkları Yoğun Bakım (ÇHYB), Genel Cerrahi Yoğun Bakım (GCYB), Anestezi ve Reanimasyon Yoğun Bakım (ARYB), İç Hastalıkları Yoğun Bakım (İHYB), Beyin Cerrahisi Yoğun Bakım (BCYB), Nöroloji Yoğun Bakım (NLYB) ve Göğüs Hastalıkları Yoğun Bakım (GHYB) ünitelerinde yatan ve hastane enfeksiyonu tanısı alan hastaların çeşitli klinik örneklerinden izole edilen 50 Pseudomonas aeruginosa suşu çalışmaya dahil edilmiştir. Nisan 2011 tarihinde P.aeruginosa suşlarının çevresel kaynaklarının belirlenmesi için ARYB, BCYB, ÇHYB, GCYB, GHYB, İHYB, NLYB, Yenidoğan Yoğun Bakım (YDYB) ve Kemik İliği Transplantasyon (KİT) ünitelerindeki, lavabolar, sabunluklar, musluk başlıkları ve musluk ağızları gibi ıslak yüzeyler ve mikroorganizmanın yerleşebileceği hasta ve hemşire masaları gibi kuru yüzeylerden toplam 92 örnek toplanmıştır. Çevresel sürüntü örnekleri steril eküvyonla alındıktan sonra Stuart taşıyıcı besiyeri içinde en kısa sürede Gazi Üniversitesi Hastanesi Mikrobiyoloji laboratuvarına ulaştırılmıştır ( Şekil 2). 31
Musluk başlığı Musluk ağzı Lavabo Şekil 2:Çevresel sürüntü örneklerinin alındığı bölgeler duyarlılık testleri 3.2.2. Bakterilerin tanımlanması ve antibiyotik Çevresel sürüntü örnekleri ve klinik örnekler mikrobiyoloji laboratuvarına ulaştırıldıktan sonra bekletilmeden %5 koyun kanlı agar ve Eosin Metilen Blue (EMB) agara ekimleri yapılmış ve 37 0 C de 24-48 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası üreme olan plaklardaki bakteri kolonileri değerlendirilmeye alınmıştır. EMB ve kanlı agardaki koloni morfolojileri, kanlı agarda hemoliz oluşturma, pigment oluşturma, Gram boyama ve %3 lük potasyum hidroksit testleri değerlendirildikten sonra Gram negatif basil olduğu saptanan izolatlar oksidaz testine alınmıştır. Oksidaz reaksiyonu olumlu bulunan suşlar indol üretimi, nitrat reduksiyonu, glukoz, sukroz, laktoz fermentasyon aktiviteleri, üreaz üretimi gibi klasik mikrobiyolojik yöntemlerle değerlendirildikten sonra otomatik 32
tanımlama cihazı (MicroScan autoscan-4, Almanya) ile tür düzeyinde tiplendirilmiş ve antibiyotik duyarlılık testleri yapılmıştır 61. Pseudomonas aeruginosa olarak tanımlanan izolatlar daha sonra PZR testinde kullanılmak üzere microbank içinde içinde - 80 0 C de derin dondurucuda saklanmıştır. 3.2.3. Rep-PZR yöntemi ile klonal ilişkinin saptanması Hastalardan ve çevreden izole edilen P.aeruginosa suşlarının arasındaki klonal ilişkinin saptanması için ERIC-1 primeri ile Rep PZR yöntemi kullanılmıştır. Rep-PZR için DNA eldesi Çalışmaya alınan bakterilerden DNA eldesi için - 80 0 C de dondurucuda saklanan bakteri stokları bir gün önce Mueller Hinton agar besiyerine pasajlanarak canlandırılmıştır. Ticari olarak sağlanan DNA izolasyon kiti (Invitek, Almanya) ile üreticinin talimatları doğrultusunda DNA elde edilmiştir. DNA elde edilmesi sırasında kısaca aşağıdaki aşamalar uygulanmıştır. 1- Isıtıcılı kuru blokta lizis aşaması : Taze pasajları yapılan Pseudomonas aeruginosa kolonileri steril öze ile toplanarak 400 µl Resuspension Buffer R içinde ezilerek ependorf tüpte süspanse edilmiştir. Süspansiyonlar Extraction Tube L ye aktarıldıktan sonra vortekslenmiş ve 65 0 C de ısıtıcılı kuru blokta 10 dk inkübe edilmiştir. Bu inkubasyon süresi sonunda örnekler 95 0 C de 5 dk. inkübe edilmiştir. Lizis etkinliğini arttırmak amacıyla tüpler birkaç kez vortekslenmiştir. 33
2- Optimal bağlanma aşamasının gerçekleştirilmesi :Ependorf tüplere 400 µl Binding Buffer B6 eklenip vortekslenmiştir. 3- Spin Filter yüzeyine DNA nın bağlanması : Ependorf tüplerdeki örnekler RTA Spin Filter setine aktarılmıştır. Oda ısında 1 dk. inkübe edildikten sonra örnekler 12.000 rpm de 1 dk. santrifüj edilmiştir. RTA Spin Filter setindeki filtre RTA Receiver Tube e aktarılmıştır. 4- Yıkama işlemi: Örnekler 500 µl Wash Buffer I eklendikten sonra 10.000 rpm de 1dk. santrifüj edilmiştir. Daha sonra filtre başka bir RTA Spin Filter setine aktarılıp üzerine 700 µl Wash Buffer II eklenerek 10.000 rpm de 1dk. santrifüj edilmiştir. Filtre yeni bir RTA Spin Filter setine aktarılmış ve 14.000 rpm de 3dk. santrifüj edilmiştir. 5- DNA elüsyon aşaması : Santrifüj edilen filtreler yeni bir ependorf tüpüne aktarıldıktan sonra üzerine ısıtılmış Elution Buffer D den 200 µl eklenmiş ve 8000 rpm de 1 dk. santrifüj edilmiştir. Filtre atılarak altta kalan sıvı kısım kullanılmıştır. 6- DNA ölçüm aşaması :Elde edilen DNA lar spektrofotometre cihazı kullanılarak ölçülerek mikrolitredeki mikrogram değerleri belirlenmiş ve konsantrasyonları 25 ng/µl olacak şekilde ayarlandıktan sonra polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirilinceye kadar - 30 0 C de dondurucuda saklanmıştır. 34
Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile klonal yakınlık saptanması Enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) dizilerine özgü ERIC 1R (5 -TGT AAG CTC CTG GGG ATT CAC-3 ) primeri kullanılarak Rep-PZR yapılmıştır 15. ERIC 1R primerinin hazırlanması Ticari olarak sağlanan liyofilize ERIC 1R primeri önce 100 pm lük konsantrasyon elde edilecek şekilde steril deiyonize su ile çözülmüştür. Daha sonra amplifikasyon reaksiyonunda kullanılmak üzere tekrar sulandırılarak 20 pm luk konsantrasyonlar elde edilmiş, ependorflara paylaştırılmış ve kullanıma kadar - 30 0 C de dondurucuda saklanmıştır. Amplifikasyon karışımına eklenmeden hemen önce oda ısısına getirilerek kullanılmıştır. Taq Polimeraz Kullanıma hazır olarak sağlanan ve konsantrasyonu 5 U/µl olan Taq polimeraz enzimi - 30 0 C de saklanmıştır. dntp Karışımı (datp, dctp, dttp, dgtp) Her biri 100 mm konsantrasyonda hazır çözelti olarak satın alınan dntp ler karıştırılarak son konsantrasyonları 2 mm olması sağlanmış, küçük hacimlerde ependorflara paylaştırıldıktan sonra -30 0 C de dondurucuda saklanmıştır. 35
MgCl 2 Solüsyonu Kullanıma hazır olarak sağlanan 25 mm konsantrasyondaki MgCl 2 solüsyonu, son konsantrasyonu 2 mm olacak şekilde uygun miktarda reaksiyon karışımına eklenmiştir. Amplifikasyon reaksiyon karışımı (25 µl) içinde, 1X Tampon (MgCl 2 'süz) (2,5 µl); 2 mm MgCI 2 (2 µl); 2,5 mm dntp (2 µl); ERIC-1R primeri (1,25 µl), 5 U/µl Taq polimeraz (0,376 µl) ve11,876 µl steril deiyionize su içerir. Toplam karışım 20 µl olacak şekilde ependorflara dağıtım yapılmışve her bir örneğe 5 µl DNA (25 ng/ml) eklenmiştir (Tablo 4). Tablo 4 : PZR amplifikasyon reaksiyon karışımı Reaksiyon karışımı 25µl 10XPZR tamponu 1X 2,5 µl 25 mm MgCl2 2 mm 2 µl 10 mm dntp karısımı 2 mm 2 µl Taq Polimeraz 5 U/µl 0,376 µl Steril deiyonize su - 11,876 µl DNA ekstraktı 25 ng/ml 5 µl ERIC-1R 20 pm 1,25 µl 36
programı uygulanmıştır: Reaksiyon karışımına daha sonra aşağıdaki amplifikasyon 94 o C de 5 dakika lizis ve denatürasyon 1 döngü 95 0 C de 30 saniye denatürasyon 37 0 C de 1 dakika primer bağlanması 4 döngü 72 0 C de 2 dakika primer uzaması 94 0 C de 30 saniye denatürasyon 60 0 C de 1 dakika primer bağlanması 35 döngü 72 0 C de 2 dakika primer uzaması 72 0 C'de 5 dakika 1 döngü Amplifikasyon ürünlerinin değerlendirilmesi Amplifikasyondan sonra PZR ürünlerini görüntülemek için %2 lik agaroz jelde Tris Borik Asit EDTA (TBE) tamponu içerisinde DNA elektroforezi gerçekleştirilmiştir. TBE tamponunun hazırlanması 5X stok TBE tamponu; 800 ml distile suda 54 gr Tris-base, 27.5 gr borik asit, 20 ml EDTA (ph:8.0) çözülerek distile su ile bir litreye tamamlanmıştır. Bu çözelti 5 kat distile su ile sulandırılarak 1X TBE tamponu elde edilmiştir. 37
%2 lik agaroz jelin hazırlanması 75 ml 1X TBE tamponu içerisine 1,5 gr agar (Oxoid, İngiltere) eklendikten sonra mikrodalga fırında ısıtılarak agar eritilmiştir. Daha sonra 55 0 C'ye soğutulan agaroz 20x20 cm boyutunda tabaklara dökülerek oda ısısında bekletilerek katılaşması sağlanmıştır ve 1X TBE tamponu ile doldurulmuş elektroforez tankına alınmıştır. Elektroforez Elektroforez için 6X konsantrasyonunda %0.25 mg/ml Orange G (Amresco, ABD), %30 gliserol içeren yükleme tamponundan 5µl alınarak 8 µl amplifikasyon ürünü karıştırıldı ve jel içindeki kuyucuklara yüklenmiştir. Jel üzerindeki ilk ve son kuyucuklara görüntülenen bantların yerlerinin saptanması amacıyla 8 µl DNA moleküler ağırlık standardı (Seegene, Kore) yüklenmiştir. Elektroforez işlemi 120 volt ta 90 dakika süreyle gerçekleştirilmiştir. Elektroforez sonrası jel 5 µg/ml etidyum bromür (Amresco, ABD) içeren solüsyonda 20 dakika boyandıktan sonra UV ışığı altında DNA bant görüntülerinin fotoğrafları çekilerek TIFF formatında kaydedilmiştir. Sonuçların analizi Gel Compar II (version 6.0;Applied Maths, Sint-Martens- Latem, Belgium) programı kullanılarak bant profilleri analiz edilmiştir. Benzer genotiplerin belirlenmesi için Dice benzerlik katsayısı kullanılarak UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean) kümeleşme analizi yapılmıştır. Benzerlik katsayısının hesaplanmasında bant ve profil toleransı, %1-1.5 olarak alınmıştır. Benzerlik katsayısı % 38
70 in altı olan izolatlar ayrı genotip, benzerlik katsayısı %70-90 arası olanlar alt tip, %95-100 olanlar aynı genotip olarak değerlendirilmiştir 58,62. 39
4. BULGULAR 4.1. Epidemiyolojik bilgiler Ocak 2010 Ağustos 2011 tarihleri arasında Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi yoğun bakımlarından izole edilen hastane enfeksiyonu etkeni 50 klinik Pseudomonas aeruginosa izolatının örnek tiplerine, izole edildikleri bölümlere göre dağılımı ve dağılım oranları tablo 5 ve şekil 2 de sunulmuştur. tiplerine göre dağılım Tablo 5 : P.aeruginosa suşlarının izole edildikleri bölüm ve örnek Örnek ARYB BCYB ÇHYB GCYB GHYB İHYB NLYB Toplam n(%) ETA* 6 4 10 0 3 6 6 35(70) İdrar 1 0 1 1 3 0 1 7(14) Kan 1 0 1 0 0 0 0 2(4) Periton 0 0 0 2 0 0 0 2(4) BAL 0 0 0 0 1 0 0 1(2) Balgam 0 0 0 0 1 2 0 3(6) Toplam (%) 7(14) 4(8) 12(24) 3(6) 8(16) 8(16) 7(14) 50(100) ETA* : Endotrakeal aspirat BAL* : Bronkoalveolar lavaj 40
P.aeruginosa 14% 16% ARYB 16% 8% BCYB ÇHYB 16% 6% 24% GCYB GHYB İHYB NLYB Şekil 3: P.aeruginosa suslarının izole edildikleri bölümler ve oranları Nisan 2011 tarihinde yoğun bakımlardan toplanan 92 adet çevresel örnekten GCYB ünitesinde bir adet musluk başlığıı ve bir adet lavabodan, ÇHYB ünitesinde bir adet musluk ağzındann ve ARYB ünitesinde bir adet lavabodan toplam dört adet P.aeruginosaa suşu izole edilmiştir. Çevresel örneklerin toplandıkları yoğun bakım üniteleri ve alındıkları yüzeyleree göre dağılımı tablo 6 da sunulmuştur. Pseudomonas aeruginosa izole edilen hastaların 26 (%52) sı erkek ve 24 (%48) ü kadındı. Hastaların 12( % 24) si çocuk, 38(%76) sı erişkin yaş grubuna aitti. Hastaların yaşları 0-86 arasında değişmektedir. 41
Tablo 6 : Çevresel örneklerin toplandıkları yoğun bakım üniteleri ve alındıkları yüzeylere göre dağılımı ARYB BCYB ÇHYB GCYB GHYB İHYB KİT NLYB YDYB Toplam Musluk başlığı 3 4 2 2 2 2 0 3 2 20 Musluk ağzı 3 4 2 2 2 2 2 3 2 22 Lavabo 3 4 2 2 2 2 2 3 2 22 Sabunluk 2 1 3 0 0 0 2 0 0 8 Hemşire masası 1 2 1 1 1 1 0 1 1 9 Hasta masası 3 2 1 2 1 1 0 1 0 11 Toplam 15 17 11 9 8 8 6 11 7 92 4.2. Antibiyotik duyarlılık testleri sonuçları Çalışmaya alınan klinik izolatlara ait antibiyotik duyarlılık oranları tablo 7 de, çevresel suşlara ait antibiyotik duyarlılık oranları tablo 8 da verilmiştir. 42
Tablo 7: Klinik suşların antibiyotik duyarlılık oranları (n:50) Antibiyotikler Yüzde (%) Duyarlı Orta Duyarlı Dirençli Amikasin 82 6 12 Gentamisin 62 12 26 Tobramisin 74 0 26 Aztreonam 0 2 98 Seftriakson 0 0 100 Seftazidim 0 0 100 Sefotaksim 0 0 100 Sefepim 0 2 98 TZP 0 0 100 Siprofloksasin 64 6 30 Levofloksasin 62 8 30 İmipenem 62 4 34 Meropenem 66 0 34 43
Tablo 8 : Çevresel suşların antibiyotik duyarlılık oranları (n:4) Antibiyotikler (%) Duyarlı Orta Duyarlı Dirençli Amikasin 50 25 25 Gentamisin 50 0 50 Tobramisin 50 0 25 Aztreonam 0 25 75 Seftriakson 0 0 100 Seftazidim 0 0 100 Sefotaksim 0 0 100 Sefepim 0 25 75 TZP 0 0 100 Siprofloksasin 50 25 25 Levofloksasin 50 25 25 İmipenem 75 0 25 Meropenem 75 0 25 44
4.3. Rep PZR sonuçları ve kümeleşme analizi Çalışmaya alınan 54 P.aeruginosa suşu Rep-PZR ile analiz edildi. Resim 1 de çalışmamıza ait 12 örneğin jel görüntüsü verilmiştir. Resim 1: P.aeruginosa suşlarının Rep-PZR jel Görüntüsü Rep-PZR ile tiplendirmeye alınan 54 suşun iki tanesinden sonuç alınamamıştır. Bu iki suş aynı protokol ile dört kez çalışılmasına rağmen DNA bantları gözlenememiştir. Bu suşlar kümeleşme analizinde değerlendirilmeye alınmamıştır. Rep-PZR yöntemi ile tiplendirilen 52 suşa ait dendogram ve kümeleşme analizi sonuçları şekil 4 ve şekil 5 te sunulmuştur. 45