I. SINIF TIBBİ MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR FÖYLERİ

I. SINIF TIBBİ MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR FÖYLERİ 2014-2015

Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-1 Mikrobiyoloji Laboratuvarında Kullanılan Araç ve Gereçler Dersin Amacı Dersin Hedefleri Bilgi Tutum Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan araç ve gereçlerin tanıtılması ve kullanım amaçlarının öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan araç ve gereçleri sıralar. Bu araç ve gereçlerin ne amaçla kullanıldığını açıklar. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan araç ve gereçler Giriş Mikrobiyoloji Laboratuvarlarında en sık kullanılan araç ve gereçler aşağıda sıralanmıştır. 1. Deney tüpleri: Serolojik deneyler, besiyeri hazırlanması, santrifüj ve çeşitli amaçlar için kullanılan farklı boyut ve hacimlerde olan silindir şeklinde cam veya ısıya dayanıklı plastikten yapılmış malzemelerdir. Şekil 1-1. Tüpler 2. Plastik santrifüj tüpleri: 1.5, 2, 15, 50ml hacimlere sahip kapaklı tüplerdir. Şekil 1-2. Plastik santrifüj tüpleri 1

3. Pipet: Çeşitli boyutlarda ve kapasitede olan, istenilen miktarda sıvıyı alarak başka bir yere aktarmada kullanılan, ince, uzun, üzeri dereceli silindir şeklinde malzemelerdir. Şekil 1-3. Pipet 4. Otomatik pipetler: Özellikle mikro yöntemlerle çalışıldığında çok küçük hacimleri aktarmaya ve dağıtmaya yarayan pipetlerdir. Şekil 1-4. Otomatik pipetler 5. Otomatik pipet ucu: Az miktarda sıvı aktarımında kullanılan plastik uçlardır. Şekil 1-5. Otomatik pipet uçları 6. Mezür: Çeşitli boyut ve hacimlerde olan silindir şeklinde üzeri dereceli cam veya plastikten yapılmış kaplardır. Sıvı maddelerin ölçümünde kullanılır. Şekil 1-6. Mezürler 2

7. Pastör pipeti: Az miktarda sıvı aktarımında kullanılan, uç kısmı ince cam veya plastik pipetlerdir. Şekil 1-7. Pastör pipeti 8. Balon: Geniş küre şeklinde gövdesi ve dar silindir şeklinde boynu bulunan, tabanı düz cam malzemelerdir. Çeşitli hacimlerde olabilir. Besiyeri ve çözeltilerin hazırlanmasında kullanılır. Şekil 1-8. Çeşitli boyutlardaki balonlar 9. Beher: Silindir şeklinde, su bardağını andıran, çeşitli hacimlerde olabilen cam veya plastik kaplardır. Şekil 1-9. Çeşitli boyutlardaki beherler 10. Erlenmayer: Kısa silindir şeklinde boynu, koni şeklinde gövdesi olan geniş ve düz tabanlı cam malzemelerdir. Çeşitli hacimlerde olabilir. Şekil 1-10. Çeşitli boyutlardaki erlenmayerler 3

11. Şişeler: Çeşitli boyut ve hacimlerde olabilen ve çeşitli amaçlarla kullanılabilen cam malzemelerdir (örneğin damlalıklı şişe, hemokültür şişeleri, koyu renkli şişeler,...) Şekil 1-11. Çeşitli boyutlardaki şişeler 12. Tüp Taşıyıcıları (sporlar): Çeşitli büyüklükteki tüpleri taşımaya yarayan araçlardır. Şekil 1-12. Tüp taşıyıcıları (sporlar) 13. Eküvyon çubuğu (Silgiç): Uçlarına su emici (hidrofil) pamuk sarılmış steril çubuklardır. Çeşitli vücut bölgelerinden inceleme örneklerinin alınması ve bazı ekimlerin yapılmasında kullanılır. 14. Eküvyonlu Tüp: Genellikle inceleme örneği alınmasında kullanılan, içerisinde tek bir eküvyon bulunan steril tüplerdir. Şekil 1-13. Eküvyon çubuğu ve eküvyonlu tüp 15. Özeler: Daha çok sıvı ortamlardan örnek alıp ekim yapmaya yarayan aletlerdir. Uç kısmı platin veya tungsten gibi kolay ısınıp soğuyan ve oksitlenmeyen telden yapılmış ya da tek kullanımlık steril plastik malzemelerdir. Genellikle ucu halka şeklindedir. Standart bakteriyolojik öze 0,01ml sıvı alır. Ucunda halkalı tel yerine düz tel bulunan, batırma kültürü yapmaya, tek koloniden örnek almaya ve katı ortamlardan örnek alıp aktarmaya 4

yarayan iğne özeler, genellikle mantar ekimlerinde kullanılan ve ucu L şeklinde kıvrılmış olan çengel özeler de mikrobiyolojide sıkça kullanılan malzemelerdir. Şekil 1-14. Plastik ve metal uçlu özeler 16. Petri kutuları: Katı besiyeri hazırlanmasında ve antibiyogram yapılmasında kullanılan geniş yuvarlak, yaklaşık 2cm derinlikte, birbirine geçen kapak ve alt kısımdan oluşan cam veya plastik malzemelerdir. Şekil 1-15. Petri kutusu 17. Lam: Direkt inceleme ve boyama için preparat hazırlanmasında kullanılan dikdörtgen şeklinde ince camlardır. 18. Lamel: Genellikle 2x2 cm boyutlarında çok ince camdan yapılmış malzemelerdir. Çeşitli amaçla kullanılabilen farklı şekilleri de olabilir. Şekil 1-16. Lam ve lameller 19. Şale: İçerisinde boyanacak preparatların (lamların) tek tek yerleştirilebildiği camdan yapılmış özel boya kaplarıdır. Şekil 1-17. Şale 5

20. Gram Boyama Seti: Gram boyamada kullanılan boyaları içeren boya setidir. Şekil 1-18. Gram boyama seti 21. Anaerobik Kavanoz: Anaerobik ve mikroaerofilik bakterilerin üretilmesinde kullanılır. Şekil 1-19. Anaerobik kavanoz 22. Desikatör: Maddelerin nem almasını önleyen, katı maddelerin kurutulması ya da besiyerlerinin mikroaerofilik ya da anaerobik ortamda inkübe edilmesini sağlayan camdan yapılmış kapağı bulunan bir nevi kavanozdur. Şekil 1-20. Desikatör 23. Manyetik karıştırıcı ve ısıtıcı: Çözeltileri homojen şekilde karıştırmaya yarayan alettir. Şekil 1-21. Manyetik karıştırıcı ve ısıtıcı 6

24. Vorteks: Deney tüpü içerisindeki sıvıyı girdaplayarak homojen bir şekilde karıştırmaya yarayan alettir. Şekil 1-22. Vorteks 25. Etüv: Mikroorganizmaların üretilmesi için kullanılan, istenilen ısıya ayarlanabilen, sıcak hava dolaplarıdır. Şekil 1-23. Etüv 26. Santrifüjler: Tüp içerisinde bulunan yoğunlukları farklı maddeleri birbirinden ayırma amacı ile kullanılan cihazlardır. Şekil 1-24. Santrifüj 27. ph metre: ph değerlerinin ölçülmesinde kullanılan aletlerdir. Şekil 1-25. ph metre 7

28. Güvenlik kabineti: Çalışan kişiyi ve çalışılan örneği korumaya yarayan çalışma ortamlarıdır. Şekil 1-26. Güvenlik kabineti 29. Distile Su Cihazı: Saf (distile) su elde edilmesinde kullanılır. Şekil 1-27. Distile su cihazı 30. Hassas Terazi: Çok küçük miktarlardaki maddelerin ölçümlerini yapılabilen terazidir. Şekil 1-28. Hassas terazi 31. Hücre kültür malzemeleri: Hücre kültürü yapılırken kullanılan pleytler, flasklar gibi malzemelerdir. Şekil 1-29. Hücre kültür malzemeleri 8

32. Thermocycler: Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) işleminde denaturation, annealing (primerlerin bağlanması) ve extention (zincirin uzaması) aşamalarını otomatik olarak yürütebilen programlanabilir bir cihazdır. Şekil 1-30. Thermocycler cihazları 33. UV illuminatör ve kamera: Floresan boyalı ürünlerin görüntülenmesini sağlar. Şekil 1-31. UV illuminatör 34. Elektroforez tankı ve güç kaynağı: Agaroz veya poliakrilamit jellerine yüklenen ürünlerin elektroforetik yüklerine göre ayrıştırılmasına olanak sağlayan bir sistemdir. Şekil 1-32. Elektroforez tankı 35. Buzdolabı ve Derin Dondurucular: Buzdolabı ısıya dayanıksız hasta örneklerinin, besiyerlerinin ve bazı kimyasal maddelerin muhafaza edildiği dolaplardır. Derin dondurucular ise dondurularak muhafaza edilmesi gereken malzemelerin ve mikroorganizmaların uzun süre saklanması için kullanılır. 9

36. Pastör Fırını: Yüksek sıcaklıklara dayanabilen malzeme ve gereçlerin kuru sıcak hava ile sterilizasyonlarında kullanılır. Şekil 1-33. Pastör fırını 37. Bek: LPG ile çalışan, küçük ocaklar olup, yakma, alevden geçirme ve steril alan sağlamada kullanılır. Şekil 1-34. Bek 38. Filtreler: Çeşitli sıvı maddelerin süzülerek steril edilmesinde kullanılan aletlerdir. Şekil 1-35. Filtre 39. Otoklav: Basınçlı buharla sterilizasyon yapmaya yarayan bir cihazdır. Şekil 1-36. Otoklav 10

40. Benmari: İstenilen ayardaki ısı derecelerinde sıcak su elde etmeğe ve suyu bu derecelerde sabit tutmaya yarayan aletlerdir. Şekil 1-37. Benmari 41. Ultraviyole Lambası: Oda havasının ve yüzeylerin sterilizasyonunda kullanılan ultraviyole ışını salan lamba sistemidir. Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Laboratuvarda gösterilen alet ve malzemeleri inceleyiniz. Kaynaklar 1. Bilgehan H (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir. 11

Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-2 Mikrobiyolojik Tanı Yöntemleri-1 A-Mikrobiyolojide Kullanılan Besiyerleri ve Ekim Yöntemleri Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Mikrobiyolojide kullanılan besiyerlerinin öğrenilmesi Besiyerlerine ekim yöntemlerinin öğrenilmesi Bakterilerin besiyerlerinde oluşturdukları koloni tiplerinin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Besiyerlerinin adlarını sayar. Besiyerlerinin hazırlanmasında kullanılan temel maddeleri sayar. Besiyerlerinin özelliklerini açıklar. Besiyerlerini kullanım amaçlarına göre gruplandırır. Besiyerlerini fiziksel özelliklerine göre sınıflandırır. Ekim yöntemlerini sıralar. Koloni tiplerini özellikleri ile birlikte sıralar. Besiyerlerini tanıyıp ayırır. Ekim yöntemlerini uygular. Koloni tiplerini değerlendirir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Temel ya da basit besiyeri Zenginleştirilmiş besiyeri (Kanlı agar, Çikolatamsı agar) Özgül besiyeri (Lowenstein-Jensen besiyeri) Seçici besiyeri (Selenit F besiyeri) Ayırıcı besiyeri (EMB agar, Kanlı agar) Ayıraçlı besiyeri (Şekerli besiyerleri, Fenol kırmızılı besiyerleri) Öze Eküvyonlu çubuk Pipet Tüpte sıvı besiyeri Tüpte yatık katı besiyeri Tüpte dik hazırlanmış katı besiyeri Anaerobik kavanoz S tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü R tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü M tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü 12

Giriş Mikroorganizmaların laboratuvar şartlarında üretilmeleri, saf olarak elde edilmeleri, çeşitli özelliklerinin incelenmesi, biyolojik ve metabolik ürünlerinin elde edilmesi için besiyeri adı verilen çeşitli besleyici ortamlar kullanılır. Besiyerlerinde hidrojen alıcı ve verici maddeler, karbon kaynağı, azot kaynağı ve mineraller üretilecek mikroorganizmanın ihtiyacı olduğu kadar mevcut olmalıdır. Besiyerlerinin Hazırlanmasında Kullanılan Temel Maddeler Su: Besiyeri hazırlanırken distile (saf) su ya da deiyonize su kullanılmalıdır. Peptonlar: Çeşitli proteinlerin pepsin, tripsin, papain gibi enzimlerle hidrolize edilmeleri sonucunda suda kolayca eriyebilen ve ısıtıldığında yeniden koagüle olmayan polipeptid, dipeptid ve aminoasit gibi maddelerden oluşur. Besiyerine eklenen bu maddelerin karışımı bakteriler tarafından azot kaynağı olarak kullanılır. Kimyasal maddeler ve tuzlar: Besiyerine eklenecek olan maddeler kimyasal olarak saf olmalıdır. Bu maddeler uygun çözücülerde çözülerek besiyerine eklenir. Kan: Besiyerlerinin zenginleştirilmesi amacıyla tavşan, koyun veya at kanı kullanılabilir. Besiyerine eklenecek olan kanlar steril ve pıhtılaşmamış olmalıdır. Serum: Koyun, tavşan, at gibi hayvanlardan steril olarak alınan kan 750 xg de 5 dakika santrifüj edilerek serum kısmı ayrılır ve buzdolabında saklanarak kullanılır. Haben sıvısı: Sirozlu hastaların periton boşluğunda toplanan sıvıdır. Steril şartlarda toplanır ve buzdolabında saklanır. Maya özütü: Çeşitli vitaminler ve aminoasitler içerdiğinden zenginleştirici olarak kullanılır. Mikroorganizmaların Laboratuvarda üretilebilecekleri besleyici ortamlar iki çeşittir. A-Canlı ortamlar 1. Embriyonlu yumurta 2. Hücre kültürleri 3. Deney hayvanları B-Cansız ortamlar Besiyerlerinin Sınıflandırılması Besiyerleri biçimlerine göre katı, sıvı, yarı katı ve yarı sıvı besiyerleri olarak ayrılırlar. Besiyerlerinin katılaştırılmasında en çok kullanılan madde agar-agar'dır. Bir çeşit deniz yosunundan elde edilen bu maddeyi mikroorganizmaların çoğu parçalayamaz. Bu madde yaklaşık 42 C'de donar ve mikroorganizmaların üretilme derecelerinde erimez. Agarın %1.5-3 oranlarında sıvı ortamlara katılması ile katı besiyerleri, %0.3-0.5 oranlarında kullanılması ile yarı katı besiyerleri elde edilebilir. Kullanılış amaçlarına ve kimyasal yapılarına göre başlıca besiyeri grupları şunlardır: 13

1-Kimyasal Yapıları Bilinen Sentetik Besiyerleri Saf kimyasal maddelerden hazırlanırlar. Eritici olarak saf su ya da iyonsuzlaştırılmış su kullanılır. Özellikle mikroorganizmaların metabolizmalarını incelemek ve biyolojik ürünlerini saf olarak elde etmek amacıyla kullanılırlar. Sadece inorganik maddeler içerenlere basit sentetik besiyeri, buna ek olarak aminoasitler gibi organik maddeler içerenlere de kompleks sentetik besiyerleri adı verilir. 2-Genel üretim besiyerleri Güncel Laboratuvar çalışmalarında kullanılan, normal vücut florasında bulunan veya patojen özellikler gösteren mikroorganizmaların çoğunun üretilebildiği besiyerleridir. Sıvı yada katı biçimde hazırlanan bu besiyerleri üreticilik özelliklerine göre ikiye ayrılırlar. a-temel yada basit besiyerleri Bunlarda başlıca pepton+tuz (peptonlu su) ya da et suyu+pepton+tuz (buyyon) gibi maddeler ve su bulunur. Buyyona agar eklemek suretiyle elde edilen katı besiyerine jeloz adı verilir. Bu ortamlar birçok mikroorganizmanın üremesi için elverişlidir. b-zenginleştirilmiş besiyerleri Temel besiyerine kan, serum, haben sıvısı, glukoz, yumurta gibi daha besleyici maddelerin eklenmesi ile elde edilen besiyerleridir (kanlı agar, çikolatamsı agar gibi). Basit besiyerlerinde üremeyen bazı mikroorganizmalar bu besiyerlerinde üretilebilirler. Şekil 2-1. Kanlı agar Şekil 2-2. Çikolatamsı agar 3-Özel besiyerleri Üremede güçlük gösteren bazı mikroorganizmaların üretilmesi için özel olarak hazırlanan besiyerleridir. Bu besiyerlerine belirli maddeler ve ayıraçlar konularak bazı mikroorganizmaların üremeleri sağlanırken diğerlerinin üremeleri engellenmiştir. a-özgül besiyerleri Yalnız bir çeşit ya da sınırlı sayıda mikroorganizmanın üretilmesi için hazırlanan besiyerleridir. (Mycobacterium tuberculosis`in üretilmesinde kullanılan Löwenstein-Jensen besiyeri gibi). b-seçici besiyerleri Şekil 2-3. Löwenstein-Jensen besiyeri 14

Bazı mikroorganizmaların üremelerini önleyici maddeler içeren, bu suretle karışık bulundukları ortamlardan belirli mikroorganizmaların seçilerek üretilmelerini sağlayan besiyerleridir (dışkıdaki Salmonella`ların çoğaltılmasını sağlayan Selenit F besiyeri gibi). Bu besiyerleri temel ya da zenginleştirilmiş katı ya da sıvı besiyerlerine bir kısım bakterilerin üremesini önleyen antibiyotikler, kimyasal maddeler, boyalar konularak hazırlanırlar. c-ayırıcı besiyerleri İçerdikleri ayıraçlar aracılığı ile benzer bakterilerin ayrı görünümde koloniler oluşturmalarını sağlayarak karışık bakterileri birbirinden ayırmaya yarayan besiyerleridir (Laktoza etkili bakterileri etkisizlerden ayırmaya yarayan Eozin Methylene Blue (EMB) agar, hemoliz yapan ve yapmayanları ayırmada kullanılan kanlı agar gibi). Şekil 2-4. EMB besiyeri d-ayıraçlı besiyerleri Mikroorganizmaların metabolizmalarına bağlı biyokimyasal özelliklerini incelemek amacıyla besiyerlerine çesitli maddeler ve mikroorganizmaların bu maddeleri değişikliğe uğrattıklarını gösteren ayıraçlar eklenerek hazırlanan besiyerleridir (şekerli besiyerleri, fenol kırmızılı besiyerleri gibi). Ekim Yöntemleri İçerisinde mikroorganizma bulunduğu bilinen ya da mikroorganizma bulunup bulunmadığı araştırılacak olan ortamlardan ekim aletleri ile alınan örneklerin belirli kurallar çerçevesinde besiyerlerine aktarılması işlemine ekim denir. Ekimleri yapılacak örnekler ya doğrudan doğruya hastalardan alınan hastalık örnekleridir ya da daha önce üretilmiş olan bakteri kültürleridir. Ekim yapılacak materyal sıvı ise öze, pipet, eküvyonlu çubuk; katı ise öze kullanılarak ekim yapılır. Ekim yapılmadan önce ve sonra çalışılacak bankonun üzeri antiseptik eriyiklerle silinmeli ve daima güvenlik kabinetinde çalışılmalıdır. 1-Tüpte sıvı besiyerine ekim: Tüp içerisindeki besiyerine ekim yapılırken tüp eğik olarak tutulur. Ekim materyali öze ile alınmış ise öze tüpe yavaşça sokulur ve özedeki materyal bırakılır. Materyal katı ise önce öze tüp duvarına dairesel hareketlerle sürülerek daha sonra yavaşça sıvı besiyeri ile karıştırılarak ezilir. Pipetle alınan sıvı materyal besiyerine damlatılarak ekim yapılır. Eküvyonlu çubuklar besiyerine daldırılır ve tüp kenarına bastırılarak içeriğinin tüpteki besiyerine geçmesi sağlanır. 15

Şekil 2-5. Tüpteki sıvı besiyerineekim 2-Tüpte yatık katı besiyerine ekim: İğne öze ile alınan materyal hiç bir yere değdirilmeksizin tüpteki besiyerinin alt noktasına şişenin dibine 2-3 mm. mesafe kalacak kadar batırılır ve aynı doğrultuda geri çekildikten sonra besiyerinin yüzeyinde zikzaklar çizilerek yayılır. Şekil 2-6. Tüpte yatık besiyerine ekim 3-Tüpte dik hazırlanmış katı besiyerine ekim: İğne öze ile alınan materyal tüpteki besiyerinin dip kısmına şişenin dibine 2-3 mm. mesafe kalacak kadar batırılıp aynı doğrultuda çıkarılarak ekim yapılır. 4-Plak besiyerine ekim: a-tek koloni düşürmek amacıyla yapılan ekim: Bu ekim yönteminde amaç bakterilerin katı besiyerine seyreltilerek ekilmeleri, bu şekilde besiyerine tek tek düşmelerinin sağlanması ve böylece birbirinden ayrı koloniler elde edilmesidir. Bu amaçla petri kutusundaki katı besiyeri dört bölge olarak düşünülür. Öze ile alınan materyal ilk bölgede bir noktadan başlayıp sık zikzaklar çizilerek ekilir ve ikinci ekim sahasına geçilir. Birinci bölgeden ikinciye doğru daha az sıklıkta zikzaklar çizilir. Üçüncü bölgede zikzaklar daha da seyrek olmalıdır. En son dördüncü bölgede bir-iki zikzak yapılarak ekim tamamlanır. Bu ekim yönteminde, her ekim sahasına geçmeden önce besiyeri 90 derece açıyla döndürülerek yeni ekim sahasına geçilir. Her ekim sahasına geçildiğinde öze sterilize edildikten sonra veya farklı öze kullanılarak ekim yapılır. 16

Eküvyonlu çubuk ile materyal alınmış ise önce bu pamuklu çubuk ilk ekim sahasına sürülür. Daha sonra öze ile yukarıdaki işlemlere devam edilir. Şekil 2-7. Tek koloni düşürmek amacıyla yapılan ekim b-plak besiyerine yaygın ekim: Antibiyotik duyarlılık testleri, faj tiplendirme deneyleri gibi amaçlar için bakterilerin plak besiyerinin yüzeyine homojen olarak dağıtılması suretiyle yaygın ekim yapmak gerekir. Ekim yapılacak plak yüzeyine örnekten pastör pipeti ya da otomatik pipet ile birkaç damla damlatılır. Örnek eküvyonlu çubuk ya da öze yardımı ile besiyerinin ortasında bir çizgi şeklinde yayılır. Steril bir cam çubuk ya da eküvyonlu çubuk ile besiyerinin ortasına kadar sık zikzaklar çizilir. Daha sonra aynı işlem besiyerinin diğer yarısında da uygulanır. Besiyeri 90 derece çevrilerek yapılan işlemler tekrarlanır. Böylece besiyerinin her tarafına homojen olarak ekim yapılmış olur. Şekil 2-8. Plak besiyerine yaygın ekim Ekim yapılan besiyerleri üretilecek mikroorganizma için gerekli optimum sıcaklık derecelerine ayarlanmış etüvlerde ve uygun atmosferik şartlarda inkübasyona bırakılır. Aerop ve fakültatif anaerop mikroorganizmaların üretilmesinde normal atmosferik koşullar yeterlidir. Anaeroplar ve mikroaerofilik mikroorganizmaların üretilmesi için kapakları sıkıca kapatılabilen cam ya da çelik silindir seklinde kaplar (anaerobik jar) kullanılır. Ekim yapılmış plaklar bu kaplara yerleştirilir ve yanlarına özel gaz karışımı sağlayan ticari kitler koynularak ağızları kapatılır ve uygun sıcaklıktaki etüvlere yerleştirilir. 17

Koloni Tipleri S (smooth=düz) tipi koloni: En sık görülen şekildir. Yuvarlak, düz kenarlı, kabarık, düz yüzeyli, nemli ve homojen kolonilerdir. R (rough=pürtüklü) tipi koloni: S tipi koloni yapan bakterilerin eski kültürlerinde ve uygunsuz koşullarda üretimi ile meydana gelen koloniler bu tipte olabildiği gibi bazı tür bakteriler doğal olarak R tipi koloni yaparlar. Yüzeyleri buruşuk veya tanecikli, kenarları girintili ve çıkıntılı, basık görünümdedirler. S tipi koloni, R tipi koloni şekline dönerse virülansı azalır. M (mucoid) tipi koloni: Bir kısım bakterilerde hücre çeperlerinin dış tabakasında polisakkarit ve bazen polipeptid yapısında, az veya çok miktarda kapsül maddesi bulunur. Bu kapsüllü bakterilerin uygun ortamlarda (serumlu, habenli, kanlı, vs) sümüksü görünüşlü, yapışkan ve akıcı koloniler oluşturdukları görülür. Uygunsuz koşullarda bu bakteriler S tipi koloni oluştururlar. L tipi koloni: Besiyerinin dip kısmına doğru uzanan kolonilerdir. Hücre duvarını kaybeden bakteriler (L formu) bu tip koloniler oluştururlar. Şekil 2-9. S tipi koloni Şekil 2-10. R tipi koloni Şekil 2-11. M tipi koloni Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1-Besiyeri gruplarına örnek olarak getirilen besiyerlerini incelenip adlarını, besiyeri grubunu ve ne amaçla kullanıldığını yazınız. 2- Katı ve sıvı besiyerlerine verilen numunelerden uygun bir şekilde ekim yaparak yaptığınız ekimi şematize ederek çiziniz. a) Tek koloni b) Homojen ekim 18

c) Sıvı besiyerine ekim d) Yatık besiyerine ekim 4- Laboratuvara hazır olarak getirilen kültürlerde koloni görünümlerini değerlendirerek, hangi tip koloni olduğunu çiziniz. a) b) c) Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası Kaynaklar 1. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA: Klinik Mikrobiyoloji Manual of Clinical Mikrobiology (Çev Edit. AC Başustaoğlu). Dokuzuncu baskı. Atlas Kitapçılık, Ankara, 2009, cilt 1, s.187-190. 2. Bilgehan H: Klinik Mikrobiyolojik Tanı, Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi, Đzmir, 2009, s.97-123. 3. Editörler: Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A: Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı. Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, 2003, s.44-54. 4. Winn Jr. W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P, Woods G, Koneman s Color Atlas and Textbook of Diagnostik Microbiology, Sixth edition, Lippincott Williams and Wilkins, s.29-38. 19

Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-3 Mikrobiyolojik Tanı Yöntemleri-2 Mikrobiyolojide Kullanılan Boyama Yöntemleri Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Mikrobiyolojide kullanılan boyama yöntemlerinin öğrenilmesi Basit boyama ve Gram boyama yöntemlerinin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Bakteri boyalarını sıralar. Basit boyama yönteminin basamaklarını sıralar. Gram boyama yönteminin basamaklarını sıralar. Basit boyama yöntemini basit boyama kılavuzuna uygun şekilde uygular. Gram boyama yöntemini Gram boyama kılavuzuna uygun şekilde uygular. Basit boyama yöntemi ile boyanmış preperatları mikroskobik olarak değerlendirir. Gram boyama yöntemi ile boyanmış preperatları mikroskobik olarak değerlendirir. Mikroskobu başkalarının yardımına ihtiyaç duymaksızın kullanır. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Gram boyama seti Mikroskop Lam Öze Bek Gram pozitif kok (Örn; Stafilokok ya da Streptokok) üremiş kültür plakları Gram negatif basil (Örn; E. coli) üremiş kültür plakları Giriş Mikrobiyolojik tanıda morfolojik incelemeler büyük değer taşır. İyi bir incelemenin en azından tanıya doğru yönlendirici değeri vardır. Morfolojik incelemelerden olan boyama işlemi, bakterilerin identifikasyonu ve sınıflandırılmalarında önemli bir işlemdir. Bunlar içinde en sık kullanılanlar şunlardır; 20

1. Basit boyama 2. Gram boyama 3. Asido rezistan boyama (Ehrlich - Ziehl-Neelsen boyama) 4. Metilen mavisi boyama 5. Giemsa boyama 6. Çini mürekkebi boyama 7. Laktofenol pamuk mavisi boyama 8. Spor boyama 9. Kapsül boyama 10. Neisser boyama Bütün boyama işlemlerinden önce preparatın hazırlanıp, uygun yöntemle tespit edilmesi gerekir. Preparatın Hazırlanması: Preparatlar doğrudan hastalık örneklerinden, kültürlerden ya da deney hayvanlarındaki patolojik lezyonlardan hazırlanır. Bunun için temiz lamlar kullanılır. Sıvı materyalden preparat hazırlanıyor ise öze ya da otomatik pipet yardımı ile bir damla örnek alınarak lamın orta kısmına bırakılır. Öze yardımı ile dairesel hareketler ile küçük bir bozuk para büyüklüğünde yayılır. Bakteri kolonisi ya da katı bir klinik materyalden preparat hazırlarken önce bir damla steril serum fizyolojik lamın ortasına damlatılır. Örnek öze ile alınarak damlanın kenarında ezilir. Dairesel hareketlerle sıvı ile karışması sağlanır. Preparat oda ısısında kurumaya bırakılır. Tespit Yöntemleri: Preparatın tespit edilmesinde amaçlanan, üzerindeki materyalin lama yapışmasını sağlamaktır. Üç yöntemle tespit işlemi yapılabilir: 1. Havada kurutularak tespit: En az güvenilir olanıdır. Hazırlanan preparat 2-18 saat bekletilmelidir. 2. Alevde tespit: En çok kullanılan yöntemdir. Preparat havada kurutulduktan sonra materyalli yüzü yukarı gelecek şekilde bir ucundan tutulur. Lamın alt yüzü yanmakta olan alevin mavi kısmına, yukarıdan aşağıya doğru yavaş yavaş hareket ettirilerek yalatılır. 3. Kimyasal maddeler ile tespit: Alevde tespit edildiğinde morfolojisini kaybedebilecek materyali (protozoa, lökosit, eritrosit, epitel hücresi vs.) tespitte kulanılır. Etil alkol (8-10 dakika), metil alkol (3 dakika) ve aseton (5 dakika) tespit işleminde en çok kullanılan kimyasallardır. Bu maddeler hazırlanan preperatın üstüne, materyal bulunan kısmını kaplayacak şekilde dökülerek kullanılır. Basit Boyama Bu yöntemde, boyama için genellikle tek bir boya kullanılır ve mikroorganizmaların morfolojileri gözlenir. 1. Preparat hazırlanıp tespit edilir. 2. Metilen mavisi, safranin veya kristal viyole gibi boyalardan birisi ile 1 dakika boyanır. 21

3. Su ile yıkanır. 4. Havada kurutulur. 5. İmmersiyon objektifi ile incelenir. Bu boyama sonucu bakteriler, metilen mavisi ile mavi, safraninle pembe/kırmızı, kristal viyole ile mor/lacivert boyanır. Gram Boyama Bakterilerin hücre duvar yapılarındaki farklılıklara dayalı bir boyama yöntemi olup, bakterileri gram pozitif ve gram negatif olarak sınıflayan bir boyama yöntemidir. Gram Boyama Becerisi Öğrenim Rehberi ARAÇLAR: Gram boyama seti, lam, su, penset, incelenecek hasta örneği ya da bakteri kültürü BASAMAK NO BASAMAKLAR 1 Preparatı hazırlayınız. (Bakınız; preparatın hazırlanması) Preparatı uygun yöntem ile tespit ediniz. (Bakınız; Tespit yöntemleri) 2 Preparat yatay konumda iken üzerine kristal viyole dökerek1 dakika bekletiniz. 3 Preparatı tazyikli olmayan su ile boya tamamen akıncaya kadar yıkayınız. 4 Preparat yatay konumda iken üzerine lügol dökerek 1 dakika bekletiniz. 5 Preparatın üzerindeki lügol solüsyonunu dökünüz. 6 Preparatın üzerine damla damla aseton alkol dökerek dekolorizasyon (renksizleştirme) yapınız. Bu işlemi kristal viyole tamamen akana kadar sürdürünüz. 7 Preparatı tazyikli olmayan su ile yıkayınız. 8 Preparat yatay konumda iken üzerine safranin (zıt boya) dökerek 30 saniye bekletiniz. 9 Preparatı tazyikli olmayan su ile yıkayınız. 10 Preparatı oda ısısında kurutunuz. 11 Preparatı immersiyon objektifi ile inceleyiniz. Bu boyamayla gram pozitif bakteriler mor, gram negatif bakteriler pembe boyanır. 22

Boyaların hazırlanışı: Metilen mavisi Kristal viyole Lugol Aseton alkol Safranin :1,5 gr metilen mavisi, 100 ml %95 lik etil alkol :1 gr kristal viyole, 10 ml %96 lık etil alkol, 100 ml saf su : 1 gr kristal iyot, 2 gr potasyum iyodür, 300 ml su :1:1 oranında %95 lik etil alkol ile %100 lük aseton karışımı :%1 lik sudaki eriyiği Asido Rezistan Boyama Özellikle Mycobacterium'lar olmak üzere Nocardia'lar gibi hücre duvarlarında bol miktarda lipid içeren mikroorganizmaların boyanmasında kullanılan bir yöntemdir. Bu boyama yönteminde asit-alkole dirençli boyanan bakteriler kırmızı (karbolfuksin ile), diğer bakteriler ve zemin mavi (metilen mavisi ile) boyanır. Metilen Mavisi Boyama Özellikle dışkı örneklerinde polimorfonükleer lökositlerin ve mikroorganizmaların gözlenebilmesi amacıyla uygulanır. Polimorfonükleer lökositler, bakteriler ve diğer hücreler mavi gözlenir. Giemsa Boyama Protozoa (Plasmodium vs.) türlerinin ve kan hücrelerinin gözlenmesi amacıyla uygulanır. Parazitler mavi-mor renkte ve kırmızı çekirdekli olarak gözlenir. Beyaz kan hücrelerinin çekirdekleri mor, sitoplazmaları mavi renkte görülür. Eritrositler ise açık kahverengi olarak gözlenir. Çini Mürekkebi Boyama Çini mürekkebi ile boyama, en sık Cryptococcus neoformans ın kapsülünün gözlenebilmesi amacıyla uygulanır. Çini mürekkebi kapsülü boyamadığından, siyah zemin üzerinde mayayı çevreleyen açık renkli kapsül gözlenir. Laktofenol Pamuk Mavisi Boyama Küf mantarlarının tanınması amacıyla uygulanır. Mavi boyanmış hifa ve spor morfolojileri incelenir. 23

Spor Boyama Spor yapan bakterilerin, sporlarının varlığını ve yerleşimini gözlemek için kullanılan bir boyama yöntemidir. Bu yöntemle bakteri kırmızı (safranin ile), içindeki spor yeşil (malaşit yeşili ile) boyanır. Neisser Boyama Corynebacterium diphteriae'larda bulunan metakromatik cisimcikleri boyamada kullanılan bir boyama yöntemidir. Bakteriler sarı, metakromatik cisimcikler kahverengi boyanır. Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Masalarda bulunan besiyerlerde üremiş bakteri kolonileri, basit ve gram boyama yöntemiyle boyanıp mikroskopta incelendikten sonra şekil (kok, basil) ve renkleri (mor, pembe) belirterek çizilecek. Boyama: Basit boyama Boyama: Gram boyama Boyama: Gram boyama Bakteri: Bakteri: S. aureus Bakteri:E.coli Şekil: Şekil: Şekil:.. Renk: Renk: Renk:. Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası NOT: Diğer boyama yöntemleri daha sonra yapılacak olan ilgili laboratuvar saatlerinde uygulamalı olarak gösterilecektir. Kaynaklar 1. Bilgehan H (2004). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Dördüncü baskı. Barış yayınları, İzmir, 73-76. 2. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı (2003). Hacettepe Üniversitesi Yayınları, 55-61. 3. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH,Landry ML, Pfaller MA (2009). Manual of Clinical Microbiology. Klinik Mikrobiyoloji. Cilt 1. 9th ed.,atlas Kitapçılık Tic. Ltd. Şti., Ankara, 183-184. 24

Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-4 Sterilizasyon ve Dezenfeksiyon Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Gerekli Malzemeler Sterilizasyon ve dezenfeksiyon yöntemlerinin öğrenilmesi Sterilizasyon kontrol yöntemlerinin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Sterilizasyon ve dezenfeksiyon ile ilgili tanımları açıklar. Sterilizasyon ile dezenfeksiyon arasındaki farkı açıklar. Sterilizasyon yöntemlerini gruplandırır. Sterilizasyon yöntemlerinin önemli özelliklerini sıralar. Sterilizasyonun işlem basamaklarını sıralar. Sterilizasyonun kontrol yöntemlerini sıralar. Dezenfeksiyon yöntemlerini gruplandırır. Dezenfektanları sıralar ve önemli özelliklerini sayar. Laboratuvarda kullandığı bazı malzemelerin (öze vb.) sterilizasyonunu yapar. Laboratuvarda kullandığı bazı malzemelerin (Laboratuvar masası vb.) dezenfeksiyonunu yapar. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Bu uygulamada öğrencilere Merkezi Sterilizasyon Ünitesi tanıtılacaktır. Sıvı sabun Kağıt havlu Alkol bazlı solüsyon Çamaşır suyu Eldiven Maske Bone Otoklav Pastör fırını Yıkama cihazları Etilen oksit sterilizasyon cihazı Giriş Bulaşıcı hastalıkların yayılması, besin maddeleri ve diğer materyallerin bozulması ve hastane enfeksiyonlarının önlenmesinde, sterilizasyon ve dezenfeksiyonun önemi yaklaşık 150 yıldan beri bilinmektedir. 25

Dezenfeksiyon ve Sterilizasyon ile İlgili Önemli Terimler Sterilizasyon Ortamın, bir madde ya da cismin mikroorganizmaların tüm canlı ve aktif şekillerinden (patojen, saprofit, spor veya vejetatif) kabul edilebilir sterilite güvence düzeyini sağlayacak ölçüde arındırılması işlemidir Dezenfeksiyon Bir cismin veya maddenin patojen (hastalandırıcı nitelikteki) mikroorganizmalarından arındırılması işlemidir. Bu işlem ile bakteri sporları dışındaki tüm formlar (bakteri, mantar, protozoon gibi tüm mikroorganizmaların vejetatif şekilleri ve viruslar) yok edilir. Dekontaminasyon Patojenik mikroorganizma sayısının koruyucu bir giysi olmaksızın kullanım için güvenli seviyesine indirgenmesidir. Antisepsi Vücut yüzeylerindeki (deri, mukoza gibi) ve çeşitli yaralardaki patojen mikroorganizmaların, kimyasal maddeler kullanılarak yok edilmesi işlemidir. Hastayla bağlantılı olarak; canlı bir dokunun veya derinin dezenfeksiyonudur Asepsi Patojen mikroorganizmalardan arındırılmış bir ortam anlamına gelmektedir Germisid Mikrorganizmaları öldüren ajanlar Sterilant (kimyasal) Yüksek düzey dezenfektan Orta düzey dezenfektan Düşük düzey dezenfektan Mikrobiyostatik Sterilizasyonu sağlayabilen kimyasal Çoğu bakteriyel endosporlar hariç mikrobiyal patojenlerin tümünü öldüren dezenfektan Bakteriyel endospor dışında tüm mikrobiyal patojenleri öldüren dezenfektan Vejetatif bakteriler ve zarflı virüsleri öldüren dezenfektan Mikroorganizmaların üremelerini önleyen madde ya da etmenlere mikrobiyostatik maddeler, bu etkiye de mikrobiyostatik etki denir. Merkezi Sterilizasyon Ünitesi Merkezi Sterilizasyon Ünitesi (MSÜ) kirli alan, temiz alan ve steril alandan oluşur. Şekil 4-1. Merkezi Sterilizasyon Ünitesi alanları 26

Şekil 4-2. Kirli alan Şekil 4-3. Temiz alan Şekil 4-4. Steril alan 27

Sterilizasyon Şekil 4-5. Sterilizasyon işlem basamakları I. Fiziksel Yöntemler ile Sterilizasyon A. Isı ile yapılan sterilizasyon 1. Kuru ısı ile sterilizasyon a) Yakma ve alevden geçirme b) Kuru sıcak hava ile sterilizasyon 2. Nemli ısı ile sterilizasyon a) Buharla sterilizasyon i. Basınçlı buharla sterilizasyon ii. Basınçsız buharla sterilizasyon iii. Akım halindeki buharla sterilizasyon b) Sıcak su ile sterilizasyon i. Kaynatma ii. Tindalizasyon iii. Koagulasyon B. Süzme (filtrasyon) ile sterilizasyon 1. Mekanik olarak süzme 2. Adsorbsiyon yoluyla süzme C. Işınlama ile sterilizasyon 1. Ultraviyole ışınları ile yapılan sterilizasyon 2. Gama ve x ışınları ile yapılan sterilizasyon II. Kimyasal Maddeler ile Sterilizasyon A. Sıvı ortamlara kimyasal maddeler eklenerek yapılan sterilizasyon 1. Timol 2. Kloroform B. Gazlar ile yapılan sterilizasyon 1. Etilen oksit 2. Beta propiolakton 28

Kuru Sıcak Hava ile Sterilizasyon: Kuru sıcak hava ile sterilizasyon için Pastör fırını adı verilen elektrikli sterilizasyon aleti kullanılır. Üzerlerinde fırının ulaştığı ısıyı takip etmeye yarayan termometre bulunur. Kuru sıcak hava ile; Cam ve metalden yapılmış malzemeler (tüp, balon, petri kutusu, pipet, penset vb.), Nemin içlerine ulaşamaması nedeniyle nemli hava ile sterilize edilemeyen yağlar (vazelin, parafin vb.), Süzgeç kağıtları ve buna benzer nitelikte, yüksek ısıda bozulmayacak malzemeler sterilize edilir. Besiyerleri ve sıvılar kuru sıcak hava ile steril edilmezler. Genel olarak kuru sıcak hava ile sterilizasyon için malzemeler; 175 C'de bir, 165 C'de iki, 150 C'de üç ve 120 C de 8 saat tutulmalıdır. Şekil 4-6. Pastör fırını Basınçlı Buhar ile Sterilizasyon Otoklav: Bu yöntemde temel ilke, doymuş ve basınç altındaki su buharında, 100 C'nin üzerinde sterilizasyondur. Bu amaç için otoklav denilen aletler kullanılır. Otoklav ile sterillemede; 1 atmosfer basınç altında 121 C'de 15-20 dakika ya da 115 C'de 30 dakika bekletmek yeterlidir. Otoklavda daha çok besiyerleri, çözeltiler, kullanılmış petriler vs. steril edilir. Basınçlı buharla sterilizasyon kullanılamadığı durumlar şunlardır: Yüksek ısı ve neme duyarlı aletler (krom kaplama, optik aletler, vs.) Buharın penetre olamayacağı maddeler (yağ, pudra vs.) Şekil 4-7. Değişik şekillerde dizayn edilmiş otoklavlar 29

Gazlar ile Yapılan Sterilizasyon Etilen Oksit: Etilen oksit 10.8 C'nin altında sıvı, üzerindeki ısılarda ise gaz halinde bulunan bir maddedir. Saf halde iken çok toksik, iritan ve patlayıcı olduğundan belli oranlarda karbondioksit ile karıştırılarak kullanılır. Etilen oksit çok etkin bir jermisit olup, sporları da öldürür. Hücre sitoplazmasındaki çeşitli maddelerle kimyasal bileşikler yaparak etki gösterir. Oldukça penetran özelliktedir, kağıt ve polietilenden yapılmış olan ambalajları geçerek, iç kısımda paketlenmiş olan aletleri steril ederken, sterillenen madde ve aletlerin niteliğini bozmaz. Şekil 4-8. Etilen oksit sterilizatörü Sterilizasyonun Denetlenmesi Isı ile yapılan sterilizasyonda; ısının derecesi ile yeterli sürede uygulanıp, uygulanmadığı ve steril edilmek istenen malzemelerin her yerine ulaşıp, ulaşmadığı sterilizasyon üzerine etkili faktörlerdir. Sterilizasyonun tam olabilmesi için otoklav ve pastör fırınlarının düzenli olarak bakımı yapılmalıdır. Ayrıca yapılan sterilizasyon işleminin etkili olup, olmadığını anlamak için de çeşitli denetleme mekanizmaları geliştirilmiştir: 1. Browne sterilite kontrol tüpleri denilen ve içlerinde 115 C'de 25 dakikada, 121 C'de 15 dakikada ve 160 C'de 1 saatte renk değiştiren sıvılar bulunan tüpler, otoklav ya da pastör fırınının ortasına yerleştirilir. Sürenin sonunda tüp içindeki sıvının renginin kırmızıdan yeşile dönmesi sterilizasyonun sağlıklı olduğunu gösterir. 2. Otoklavlar için yapılmış özel ilaçlı yapışkan bantlar bulunmaktadır. Steril edilmek istenen paketin üzerine yapıştırılan bu bantların, sterilizasyon süresi sonunda renk değiştirmesi, bu paketin otoklavlandığını, bazıları da sterilizasyonun derecesini gösterir. 3. Bacillus stearothermophilus ve Bacillus subtilis gibi sporları 121 C'de 12 dakikada ölen bakterilerin sporları uygun tüpler içinde otoklavın ortasına yerleştirilir. Sterilizasyon süresi sonunda otoklavdan çıkarılan bu tüplerin içine sporların üremesi 30

için uygun olan tiyoglukolatlı buyyon ilave edilir. Tam sterilizasyon sağlandı ise; sporların ölmüş olması ve besiyerinde herhangi bir üreme olmaması gerekir. Dezenfeksiyon I. Fiziksel Yöntemler ile Dezenfeksiyon A. Sıcak su ile dezenfeksiyon: Ucuz, kolay, güvenilir bir yöntemdir. Üç şekilde uygulanabilir: 1. Kaynar su ile dezenfeksiyon: 100 C de vejetatif şekiller birkaç dakikada ölürler. 2. 75 100 C de sıcak suda tutma ile dezenfeksiyon. 3. Pastörizasyon: 63 65 C arasında en az 30 dakika tutma ile dezenfeksiyon. B. UV ışınları ile işleme tabi tutma: II. Kimyasal Yöntemler ile Dezenfeksiyon A. Anorganik Bileşikler 1. Asit ve alkaliler: H 2 SO 4, HNO 3, HCl, KOH, NaO, vb. 2. Ağır madenler ve tuzlar: CuSO 4, HgCI 2, AgNO 3, vb. 3. Oksidan maddeler: %3 oranında H 2 O 2 ve 1/1000 oranında KMnO 4, vb. 4. Halojenler ve bileşikleri: Klor, brom ve iyot germisittir. 5. Kireçli maddeler B. Organik Bileşikler 1. Organik metal bileşikleri: Çoğunlukla Hg ve Ag bileşikleridir. 2. Fenoller ve alkoller a) Alkoller b) Klorheksidin 3. Deterjanlar: Yüzey aktif maddelerdir. a) Anyonik bileşikler: Sabunlar büyük moleküllü yağ asitlerinin Na ve K tuzlarıdır. b) Noniyonik bileşikler: Polieterler ve poligliserol esterleri bu gruptadır. c) Katyonik bileşikler: En çok bilineni benzalkonyum klörür (Zefiran), stilpiridiyum klorür ve diaperen klorürdür. C. Gaz dezenfektanlar 1. Kükürtdioksit 2. Formaldehit: Formalin formaldehitin %40 lık çözeltisidir. 3. Etilen oksit 4. Kloroform 5. Boyalar: Malaşit yeşili, brillant yeşili, kristal viole, metilen mavisi, rivanol 31

Tablo 4-1. Yaygın olarak kullanılan dezenfektanlar ve kullanım alanları Germisidler Glutaraldehid % 2-3,2 Hidrojen peroksit % 3-25 Klor Kullanım dilusyonu 100-1000 ppm bağışık klorin Dezenfeksiyon seviyesi Yüksek / Sterilizasyon Yüksek / Sterilizasyon Yüksek İzopropil alkol % 60-95 Orta Hastane uygulamaları Endoskoplar Kontakt lensler Bazı yarı kritik cihazlar Küçük alan yüzeyleri Fenol bileşikleri % 0,4-5 Orta Cerrahi aletler İyodoforlar Dörtlü amonyum bileşikleri 30-50 ppm serbest iyodin Orta % 0,4-1,6 akışkan Düşük Tıbbi cihazlar Gıda hazırlama sahaları ve yerler El antisepsisi Dezenfeksiyon ve Antisepsi Uygulama Yöntemleri Ellerin 15-20 saniye süreyle sabunla yıkanmasıyla mevcut mikroplar, lipit içeren kir tabakası ile birlikte, lipit yapısının erimesi ve akması ile ortamdan uzaklaştırılırlar. Bu tür el yıkama işlemine hijyenik el yıkama adı verilir. Hijyenik el yıkama ile günlük yaşantı için yeterli antisepsi sağlanır. Hastanelerde doğrudan hasta ile ilişkisi olan sağlık personelinin %3 heksaklorofenli, %5 krezollü sabunlar ile el yıkamaları daha etkin bir önlemdir. Hijyenik el yıkama ile geçici floranın tamamı, kalıcı floranın ise bir kısmı ortadan kaldırılmış olur. Hijyenik el yıkamasından sonra, antiseptik maddelerle yapılan el yıkamasında ise mikroorganizmaların öldürülmesi ya da gelişmelerinin durdurulması amaçlanır. Bu tür el yıkama yöntemine cerrahi el yıkama yöntemi adı verilir. Cerrahi el antisepsisi için önerilen çeşitli yöntemler içinde en etkililerinden biri; ellerin önce %5 krezollü veya %3 heksaklorofenli sabun ya da emülsiyonlarla 7 dakika sabunlanıp, fırçalanmasından sonra 3 dakika süre ile %70'lik etil alkolle muamele edilmesidir. Önerilen bir diğer yöntem ise klorheksidinin deterjan içindeki %4'lük kremi ile ellerin 2-3 dakika fırçalanıp, yıkanmasıdır. Deri antisepsisi Çeşitli cerrahi girişimlerden önce, cerrahi girişim yapılacak olan bölgedeki derinin antisepsisi gereklidir. Bu amaçla önce deri çok kirli ise sabunlu su ile yıkanmalı, sonra çeşitli antiseptiklerle muamele edilmelidir. Kullanılan antiseptiklerin başında iyot tentürü gelir. Bunun yanısıra alkol, alkol iyot, merthiolat, mersol gibi antiseptikler de kullanılabilir. 32

Yara antisepsisi Toz, toprak gibi maddelerle kirlenmiş yaralardaki yabancı cisimler temizlenir ve yara bölgesi sabunlu su ile yıkanarak kaba kirleri giderilir. Daha sonra %1 benzalkonyum klorür ve %3 hidrojen peroksit ile yıkanır. Ayrıca yara, iyot tentürü, %0.1 merthiolat veya alkol ile de silinebilir. Suların dezenfeksiyonu Bu amaçla klor ve klor verici maddeler kullanılır. Şehir şebekesi suları gibi, büyük miktarlardaki suyun dezenfeksiyonunda klorinatör denilen cihazlarla su içerisine gaz halinde klor verilir. Etkin bir klorlamada, klorlama işleminden 1 saat sonra klorlanmış suda litrede 0.2 mg bağımsız klor bulunması gerekir. Laboratuvar dezenfeksiyonu Çalışma alanları (banklar) dezenfeksiyon için, her çalışma günü sonunda %5 fenol, %5 krezol, %3 lizol gibi dezenfektanlardan birisi ile temizlenmelidir. Virüs laboratuvarlarında ise, bu maddelerin viruslara etkisi az olduğundan ayrıca %1-3 sodyum veya kalsiyum hipoklorit ile silinmelidir. Kullanılan tüm mikroplu ekim ve materyaller otoklavlanmalıdır. Döşeme ve duvarlar, hastane uygulamasındaki gibi, önce sabunlu su ile iyice fırçalanmalıdır. Daha sonra %3-5 fenol veya %5 krezol eriyikleri ile silinebilir. Fayans ve yağlı boya duvarlara da aynı işlem uygulanabilir. Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Sterilizasyon ve dezenfeksiyonda kullanılan alet ve malzemeleri inceleyiniz. Kaynaklar 1. Bilgehan H (2005). Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi. 11. baskı. Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi, İzmir, 189-226. 2. Poyraz Ö (1998). Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Kılavuzu. T.C. Cumhuriyet Üniversitesi Yayınları No:68, Sivas, 30-38. 3. Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A (2003). Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı. Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, 15-23. 4. Cengiz T (2001). Mikrobiyoloji Pratik Kitabı. Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, 3. baskı. Antıp A.Ş. Yayınları, Ankara, 33-54. 33