ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Murat YILMAZTEKİN BİYOTEKNOLOJİK YOLDAN DOĞAL İZOAMİL ASETAT VE ETİL ASETAT AROMALARININ ÜRETİMİ ÜZERİNDE ARAŞTIRMALAR GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOTEKNOLOJİK YOLDAN DOĞAL İZOAMİL ASETAT VE ETİL ASETAT AROMALARININ ÜRETİMİ ÜZERİNDE ARAŞTIRMALAR Murat YILMAZTEKİN DOKTORA TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu tez 11/02/2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği ile Kabul Edilmiştir. İmza... İmza... İmza... Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Prof.Dr. Ahmet CANBAŞ I. DANIŞMAN II. DANIŞMAN ÜYE İmza... Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK ÜYE İmza Prof. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAY ÜYE Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No : Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri ve TÜBİTAK-TOVAG Tarafından Desteklenmiştir. Proje Numaraları: ZF2004D34, ZF2004BAP13, ZF2004BAP20 ve TÜBİTAK-TOVAG- 3393 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ DOKTORA TEZİ BİYOTEKNOLOJİK YOLDAN DOĞAL İZOAMİL ASETAT VE ETİL ASETAT AROMALARININ ÜRETİMİ ÜZERİNDE ARAŞTIRMALAR Murat YILMAZTEKİN ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI I. Danışman : Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU II. Danişman : Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Yıl: 2009, Sayfa: 103 Jüri : Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU Prof. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAY Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Bu çalışmada, Williopsis saturnus mayası kullanılarak melastan fermantasyon yoluyla ve melas ortamında fuzel yağı ilavesiyle biyodönüşüm yoluyla izoamil asetat üretimi; Pichia mayası kullanılarak melastan fermantasyon yoluyla etil asetat üretimi ele alınmıştır. Araştırmada 3 farklı Williopsis saturnus maya ırkının (HUT 7087, IAM 12217 ve NCYC 22), sıcaklığın (15 ºC ve 25 ºC) ve havalandırmanın (havalandırmasız, yarı havalandırmalı ve havalandırmalı) izoamil asetat üretimine etkisi saptanmış ve daha sonra belirlenen en uygun koşullarda ortama ilave edilen fuzel yağının biyodönüşümü ile izoamil asetat üretiminin arttırılması hedeflenmiştir. Etil asetat üretiminde ise Pichia cinsine ait 2 farklı mayanın (Pichia anomala NCYC 432 ve Pichia subpelliculosa NCYC 436), sıcaklığın (15 ºC ve 25 ºC) ve havalandırmanın (havalandırmasız, yarı havalandırmalı ve havalandırmalı) etkileri araştırılmıştır. Fermantasyon denemeleri kontrollü koşullar altında fermentörlerde, biyodönüşüm denemeleri ise orbital karıştırıcıda erlenmayerler içerisinde gerçekleştirilmiştir. Aroma maddelerinin belirlenmesinde Gaz Kromatografisi-Alev İyonlaşma Dedektörü kullanılmıştır. Elde edilen bulgulara göre ele alınan 3 maya ırkı içerisinde Williopsis saturnus HUT 7087 nin en yüksek miktarda izoamil asetat üreten ırk olduğu ve bu maya ırkı ile 25 ºC de 15 ºC ye göre, yarı havalandırmalı ortamda havalandırmasız ve havalandırmalı ortama göre daha fazla izoamil asetat üretildiği belirlenmiştir. Saptanan en uygun koşullarda ortama ilave edilen % 1 oranında fuzel yağı izoamil asetat üretiminde 3 kat artışa neden olmuş ve üretilen izoamil asetat miktarı 354 mg/l olarak belirlenmiştir. Pichia cinsine ait mayalardan ise Pichia anomala NCYC 432 melastan en fazla etil asetat üreten maya olmuştur. 25 ºC de 15 ºC ye göre ve yarı havalandırmalı ortamda havalandırmasız ve havalandırmalı ortama göre daha fazla etil asetat üretilmiş ve belirlenen en uygun fermantasyon koşullarında ulaşılan en yüksek etil asetat miktarı yaklaşık 6.7 g/l olmuştur. Anahtar Kelimeler: Doğal aroma, Williopsis saturnus, Pichia, fermantasyon, biyodönüşüm I

ABSTRACT PhD THESIS INVESTIGATIONS ON THE BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTION OF NATURAL ISOAMYL ACETATE AND ETHYL ACETATE Murat YILMAZTEKİN DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA I. Supervisor : Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU II. Supervisor : Assoc. Prof. Dr. Hüseyin ERTEN Year: 2009, Pages: 103 Jury : Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU Prof. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAY Assoc. Prof. Dr. Hüseyin ERTEN In this study, the production of isoamyl acetate using Williopsis saturnus from sugarbeet molasses by fermentation and from fusel oil in a molasses based medium by bioconversin; and the production of ethyl acetate using Pichia yeasts by fermentation were studied. For isoamyl acetate production the effects of 3 different strains of Williopsis saturnus (HUT 7087, IAM 12217 and NCYC 22), temperature (15 ºC and 25 ºC) and aeration (aerated, semi-aerated and unaerated) on the production of isoamyl acetate were determined and enhancement of isoamyl acetate production by bioconversion with addition of fusel oil at the most suitable conditions was aimed. For ethyl acetate production, the influence of 2 different yeasts (Pichia anomala NCYC 432 and Pichia subpelliculosa NCYC 436), temperature (15 ºC and 25 ºC) and aeration (aerated, semi-aerated and unaerated) were examined. Fermentation and bioconversion trials were performed with batch fermentors at controlled conditions and with orbital shaker in flasks, respectively. Flavour compunds were determined with gas chromatography-flame ionization detector. According to the results obtained, Williopsis saturnus HUT 7087 was the highest isoamyl acetate producer among Williopsis saturnus strains, and that strain formed higher amount of ester at 25 ºC than at 15 ºC, at semi-aerated medium than aerated and unaerated mediums. The addition of 1% of fusel oil into medium caused a 3 fold increase in isoamyl acetate production and the maximum amount of isoamyl acetate produced was 354 mg/l. Pichia anomala NCYC 432 produced higher level of ethyl acetate than that of Pichia subpelliculosa NCYC 436 from molasses. The highest amount of ethyl acetate was determined at 25 ºC than at 15 ºC, at semi-aerated medium than aerated and unaerated mediums, and the maximum amount was found about 6.7 g/l. Keywords: Natural flavour, Williopsis saturnus, Pichia, fermentation, bioconversion II

TEŞEKKÜR Doktora tez çalışmam sırasında araştırma konusunun belirlenmesi, araştırmanın planlanması ve sonuçların değerlendirilmesinde tecrübelerinden faydalandığım başta birinci danışmanım sayın Prof. Dr. Turgut CABAROĞLU olmak üzere, ikinci danışmanım sayın Doç. Dr. Hüseyin ERTEN e, tezin yürütülmesi sırasında yapmış oldukları katkılardan dolayı Tez İzleme Komitesi üyeleri sayın Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ ve sayın Prof. Dr. E. Sultan VAYISOĞLU GİRAY a ve tez jürisinde yer alarak tezimi değerlendiren sayın Prof. Dr. Filiz ÖZÇELİK e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım sırasında maddi ve manevi desteğini gördüğüm başta değerli arkadaşım Arş. Gör. Adnan BOZDOĞAN a, bölüm hocalarıma, acı ve tatlı pek çok anıyı paylaştığım çalışma arkadaşlarıma ve bölüm çalışanlarına minnet duyduğumu belirtmek isterim. Araştırmam sırasında kullanılan melası sağlayan Özmaya A.Ş. (Ceyhan, ADANA) ne, fuzel yağının temin edilmesinde yardımcı olan Malatya Şeker Fabrikası na, maya suşlarını sağlayan HUT, IAM ve NCYC kültür koleksiyonlarına, tez çalışmamı maddi olarak destekleyen Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri Destekleme Birimi ne ve Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırmalar Kurumu na teşekkür ederim. Son olarak, bu günlere gelmemde sonsuz emekleri olan ve maddi manevi desteklerini esirgemeyen anneme, babama ve kardeşlerime, son beş yıldır hayatımı renklendiren sevdiğim insana minnettarlığımı ifade etmek isterim. III

Sonsuz sevgi, ilgi ve destekleri ile her zaman yanımda olan anneme ve babama IV

İÇİNDEKİLER Sayfa No ÖZ... I ABSTRACT...II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER....V ÇİZELGELER DİZİNİ... IX ŞEKİLLER DİZİNİ...X RESİMLER DİZİNİ...XIII SİMGELER VE KISALTMALAR...XIV 1. GİRİŞ... 1 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR... 4 2.1. Aroma Maddelerinin Sınıflandırılması... 4 2.2. Biyoteknolojik Yollarla Doğal Aroma Maddelerinin Üretim Yöntemleri... 5 2.2.1. Mikrobiyal Yolla Üretim... 5 2.2.1.1. Fermantayon Yoluyla Üretim... 6 2.2.1.2. Biyodönüşüm Yoluyla Üretim... 8 2.2.2. Enzimatik Yolla Üretim...10 2.3. Esterler...11 2.3.1. Biyoteknolojik Yollarla Esterlerin Üretimi...12 2.3.2. Esterlerin Oluşum Mekanizması...13 2.3.3. Ester Oluşumunu Etkileyen Faktörler...15 2.3.3.1. Maya Cinsi...15 2.3.3.2. Ortam Bileşimi...17 2.3.3.3. Sıcaklık...18 2.3.3.4. Havalandırma...19 2.3.3.5. Substrat Miktarı...22 2.4. Biyoteknolojik Yolla Aroma Üretiminde Gıda Sanayi Artıklarının Kullanımı...23 2.4.1. Melas...24 2.4.2. Fuzel Yağı...26 V

3. MATERYAL ve METOT...27 3.1. Materyal...27 3.1.1. Mayalar...27 3.1.2. Besiyerleri ve Kimyasallar...27 3.1.3. Melas...27 3.1.4. Fuzel Yağı...28 3.1.5. Fermentör...29 3.2. Metot...29 3.2.1. Fermantasyon ve Biyodönüşümde Kullanılan Melas Çözeltisinin Hazırlanması...29 3.2.2. Aşılama Kültürünün Hazırlanması...30 3.2.3. Fermantasyon Koşulları...30 3.2.3.1. Havalandırmalı Fermantasyon...31 3.2.3.2. Havalandırmasız Fermantasyon...31 3.2.3.3. Yarı-Havalandırmalı Fermantasyon...31 3.2.4. Biyodönüşüm Koşulları...31 3.2.5. Fuzel Yağı Toksisitesinin Belirlenmesi...32 3.2.6. Örneklerin Alınması...32 3.2.7. Örnekler Üzerinde Yapılan Analizler...32 3.2.7.1. Maya Sayımı ve Canlılık Oranı...32 3.2.7.2. Yoğunluk...33 3.2.7.3. ph...33 3.2.7.4. Etil Alkol...33 3.2.7.5. Aroma Maddelerinin Analizi...34 3.2.7.5.(1). Cevap Faktörünün Hesaplanması...36 3.2.7.5.(2). Miktar Tayini...37 3.2.8. İstatistiksel Değerlendirme...37 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA...38 4.1. İzoamil Asetat Üretimi...38 4.1.1. W. saturnus Mayası ile İzoamil Asetat Üretimi...38 4.1.1.1. Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı...38 VI

4.1.1.2. Fermantasyonun Gidişi...39 4.1.1.3. ph...40 4.1.1.4. Etil Alkol Üretimi...41 4.1.1.5. 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi...42 4.1.1.6. İzoamil Asetat/Amil Alkol Oranı...44 4.1.1.7. İzoamil Asetat Üretimi...45 4.1.2. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla İzoamil Asetat Üretimi...47 4.1.2.1. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla İzoamil Asetat Üretiminde Sıcaklığın Etkisi...47 4.1.2.1.(1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı...47 4.1.2.1.(2). Fermantasyonun Gidişi...49 4.1.2.1.(3). ph...50 4.1.2.1.(4). Etil Alkol Üretimi...51 4.1.2.1.(5). 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi...52 4.1.2.1.(6). İzoamil Asetat Üretimi...55 4.1.2.2. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla İzoamil Asetat Üretiminde Havalandırmanın Etkisi...57 4.1.2.2.(1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı...57 4.1.2.2.(2). Fermantasyonun Gidişi...58 4.1.2.2.(3). ph...60 4.1.2.2.(4). Etil Alkol Üretimi...60 4.1.2.2.(5). 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Üretimi...62 4.1.2.2.(6). İzoamil Asetat Üretimi...63 4.1.3. W. saturnus HUT 7087 Mayası Kullanılarak Biyodönüşüm Yoluyla İzoamil Asetat Üretimi...66 4.1.3.1. Fuzel Yağının Maya Gelişimi ve Canlılık Oranına Etkisi...66 4.1.3.2. Fuzel Yağının Yoğunluğa Etkisi...68 4.1.3.3. Fuzel Yağının Etil Alkol Üretimine Etkisi...68 4.1.3.4. 2-Metil-1-butanol ve 3-Metil-1-butanol Miktarlarındaki Değişimler69 4.1.3.5. Fuzel Yağının İzoamil Asetat Üretimine Etkisi...72 VII

4.2. Etil Asetat Üretimi...74 4.2.1. P. anomala ve P. subpellicolasa Mayaları ile Etil Asetat Üretimi...74 4.2.2. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil Asetat Üretimi...75 4.2.2.1. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil Asetat Üretiminde Sıcaklığın Etkisi...75 4.2.2.1.(1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı...75 4.2.2.1.(2). Fermantasyonun Gidişi...76 4.2.2.1.(3). ph...77 4.2.2.1.(4). Etil Alkol Üretimi...78 4.2.2.1.(5). Etil Asetat Üretimi...79 4.2.2.2. P. anomala NCYC 432 Mayası Kullanılarak Fermantasyon Yoluyla Etil Asetat Üretiminde Havalandırmanın Etkisi...80 4.2.2.2.(1). Maya Gelişimi ve Canlılık Oranı...80 4.2.2.2.(2). Fermantasyonun Gidişi...82 4.2.2.2.(3). ph...82 4.2.2.2.(4). Etil Alkol Üretimi...83 4.2.2.2.(5). Etil Asetat Üretimi...85 5. SONUÇ ve ÖNERİLER...88 KAYNAKLAR...91 ÖZGEÇMİŞ...103 VIII

ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa No Çizelge 2.1. Fermantasyon ve mikrobiyal biyodönüşümlerin genel özellikleri... 6 Çizelge 2.2. Mikrobiyal biyodönüşümle üretilen bazı aroma maddeleri... 9 Çizelge 2.3. Fermantasyon sırasında ester oluşumunu etkileyen faktörler...15 Çizelge 2.4. Farklı maya türleri tarafından üretilen esterler...17 Çizelge 2.5. Aerobik mayalar tarafından farklı fermantasyon koşullarında üretilen şaraplarda tespit edilen etil asetat miktarları...21 Çizelge 2.6. Aerobik mayalar tarafından farklı fermantasyon koşullarında üretilen şaraplarda tespit edilen izoamil asetat miktarları...21 Çizelge 2.7. Aroma maddelerinin üretiminde kullanılan bazı gıda artıkları...24 Çizelge 2.8. Şeker pancarı melasının kimyasal bileşimi...25 Çizelge 3.1. Melasın fiziksel ve kimyasal özellikleri...28 Çizelge 3.2. Biyodönüşüm denemelerinde kullanılan fuzel yağının bileşimi...28 Çizelge 3.3. Aroma maddelerinin kalibrasyon verileri...35 Çizelge 4.1. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlarda izoamil asetat/amil alkol oranı....44 Çizelge 4.2. W. saturnus mayaları tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları...46 Çizelge 4.3. Farklı sıcaklıklarda W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları...55 Çizelge 4.4. Farklı havalandırma koşullarında W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları...65 Çizelge 4.5. Fuzel yağı konsantrasyonunun amil alkollerin biyodönüşümü üzerine etkisi...72 Çizelge 4.6. Farklı konsantrasyonlarda fuzel yağı ilavesinde W. saturnus HUT 7087 tarafından üretilen izoamil asetat miktarları ve üretim hızları...73 Çizelge 4.7. Farklı sıcaklıklarda P. anomala NCYC 432 tarafından üretilen etil asetat miktarları ve üretim hızları...79 Çizelge 4.8. Farklı havalandırma koşullarında P. anomala NCYC 432 tarafından üretilen etil asetat miktarları ve üretim hızları...86 IX

ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa No Şekil 2.1. Tipik bir fermantasyon işlemi... 8 Şekil 2.2. Aroma sanayinde kullanılan bazı önemli esterler...12 Şekil 2.3. Esterlerin kimyasal ve biyokimyasal yolla sentezlenmesi....13 Şekil 2.4. Mayalarda ester oluşumunun biyokimyası....14 Şekil 3.1. Etil alkol analizlerinde elde edilen örnek kromatogram...34 Şekil 3.2. Aroma maddelerinin analizlerinde elde edilen örnek kromatogram...36 Şekil 4.1. W. saturnus mayalarının gelişimi...39 Şekil 4.2. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlara ait yoğunluk değerleri...40 Şekil 4.3. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlara ait ph değerleri...41 Şekil 4.4. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki etil alkol üretimi...42 Şekil 4.5. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki 2-metil-1- butanol üretimi...43 Şekil 4.6. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki 3-metil-1- butanol üretimi...44 Şekil 4.7. W. saturnus mayaları ile gerçekleştirilen fermantasyonlardaki izoamil asetat üretimi...46 Şekil 4.8. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı...48 Şekil 4.9. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlardaki yoğunluk değişimi...49 Şekil 4.10. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlardaki ph değişimi...50 Şekil 4.11. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda etil alkol üretimi...51 Şekil 4.12. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda 2-metil-1-butanol üretimi...53 X

Şekil 4.13. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda 3-metil-1-butanol üretimi...53 Şekil 4.14. W. saturnus HUT 7087 maya ile farklı sıcaklıklarda yürütülen fermantasyonlarda izoamil asetat üretimi...55 Şekil 4.15. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı...57 Şekil 4.16. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yoğunluk değişimi...59 Şekil 4.17. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında ph değişimi...60 Şekil 4.18. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında etil alkol üretimi...61 Şekil 4.19. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında 2- metil-1-butanol üretimi...62 Şekil 4.20. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında 3- metil-1-butanol üretimi...63 Şekil 4.21. W. saturnus HUT 7087 mayası ile farklı havalandırma koşullarında izoamil asetat üretimi...64 Şekil 4.22. Biyodönüşüm süresince canlı maya sayısı...67 Şekil 4.23. Biyodönüşüm süresince canlılık oranı...67 Şekil 4.24. Biyodönüşüm süresince gözlenen yoğunluk değerleri...68 Şekil 4.25. Biyodönüşüm süresince etil alkol üretimi...69 Şekil 4.26. Biyodönüşüm süresince 2-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim...70 Şekil 4.27. Biyodönüşüm süresince 3-metil-1-butanol miktarlarındaki değişim...71 Şekil 4.28. Biyodönüşüm süresince üretilen izoamil asetat miktarlarındaki değişim 73 Şekil 4.29. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlardaki maya gelişimi...75 Şekil 4.30. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlardaki yoğunluk değerleri...76 Şekil 4.31. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlardaki ph değerleri...77 XI

Şekil 4.32. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlarda üretilen etil alkol miktarları...78 Şekil 4.33. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı sıcaklıklarda gerçekleştirilen fermantasyonlarda üretilen etil asetat miktarları...79 Şekil 4.34. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki canlı maya sayısı...81 Şekil 4.35. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki yoğunluk değerleri...82 Şekil 4.36. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki ph değerleri...83 Şekil 4.37. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki etil alkol üretimi...84 Şekil 4.38. P. anomala NCYC 432 mayası ile farklı havalandırma koşullarında yürütülen fermantasyonlardaki etil asetat üretimi...85 XII

RESİMLER DİZİNİ Sayfa No Resim 3.1. Fermantasyon denemelerinde kullanılan fermentörler.29 XIII

SİMGELER VE KISALTMALAR W : Williopsis P : Pichia S : Saccharomyces AATaz : Alkol asetiltransferaz ATF1 ve ATF2 : Alkol asetiltransferaz I ve Alkol asetiltransferaz II enzimlerini kodlayan genler NCYC : National Collection of Yeast Cultures (Ulusal Maya Kültür Koleksiyonu, İngiltere) IAM : Institute of Applied Microbiology Culture Collection (Uygulamalı Mikrobiyoloji Enstitüsü Kültür Koleksiyonu, Japonya) HUT : Hiroshima University Culture Collection (Hiroşima Üniversitesi Kültür Koleksiyonu, Japonya) MEA : Malt Ekstrakt Agar MEB : Malt Ekstrakt Broth GC : Gas Chromatography (Gaz Kromatografisi) FID : Flame Ionization Detector (Alev İyonlaşma Dedektörü) XIV

1. GİRİŞ Murat YILMAZTEKİN 1. GİRİŞ Aroma maddeleri burun yoluyla ve ürün ağızdayken geniz yoluyla algılanan uçucu ve koku veren özellikteki alifatik ve aromatik yapılı kimyasal bileşiklerdir. Gıdanın tüketici tarafından tercih edilmesinde birinci derecede rol oynayan aroma maddeleri, gıdanın en önemli kalite kriterlerinden birini oluşturmaktadır. Bu bileşikler gıdalarda çok sayıda ve nanogram ile miligram gibi düşük miktarlarda bulunmalarına rağmen gıdanın kendine özgü duyusal özelliğini belirler. Gıdaların aroması aldehitler, alkoller, ketonlar, esterler, laktonlar, terpenler, pirazinler, uçucu fenoller ve kükürtlü bileşikler gibi çeşitli kompleks gruplardan oluşmaktadır (Reineccius, 2006). Bir gıdanın aroması hammaddenin doğal yapısından, ürünün işlenmesi sırasında uygulanan kesme, sıkma, ezme, haşlama, pişirme, kızartma, kavurma, fermantasyon, tütsüleme vb. çeşitli işlemlerden veya ürüne dışarıdan ilave edilen aroma bileşiklerinden ileri gelir. Gıdalarda arzu edilen aromanın yeterli olmaması, üretim sırasında ortaya çıkan kayıpları geri kazandırmak, gıdada doğal olarak bulunan bir kokuyu maskelemek, aromasız gıdalara başka bir aroma kazandırmak veya ürünü farklılaştırmak gibi çeşitli nedenlerle ürünlere aroma maddesi ilavesi yapılmaktadır (Elmacı, 2001; Reineccius, 2006; Bayrak, 2006). Aroma maddeleri özellikle gıda sanayinde sıkça kullanılan katkı maddeleri arasında gelmektedir. Uzun zamandan beri bitkiler aroma maddelerinin esas kaynağı olmuşlardır. Ancak bunların düşük miktarlarda bulunmaları, saflaştırılmalarının zor olması ve pahalı olmaları nedeniyle günümüzde kimyasal yolla sentezlenen aroma maddeleri daha çok kullanılmaktadır. Bugün piyasada kullanılan aroma maddelerinin yaklaşık % 80 den fazlasını sentetik aroma maddeleri oluşturmaktadır (Krings ve Berger, 1998). Ancak son zamanlarda müşteri taleplerinin doğal ürünlere kayması, kimyasal ürünlerin insan sağlığını ve çevreyi tehdit etmesi ve uluslararası mevzuatlarda kimyasal yollarla elde edilen ürünlere getirilen kısıtlamalar alternatif yolların ortaya çıkmasına neden olmuştur. Aroma maddelerinin üretiminde son dönemlerde oldukça ilgi gören yöntemlerden biri de biyoteknolojik işlemlerin kullanılmasıdır. Modern 1

1. GİRİŞ Murat YILMAZTEKİN biyoteknolojide yaşanan gelişmeler sonucunda doğal aroma maddelerinin mikroorganizmalar, izole edilmiş enzimler ve bitki hücre kültürlerinden yararlanılarak üretilmesi mümkün olmuştur. Günümüzde yaklaşık 100 kadar doğal aroma bileşiği biyoteknolojik yöntemlerle üretilmektedir (Reineccius, 2006). Prensipte biyoteknolojik yolla aroma maddesi üretiminde iki yöntem yaygın olarak kullanılmaktadır. Birincisi mikroorganizmaların kullanıldığı fermantasyon yoluyla üretim (de novo sentezi), ikincisi ise mikroorganizmaların veya enzimlerin kullanıldığı biyodönüşüm yoluyla üretimdir (Janssens ve ark., 1992). Biyoteknolojik yöntemlerin sağladığı en önemli avantajlar, tarımsal üretimde karşılaşılan sorunlardan (iklim, bitkisel hastalıklar, pestisit kullanımı, pazar arayışı, tarım politikaları vb.) bağımsız olması ve endüstriyel ölçekte uygulanabilir olmasıdır (Krings ve Berger, 1998). Biyoteknolojik üretimin kimyasal yolla üretime göre avantajları ise, daha esnek reaksiyon koşullarına, yüksek ürün ve substrat spesifikliğine sahip olması ve çevreyi daha az kirletmesidir (Xu ve ark., 2007). Kısa zincirli yağ asitleriyle alkoller arasında meydana gelen esterler, aroma maddeleri arasında önemli bir grup olup meyve aroması veren bileşikler olarak tanınırlar. İzoamil asetat ve etil asetat gıdalara meyvemsi tat ve koku verdiklerinden gıda endüstrisinde sıklıkla kullanılan aroma maddeleridir. Bunların doğal kaynaklardan elde edilen formları hem pahalı olmakta, hem de miktar olarak yetersiz kalmaktadır. Bu yüzden aroma maddelerinin üretiminde son yıllarda oldukça ilgi gören biyoteknolojik yollarla üretim, doğal izoamil asetat ve etil asetat üretiminde de alternatif yöntemlerden biri olarak görülmektedir. Ülkemizde gıda sanayi artıklarının yeterince değerlendirilememesi hem çevre sorunlarına hem de ekonomik kayıplara yol açmaktadır. Biyoteknolojik yöntemlerle aroma maddelerinin üretiminde, gıda sanayi artıkları karbon ve azot kaynağı olarak fermantasyon işlemlerinde kullanılabilmektedir. Bu şekilde gıda artıklarının değerlendirilmesiyle hem doğal aroma maddelerinin üretiminde maliyetin düşürülmesi, hem de ülke ekonomisine katkı sağlanması düşünülmektedir. Değerlendirilebilecek gıda artıkları arasında melas hem içerik bakımından, hem de ucuz temin edilebilmesi açısından potansiyel oluşturabilecek niteliktedir. 2

1. GİRİŞ Murat YILMAZTEKİN Tarımsal hammaddelerden etil alkol üretiminde yan ürünlerden biri de damıtma işlemi sonrasında ortaya çıkan damıtma artıklarıdır. Damıtma işleminden sonra geride kalan kuyruk (son kısım) fuzel yağları olarak da adlandırılan yüksek alkolleri ve özellikle amil alkolleri içerir. Mayalar özellikle izoamil asetatı ve bazı uçucu asetatları yüksek alkollerden üretebilmektedir. Bu durumda, ucuz bir yan ürün olan damıtma artıkları izoamil asetat üretimi için önemli bir kaynak olarak görünmektedir. Bu çalışmada karbon kaynağı olarak melas kullanarak W. saturnus mayası ile izoamil asetat ve P. anomala ve P. subpelliculosa mayaları ile etil asetat üretimi ele alınmış ve, W. saturnus mayası ile izoamil asetat üretiminde; - En uygun maya ırkının belirlenmesi - Fermantasyon yoluyla üretim sırasında sıcaklık (15 ve 25 ºC) ve havalandırmanın (havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız) etkisi ve - Biyodönüşüm yoluyla üretim sırasında ortama farklı konsantrasyonlarda (% 1, 2 ve 3) fuzel yağı ilavesinin etkisi, P. anomala ve P. subpelliculosa ile etil asetat üretiminde ise; - Fermantasyon yoluyla üretim sırasında sıcaklık (15 ve 25 ºC) ve havalandırmanın (havalandırmalı, yarı havalandırmalı ve havalandırmasız) etkisi araştırılmıştır. 3

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Aroma Maddelerinin Sınıflandırılması Aroma maddeleri genel olarak doğal ve yapay aroma maddeleri olarak gruplandırılır. Aroma maddelerinin elde edildikleri kaynakların çok farklı ve çok çeşitli olması, uluslararası mevzuatlarda kesin tanımlarının yapılmasına neden olmuştur. Amerika Birleşik Devletleri nde aroma maddeleri doğal ve yapay olmak üzere iki gruba ayrılmış ve doğal aroma maddeleri, esansiyel yağlar; yağlı reçineler; esanslar; protein hidrolizatları; baharat, meyve suyu, sebze veya sebze suyu, maya ekstraktları, bitki tomurcuk, kabuk, kök ve yaprakları, et, deniz ürünleri, kümes hayvanları, yumurta ve süt ürünlerinin kızartılması, ısıtılması ve enzimle muamele edilmesinden sonra elde edilen destilatları veya esas işlevi aroma vermek olan fermantasyon ürünleri şeklinde tanımlanmıştır. Avrupa Birliği Aroma Yönergesi nde ise doğal aroma maddeleri, bitkisel veya hayvansal kaynaklardan fiziksel, enzimatik veya mikrobiyolojik yollarla elde edilen aroma verici madde veya madde karışımları olarak ifade edilmiştir (Vandamme ve Soetaert, 2002). Her iki tanımdan da anlaşıldığı gibi aroma maddelerinin doğal olarak adlandırılabilmesi için elde edildiği hammaddenin de (substrat veya ön bileşik) doğal olması gerekmektedir. Doğal bir aroma maddesinin adı Doğal Çilek Aroması ifadesinde olduğu gibi bir gıda maddesine veya bir aroma kaynağına referans oluşturuyorsa, bu aromanın tamamının uygun fiziksel, enzimatik veya mikrobiyolojik yollarla bu gıdadan veya kaynaktan elde edilmesi zorunludur. Aksi durumda doğal ifadesi kullanılamaz (Anonim, 1997a). Birçok Avrupa ülkesinde doğal ve yapay aroma maddelerinin yanında doğala özdeş aroma maddeleri ayrı bir sınıf olarak kabul edilmektedir. Kimyasal yollarla sentezlenen bu bileşikler, doğal formlarıyla aynı özellikleri gösterirler (Janssens ve ark., 1992; Vandamme ve Soetaert, 2002). Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğine göre aroma maddeleri, doğal aroma maddeleri, doğala özdeş aroma maddeleri ve yapay aroma maddeleri olarak sınıflandırılmaktadır (Anonim, 1997a). 4

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN 2.2. Biyoteknolojik Yollarla Doğal Aroma Maddelerinin Üretim Yöntemleri 2.2.1. Mikrobiyal Yolla Üretim İnsanoğlu yüzyıllardan beri farklı teknikler kullanarak hoş kokulu ve aromalı gıdalar üretmiş, fakat aroma oluşumunda mikroorganizmaların rol oynadığını ancak geçtiğimiz yüzyılda mikrobiyoloji ve biyokimyada yaşanan gelişmeler sayesinde öğrenebilmiştir. Yapılan araştırmalar sonucunda mikroorganizmaların, birçoğu önemli aroma bileşiği olan ikincil ürünleri ürettiği belirlenmiştir (Vanderhaegen ve ark., 2003). Biyoteknolojik yolla doğal aroma maddesi üretim yöntemlerinden birisi de mikroorganizmaların kullanılmasıdır. Mikroorganizmaların kullanıldığı üretim tekniklerinde fermantasyon ve mikrobiyel biyodönüşüm olmak üzere temel olarak iki yöntemden yararlanılmaktadır; Birinci yöntemde, ortamda bulunan karbonhidrat, yağ ve protein gibi maddeler fermantasyona uğramakta ve yıkıma uğrayan bileşiklerden aroma maddeleri üretilmektedir (de novo sentezi). İkinci yöntemde ise, ortama ilave edilen ve reaksiyonu başlatan ön bileşiklerden (prekursör) az basamaklı reaksiyonlarla aroma maddeleri üretilmektedir (Janssens ve ark., 1992). Fermantasyonla üretimde karbon ve azot kaynaklarına ihtiyaç duyulurken, mikrobiyel biyodönüşümde uygun bir substrat yeterli olmaktadır. Her iki yöntemin genel özellikleri karşılaştırılarak Çizelge 2.1 de verilmiştir. 5

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN Çizelge 2.1. Fermantasyon ve mikrobiyel biyodönüşümlerin genel özellikleri (Winterhalter ve Schreier, 1993) Özellik Fermantasyon Mikrobiyal biyodönüşüm Mikroorganizmalar Çoğalan hücreler Çoğalma evresindeki ve durgun evredeki hücreler Reaksiyon Birden fazla reaksiyon Basit (tek veya birkaç basamaklı) katalitik reaksiyonlar Reaksiyon süresi Uzun Kısa Substrat Ucuz karbon ve azot kaynakları Spesifik (bazen pahalı) Ürün Doğal Doğal veya yapay Ürün miktarı Az Yüksek Ürünün saflaştırılması Zor Kolay 2.2.1.1. Fermantasyon Yoluyla Üretim Fermantasyon, çok eski zamanlardan beri gıda biliminde sürekli kullanılan bir yöntemdir. Biyokimyasal yönden fermantasyon, mikroorganizmalar tarafından salgılanan enzimlerin organik maddelerde oluşturduğu parçalanma veya kimyasal değişiklikler olarak tanımlanır (Canbaş, 1988). Biyoteknolojide ise, bir ürünün mikroorganizma kültürleri vasıtasıyla uygun koşullarda üretilmesidir. Oluşan ürün biyokütle, enzimler ve metabolitler olabildiği gibi, bazı bileşiklerin modifikasyonu da gerçekleştirilebilmektedir (Stanbury ve ark., 1995). Aynı zamanda organik asitlerin, antibiyotiklerin, amino asitlerin ve nükleik asit türevlerinin üretimi için de uygun bir yöntemdir. Bu teknikte ucuz karbon ve azot kaynakları kullanılmakta ve amaçlanan ürün, mikroorganizmaların karmaşık metabolik etkinlikleri sonucu meydana gelmektedir (Korukluoğlu, 1998). Mikroorganizmaların bazı aroma maddelerini sentezleyebilme yeteneğinde oldukları uzun zamandan beri bilinmektedir. Üretiminde fermantasyonun temel rol oynadığı şarap, bira, yoğurt, ekmek gibi birçok geleneksel gıdanın karakteristik 6

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN özelliğini ve aromasını mikroorganizmaların faaliyeti sonucunda oluşmaktadır (Janssens ve ark., 1992). Mikroorganizmalar karbonhidrat, alkol, protein, yağ gibi çeşitli maddeleri kullanarak aroma maddelerini üretebilmektedir. Fermantasyon yoluyla aroma maddelerinin üretiminde yüzey kültür ve derin kültür yöntemleri olmak üzere başlıca iki yöntem kullanılmaktadır (Berger, 1995). Yüzey kültür yönteminde mikroorganizmalar sıvı, yarı katı veya katı substratların yüzeylerinde gelişir. Bu sistemde metabolizma ürünü, mikroorganizma türüne göre hücre içinde kaldığı gibi hücre dışına da salgılanabilir veya her iki halde de bulunabilir. Üretim sırasında yüzey alanı arttırıldıkça havadan oksijen sağlanması ve mikroorganizmanın substrat içerisinde homojen bir şekilde dağılımı daha kolay olmakta ve verimde artış sağlanmaktadır (Pekin, 1993; Najafpour, 2007). Bu amaçla son yıllarda döner tamburlu ve daldırmalı biyoreaktörler geliştirilmiştir (Longo ve Sanromán, 2006). Derin kültür yönteminde ise mikroorganizmalar substratın içerisinde gelişir. Gereken hava/gaz karışımı çoğunlukla uygun bir havalandırma düzeneği ile fermantasyon ortamına verilir. Bu amaçla karıştırma ve havalandırma özelliğine sahip fermentörler kullanılır (Pekin, 1993; Najafpour, 2007). Aroma üretiminde yüzey kültür yöntemi daha yaygın kullanılır ve özellikle ucuz tarımsal atıklardan aroma eldesinde tercih edilir. Kullanılan bu iki yöntem kıyaslanacak olursa, yüzey kültür yöntemi derin kültür yöntemine göre düşük maliyetle daha yüksek verimde ve daha iyi özellikte ürün elde edilmesini sağlamaktadır (Couto ve Sanromán, 2006). Fermantasyon yoluyla aroma maddesi üretiminde izlenecek yol sırasıyla aşağıda verilmiştir (Şekil 2.1) (Stanbury ve ark., 1995). -Fermantasyon ortamının formülasyonu veya bileşiminin belirlenmesi, -Fermantasyon ortamının, fermentörün ve kullanılacak ekipmanların sterilizasyonu, -Üretim fermentörünün aşılanması için yeterli miktarda aktif saf kültürün üretilmesi, -Ürün oluşumu için fermentördeki mikroorganizmaların en uygun şartlarda gelişmesi, -Ürünün fermantasyon ortamından ekstraksiyonu ve saflaştırılması -İşlem sonrası oluşan atıkların arıtılması. 7

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN Mikroorganizmaların fermantasyon sırasında oluşturdukları başlıca aroma maddeleri yüksek alkoller, esterler, uçucu asitler, karbonil bileşikleri, terpenler, laktonlar, pirazinler ve kükürtlü bileşiklerdir (Reineccius, 2006). Biyokütle Fermantasyon sıvısı Hücre ayırma Stok kültür Orbital karıştırıcı Aşılama fermentörü Sıvı kısım Ortamın sterilizasyonu Üretim fermentörü Ürün ekstraksiyonu Ortamın formülasyonu Ürünün saflaştırılması Atıkların arıtılması Ortam ham maddesi Ürünün paketlenmesi Şekil 2.1. Tipik bir fermantasyon işlemi (Stanbury ve ark., 1995). 2.2.1.2. Biyodönüşüm Yoluyla Üretim Mikroorganizmaların bir bileşiği yapısal yönden kendisine benzer başka bir bileşiğe dönüştürmesi olayına mikrobiyel biyodönüşüm denir (Crueger ve Crueger, 1990). Bir başka deyişle, mikroorganizmalar tarafından katalizlenen kimyasal dönüşümlerdir. (Telefoncu, 1995). Biyodönüşüm olayına en klasik örnek olarak asetik asit bakterileri tarafından etil alkolden asetik asit üretimi gösterilebilir. Günümüzde mikrobiyel biyodönüşümle üretilen birçok aroma maddesi olmasına karşın bunların halen büyük çoğunluğu araştırma düzeyindedir. Bunlardan önemli bulunanlar ve endüstriyel düzeyde üretilenler Çizelge 2.2 de verilmiştir. 8

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN Çizelge 2.2. Mikrobiyal biyodönüşümle üretilen bazı aroma maddeleri Bileşik Mikroorganizma Substrat Oluşan koku Vanilin Serratia Ferulik asit Vanilya Amycolatopsis Pseudomonas Öjenol İzoöjenol γ-dekalakton Candida Risinoleik asit Şeftali Yarrowia Sporobolomyces Benzaldehit Ischnoderma L-Fenilalanin Badem İzoamil asetat W. saturnus Amil alkol Muz 2-Feniletanol Saccharomyces L-Fenilalanin Gül benzeri Kluyveromyces Mikrobiyel biyodönüşüm sırasında gerçekleşen bazı reaksiyon türleri arasında oksidasyon, hidroliz, esterleşme, dehidrasyon, fosforilasyon, C-C bağlarının koparılması, indirgenme reaksiyonları gelmektedir. Biyodönüşümde genellikle verim çok yüksektir. Verimi etkileyen faktörler arasında mikroorganizma türü, ph, sıcaklık, hücre zarı geçirgenliği, ürün inhibisyonu, substratların ortamda çözünürlük derecesi gibi özellikler sayılabilir. Birçok mikrobiyal biyodönüşüm olayında iki substrat gereklidir. Bunlardan biri mikroorganizmaların gelişmesi için gereklidir. Diğeri ise, dönüşüme uğrayacak substrattır. Mikroorganizma gelişimi için gerekli substrat doğal kaynaklardan ucuz olarak karşılanabileceğinden maliyet düşürülmüş olur (Crueger ve Crueger, 1990). Biyoteknolojide kullanılan farklı mikrobiyal biyodönüşüm teknikleri vardır. Bunlar; Çoğalan hücreler ile biyodönüşüm: Hücreler ideal besi ortamında üretilir ve yapılan testlerle belirlenen şekilde biyodönüşüme uğratılacak substrat ortama katılır, 9

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN Durgun evredeki hücreler ile biyodönüşüm: Mikroorganizma ideal besiyerinde üretilir, filtrasyon veya santrifüj ile ayrıldıktan sonra biyodönüşüm ortamına ilave edilir, Sporlar ile biyodönüşüm: Küfler spor oluşumu için ideal koşullarda üretilir ve sporlar misellerden ayrılıp soğukta saklanır. Biyodönüşüm yapılacağı zaman bu sporlardan yararlanılır, İmmobilize hücreler ile biyodönüşüm: Mikroorganizmalar ürün ve substratın geçişine izin veren bir polimer matrikste (poliakrilamid, kapa-karragenan, alginat, selüloz, nişasta vb.) tutuklanır veya bir polimere bağlanır. İmmobilize hücreler istenildiği anda ortamdan uzaklaştırılabilir, yeniden kullanılabilir, kesikli ve kesiksiz fermantasyonlara uygundur (Telefoncu, 1995). Mikrobiyel biyodönüşüm yüksek substrat seçiciliği, az miktarda yan ürün oluşumu ve asıl ürünün kolay izole edilmesi ve saflaştırılması gibi önemli avantajlara sahip olması nedeniyle daha çok tercih edilmektedir. Bu yöntem aroma maddelerinin yanında bazı katkı maddelerinin endüstriyel ölçekli üretimlerinde de sıklıkla kullanılmaktadır (Xu ve ark., 2007). 2.2.2. Enzimatik Yolla Üretim Enzimler mikrobiyel hücrelere nazaran substratların ürüne dönüşümünde yüksek stereo- ve enantio-seçiciliğe sahip oldukları için aroma maddeleri üretiminde etkin bir biçimde kullanım alanı bulmuşlardır (Berger, 1995). Lipazlar, esterazlar, proteazlar, nükleazlar ve farklı glukozidazlar aroma bileşiklerinin ekstraksiyonu işlemlerinde kullanılan enzimlerden bazılarıdır. Kofaktörden bağımsız olarak çalışan bu enzimler hidroliz ve transesterifikasyon reaksiyonlarıyla optikçe saf alifatik ve aromatik esterlerin ve laktonların üretiminde potansiyel oluşturmaktadırlar (Krings ve Berger, 1998). Enzimatik biyodönüşüm aroma üretiminde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem yaygın olarak ester üretiminde kullanılmaktadır. Lipaz enzimi kullanılarak asit ve alkolden ester sentezlenebilmektedir (Abbas ve Comeau, 2003). 10

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN Enzim katalizli reaksiyonların kimyasal katalizli reaksiyonlara göre bazı önemli üstünlükleri vardır (Telefoncu, 1995). Bunlar; Spesifiklik: Enzimatik reaksiyonlarda prensip olarak yan ürün oluşmaz (etki spesifikliği) ve çoğu enzimler yalnız belirli bir substrat ile oluşan reaksiyonu katalizlerler (substrat spesifikliği), Reaksiyon Koşullarının Ilımlılığı: Enzimatik reaksiyonlar sulu ortamda nötral ph dolayında ve genellikle 40 º C den daha düşük sıcaklıklarda gerçekleşir, Aktivasyon Enerjisinin Düşürülmesi: Enzimatik reaksiyonlarda ara madde katalizi mekanizması sonucu aktivasyon enerjisi çok düşmekte ve reaksiyon yüksek hızla gerçekleşmektedir. Bu üstünlükler kimyasal olarak çok karmaşık yollardan gerçekleştirilebilen veya hiç gerçekleştirilemeyen birçok reaksiyonun enzimler yardımıyla kolayca yürümesine olanak sağlar. 2.3. Esterler Aroma maddeleri arasında esterler ayrı bir öneme sahiptir. Organik bileşiklerin önemli bir sınıfını oluşturan esterler farklı yollarla sentezlenirler. Alkol ve karboksilik asitlerin reaksiyonu sonucu (esterifikasyon); açil gruplarının esterlerle asitler arasında (asidiolizis), esterle alkoller arasında (alkolizis) ve esterlerin kendi aralarında (transesterifikasyon) karşılıklı değişimi sonucu meydana gelebilmektedirler. Uzun zincirli asitlerle alkoller arasında meydana gelen reaksiyonlar sonucu oluşan esterler gıda, deterjan, kozmetik ve farmakoloji endüstrilerinde katkı maddesi olarak kullanılmakta, kısa zincirli asitlerle alkollerin ürünleri ise önemli aroma maddelerini oluşturmaktadır. Fermente içeceklerde en büyük ve en önemli aroma maddeleri grubunu uçucu esterler oluştururlar. Uçucu esterler kendi aralarında iki grupta toplanırlar. Birinci grup asetat esterleridir. En önemlileri etil asetat, izoamil asetat ve feniletil asetat tır. İkinci grup esterleri ise orta zincirli yağ asidi etil esterleri oluşturur. Etil hekzanoat, etil oktanoat ve etil dekanoat yağ asidi etil esterlerine örnek olarak verilebilirler (Verstrepen ve ark., 2003a). Birçok alkol asetatları ticari olarak önemli bileşikler olup bunlardan etil asetat ve 11

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN izoamil asetat aroma sanayinde yaygın olarak kullanılmaktadır (Şekil 2.2). Özellikle izoamil asetat keskin muz aroması vermesi nedeniyle gıda sanayinde tüketimi oldukça fazladır ve yıllık üretimi 74 ton civarındadır (Krishna ve ark., 2001; Güvenç ve ark., 2002; Buzzini ve ark., 2003). O O O O O O Etil asetat İzoamil asetat Feniletil asetat O O İzobütil asetat Etil kaproat Şekil 2.2. Aroma sanayinde kullanılan bazı önemli esterler (Verstrepen ve ark., 2003a). O O 2.3.1. Biyoteknolojik Yollarla Esterlerin Üretimi Esterlerin doğal formları oldukça pahalı ve zor temin edilirler. Kimyasal olarak sentezlenenler ise ucuz ama doğal olmadıkları için tercih edilmemektedir (Vadali ve ark., 2004). Bu nedenle son dönemlerde bu aroma maddelerinin doğal formlarının enzim ve mikroorganizmalar yardımıyla üretimi üzerine yapılan çalışmalar artmıştır. Özellikle esterazlar ve lipazlarla üretimleri üzerine yapılmış çalışmalar fazladır (Horton ve ark., 2003). Genellikle farklı kaynaklardan elde edilen serbest ve immobilize lipazlarla organik çözücülerde üretimleri üzerine çalışmalar yapılmıştır. Güvenç ve ark. (2002), Mucor miehei den elde ettikleri serbest lipazları kullanarak heptan içerisinde esterifikasyonla 37 C de 24 saat içerisinde 26 g/l (% 80 verimle) izoamil asetat elde edildiğini ve Candida cylindraccea dan elde edilen 12

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN immobilize lipazlarla hekzan içerisinde, 30 C de 24 saatlik bir süre sonunda % 100 verimle (17 g/l) izoamil asetat üretiminin gerçekleştirildiğini bildirmişlerdir. 2.3.2. Esterlerin Oluşum Mekanizması Esterler, kimyasal veya biyokimyasal yolla sentezlenirler (Şekil 2.3). Kimyasal yol, yani alkol ve asit arasındaki basit ve kondensasyon reaksiyonu ile oluşum oldukça yavaştır. Bu nedenle, esterler mikroorganizmalar tarafından genellikle biyokimyasal yolla üretilir (Şekil 2.4). - Kimyasal sentez (kondensasyon reaksiyonu): R -OH + R-COOH R-COO-R + H 2 O - Biyokimyasal sentez (alkol asetiltransferaz reaksiyonu): R -OH + R-CO ~ SCoA R-COO-R + CoASH Şekil 2.3. Esterlerin kimyasal ve biyokimyasal yolla sentezlenmesi (Mason ve Dufour, 2000). Maya hücresi esterleri, alkol ve asetil koenzim A arasında meydana gelen ve çeşitli enzimler tarafından katalizlenen reaksiyonlar sonucunda oluşturur (Peddie, 1990; Mason ve Dufour, 2000; Quilter ve ark., 2003; Verstrepen ve ark., 2003a). Ester üretiminde etkili olan en önemli enzimler ATF1 ve ATF2 genleri ile kodlanan alkol asetiltransferazlardır (AATaz I ve AATaz II; EC 2.3.1.84). Ester üretiminden sorumlu olan enzimlerle esterleri hidroliz eden esterazlar arasındaki denge, oluşan net ester miktarı açısından önemlidir. Bu yüzden, esteraz aktivitesindeki artış oluşan ester miktarında düşüşlere neden olabilmektedir (Verstrepen ve ark., 2003a). S. cerevisiae ile izoamil asetat ve etil asetat gibi asetat esterlerinin üretiminde alkol asetiltransferaz, etanol asetiltransferaz ve izoamil alkol asetiltransferaz olmak üzere 13

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN üç farklı enzimin rol oynadığı bildirilmektedir (Peddie, 1990; Erten ve Canbaş, 2003). Oksijen Doymamış yağ asitleri Fermente edilebilir şeker Azot Azot metabolizması Yüksek alkol Asetil koenzim A AATaz genleri (ATF 1, ATF 2) Ester sintaz Ester Şeker ve lipid metabolizması Ester Şekil 2.4. Mayalarda ester oluşumunun biyokimyası (Verstrepen ve ark., 2003a). Mayaların esterleri neden oluşturduğu konusunda kesin bir bilgi bulunmamaktadır. Ancak bu konuda çeşitli varsayımlar ileri sürülmüştür (Peddie, 1990; Dufour ve Malcorps, 1995). Bu varsayımlara göre; 1. Esterler, alkol fermantasyonu sırasında şekerlerin metabolizmasından ortaya çıkan bileşikler olabilir ve hücre için önemli değillerdir, 2. Ester oluşumu asetil yükünün kontrolü açısından önemli olabilir, çünkü asetil koenzim A ve serbest-koenzim A miktarları ara reaksiyonlar için önemlidir, 3. Ester üretimi, toksik maddeleri uzaklaştırma mekanizması ile ilgili olabilir; özellikle C8-C14 arasındaki yağ asitleri maya için toksiktir; ester oluşumu ile bu yağ asitlerinin maya hücresine olumsuz etkileri ortadan kaldırılır. Fermantasyonun başlangıcında yani logaritmik çoğalma evresinde esterlerin sentezi oldukça düşüktür. Bunun sebebi, maya gelişimi için asetil koenzim A ya duyulan metabolik ihtiyaçtır. Oksijen ve asetil koenzim A doymamış yağ asitlerinin 14

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN ve sterollerin üretiminde hızla tüketilir. Daha sonra, doymamış yağ asitleri ve sterollerin üretimi ile ester üretimi için kullanılan asetil koenzim A miktarı dengelenir. Bu evre ester üretiminin ilk aşamasını oluşturur ve fermantasyonun ilk sekiz saatinde gerçekleşir. Yağ asitlerinin ve sterollerin sentezi sona erdiğinde ortamdaki asetil koenzim A miktarı (ve asetil yükü) artar ve en yüksek seviyesine ulaşır. Kısa süren bu evre ise, ester oluşumun ikinci aşamasını oluşturur ve fermantasyonun ortalarında (yirminci ve otuzuncu saatler arası) yani durgun evrede görülür. Ancak, esterlerin büyük bir kısmı bu aşamada oluşturulur (Peddie, 1990). 2.3.3. Ester Oluşumunu Etkileyen Faktörler Fermantasyon işlemlerinde esterlerin oluşumuna etki eden birçok teknolojik parametre vardır. Bu parametreler Çizelge 2.3 te verilmiştir. Çizelge 2.3. Fermantasyon sırasında ester oluşumunu etkileyen faktörler (Dufour ve Malcorps, 1995) Maya Karakteristiği Ortam bileşimi Fermantasyon koşulları Maya türü Lipidler Sıcaklık Fizyolojik durum Oksijen Basınç Aşılama oranı Şeker içeriği Karıştırma Kullanılabilir azot Çinko Fermentör dizaynı Fermantasyon yöntemi 2.3.3.1. Maya cinsi Maya ester üretimini etkileyen önemli faktörler arasındadır. Her mayanın kendine has karakteristik ester profili vardır ve bazı esterleri diğerlerinden fazla üretebilmektedirler (Peddie, 1990). Mayalar arasındaki ester üretim farklılıkları ise büyük ölçüde mayalardaki AATaz aktiviteleri ile ilişkilendirilmektedir. Bu yüzden mayalar arasındaki bu tip genetik farklılıklar ester üretiminin optimizasyonunda bir 15

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN kriter olarak kullanılmaktadır (Verstrepen ve ark., 2003a). Ortama aşılanan maya miktarının artması üretilen ester miktarını azaltmaktadır. Peddie (1990), aşılanan maya miktarının normal miktarın iki katı olması durumunda sadece etil asetat miktarında önemsiz artışlara neden olduğunu bildirmiştir. Quilter ve ark. (2003) ise, ortama aşılanan maya miktarında 12 g/l lik bir artışın sadece izoamil asetat ve amil alkol miktarlarında çok az bir artışa neden olduğunu belirlemiştir. Pichia ve Hanseniaspora cinsine ait mayaların etil alkol, jeraniol, izoamil alkol ve 2- feniletanol gibi alkollerin esterifikasyonunu sağlayarak meyvemsi aromaya sahip esterleri üretirken (Mingorance-Cazorla ve ark., 2003), benzer şekilde, Williopsis, Candida, Debaryomyces, Hanseniaspora ve Issatchenkia cinslerine ait mayaların kullanıldığı fermantasyonlarda izoamil alkol ve izoamil asetat ın uçucu bileşikler arasında en yüksek konsantrasyona sahip bileşikler olduğu belirlenmiştir (Buzzini ve ark., 2003). Kluyveromyces marxianus un ise elma posası, melas, ayçiçeği kepeği ve hurma kepeği gibi farklı ortamlarda fermantasyonla aroma bileşiklerini ürettiği belirlenmiş ve üretilen bileşikler arasında en fazla etil asetat, etanol ve asetaldehite rastlanmıştır (Medeiros ve ark., 2000). Farklı maya türleri tarafından üretilen çeşitli esterler Çizelge 2.4 te verilmiştir. 16

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN Çizelge 2.4. Farklı maya türleri tarafından üretilen esterler (mg/l) (Fleet ve Heard, 1993; Erten, 1997; Erten ve Campbell, 2001; Zöhre ve Erten, 2003) Maya türleri Etil İzobütil Etil İzoamil Etil Etil asetat asetat bütirat asetat hekzanoat oktanoat S. cerevisiae 6-970 0.1-0.4 0.05-3.7 0.1-16 0.01-3.2 0.01-1.5 Kloeckera apiculata 25-870 0.2-0.04-5 0.02-1 0.04-0.8 Hansenula (Pichia*) anomala 137-2150 - - 1-11 - - P. fermentans 92-554 0.04-0.8 0.04-0.4 0.5-9 0.75 1.3 P. membranefaciens 30 - - - - - Hansenula (Pichia*) subpelliculosa 21 - - - - - Hansenula (Williopsis*) saturnus 385 - - 27 - - *KURTZMAN, 1998 a göre 2.3.3.2. Ortam bileşimi Fermantasyon ortamında bulunan lipitler ester oluşumunu etkileyen faktörler arasında yer alır. Oleik, linoleik ve linolenik gibi doymamış yağ asitlerini fazla miktarda içeren fermantasyon ortamlarında sentezlenen ester miktarı düşük olmaktadır ve bu durumun birkaç nedeninin olduğu tahmin edilmektedir. Bunlar; doymamış yağ asitlerinin hücreye alınması sırasında hücre membranının geçirgenliğinin değişmesi, ATTaz enziminin aktivitesinde azalma ve doymamış yağ asitlerinin hücre gelişimini teşvik ederek ortamda ester sentezi için yeterli miktarda asetil koenzim A nın bulunmamasına yol açmasıdır (Peddie, 1990; Dufour ve Malcorps, 1995). Dufour ve Malcorps (1995), bira şırasına 178 μm linoleik asit 17

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Murat YILMAZTEKİN ilavesinden sonra oluşan etil asetat miktarında yaklaşık % 80 oranında bir düşüş olduğunu belirlemişlerdir. Fermantasyon ortamında bulunan toplam şeker miktarının yanında, fermente olabilir şeker içeriği de ester oluşumunu etkiler. Genellikle yüksek glukoz ve fruktoz içeriğine sahip ortamlarda yüksek maltoz içeren ortamlara nazaran daha fazla ester oluşumu gözlenmiştir. Bunun sebebi henüz açığa kavuşturulmuş değildir. Fakat, glukoz metabolizmasında yüksek seviyelerde asetil koenzim A üretiminin gerçekleştiği ve böylece ester üretiminde artış olduğu tahmin edilmektedir. Diğer varsayımlar ise, glukoz içeren ortamda gelişen hücrelerin daha fazla yüksek alkol ürettikleri veya glukozun AATaz ı kodlayan ATF1 ve ATF2 genlerini daha fazla açığa çıkardığı doğrultusundadır (Younis ve Stewart, 1998; Verstrepen ve ark., 2003b). Plata ve ark. (2003), farklı kaynaklardan elde edilen P. subpelliculosa, Kluyveromyces marxianus, Torulaspora delbrueckii ve S. cerevisiae türlerine ait mayalarla, fermente edilebilir şeker olarak 250 g/l glukoz içeren sentetik şırada gerçekleştirilen fermantasyon denemelerinde en yüksek izoamil asetat ve etil asetat üretiminin fermantasyonun ilk 72 saatinde gerçekleştiğini bildirmişlerdir. Ester üretiminin fermantasyonun ilk safhasında gerçekleşmesinin muhtemel nedeni olarak AATaz enziminin aktivitesinden kaynaklandığı ileri sürülmüştür. Diğer bir çalışmada ise, melasta S. cerevisiae ile gerçekleştirilen fermantasyonlarda, ortam yoğunluğu yani şeker içeriği arttıkça izoamil asetat miktarının 4.2 mg/l den 17.4 mg/l ye yükseldiği belirlenmiştir (Quilter ve ark., 2003). 2.3.3.3. Sıcaklık Sıcaklık ester oluşumunu etkileyen önemli faktörlerden biridir. Genellikle 10-25 ºC aralığında artan ortam sıcaklığı üretilen ester miktarını arttırmıştır. 12 ºC de üretilen ester miktarının 10 ºC de üretilen ester miktarından % 75 oranında daha fazla olduğu bildirilmiştir. Aynı şekilde, ortam sıcaklığı 10 ºC den 16 ºC ye çıkarıldığında üretilen ester miktarındaki artış % 40-50 olarak bulunmuştur (Peddie, 1990; Verstrepen ve ark., 2003a). Fakat mayalar, farklı ester türleri göz önüne 18