1. GİRİŞ Süt, canlının gereksinimlerini karşılayabilecek bütün besin maddelerini; yani değerli proteinleri, lipidleri, şekerleri, mineral maddeleri, vitaminleri ve yaşam için gerekli birçok besin elementini yeter ve dengeli biçimde içeren tek gıdadır (Kurt 1993). Mikroorganizmaların gelişmesine çok uygun bir ortam olan süt, gerekli önlemler alınmadığında niteliğini uzun süre koruyamaz, bozulur. Bunu önlemek için süt uygun yöntemlerle işlenerek dayanıklı ve güvenli hale getirilerek, çeşitli ürünlere dönüştürülerek tüketicinin yararına sunulmaktadır (Üçüncü 2005). Tüketiciye sunulan bu ürünlerin raf ömürleri süresince dayanıklılıklarını yitirmemeleri gerekmektedir. Aksi halde tüketicinin arzu ettiği tat-aroma, yapı, kalite kaybolacaktır. Avrupa kalite kontrol örgütü kaliteyi; ürün ya da hizmetin belirli bir gereksinimi karşılama yeteneklerini etkileyen karakteristik özelliklerin tamamı olarak tanımlamaktadır (Köseoğlu 2006). Bu kapsamda peynir, yoğurt, Ayran ve diğer fermente süt ürünlerinde, standart kaliteyi sağlamada, karakteristik tat ve aroma elde etmede kullanılan starter kültürler etkilidirler (Tunail 1983, Halkman 1991). Starter kültürler: Sütte bulunan zararlı mikroorganizmaların gelişimini sınırlamak, ürüne özgü tat-aroma ve yapının oluşmasını sağlamak ve her zaman aynı yüksek standart kalitede ürün elde etmek amacı ile süte katılan yararlı mikroorganizmalar olarak tanımlanabilir (Üçüncü 2004). Süt ürünlerinde yaklaşık 100 yıldan bu yana endüstriyel boyutta üretilmiş starter kültürler kullanılmaktadır (Aslım vd. 2000). Her ne kadar yoğurt ve peynirle ilgili arkeolojik bulgular günümüzden 6000 yıl öncesine gitmekte ise de süt endüstrisinde bilinçli olarak starter kültür kullanımına 1970 lerden sonra başlanmıştır (Merilainen 1988, Koçak vd. 1994). Bugün başta laktik asit üretimi, proteolitik aktivite, faj dirençliliği, aroma oluşturma gücü vb. özelliklere göre seçilmiş starter kültürler süt ürünleri endüstrisinde yaygın bir şekilde kullanılmaktadır (Demirci 2000). 1

Standart kalitede ve sağlıklı süt ürünlerinin elde edilmesi için hiç kuşkusuz iyi, kaliteli sütün kullanımı ve hijyenik koşullarda üretimin yanı sıra pastörizasyon ve benzeri etkin ısıl işlemlerin uygulanmasına bağlıdır (Akın 2006). Fakat uygulanan ısısal işlemler, sütte bulunan patojen ve diğer zararlı mikroorganizmalarla birlikte yararlı bazı bakterilerin de yok olmasına neden olmaktadırlar. Pastörizasyon ile öldürülemeyen ısıl işlemlere dirençli bakteriler, ya da üretim sürecinde bulaşabilen çeşitli mikroorganizmalar kolaylıkla gelişerek ortama egemen olmakta ve üründe kusurlara yol açmaktadır. Fermente süt ürünlerindeki tipik lezzetin oluşturulabilmesi için süte, pastörizasyon ile yitirilen yararlı bakterilerin saf kültür halinde katılması teknolojik bir zorunluluktur (Demirci 2000, Üçüncü 2005, http://www.mikrobiyoloji.org/genelpdf/210011002.pdf., 2007). Süt ürünlerinin çoğunun (peynir ve fermente süt ürünleri) yapımında genel ilke, sütün bileşiminde bulunan temel besin maddelerinin, başta laktoz olmak üzere protein ve yağın belirli düzeylerde parçalanmasına dayanır. Bu bağlamda en önemli görev saf kültür mikroorganizmalarına yani laktik asit bakterilerine düşer. Gerçekte bu bakterilerden istenen de ürünler bazında belirli oranda laktik asit ile tat ve aroma maddelerini oluşturmak, belli düzeyde proteoliz gerçekleştirmek, antimikrobiyel etkinlik göstererek istenmeyen ve patojen bakterilerin etkinliklerini sınırlamak ve bazı ürünler için polisakkarit oluşturmaktır (Kosikowski and Mistry 1997, Üçüncü 2004, 2005). Süt endüstrisinde kullanılan kültürler esas olarak laktozu parçalayarak laktik asit oluştururlar (Stanley 1998, Aslım vd. 2000, Akın 2006). Starter kültürler proteolitik enzimlere de sahiptirler (Kılıç 1991, Üçüncü 2005). Laktik asit bakterilerinin lipolitik aktiviteleri sonunda oluşan parçalanma ürünleri (keton, ester ve aldehit) aromaya katkı sağlarlar. Süt ve süt ürünlerinin çoğunda serbest yağ asitlerinin oluşumu istenmemesine karşın, diğer bileşenlerle birlikte karakteristik aroma meydana getirdiklerinden bazı ürünlerde bu asitlerin oluşumu arzu edilir (Üçüncü 2005). 2

Gıdalarda mikroorganizmaların etkili şekilde gelişimlerinin kontrol altına alınmasında farklı yöntem ve uygulamalar bulunmaktadır. Geçmişte mikrobiyel ekosistemi etkileyen faktörlere ilişkin çeşitli önlemler alınmasına karşın, günümüzde bu önlemler daha çok gıda ürünlerinin karakteristik duyusal özelliklerinin oluşumunu etkileyen mikrobiyel gelişme derecesi ve mikroorganizma metabolizmasının direkt olarak kontrol edilmesi üzerine yoğunlaşmıştır (Anonim 2006). Bu amaçla kullanılan starter kültürlerin işlevlerini tam anlamıyla yerine getirebilmesi için aktivitelerinin yeterli olması gerekmektedir. Ayrıca kültürlerin aktivitelerini azaltıcı bütün olumsuzluklar en etkin biçimde ortadan kaldırılmalıdır. Starter kültürlerin glikolitik aktivite sonunda oluşturduğu laktik asit ürünün karakteristik özelliklerinin oluşmasında etkilidir (Stanley 1998). Starter kültür aktivitesi inkübasyondan sonraki soğutma, asitlik, depolama süresindeki sıcaklık ve süreye bağlı olarak değişiklik gösterir. Starter kültürlerin metabolik aktivitesini kontrol etmek için soğutma önemlidir ve dikkat edilmesi gereken bir kriterdir (Ross 1982, http://www.dairyscience.info/cheese-starters-htm., 2007). Starter kültürlerin aktivitelerini olumsuz yönde etkileyen bir faktör de bakteriyofaj riskidir. Bakteriyofaj, yararlı bakteri hücresine girerek, orada çoğalan ve hücreyi parçalayarak, erimesine yol açan virüslerdir (Akın 2006). Faj enfeksiyonu, starter kültürlerin asidifikasyon hızını yavaşlatır ve ciddi boyutlarda ekonomik kayıba yol açar (Pearce 1969, Cogan and Accolas 1990, Emond et al. 1998, http://www.cheesereporter.com/comotto/comotto.oct12.2007.htm., 2007, Anonymous 2008a, http://www.wipo.org/pctdb/en/wo.jsp?wo=1999009838, 2008). Süt fermentasyon süreçlerindeki kesintilerin ana nedeni faj enfeksiyonu ile starter bakterilerin parçalanması ve bunun sonucunda laktik asit üretiminin azalmasıdır (Tükel 2002). Fajların aktiviteleri sonucunda üretim süreleri uzar, üretim kalitesi düşer ve en kötüsü üretimin tamamiyle kaybına neden olur. Bu sebeplerden dolayı kullanılan kültürlerin faj enfeksiyonu sonucu inaktive olması halen bütün dünyada önemini koruyan ticari bir sorundur (Cogan and Accolas 1990, http://www.foodsci.uoguelph.ca/dairyedu/micro.html#starter, 2007). Süt endüstrisinde starter kültürlerin önemi ekonomik açıdan yüksek olduğundan, bakteri ölüm ve bakteri canlı sayısının zarar görmesinin minimize edilmesi gerekir. Starter 3

kültürlerin üreme ve gelişmesini etkileyen faktörlerle ilgili detaylı bilgiler çoğu çalışmalarda belirtilmiştir (Gray and Postgate 1976, Andrew and Rusell 1984, Hurst and Nasim 1984, Akın 2006). Bakteri sayısı, gıdalarda mikrobiyolojik kalitenin belirlenmesinde indikatör olarak yaygın şekilde başvurulan bir kriterdir (Doğan ve Tükel 2000). Fermente süt ürünlerinin üretiminde kullanılacak starter kültürler maksimum canlı bakteri sayısına sahip olmalıdırlar (Akın 2006). Süt sanayii açısından starter kültürlerin endüstriyel özelliklerinin belirlenmesi yararlı bir uygulamadır. Kültürlerin tam anlamıyla tanımlanmaları, morfolojik ve fizyolojik özelliklerinin belirlenmesiyle mümkündür. Süt endüstrisinde direkt kültür kullanımı (direct-to-vat) rahat olup, faj enfeksiyon riskini elimine ettiği ve içerdiği suşların dengeli olması nedeniyle tercih edilmektedir. İnkübasyon süresinin biraz uzaması dışında, son üründeki bakteri sayısı ve oranları konusunda daha kesin sonuçlar alınmakta, iş gücü ve enerji tasarrufu sağlanmaktadır. Fakat fiyatı pahalı olduğu için işletmeciler bu tip kültürleri sürekli kullanamayabilirler. Ekonomik yönden daha uygun olan bulk starter kültür üretimini tercih etmektedirler (Anonymous 1998, Surono and Hosono 2002, Anonymous 2008a). Bu araştırmada, endüstride çok kullanılan, süte katılan ve yararlı mikroorganizmalar olarak tanımlanan bulk starter kültürlerin bazı özelliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda ülkemizde ticari olarak satılan yoğurt, Ayran, Kaşar peyniri ve Beyaz peynir kültürleri kullanılmıştır. Kültürlerin işlevlerini tam olarak yapabilmeleri aktivitelerine bağlı olduğundan, araştırmada bulk starter kültürlere 5 gün boyunca; * Aktivite testi * Faj testi (sadece ilk gün) * Bakteri koloni sayılarının belirlenmesi işlemleri uygulanmıştır ve sonuçlar istatistik olarak değerlendirilmiştir. 4

2. KURAMSAL TEMELLER Genel bir tanımlama ile gıda üretiminde kullanılan mikroorganizmalara starter kültür denilir (http://www.mikrobiyoloji.org/genelpdf/942000310.pdf., 2008). Ya da starter kültür kontrollü koşullarda standart kalitede ürün elde etmek için gıda sanayiinde kullanılan mikroorganizmalardır (Ateş ve Patır 2001, Kayagil 2006). Bazı gıdalarda işlevi asit geliştirmek iken, bazı gıdalarda aroma geliştirme, tekstürü iyileştirme ve proteolitik aktivite gibi belirli bir amaca yönelik olarak kullanılırlar (Cogan and Accolas 1990, Halkman 1991). Bu nedenle çeşitli fermente süt ürünlerinin üretiminde kullanılmak üzere farklı laktik asit bakterileri içeren saf kültürler hazırlanır. Uluslararası pazarlama yapan saf kültür üretim laboratuvarları genellikle farklı aroma profillerinde ve farklı yapısal özellikler sağlayacak kültürler hazırlamaktadır. Süt fabrikaları bu kültürlerden birini seçerek, tüketiciler için düzenli olarak aynı tat, aroma ve yapıda ürün üretirler (Tağhan ve Öztürk 2002). Süt endüstrisi açısından bu kültürlerin kullanımı çok avantajlıdır (Mora et al. 2004). Çiğ sütte peynir ve tereyağ için gerekli bakteriler bulunurken, yoğurt, kefir, kımız için gerekli mikroorganizmalar son derece azdır. Dolayısı ile bu ürünlerin yapımı için dışarıdan starter kültür ilavesi zorunludur. Endüstriyel üretimde süt pastörize edildikten sonra starter kültür ilave edilir. Çünkü çiğ sütün pastörizasyonu sonunda yararlı bakteriler imha olmaktadır ve yerine geçecek bakterilere ihtiyaç duyulmaktadır (http://www.mikrobiyoloji.org/genelpdf/210011002.pdf., 2007). Starter kültürler ticari stabilizatörlere alternatif olarak kullanılabilmektedir. Starter kültürlerin kullanımı ile yoğurdun tekstüründe iyileşme ve serum ayrılmasında azalma sağlanmaktadır. Süt ürünlerinde viskoziteyi artırıcı, yapıyı kalınlaştırıcı, stabilize edici ve su bağlayıcı olarak da yararlanılmaktadır (Milci vd. 2005). Peynir mezofilik bakteri florası içinde, doğal mikrofloradan ve peynire starter olarak katılan bakterilerden kaynaklanan çok çeşitli mikroorganizmalar bulunabilir. Bu 5

bakteriler laktik asit, aroma ve tat gelişiminde etkili olan maddeler üretirler (Northold 1984, Zottola 1992, Üçüncü 2005, Köseoğlu 2006). Koruyucu kültürler gıdalarda doğal olarak bulunabilen ya da bulunmayan gıda üretiminde kullanıma uygun bakterilerdir. Bu tip kültürler de fermentasyonda istenilen doku ve lezzet profilini sağlama ya da probiyotik olan türlerin sağlığa yararlı etkilerinden daha çok bir ürün içinde gelişme kabiliyeti ve patojen ya da istenmeyen bakterileri inhibe etme potansiyellerine göre seçilmektedir (Kesenkaş vd. 2006). Şenel (1999) maya ile kontamine edilen (kontrol) ve maya kontaminantı ile birlikte koruyucu kültür katılan örneklerle referans örnekteki yoğurt bakterilerinin sayısını depolama süresince belirlemiştir. Aynı çalışmayı küf ile de tekrarlamıştır. Maya ile yapılan çalışmada koruyucu kültür katkılı örneklerdeki yoğurt bakterilerinin sayısı referans örneğe kıyasla büyük bir farklılık göstermemiştir. Referansın bakteri sayısı 1.gün 9x10 6 kob/ g, 30.gün 37x10 7 kob/ g; katkılı örnekteki bakteri sayısı ise 1.gün 5,9x10 6 kob/ g, 30.gün 30x10 7 kob/ g olarak saptanmıştır. Küf ile yapılan çalışmada ise referans örnekteki yoğurt bakterileri sayıca azalma göstermiştir; 1.gün 26x10 7 kob/ g iken 30.gün 15x10 7 kob/ g olmuştur. Koruyucu kültür katkılı örneklerde ise başlangıç değerlerine göre çok daha az miktarda bir düşüş görülmüştür. Bakteri sayısı 1.gün 26x10 7 kob/ g iken 30.gün 20x10 7 kob/ g olmuştur. Güven vd. (2006) nin yapmış olduğu bir çalışmada, yarı sert Keçi peynirinin kimyasal, fiziksel ve duyusal özellikleri üzerine starter kültür oranı ile pıhtının ısıtılmasının ve olgunlaşma süresinin etkileri araştırılmıştır. Peynirlerin titrasyon asitliği değerlerinin farklı starter kültür oranları ile pıhtının ısıtılması işlemlerinden etkilendiği ve bu değerlerin olgunlaşma süresince arttığı bulunmuştur (p<0,05). Karabıyıklı ve Karapınar (2007) yaptıkları bir çalışmada, Kopanisti peynirinin fermentasyonunda rol oynayan laktik asit bakterilerinin sayısal değişimini fermentasyonun başlangıcından sonuna kadar takip etmişlerdir. Ayrıca fermentasyon süresince peynirdeki küf ve maya sayılarını da belirlemişlerdir. Fermentasyonun farklı 6

aşamalarından izole edilen laktik asit bakterilerini tanımlamaya çalışmışlar ve elde edilen son ürünlerin Türk Gıda Kodeksi nde yer alan peynir standartlarına uygunluğunu saptamışlardır. Peynirlerdeki maya ve küf sayısı 10 6 civarında olup 2001-19 no lu Mikrobiyolojik Kriterler Tebliği ndeki peynir standardında belirtilen sınırların çok üzerinde olduğu belirlenmiştir. Tekinşen (1978) tarafından yapılan bir çalışmada; 0-3 günlük taze Kaşar peynirlerin mezofilik aerobik bakteri sayısı 6,9x10 7-4,2x10 9 adet/ g arasında bulunmuştur. Sert ve Kıvanç (1984) Erzurum piyasasında taze olarak tüketime sunulan 30 adet taze Beyaz peynir örneği üzerinde yaptıkları çalışmada mezofilik aerobik bakteri sayısının 9,3x10 7-9,5x10 9 arasında olduğunu saptamışlardır. Coşkun ve Öztürk (2000), Van da faaliyet gösteren farklı iki işletmeden aldıkları 30 ar adet Kaşar ve Beyaz peynirlerin mikrobiyolojik ve kimyasal özelliklerini incelemişlerdir. Beyaz peynir örneklerinde mezofilik aerobik bakteri sayısı 7,14 log kob/ g; Kaşar peyniri örneklerindeki mezofilik aerobik bakteri sayısı ise 6,77 log kob/g olarak belirlenmiştir. Öner vd. (2005) tarafından yapılan bir çalışmada, tulum peyniri kalitesi üzerinde starter kültür kullanımının etkileri ve tulum peyniri üretimine uygun starter kültür karışımı araştırılmıştır. Bu kapsamda yapılan mikrobiyolojik analiz sonuçlarına göre 90 günlük olgunlaşma sonunda peynirdeki toplam aerob bakteri sayısının 7,25-7,97 log kob/ g arasında olduğu saptanmıştır. Çetinkaya ve Soyutemiz (2006) Kaşar peynirindeki, üretim ve olgunlaşma süresince, mikrobiyolojik ve kimyasal değişimleri incelemişlerdir. Kaşar peyniri örneklerindeki toplam aerobik bakteri sayısı 5,36-6,44 log cfu g -1, laktik asit bakteri sayısı MRS agarda 7,08 7,40 log cfu g -1 ve M17 agarda 5,25 5,76 log cfu g -1 olarak belirlenmiştir. 7

Çelik (2002) yoğurttaki laktik kültürlerin sayımı için MRS agar ve M17 agar ı kullanmıştır. Oluşan koloniler kob/ g şeklinde sayılmıştır. Yoğurt örneklerindeki laktik asit bakterileri sayısı taze yoğurtlarda ortalama 7 log/g civarında, 14 gün depolanan yoğurtlarda ise en düşük bakteri sayısı 3,81 log/g olmuştur. Çalışmada yoğurt örneklerinin titrasyon asitlikleri de belirlenmiştir. Taze olan yoğurtlarda asitlik değerleri en düşük % 1,09 ve % 1,03 olarak saptanmış, en yüksek asitlik değerleri ise 14. gününde % 1,18 ve % 1,17 olarak bulunmuştur. Elliker and Frazier (1938) İsviçre peyniri starter kültürünün aktivitesini belirlemek için bir çalışma yapmışlardır. Steril olarak hazırlanan rekonstitüe süt kültürlerin maksimum gelişebileceği sıcaklık derecelerinde tutulmuştur. Canlı hücre sayısı mikroskopta direkt olarak incelenerek kültür bakterisinin çoğalması gözlenmiştir. Aynı zamanda 8 saat boyunca her saatte ph ve titre edilebilir asitlik de ölçülmüştür. Anderson and Meanwell (1942) Cheddar peyniri starter kültürünün aktivitesini, sterilize edilmiş süte % 1 oranında starter inoküle edip, 6 saat 30 ºC de inkübasyona bırakarak, ölçmüştür. Asitlik, % 0,5 lik fenolfitaleyn damlatılmış inkübe edilmiş sütün 0,11 N NaOH ile titre edilmesiyle belirlenmiştir. Yapılan bir denemede ana starter kültürde, üretimde ilk kullanılırken ölçülen aktivite faktörü 0,56 iken, 3 kez inoküle edildikten sonraki aktivitesi hızla azalmıştır ve aktivite faktörü 0,23 e düşmüştür (Horrall and Elliker 1950). Peynir üretiminde kullanılan dondurulmuş starter kültürlerin aktiviteleri üzerine yapılan bir çalışmada, kültürlerin aktiviteleri, bu kültürle inoküle edilmiş yağsız sütün 30 ºC de 18 saat inkübasyonu boyunca sütün ph değerindeki değişim kaydedilerek izlenmiştir. Elde edilen sonuçlar kontrol starter kültürlerin aktiviteleri ile karşılaştırılmış ve önemli ölçüde farklılık kaydedilmemiştir. Sıvı nitrojen ile dondurulan starter kültürlerin yeniden kullanılmasında ve aktivitelerinde herhangi bir problemle karşılaşılmamıştır. Dondurulmuş kültürler inkübasyonun ilk 6 saatinde çoğalmanın aktif fazında 8

bulunduklarından aktiviteleri durgun fazda yer alan diğer kültürlere oranla daha fazladır (Keogh 1970). Ashour et al. (1985) L. bulgaricus ve S. thermophilus suşlarının tek kültürlerinin asit üretimini % 0,73-0,86; karışık kültürlerinin asit üretimini ise % 1,02-1,20 arasında bulmuşlardır. Jones et al. (1990) % 24 kurumaddeli rekonstitüe yağsız süt ve ultra filtrasyonla konsantre edilmiş retentat kullanılarak hazırlanan ve laktik asit bakterisi içeren peynir bulk starter kültürlerin 2 C de 5 gün depolanmasının, kültürlerin aktivitesi üzerindeki etkisini incelemişlerdir. % 10 rekonstitüe yağsız süt içine kültür inoküle edildikten sonra ortam ph sının 5,2 ve 4,6 ya düşünceye kadarki geçen süre starter kültürün aktivitesinde indikatör olarak kullanılmıştır. İki yöntemde de kültür aktivilerinde ve canlı hücre sayısında bir azalma gözlenmemiştir. Bir rapordan yararlanılarak Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris kültürleri için kültür aktivite testi yapılmıştır. Yağsız süttozundan hazırlanmış pastörize edilmiş rekonstitüe süte (test 1) ve peyniraltı suyu ilave edilmiş süte (test 2) bu kültürlerden % 2 oranında inoküle edilmiştir. 37 ºC de 4 saat inkübasyona bırakılan bu örneklerde inkübasyon sonunda titre edilebilir asitlik test 1 için % 0,34; test 2 için % 0,25 olarak ölçülmüştür. Ayrıca zamana karşı ph değerleri Çizelge 2.1 de grafik gösterimi ise Şekil 2.1 de verilmiştir. Test 1 ortamında kültürün iyi çalışması sonucu ph beklenen değerlere ulaşmıştır. Fakat Test 2 ortamında kültür aktivitesi peyniraltı suyunda bulunan inhibitör bakteriler sonucunda yavaşlamıştır ve ph değeri istenen seviyeye ulaşmamıştır (http://www.foodsci.uoguelph.ca/cheese/sectionb.htm, 2008). 9

Çizelge 2.1 Aktivite testi sonuçları zamana karşı ph değerleri (http://www.foodsci.uoguelph.ca/cheese/sectionb.htm, 2008) SAAT 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 TEST 1 6.62 6.59 6.5 6.4 6.15 5.74 5.39 5.08 4.92 4.87 TEST 2 6.61 6.57 6.5 6.42 6.35 6.31 6.3 6.3 6.29 6.29 Şekil 2.1 Kültür aktivitesi (http://www.foodsci.uoguelph.ca/cheese/sectionb.htm., 2008) Nielsen (1998) peynir üretiminde bulk olarak kullanılan starter kültürlerin aktivitelerini belirlemiştir. % 1,5 oranında kültür inoküle ettiği peynir sütünü 30 C de 5 saat inkübasyona bırakmış ve inkübasyon bitiminde ph değerini kaydetmiştir. Aslım vd. (2000) yağsız süt örneklerine % 1 oranında starter kültür inoküle etmişler ve inkübasyon sonunda aktifleştirilen bakteri kültürlerinde standart kültürel yöntemle canlı hücre sayımı yapılmış. Bu sayımlar sonucu kültürlerde 9,90x10 7 9,32x10 8 kob/ml düzeyinde hücre olduğu görülmüştür. Ayrıca bu çalışmada L. bulgaricus ve S. thermophilus suşlarının tek ve kombinasyonlarının ürettikleri metabolik ürünler belirlenmiştir. Tek kültürlerinin asit üretimi % 0,53-1,20 arasında, karışık kültürlerinin asit üretimi ise % 0,82-1,41 arasındadır. 10

Özyurt (2005) Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus ve Streptococcus salivarius ssp. thermophilus bakterilerinin asidifikasyon aktivitelerini belirlemek amacıyla, -18 C de korunan L. bulgaricus suşları MRS broth, S. thermophilus suşları ise M17 broth besiyerlerinde ikişer kez aktifleştirildikten sonra inokülasyon oranı % 1 olacak şekilde 10 ml yağsız süt (skim milk) besiyeri içeren tüplere ayrı ayrı ekilmiş ve 42-43 C de inkübasyona bırakılmışlardır. Asit aktivitesi, kültürlerin besiyerine inokülasyonundan sonra inkübasyonun başlangıcında ölçülen ph değeri ile, 6. ve 24. saatlerinde ölçülen ph değerlerinin farkı ( ph) alınarak hesaplanmıştır. Endüstriyel kökenli S. thermophilus suşları asit aktivitesi yüksek ( ph:1,08-1,54), orta ( ph: 0,60-0,97) ve yavaş ( ph: 0,09-0,11) olarak 3 gruba ayrılmıştır. Yılmaz (2002) ın pastörize sütlerden izole ettiği S. thermophilus suşlarının 6 saatlik inkübasyon sonuçlarına göre orta derecede asitlik ( ph: 0,60-0,96) geliştirdikleri belirlenmiştir. Aynı projede kullanılan pastörize sütlerden izole edilen L. bulgaricus suşlarının 6 saat sonunda belirlenen asit aktivitesi ( ph: 0,59-0,89) ise düşük bulunmuştur. 24. saat sonunda ph yı endüstriyel suşlar kadar düşürseler de onlardan daha düşük asit aktivitesine sahiptirler. Daha önceki çalışmalarda ise bu suşlarda saptanan ortalama ph değeri 0,70 olarak belirlenmiştir (Tunail vd. 2002). Yoğurt starter kültürlerinin asit üretme yetenekleri belirlemek amacıyla, UHT süte % 1 düzeyinde kültür ilave edilmekte ve 3 saatlik inkübasyon sırasında belirli periyotlarda ph ölçümü yapılmaktadır. Aynı koşullarda ancak kültür içermeyen sütte de ph ölçümü alınmakta ve ph gradiyeni ( ph) belirlenmektedir. Yoğurt kültürleri için ph nın 1,50-2,00 olması gerektiği belirtilmiştir (Özer 2006). Diğer bir çalışmada ise farklı starter kültürler kullanılarak sütten ve yoğurttan yapılan Ayranların 1., 7. ve 15. günündeki mikrobiyolojik özellikleri incelenmiştir. Depolama süresince koliform ve E.coli miktarı azalırken toplam laktik asit bakterisi, maya ve küf miktarında artış gözlenmiştir. Sonuç olarak sütten üretilen Ayranın yoğurttan üretilen Ayrandan daha iyi mikrobiyolojik özelliklere sahip olduğu ayrıca kullanılan kültürün ve depolama süresinin Ayrandaki toplam laktik asit bakteri sayısını istatistiksel olarak önemli derecede etkilediği saptanmıştır (Var et al. 2006). 11

Patır vd. (2006) açık ve orijinal ambalajlı Ayranlarda mikrobiyolojik kaliteyi belirlemek için analizler yapmışlardır. Ayranlardaki toplam mezofilik aerob mikroorganizma sayısı açık ambalajlarda ortalama 8,02 log 10 kob/ml, orijinal ambalajlarda ise ortalama 7,03 log 10 kob/ml olarak belirlenmiştir. Koçak et al. (2006) Ayran üretim metotları üzerine çalışma yapmışlardır. İnkübasyondan önce Ayran sütüne su ilave edilmesi veya inkübasyondan sonra yoğurda suyun ilave edilmesinin, Ayranın kimyasal, mikrobiyolojik ve duyusal özellikleri üzerindeki etkileri incelenmiştir. Depolama sürecinde ph değerlerinde 0,1 birimlik bir düşüş, laktik asit içeriklerinde ise % 10 oranında bir artış gözlenmiştir. 7 günlük depolama süresi içinde L. bulgaricus ve S. thermophilus bakterilerinin sayılarında bir düşüş saptanmamıştır. Köşker vd. (1983) TOAG-470 nolu proje kapsamında liyofilize yoğurt kültürü üretimi için liyofilizasyonda canlılık ve aktiviteyi en çok etkileyen faktörler araştırılmış, bakterileri üretme ortamı, koruma ortamı, depolama sıcaklığı ve süresi üzerinde çalışılmış ve 6 aylık depolama sonucunda L. bulgaricus da % 68, S. thermophilus da % 75 lik canlılık elde edilmiştir. Halkman vd. (1987) liyofilize yoğurt kültürü üretimi için vakumlu ve vakumsuz koruma koşullarının etkisini araştırmışlardır. Çalışmada iki parametre belirlenmiştir. Bunlardan ilki; 18 ay süre ile -18 C de depolanmış liyofilize kültürlerin vakum ve normal atmosfer basıncı altındaki canlılık kayıplarının kıyaslanmasıdır. Depolama süresi canlılığı etkileyen en önemli faktör olarak belirlenmiştir. Vakumlu depolama koşulu, liyofilizasyondan etkilenen L. bulgaricus D1 in yüzde canlılığının korunmasını olumlu yönde etkilemiştir. Diğer parametre olarak 2 değişik kültür kombinasyonu alınmıştır ve aynı koşullarda depolanan farklı kombinasyonların metabolik aktivitelerine göre kıyaslama yapılmıştır. Vakumlu depolanan kültürlerde asit aktivitesinin daha iyi korunduğu ortaya çıkmıştır. Liyofilize kültürlerde 6 aydan fazla depolanan kültürlerde önemli ölçüde aktivitenin azaldığı belirlenmiştir. Kültürlerin direkt set olarak değil, yeterince aktifleştirildikten sonra kullanılması daha uygun görülmüştür. 12

Beyatlı ve Tunail (1991) tarafından yürütülen bir projede yoğurtlardan izole edilen bazı bakterilerin starter olarak kullanılabilmeleri üzerinde durulmuş, bakterilerin laktik asit üretim yetenekleri ve proteolitik aktiviteleri saptanarak 20 kombine kültür birbiriyle kıyaslanmış ve ilk defa piyasa yoğurtları ile kıyaslamalı bir çalışma gerçekleştirilmiştir. Halkman ve Halkman (1991) tarafından yapılan bir çalışmada, Kaşar peyniri starter kombinasyonunu oluşturmak için 6 bakteri ile 4 farklı kombinasyon oluşturulmuş ve her kombinasyon için 3 farklı katılma oranı belirlenmiş, 0-4-8-12-16-20-24. saatlerdeki laktik asit oluşturma, ph ile saf kültürde haşlama öncesi ve sonrası canlı hücre sayımlarına göre hangi kombinasyonun uygun olduğu saptanmıştır. Starter kültürlerin aktiviteleri asitlikle ölçülmüştür. Sozzi and Maret 1975 yılında Streptococcus salivarius ssp. thermophilus mikroorganizmasının biyokimyasal aktivitesinin ölçümü üzerinde yaptıkları bir çalışmada, kültürün biyokimyasal aktivitesini mikroorganizmanın gelişebileceği değişik sıcaklık aralıklarında iki değer açısından incelemiştir. İlk değerde kültür mikroorganizmasının tek ve saf olarak biyokimyasal aktivitesi ölçülürken, ikinci değerde bu aktivite kültür mikroorganizmasının fajı ile kontamine olduğu durumda saptanmıştır. Kültür mikroorganizması saf olarak en yüksek biyokimyasal aktiviteyi gösterirken, faj ile kontamine olduğu durumda ise aktivite istenen seviyeye çıkamamış en düşük değerde kalmıştır. İmmobilize Hücre Teknolojisi (ICT) kullanılarak elde edilen dondurularak kurutulmuş kültürler, süt endüstrisinde organik asit üretimi, inokülasyonun devamı ve faja dirençli konsantre kültür üretimi için kullanılmaktadır (Steenson et al. 1987, Champagne et al. 2000). Dondurularak kurutulmuş Streptococcus thermophilus kültürleri cheddar peyniri yapımında direkt olarak başarılı bir şekilde kullanılmıştır (Stanley 1996). Bir raporda, kondüktans ve empedans (özdirenç) ölçüm süresi kültür aktivitesinin ölçümü için alternatif metod olarak denenmiştir (Hassan and Frank 2001). 4 ºC de depolanan starter kültürün titre edilebilir asitlik değerlerine, empedans ölçüm süresi ve 13

ph değerlerine bakıldığında, kültür aktivitesinin en çok 2 ve 5 gün arasında hızla azaldığı belirtilmektedir. Kültür aktivitesi, inkübasyon süresince titre edilebilir asitlikteki artış ve ph daki düşüş ile ölçülebilmiştir (Tsai and Luedecke 1989, Carvalho et al. 2003). Bu sonuçlar empedans ölçüm metoduyla elde edilen sonuçlarla karşılaştırılmıştır. Empedans ölçüm metoduyla kültür aktivitesi belirlenirken, laktik asit üretimi ve proteinaz aktivitesine dikkat edilmelidir. Şekil 2.2.a. 4 ºC de depolamanın, laktik starter kültürlerin IDT (Impedance Detection Time) ile ölçülen aktiviteleri üzerine etkisi, b. 4 ºC de depolamanın, laktik starter kültürlerin ph ile ölçülen aktiviteleri üzerine etkisi (Tsai and Luedecke 1989) Benzer bir çalışma Carvalho et al. (2003) tarafından yapılmıştır. İmpedimetrik yöntemle dondurularak kurutulmuş L. bulgaricus un aktivitesi ölçülmüştür. Liska and Calbert (1957) yaptıkları testte 2,3,5-trifeniltetrazolyum kloridi kullanarak laktik bakteriyofajları belirlemişlerdir. Test süresi yaklaşık 4,5 saattir ve diğer yöntemlerden daha kısa sürede sonuç elde edilmektedir. Sing and Klaenhammer (1993), Heap-Lawrance starter kültür aktivite testini kullanarak bakteriyofaja dirençli kültür rotasyon stratejisi üzerinde çalışmışlar ve bu sistemin süt 14

endüstrisinde kullanılan starter kültürleri faj enfeksiyonundan koruduğunu kanıtlamışlardır (Heap and Lawrance 1981). Özyurt (2005) S. thermophilus suşlarının, güçlü faj direnç özelliği ile endüstriyel suşlardan üstün ve alternatif starter potansiyellerinin yüksek olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte L. bulgaricus suşlarının faj direnç özelliğinin stabil olmadığı, süreye bağlı olarak çok farklı şablonlar gösterebildiğini raporlamıştır. Starter kültürler; proteolitik aktivitelerine göre, kazeini değişik oranlarda hidrolize ederler. Bundan dolayı da kullanılan starter kültürün proteolitik aktivite düzeyi randımanı etkiler (Fox et al. 2000). Peynir yapımında kullanılan starterlerin, randımanı etkilediği belirtilmiştir (Aydemir ve Koçak 2007). Anderson (1975) yoğurt starter kültür üretimi üzerine yaptığı çalışmada püskürterek kurutma yöntemini kullanmıştır. Kurutma sıcaklığı olarak 75-80 ºC seçilmiştir ve kültürlerde hiçbir kayıp olmamıştır. Bu yöntem avantajlı olmasına rağmen yaygın olarak kullanılmamıştır. Fakat bu toz kültürlerin kullanımı sırasında birçok sorunlar ortaya çıkmış ve 1940 lı yıllarda liyofilize kültür üretimine başlanmıştır (Tağhan ve Öztürk 2002, http://www.wipo.org/pctdb/en/wo.jsp?wo=1999009838, 2008). Bir laboratuvarda yapılan faj tesbiti (Yaman 2007), peynir altı suyunun 0,2 mikronluk özel filtrelerden geçirilerek, asitlik gelişimlerinin takip edilmesi esasına göre yapılmaktadır (Anonymous 1991b). Benzer bir çalışmada Nielsen (1998) Cheddar peyniri üretimi yapılan fabrikada topladığı peyniraltı suyunda bakteriyofaj testi yapmıştır. Peyniraltı suyu steril 0,45 µm membran filtreden süzülür ve elde edilen filtrattan yararlanarak faj testi yapılır (Anonymous 1991b). 15

Dondurularak kurutulmuş ticari kültürlerdeki tipik hücrelerin sayısı 10-20x10 9 kob/ ml, dondurulmuş kültürlerde ise 10-30x10 9 kob/ ml düzeyindedir (Akın 2006). Değişik formlardaki starter kültürlerin bakteri sayıları sırasıyla şöyledir; *Sıvı kültürler, 0,5x10 9 cfu/ ml veya cfu/ g *Toz kültürler; -Dondurularak kurutulmuş toz kültürler, 1x10 9 cfu/ ml veya cfu/ g -Dondurularak kurutulmuş konsantre toz kültürler, 100 200 x10 9 cfu/ ml veya cfu/ g *Dondurulmuş kültürler; -Derin dondurulmuş konsantre kültürler, 2-7x10 9 cfu/ ml veya cfu/ g -Derin dondurulmuş süper konsantre kültrüler, 100-200x10 9 cfu/ ml veya cfu/ g dır (Üçüncü 2005). Süt endüstrisi geliştikçe starter kültür kullanımı yaygınlaşmış, kültür üreten laboratuvarların sayısı artmış ve kültür üretim tekniğinde önemli gelişmeler olmuştur (Yaygın ve Toklu 2000). Starter kültürler; sıvı, liyolifize ve dondurulmuş kültür olarak piyasaya sunulmaktadır. Bu kültürler direkt olarak kullanılabildiği gibi işletmelerde kulllanılmak üzere özelliklerine göre ana, ara ve işletme kültürü olarak çoğaltılırlar (Rasic and Kurmann 1978, Cogan and Accolas 1990, Anonymous 1995, Fox and McSweeney 1998, Tağhan ve Öztürk 2002, Üçüncü 2005, Akın 2006 ). Süt fabrikaları için üretilen ilk saf kültür sıvı kültürdür (Yaygın ve Toklu 2000). Stok kültür üretiminde süttozundan veya starter üretimi için hazırlanmış özel ürünlerden (içerisinde peynir suyu tozu, maya ekstraktı, mineral tuzlar ve üreme maddeleri bulunur) yararlanılabilir. Süttozuna benzeyen bu özel ürünlerden elde edilen rekonstitüe sütler kültürlerin üretiminde de kullanılmaktadır. Özel fermentasyon tanklarına alınan, burada sterilize edilen ve aynı tankta 42 ºC ye soğutulan bu rekonstitüe süte seçilmiş kültür ile ekim yapılır. 42 ºC de inkübasyon sırasında kültürde canlı bakteri sayısının artması için fermentasyon tankına zaman zaman steril CaO ve MgO katılır ve ortamın ph sı 6,60 civarında tutulur (Tağhan ve Öztürk 2002, Üçüncü 2004, Özer 2006). 16

Böylece bakterilerin daha uzun süre faaliyet göstermesi sağlanarak kültürde canlı bakteri sayısı arttırılır. Sıvı kültürlerde canlı mikroorganizma sayısı 1 ml de 100 milyon civarındadır. 5 ºC de 1 hafta raf ömrü olduğu belirtilmektedir (Üçüncü 2005). Sıcaklığın artması bakterilerin faaliyetlerini arttırırken bakteriler arasındaki dengeyi bozacaktır ve bazı bakterilerin ölümüne neden olacaktır. Bu nedenle sıvı kültürler inkübasyon sonrası hızla 4 ºC ye soğutularak bakteri gelişimi kontrol altına alınmaktadır (Özer 2006). Ana, ara ve işletme kültürü olarak çoğaltılabilirler. Çoğaltma için işletmelerde özel eleman gerekli olup, çoğaltma sırasında bakteri ve mayalarla bulaşma riski vardır. Bu nedenle hazırlanan kültürün kısa sürede kullanılması gerekir. Ayrıca çoğaltma işlemi dikkatli yapılmazsa bakteriler arasındaki oran değişir (Yaygın ve Kılıç 1993, Fox and McSweeney 1998, Tağhan ve Öztürk 2002, Akın 2006, Özer 2006, http://www.wipo.org/pctdb/en/wo.jsp?wo=1999009838, 2008). Saf kültürleri daha uzun süre muhafaza etmek amacıyla kültür kurutma yöntemleri geliştirilmiştir (Yaygın ve Kılıç 1993, Yaygın ve Toklu 2000, Akın 2006). Porubcan and Sellars (1975) yapmış oldukları çalışmada konsantre edilen kültür bakterileri dondurarak kurutma işlemine tabi tutmuşlardır. Bu yöntemle üretilen ticari kültürün direkt olarak kullanımının uygun olduğu bulunmuştur. Liyofilize kültür üretimi için uygulanan temel işlemler şöyledir: Sıvı kültür liyofilizatör adı verilen cihazda önce -40, -60 ºC arasında dondurulur. Sonra 0,1 mm civa basıncından daha düşük basınç altında, vakumda, donma noktasının altındaki bir sıcaklıkta kültürdeki su uçurulur (Tofte-Jespersen 1974, Özer 2006). Suyun uçurulması düşük derecelerde yapıldığından elde edilen kültürdeki mikroorganizma kaybı çok düşük olur. % 2-3 civarında su içeren liyofilize kültür uzun süre saklanabilir. Standart liyofilize kültürlerde canlı bakteri sayısı 1 gramında 10 8 10 9 civarındadır. Konsantre liyofilize kültürün 1 gramındaki canlı bakteri sayısı ise 10 11 10 12 arasındadır (Özer 2006). Çok fazla canlı bakteri içermesi nedeniyle konsantre liyofilize kültür çoğaltılmaksızın doğrudan doğruya işletme kültürü olarak kullanılır. Konsantre liyofilize kültür laboratuvarda çoğaltılmadığı için, L. bulgaricus ile S. thermophilus 17

arasındaki oran değişmez (Yaygın ve Kılıç 1993, Fox and McSweeney 1998). Latent fazı uzundur (Surono and Hosono 2002). Ayrıca bu kültürü kullanmak için fabrikalarda özel laboratuvar ve teknik elemana gereksinim duyulmaz. Bu özelliklerinden dolayı, konsantre liyofilize kültür kullanımı son yıllarda çok artmıştır. İşletmeye gönderilmesi kolay olmasına rağmen fiyatı pahalıdır (Yaygın ve Kılıç 1993). Yeni bir yöntem olarak immobilize hücre teknolojisi ile üretilen dondurularak kurutulmuş starter kültürlerin süt endüstrisinde kullanımı bir çok avantaj sağlamaktadır (Champagne et al. 2000). İlk dondurulmuş saf kültür üretimi sıvı kültürlerin -30, -40 ºC de dondurulması ile elde edilmiştir (Yaygın 1988, Yaygın ve Kılıç 1993, Tağhan ve Öztürk 2002, Üçüncü 2004). Günümüzde ise bu dondurma işlemi -196 ºC de sıvı azot içerisinde yapılmaktadır ve bu konuda ticari bir patent alınmıştır (Christensen 1969, Yaygın ve Toklu 2000, Hassan and Frank 2001). 1 gramında 10 8 civarında canlı mikroorganizma içerirler. Konsantre dondurulmuş kültürlerin 1 gramında 10 11 civarında canlı bakteri bulunur (Yaygın 1988, Fox and McSweeney 1998, Surono and Hosono 2002). Bu yüzden konsantre dondurulmuş kültür, doğrudan işletme kültürü hazırlanmasında kullanılabilir. Kültür kullanılmadan önce 20 ºC de, klorlu su içerisinde bir süre bırakılarak sıvı hale getirilir (Özer 2006). Bu kültür liyofilize kültür için belirtilen avantajlara sahiptir. Bu yüzden son yıllarda konsantre dondurulmuş kültür kullanımı çok artmıştır (Yaygın 1988). Sıvı azot kullanarak dondurulmuş kültürlerin avantajları; uygunluk, kültür güvenliği, günlük performansın gelişimi ve tür dengesi, fajları daha iyi kontrol edebilme ve kalitenin geliştirilmesidir. Dezavantajları ise dondurmada kullanılan sıvı azotun sağlanmasındaki zorluklar, yüksek fiyat ve starter kültür üretenlere büyük bağlılıktır (Akın 2006). Starter kültürler; geliştikleri optimum sıcaklık derecelerine, içerdikleri mikroorganizma suşlarına, oluşturdukları metabolitlere ve ticari formlarına göre gruplandırılırlar. Ancak 18

süt endüstrisinde kullanılan kültürler; bakteri kültürleri, küf kültürleri ve bakteri-maya karışık kültürleri olmak üzere ayrılabilmektedir (Yaygın ve Toklu 2000, Üçüncü 2005). Optimum sıcaklık derecelerine göre starter kültürler; *Mezofilik kültürler: Homo- ve heterofermentatif laktokok türlerinden oluşan ve optimum gelişme sıcaklıkları 18-30 ºC arasında değişen, tek suşlu, çok suşlu ve karışık suşlu kültürlerdir (Üçüncü 2004). *Termofilik kültürler: Mezofil kültürler gibi; ph değerini düşürerek, antibiyotik ve gelişmeyi önleyici diğer maddeler oluşturarak bakterisid özellik gösterirler. Glikolitik ve proteolitik aktiviteleri laktik streptokoklara kıyasla daha yüksektir (http://www.foodsci.uoguelph.ca/dairyedu/micro.html#starter., 2007, http://www.oxoid.com/uk/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=cm0361&c=uk&lang =EN., 2008). İçerdikleri mikroorganizma suşuna göre starter kültürler; *Karışık suşlu kültürler: Çeşitli fermente süt ürünlerinin yapımında yaygın olarak kullanılan tiptir (Kosikowski and Mistry 1997). Çeşitli mezofil laktik asit bakteri suşlarının karışımlarından oluşurlar ve çoğu kez hangi suşları ne oranda içerdikleri belli değildir. Olası bir faj enfeksiyonundan da farklı şekillerde etkilenebilirler. *Tek suşlu kültürler: Bu tip kültürler karışık suşlu kültürlerden; asit oluşturma, lezzet oluşturma ve faj direnci gibi özelliklerine göre seçilen suşlardır. Son yıllarda faja duyarlı olmayan suşların seleksiyonunun mümkün olması ile bu tip tek suşlu kültürler rotasyonsuz olarak kullanılmaktadırlar. *Çok suşlu kültürler: Özellikleri bilinen üç veya daha fazla suşun belirli oranlarda karışımlarından oluşur. Avantajları şunlardır; rotasyona gerek kalmadığı için sürekli aynı kültürün kullanılabilmesi, starter aktivitesinin daha düzenli olması, faj nedeniyle aktivite kaybı riskinin en aza indirilmesi ve daha düşük oranda starter kullanabilme olanağıdır (Kayagil 2006, Üçüncü 2004, 2005). İşletmeye gelen sıvı, standart liyofilize ve dondurulmuş stok kültürlerin miktarı az ve içerdikleri mikroorganizma sayıları yetersiz bulunduğundan, bu kültürler ana, ara ve 19

işletme kültürü olarak çoğaltılırlar (Yaygın ve Kılıç 1993, Kosikowski and Mistry 1999, Akın 2006). İşletmelerde bilgili teknik eleman mevcut ise laboratuvardaki kültürlerden uzun süre yararlanmak mümkündür. Bunun için laboratuvarda en az birkaç farklı laktobasil ve streptokok suşu bulunması gerekir. Bu suşlarla hazırlanan stok kültür işletmede çoğaltılır (Şekil 2.3). Böylece kültürde yanlış bir işlem yapıldığı zaman yedek kültür devreye alınır. Şekil 2.3 Starter kültürün ana, ara ve işletme kültürü olarak çoğaltılması (Cogan and Accolas 1990) Saf kültür hazırlanması sırasında başarılı olabilmek için, kültürdeki bakterilerin aktif olmaları gerekir. Kültür, süte katıldığı zaman bakteriler mümkün olduğu kadar çabuk süt şekerini fermente etmeli ve sütte çoğalmalıdır. Laktozun fermentasyonu sırasında bakteri sayısı hızla artar. Bir süre sonra oluşan laktik asidin etkisi ile bakteriler ölmeye başlar. Bu durum bakteri populasyonunun tipik gelişme eğrisini verir (Tağhan ve Öztürk 2002, Akın 2006). Mikroorganizmaların yaşı ve aktivitesi arasında direkt bir ilişki vardır. Bundan yararlanılarak starter bakterilerin aktivitesi hakkında karar verilebilir. Ortalama inokülasyon % 2-3 aralığında değişir ve starter kültür yaklaşık 10 8 kob/ml canlı bakteri içerir (Cogan and Accolas 1990, Tağhan ve Öztürk 2002). 20

Bakterilerin gelişme eğrisi 4 döneme ayrılır (Rasic and Kurmann 1978, http://www.med.gazi.edu.tr/egitim/donem1/dersler/bakterimetabolizmaskcaglar.htm., 2008, http://www.mikrobiyoloji.org., 2008). 1) Duraklama dönemi (Latent Faz): Bakteri kültürü süte katıldıktan sonra, bakteriler önce yeni ortama adapte olurlar ve yeni besiyerinde bulunan besinlerden yararlanmak için gerekli olan enzimleri sentezlerler. Hücrelerin büyüklüğü artar. Bakteriler ortamdaki gıda maddelerini etkin bir şekilde kullanmaya başladıktan sonra çoğalırlar. Bu dönemin süresi, bakteri suşunun ihtiyaç duyduğu besinlerin varlığına, bakterilerin fizyolojik durumuna, kültür koşullarına bağlıdır. Direkt süte katılan liyofilize ve dondurulmuş kültürlerin duraklama dönemi daha uzundur. 2) Hızlanma ve logaritmik çoğalma dönemi: Hücrelerin düzenli bir şekilde bölündüğü, bakteri sayısının artışının logaritmik olarak fazlalaştığı dönemdir. Bu dönemde hücreler maksimum aktivite gösterirler. Bunların çoğalması, bölünmesi için geçen zaman kısalır. Logaritmik çoğalma döneminin sonunda bakteriler başlangıçtaki kadar hızlı bölünemezler, çoğalamazlar. Fakat toplam bakteri sayısı çok fazla olduğundan bölünme sonucu artan hücre sayısı da çok fazladır. 3) Yavaşlama ve sabit dönem: Besinler azalmış veya toksik maddeler (laktik asit, asetaldehit, peroksit gibi) artmaya başlamış ve ph düşmüştür. Sabit dönemde ortamda yaşlı hücre sayısı arttığı ve laktik asit gibi metabolizma ürünleri çoğaldığı için hücre sayısı sabit kalır. Yani hücre ölümü ile hücre çoğalması arasında bir denge oluşur. 4) Ölüm veya azalma dönemi: Bu dönemde canlı hücrelerin sayısı azalmaya başlar. Ölen hücrelerin sayısı, yeni meydana gelen hücrelerin sayısından daha fazla olmuştur. Gelişme koşulları kötüleşmiştir (http://www.mikrobiyoloji.org., 2008). Bakterilerin gelişme eğrisindeki fazların süresi mikroorganizmalar arasında ve çeşitli ortamlar arasında farklılık gösterir (http://www.med.gazi.edu.tr/egitim/donem1/dersler/bakterimetabolizmaskcaglar.htm., 2008). Bakterilerin üreme dönemleri Şekil 2.4 de gösterilmektedir. 21

Şekil 2.4 Bakterilerin Üreme Dönemleri (http://www.mikrobiyoloji.org., 2008) En aktif kültürler sıvı kültürlerdir. Bu kültürler kısa bir duraklama dönemi geçirirler ve laktozu fermente ederek laktik asit oluştururlar. Direkt olarak kullanılan konsantre liyofilize ve konsantre dondurulmuş kültürler biraz daha uzun duraklama dönemi geçirirler. Bunun nedenleri şunlardır; -Konsantre dondurulmuş ve konsantre liyofilize kültürlerin 1 ml sindeki canlı hücre sayısı 10 12 civarında olmasına rağmen süte katılan kültür oranı düşüktür. Bunun avantajlarından birincisi, üretim masraflarını azaltmasıdır. İkincisi, süte fazla miktarda kültür katılması, süte giren metabolizma artıklarının miktarını da fazlalaştırır. Bu durum fermentasyonun kontrolünde sorunlar ortaya çıkarır. Örneğin; yoğurtta kalite düşer, acı tat oluşur, serum ayrılması artar. -Konsantre dondurulmuş ve konsantre liyofilize kültürlerdeki bakterilerin süte adaptasyonu için daha uzun zamana ihtiyaç vardır. Bu yüzden direkt olarak ilave edilen bu kültürler, iş akışını geciktirebilir (Tağhan ve Öztürk 2002). İşletmelerde kültürlerin düzenli olarak kalite kontrolü yapılır (Tekinşen 1997, Ellner 2001, Tağhan ve Öztürk 2002). -İşletmelerde hazırlanan kültürlerin düzenli olarak günlük duyusal özellikleri kontrol edilmelidir. Kültürün kendine özgü tat, aroma ve kokusunda herhangi bir değişim belirlenmiş ve bu değişiklik yabancı mikroorganizma bulaşmasından ileri gelmiş ise böyle kültürlerin kullanılmasına son verilmelidir. 22

-Saf kültürler için en önemli sorun çoğaltım sırasında bunlara yabancı mikroorganizma bulaşmasıdır. Kültürden hazırlanan preparatın mikroskopta incelenmesi ile kültürde yabancı mikroorganizma aranır. Özellikle mayalar hemen belirlenir. Mikroskopta yapılan kontrolde ayrıca bakterilerin birbirlerine oranı ve morfolojik durumları kontrol edilir. Kültürlerde saflık kontrolünde, koliform bakteriler, küf ve maya aranır, katalaz testi yapılır (Tekinşen 1997, Tağhan ve Öztürk 2002). -Yoğurt ve diğer fermente süt ürünlerinin üretiminde starter kültürlerin özelliklerinin gerçekleşebilmesi starter kültürün yeteneği, onun saflığı ve aktivitesine bağlıdır. Bununla ilgili olarak farklı aktivite testleri önerilmiştir (Heap and Lawrence 1988, http://www.foodsci.uoguelph.ca/cheese/sectionb.htm., 2008). Burada söz konusu aktivite glikolitik aktivite, yani bakterilerin laktozu parçalayıp laktik asit oluşturma durumudur. Ayrıca aktivite testi peyniraltı suyundaki fajın belirlenmesinde de bir gösterge olarak kullanılabilmektedir (Anonymous 2008e). Sütün içerisinde antibiyotik ile hidrojen peroksit ve klor gibi antiseptik maddelerin bulunması veya bakterilerin faaliyetini önleyici ilaçların mevcut olması, kültürde asitliğin düşük olmasının en önemli nedenlerinden biridir. Bakteriler antibiyotiklere, antiseptik maddelere, dezenfektan maddelere karşı çok duyarlıdırlar. Bu nedenle kültür hazırlanacak sütlerde bu maddeler kesinlikle olmamalıdır. Tat ve aroma oluşturan unsurların kültürde yeterince bulunması gerekir. Bakterilerin faaliyetini önleyen faktörler ve asitlik gelişmesini engelleyen maddeler, tat ve aroma oluşumunu engeller. Kültürde yer alan bakteri suşlarının özellikleri de yetersiz tat oluşumuna sebep olabilirler. Bazı kültürlerin yüzeyinde veya dip kımında serum birikebilir. Kültürde kuru maddenin düşük olması, inkübasyon sıcaklığının yüksek ve inkübasyon süresinin uzun olması, pıhtı oluşmaya başladıktan sonra kabın hareket etmesi su salmayı arttırır. Saf kültürlerde görülen kusurlar ve sebepleri Çizelge 2.2 de belirtilmiştir. 23

Çizelge 2.2 Kültürlerde görülen hatalar ve sebepleri (Tağhan ve Öztürk 2002) Hatalar Yetersiz Asitlik Gelişimi Laktobasil fazlalığı Laktobasil azlığı Dejenere olmuş basiller ph nın düşük olması Yabancı mikroflora kontaminasyonu Sebepleri İnhibisyon maddeleri, bakteriyofaj İnkübasyon sıcaklık ve/veya süresinin fazla olması İnkübasyon sıcaklık ve/veya süresinin az olması İnhibisyon maddeleri, kokların olmaması ve bakteriyofaj İnkübasyonun uzun süreli ve soğutmanın çok yavaş olması Hava enfeksiyonu, yetersiz hijyen, yetersiz ısıl işlem Bakteriyofaj virüs olup, hiçbir metabolik aktiviteleri olmayan, konakçı bir hücre olmadan yaşayıp çoğalamayan canlılardır (David 1967, Robinson and Wilbey 1998, Tağhan ve Öztürk 2002, Akın 2006, http://www.mikrobiyoloji.org/genelpdf/942000310.pdf., 2008). Bu canlılar ilk olarak 1915-1917 yılları arasında Twort ve d Herelle adlı iki araştırmacı tarafından keşfedilmiştir (Kılıçturgay vd. 1992). Süt endüstrisinde kullanılan mezofilik starter kültürlerdeki bu virüsün varlığı ise ilk kez Whitehead ve Cox (1935) tarafından belirlenmiştir (Hassan and Frank 2001). Faj enfeksiyonu ile laktik asit üretimi yavaşlamakta, ürün miktarı ve kalitesi düşmektedir (Cogan and Accolas 1990, Tağhan ve Öztürk 2002, Tükel vd. 2002, Üçüncü 2005, Yaman 2007). Kültürlerde yer alan bakterilerin özgül fajlarıyla enfekte olmaları bakterilerin lizizi ile sonuçlanmaktadır. Bu süreç kültürün asit oluşturmasını yavaşlattığı gibi ürünün tat ve aromasının bozulmasına, viskozitesinin değişmesine neden olur (Cogan and Accolas 1990, Tunail vd. 2000, Anonymous 2008a). Büyük faj problemlerinde fermentasyonlar durma noktasına gelebilir ve işletme uzun süren ekonomik sıkıntılarla karşı karşıya kalabilir (Cogan and Accolas 1990, Kavas ve Akbulut 1993, Robinson and Wilbey 1998, Hassan and Frank 2001, Tağhan ve Öztürk 2002, Akın 2006, Yaman 2007). Fajların morfolojileri, konakçı spektrumları ve serolojik özelliklerinin fajların klasifikasyonunda yetersiz kalması onların moleküler düzeyde tanımlanmalarını gündeme getirmiştir (Tunail vd. 2000). 24

İşletmede doğru bir yerleşim planı, kültür odalarının tasarımı, kültür tanklarının dizaynı ve sanitasyon önlemleri ile fajların gelişimini alt düzeyde tutmak mümkündür. Bu kapsamda bulk kültür üretim ünitesinin diğer proses alanlarından uzakta ve ayrı bir bölümde olması, havasının faj tutan filtreler (HEPA) ile sterilizasyonu sağlanmalıdır (Cogan and Accolas 1990, Robinson and Wilbey 1998, Tağhan ve Öztürk 2002, Üçüncü 2005, Akın 2006). Kültür tankları bulk starter kültür üretimi için uygun materyalden, gerektiği şekilde dizayn edilmeli ve üst kısımda boşluk bırakılmadan tam kapasite ile kullanılmalıdır. Bulk starter kültürün inokülasyonu için kanallar dizayn edilmelidir. İşletmede personel hijyenine önem verilmeli, üretimden önce dezenfeksiyon yapılmalı, klor bazlı dezenfektanlar kullanılmalı, 200 ppm ve daha yüksek miktarda aktif klor içeren dezenfektanlar 30-40 ºC de 20 dakika süre ile uygulanmalıdır. Isıl işlemle dezenfeksiyonda; sıcak su kullanılacaksa 95 ºC de 15 dakika, buhar kullanılacaksa 95 ºC de 15-30 saniye yeterli olmaktadır (Kosikowski and Mocquat 1958, Ergüllü 1983, Cogan and Accolas 1990, Tunail vd. 2000). Ekipmanların klorla temizlenmesi sırasında, kalıntı klorun su ile yıkanarak uzaklaştırılması yeniden faj kontaminasyonuna neden olacağından yıkamadan kullanılması önerilmektedir. Yoğurt starter bakterileri üzerine bakteryofajların etkisini kontrol etmek için diğer bir yaklaşım starter kültür gelişme ortamına formik asit ilavesidir (Lembke et al. 1987, Akın 2006). Ayrıca aseptik üretim koşulları ve doğru starter kültür suşu seçmek bakteriyofaj etkisini azaltmaktadır (Anonymous 1991a, Anonymous 2008a). Kullanılan kültürlerin faja dirençli suşlar içermesi, kültürün önerilen şekilde kullanılması ve kültür rotasyonunun düzenli olarak yapılması gerekmektedir (Tunail vd. 2000, Hassan and Frank 2001, Yaman 2007). Starter kültürlerde aranan en önemli özelliklerden biri onların fajlarına karşı dirençli olmalarıdır. Fajlara duyarlı suşlar tembel fermentasyonlara neden olur ve asitliğin çok yavaş gelişmeşi veya gelişememesine bağlı olarak ya ürün kalitesi düşer, ya da kuvvetli faj atakları sonucu ürün oluşumu tamamen engellenebilir. Bu prosesin durması anlamına gelir ve işletmenin ekonomik olarak zorlanması, müşterinin yitirilmesi söz 25

konusudur. Faj dirençliligin (faj-konakçı özgüllüğüne göre belirlenen litik şablonun) işletmelerde kullanılan kültür rotasyon programları için önemi fazladır (Özyurt 2005). 1950 yılından itibaren fermente süt üretiminin büyük işletmelerde merkezileştirilmesi, işletmelerin işletme kültürüne olan ihtiyaçlarını arttırmıştır. Bunun sonucu olarak da starter kültürlerin üretildiği alet ve ekipmanlarda çok önemli gelişmeler olmuş, farklı tiplerde mekanik korumalı sistemler geliştirilmiştir (Akın 2006). 26

3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal 3.1.1 Süttozu Araştırmada Sütaş A.Ş. de üretilen yağsız süttozu kullanılmıştır. 3.1.2 Starter kültürler Araştırmada ticari adları aşağıda belirtilen starter kültürler kullanılmıştır. YOMIX 332 (Danisco): Derin dondurulmuş termofilik bulk set kültürdür. Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ve actobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus içerir. CSK 104 (CesKa -star): Derin dondurulmuş termofilik bulk set kültürdür. Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ve Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus içerir. YOMIX 502 (Danisco): Dondurularak kurutulmuş termofilik bulk set kültürdür. Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ve Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus içerir. CM 310-50 (Lb bulgaricum): Dondurularak kurutulmuş mezofilik bulk set kültürdür. Lactococcus lactis, Streptococcus salivarius ssp. thermophilus ve Lactobacillus helveticus içerir. 3.1.3 Starter kültür hazırlamada kullanılan materyal İşletme kültürünün hazırlanmasında VIS-START TW 50 Medya (Danisco) kullanılmıştır. Süttozuna benzeyen bu özel materyal içinde peyniraltı suyu tozu, maya ekstraktı, mineral tuzlar ve geliştirme ajanları bulunmaktadır. Özellikle termofil laktik asit bakterilerinin üretilmesi için uygun besi ortamıdır. Bu besi ortamı gelişmeyi engelleyecek maddelerden arınmıştır ve faja karşı koruyucu maddeler içerir. 27