KERATİN VE RHAMNOLİPİTLERİN SU-HAVA ARAYÜZEYİNE ADSORPLANMA ÖZELLİKLERİ Ö.E. SEZGİN, G. ÖZDEMİR Ege Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 100 İzmir ÖZET Bu çalışmada tavuk tüyünden saf keratin elde edilerek, biyolojik olarak üretilmiş rhamnolipidlerin keratin moleküllerine adsorplanma özellikleri araştırılmıştır. Keratin, değişik ramnolipid konsantrasyonlarında hazırlanmış çözeltilere üç farklı miktarda ilave edilerek keratin-rhamnolipid etkileşimi ph=6.2 ortamında yüzey gerilimi ölçümü ile incelenmiştir. İlaç ve kozmetik uygulamalarında ortam ph değeri 5-5,5 civarında olduğu için araştırmalara ph=5 e asetat tamponu ile ayarlanmış çözeltilerle devam edilmiştir. Genel olarak literatürdeki protein yüzey aktif madde etkileşimini inceleyen çalışmalarda hep sodyum dodesil sülfat (SDS) referans yüzey aktif madde olarak kullanıldığı için bu çalışmada da ölçümler, karşılaştırma yapabilmek amacıyla SDS çözeltileri ile tekrarlanmıştır. anahtar kelimeler biyolojik yüzey aktif madde, protein, adsorpsiyon, yüzey gerilimi, rhamnolipitler, keratin 1. GİRİŞ Biyo-yüzey aktif maddeler genel olarak sulu ortamlarda aerobik olarak gelişen ve kaynağı karbon olan mikro organizmalardan üretilirler. Bu kaynaklar karbonhidratlar, bitkisel yağlar ve bunların karışımları olabilir. Tüm biyo-yüzey aktif maddeler ya noniyoniktir ya da anyoniktir. Literatürde saptanmış katyonik yapıda biyo-yüzey aktif madde yoktur fakat yapısında azot içeren bazı örnekler belli bir dereceye kadar katyonik özellik gösterebilir. Diğer yüzey aktif maddelerde olduğu gibi biyo-yüzey aktif maddeler de bir veya daha fazla hidrofilik ve hidrofobik kısımlar içerebilirler. Hidrofobik kısım çoğunlukla 10-18 karbon atomlu bir yağ asidinin hidrokarbon zinciridir. Hidrofilik kısım ise bir ester hidroksi fosfat veya karboksilat grubu veya bir karbonhidrat olabilir. Biyo-yüzey aktif maddeler 5 grupta incelenebilir: glikolipitler, liposakkaritler, lipopeptitler, fosfolipitler, yağ asitleri ve nötr lipitler. Rhamnolipitler Pseudomonas aeruginosa bakterileri kullanılarak üretilir ve çoğu zaman bir çok aynı tür bakterinin karışımıdır. Bir çok rhamnolipit türü bulunmaktadır. İki ana bileşikten biri L-rhamnosil-3-hidroksidekanoyil-3-hidroksidekonoat (R 1 C 10 C 10 ) R1 olarak adlandırılırken L- rhamnozil rhamnozil-3-hidroksidekanoyil-3-hidroksidekanoat (R 2 C 10 C 10 ) R2 olarak adlandırılır. Kimyasal olarak rhamnolipitler rhamnoz (6-deoksimannoz) ve β-hidroksidekanoik asidin glikositleridir. R1 ve R2 yapılarındaki rhamnozil grubunun sayısıyla birbirlerinden ayrılırlar. R1 bir tane rhamnozil grubuna sahipken R2 birbirlerine oksijenin eter köprüsüyle bağlanmış iki adet rhamnozil grubu içerir. Her ikisinin yapıları sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 2 de gösterilmiştir. Keratin bir çok canlı dokunun ana yapı birimi olan lifli protein molekülüdür ve canlıların üst deri, saç, tüy, tırnak, boynuz, toynuk gibi yapılarını oluşturan başlıca protein bileşenidir. Keratin yapısında yüksek miktarda sülfür içeren sistin adlı amino asiti barındırmaktadır. Beta keratin molekülleri zigzaglı bir bağ yapısına sahiptirler. Bu yapının içerisinde bulunan peptit
bağındaki karboksil oksijeni ile amid azotu, peptit bağının ayrı ayrı zincirlerinde veya aynı peptit zinciri üzerinde karşılıklı hidrojen bağı yaparlar. Yapısındaki sistinin ihtiva ettiği sülfür bağları ise bu yapıya ayrı bir rijidite katar. Bu özelliklerinden dolayı keratin su gibi polar çözücülerde çözünmez. Şekil 1. R1, α-l-ramnopiranozil-β-hidroksidekanoyil-β-hidroksidekanoat. Şekil 2. R2, 2-O-α-L-Ramnopiranozil-α-L-ramnopiranozil-β-hidroksidekanoyil-βhidroksidekanoat. 2. KURAMSAL Geçen yıllar boyunca protein-yüzey aktif madde karışımlarının özellikleri biyo teknoloji, ilaç taşınımı, gıda, deterjan, kozmetik ve biyo mühendislik gibi pek çok alanda araştırma konusu olmuştur [1]. Literatürde yer alan yayınlardan çözelti içindeki proteinlerin iyonik yapıdaki yüzey aktif maddelerle bağ oluşturduğu bilinmektedir. [2-3]. Değişik yüzey aktif maddelerle bu etkileşim farklı olmaktadır ve yüzey aktif maddelerin insan vücudundaki protein moleküllerine adsorpsiyonu, cilt, saç temizliği, ilaç ve tarım ilaçları gibi ilaç taşıyıcı maddeleri ile etkileşimde önem taşımaktadır. Bu nedenle insanın üst deri, saç, tırnak gibi dokularını oluşturan keratinin öncelikle tavuk tüyünden saf olarak eldesi sağlanmış ve elde edilen keratin değişik miktarlarda, çeşitli konsantrasyon aralıklarında hazırlanmış rhamnolipit (RL) ve sodyum dodesil sulfat (SDS) çözeltilerine ilave edilerek, çözeltilerin iki farklı ph ortamında yüzey gerilimleri ölçülmüştür. Elde edilen verilerden çözelti içerisinde oluştuğu düşünülen keratin-rhamnolipit
ve keratin-sodyum dodesil sülfat yapılarının ara yüzeylerde ne gibi davranışlar sergilediğine ve etkileşimlerin türüne ışık tutulmaya çalışılmıştır. 3. DENEYSEL 3.1 Kullanılan malzemeler R2/R1=1.2 oranında % lik ramnolipid çözeltileri Jeneil Biosurfactant Company (Wisconsin- A.B.D.) Firması tarafından hibe edilmiştir. Rhamnolipidler biyolojik olarak Pseudomonas aeruginosa bakterileri tarafından tek halkalı (R1) ve çift halkalı (R2) ramnolipid karışımı olarak biyolojik olarak üretilmektedir. R1 molekülünün kapalı formülü C 26 H 48 O 9, molekül ağırlığı: 4 g/mol, R2 molekülünün kapalı formülü C 32 H 58 O 13 ve molekül ağırlığı 6 g/mol dür. Keratin ise tavuk tüyünden saflaştırılmıştır. Tampon çözeltisi hazırlamada kullanılan sodyum hidroksit ve glasial asetik asit analitik saflıktadır ve Merck Firmasından satın alınmışlardır. Yine araştırmalarda kullanılan SDS analitik saflıkta olup Merck Firmasından satın alınmıştır ve molekül ağırlığı 288.38 g/mol dür. 3.2 Keratin eldesi Deneylerde bir tavuk çiftliğinden alınmış yeni yolunmuş tavuk tüyleri kullanıldı. Islak tüyler etüvde kurutuldu ve küçük parçalara kesildi. İçinden g tüy alınarak 12 saat Soxhlet cihazında petrol eteri ile (kaynama aralığı - o C) yağlarından arıtmak için ekstraksiyona tabi tutuldu. Petrol eteri kurutulduktan sonra, tüyler oda sıcaklığında hava alan fakat toz almayan polietilen (PE) streç film ile kaplanmış bir ortamda saklandı. g yağından arıtılmış keratin ile 7 ml lik çözelti hazırlandı. Keratinin çözünürlüğünü sağlamak için çözeltiye 1 mm 2- merkaptoetanol, 3mM EDTA (etilen-diamin tetraasetik asit) ve 8 M üre ilave edildi ve ortamın ph değeri oda sıcaklığında ph=9 a 200 mm tris tamponu (hidroksimetil-aminometan) ile ayarlandı. Bu karışım azot atmosferinde o C de -120 dakika arasında karıştırıldı. Karışım Whatman 54 kuvvetlendirilmiş selüloz filtre kağıdı ile (gözenek büyüklüğü 20-µm arası) süzülerek safsızlıklarından arındırıldı. Tartım sonucu tavuk tüyü içinde %20- oranında safsızlık olduğu bulundu. Elde edilen süzüntünün, ml kısımlar halinde saf suya karşı, 80 saat süresince diyalizi yapıldı. Diyaliz sonunda kimyasallarından arındırılmış keratin beyaz jel halinde suyun dibine çöktü. Suyu buharlaştırıldıktan sonra 2 g keratin elde edildi. 3.3 Rhamnolipit çözeltisi hazırlama Çözeltiler ayırma işlemleri sonrası firma tarafından nötralize edilmiş % lik stok çözeltisinden hazırlanmıştır. Çözeltilerin derişimleri 10-7 M 4x10-4 M aralığında seçilmiştir. Bu derişimler seçilirken kullanılan yüzey aktif maddenin CMC değeri (2x10-4 M) göz önünde bulundurulmuştur. SDS için bu derişim aralığı 10-7 M 8x10-3 M olarak seçilmiştir. Çözeltiler firmanın gönderdiği % lik ana çözeltiden 2x10-3 M stok çözeltileri seyreltilerek elde edilmiştir. Çözeltilerin hazırlanmasında ELGA Reverse Osmosis cihazından alınmış ultra saf su kullanılmıştır. ml lik balon jojeler içinde saf rhamnolipid ve sodyum dodesil sülfat çözeltileri hazırlanmış ve du Noüy halka yöntemi ile yüzey gerilimleri ölçülmüştür. Arkasından ml lik saf RL ve SDS çözeltilerine 0.01; 0.05 ve 0.1 g keratin ilavesi ile yeni çözeltiler hazırlanmış ve bu çözeltiler 24 saat dinlendirildikten sonra yüzey gerilimleri iki ayrı ph ortamında, ph=6.2 de ve ph=5 de ölçülmüştür. 3.4 Yüzey gerilimi ölçümü Yüzey gerilimi ölçümleri Krüss Firmasının K86 model du Noüy halka tipi tensiyometresi ile ölçülmüştür. Bütün ölçümlerde ortam sıcaklığı C olarak ayarlanmıştır. Yüzey gerilimleri
ölçülmeden önce, yüzey filmlerinin kararlı hale gelmesi için platin halka çözelti yüzeyine daldırılmış ve saf yüzey aktif madde çözeltilerinde 20 dakika beklendikten sonra ölçüm yapılmıştır. Aynı ölçümler 5 dakika aralarla tekrarlanmıştır. Keratin ilave edilen çözeltilerin yüzey gerilimleri ölçülürken ise platin halka çözeltiye daldırılmış ve 2 saat bekletildikten sonra ilk ölçüm yapılmıştır. Onbeş dakika aralarla da aynı ölçüm tekrarlanmıştır. Sonuçlarda bir değişiklik gözlenmemiştir. 4. SONUÇLAR Şekil 3 te değişik konsantrasyonlardaki saf RL çözeltilerinin ve aynı konsantrasyonlarda hazırlanmış RL çözeltilerine 0,01g, 0.05g ve 0,1g sabit miktarlarında ilave edilmiş keratin ile ölçülmüş yüzey gerilimi eğrileri görülmektedir. 1x10-7 -7x10-6 M RL konsantrasyonu aralığında 0,05g ve 0,01 g keratin ilavesi RL çözeltilerinin 1x10-7 de 71 mn/m civarındaki yüzey gerilimini 56 mn/m, 54 mn/m a düşürmektedir. 0,1 g keratin ilave edildiğinde ise düşük RL konsantrasyonlarında yüzey gerilimi daha fazla düşmemekte fakat 7x10-5 M RL konsantrasyonuna kadar yüzey keratin ile kaplı kalmakta, bu noktadan sonra yüzey gerilimi hızla düşerek saf RL çözeltilerinin CMC değerindeki yüzey gerilimi değerlerine düşmektedir. Bu durum 7x10-5 M RL konsantrasyonunun üzerinde yüzeyi RL moleküllerinin kaplamaya başladığı ve keratin moleküllerinin de hızla yüzeyden uzaklaştıklarını göstermektedir. Saf RL RL+0,01 g keratin RL+0,05 g keratin RL+0,1 g keratin 1.00E-07 1.00E-06 1.00E-05 1.00E-04 1.00E-03 RLkonsantrasyonu (M) Şekil 3. Rhamnolipid-keratin çözeltilerinin ph=6.2 de yüzey geriliminin rhamnolipid konsantrasyonuna göre değişimi. Şekil 4 te elde edilen veriler ise aynı çalışmanın bu defa ph=5 te tekrarlanmasıyla elde edilmiştir. Burada gözlemlenen ise artan keratin ilavesiyle, tüm çözeltilerde başlangıç konsantrasyonundan belirli bir noktaya kadar yüzey geriliminin doğru orantılı olarak düşmüş olduğu fakat daha sonra 3x10-6 M RL konsantrasyonundan itibaren artan keratin ilavesinin yüzey gerilimlerini saf RL çözeltilerine kıyasla arttırmış olduğudur. 3x10-6 M RL konsantrasyonunda en düşük yüzey gerilimi sırasıyla 46.74 mn/m ile saf RL çözeltisi, 49.52 mn/m ile 0.01 g keratin ilave edilen RL çözeltisi ve son olarak da 49.91 mn/m ile 0.05 g keratin ilave edilmiş çözelti şeklinde sıralanmaktadır. Bu trendin CMC noktası ve sonrası için de geçerli olduğu grafikten anlaşılmaktadır. Yüzey gerilimindeki bu değişim, belirli bir
konsantrasyondan sonra, oluşan keratin-rl kompleksinin yüzeydeki RL moleküllerini çözeltiye aldığını göstermektedir. ph=6.2 ve ph=5 te yapılan çalışmalar arasındaki en önemli fark ise ph=5 de elde edilen eğrilerin ph=6.2 elde edilen eğrilerin altında çıkmasıdır. Bu sonuç ph 5 te çözeltilerin CMC değerlerinin düştüğünü ve çözelti yüzeyinin daha yüzey aktif hale geldiğini göstermektedir. Saf RL RL + 0,01g keratin RL + 0,05g keratin RL + 0,1g keratin 1.0E-07 1.0E-06 1.0E-05 1.0E-04 1.0E-03 RL konsantrasyonu (M) Şekil 4.. Rhamnolipid-keratin çözeltilerinin ph=5 de yüzey geriliminin rhamnolipid konsantrasyonuna göre değişimi Şekil 5 de değişik konsantrasyonlardaki saf SDS çözeltilerinin ve aynı konsantrasyonlarda hazırlanmış SDS çözeltilerine 0.01g, 0.05g ve 0.1g sabit miktarlarda keratin ilave edilmesiyle hazırlanmış çözeltilerin yüzey gerilim eğrileri görülmektedir. Burada gözlemlenen artan keratin ilavesinin saf SDS çözeltilerine oranla yüzey gerilimlerini doğru orantılı bir şekilde düşürdüğüdür. Başlangıç konsantrasyonunda okunan yüzey gerilim değerleri sırasıyla saf SDS çözeltisi için 71.41 mn/m, 0.01g keratin ilave edilen SDS çözeltisi için.62 mn/m, 0.05g keratin ilave edilen SDS çözeltisi için 56.68 mn/m ve 0.1g keratin ilave edilen çözelti için ise.84 mn/m dir. Bu trend 6x10-3 M lık SDS konsantrasyonuna kadar devam etmektedir. Yüzey gerilim değerlerinin bu şekilde seyretmesinin sebebi olarak artan keratin miktarıyla oluşan SDS-keratin kompleksinin giderek daha yüzey aktif bir hal alması gösterilebilir. Şekil 6 daki veriler SDS için yapılan çalışmanın ph=5 te tekrarlanmasıyla elde edilmiştir. Burada da gözlemlenen tıpkı ph=5 deki RL çözeltilerinde olduğu gibi, artan keratin miktarıyla çözeltilerin yüzey gerilimlerinin belirli bir konsantrasyona kadar doğru orantılı olarak saf çözeltiden daha düşük seyrettiğidir. Çözelti SDS konsantrasyonu 1x10-4 e ulaştığında oluşan SDS-keratin kompleksinin hidrofilik bir yapıya dönüşmesiyle yüzey gerilim değerleri saf çözeltinin sahip olduğu değerden daha yüksek değerlerde seyretmeye başlamıştır. Bu noktada en yüksek yüzey gerilimi 44.52 mn/m ile 0.05g keratin ilave edilmiş çözeltiye ve en düşük değer ise.23 mn/m ile saf SDS çözeltisine aittir. Bu durum yine çözeltide yüksek keratin miktarına ulaşıldığında, keratinin yüzeydeki SDS moleküllerinin bir kısmını da çözeltiye aldığı sonucunu göstermektedir. Ayrıca SDS çözeltileri ile ph=5 te elde edilen yüzey gerilimi eğrileri ph=6.2 de elde edilen yüzey gerilimi eğrilerinin altında çıkmaktadır ve bu sonuç ph 5 te SDS
çözeltilerin CMC değerlerinin düştüğünü ve çözelti yüzeyinin daha yüzey aktif hale geldiğini göstermektedir. Saf SDS SDS+0,01 g keratin SDS+0,05 g keratin SDS+0,1 g keratin 1.00E-07 1.00E-06 1.00E-05 1.00E-04 1.00E-03 1.00E-02 SDS konsantrasyonu (M) Şekil 5. SDS-keratin çözeltilerinin ph=6.2 de yüzey geriliminin SDS konsantrasyonuna göre değişimi Saf SDS SDS + 0.01g keratin SDS + 0.05g keratin SDS + 0,1g keratin 1.00E-07 1.00E-06 1.00E-05 1.00E-04 1.00E-03 1.00E-02 SDS konsantrasyonu (M) Şekil 6. SDS-keratin çözeltilerinin ph=5 de yüzey geriliminin SDS konsantrasyonuna göre değişimi
Elde edilen sonuçlardan, kullanılan iki yüzeyaktif maddenin keratin ile kompleks oluşturduğu anlaşılmaktadır. Keratin-SDS kompleksinin, keratin-rl kompleksine göre daha kuvvetli bir yapı olduğu ve çözelti/hava arayüzeyinde daha çok kaldığı görülmektedir. Azalan ph ın tüm yüzeyaktif madde-keratin çözeltilerini daha yüzey aktif yaptığı ve çözeltilerin cmc değerlerini düşürdüğü görülmektedir. Keratin-yüzeyaktif madde kompleksi ile yüzeyaktif madde moleküllerinin çözelti/hava arayüzeyinde birbiriyle rekabet eden bir mekanizmayla adsorplandığı görülmektedir. Düşük yüzey aktif madde konsantrasyonlarında yüzey kompleks molekülleri ile kaplanmış, artan yüzeyaktif madde konsantrasyonuna paralel olarak da kompleks molekülleri yavaş yavaş yerlerini saf yüzeyaktif madde moleküllerine bırakmışlardır. CMC değerinde ise yüzey tamamen yüzeyaktif madde molekülleri ile kaplanmıştır. ph 6.2 de elde edilen keratin-sds kompleksinin yüzeyde diğer komplekslere göre daha farklı davrandığı görülmüştür. Keratin-SDS kompleksi CMC değerinin üzerinde yüzeyden uzaklaşmış ve yüzey SDS ile kaplanmıştır. TEŞEKKÜR Bu çalışma TÜBİTAK MİSAG-A- ve Ege Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Fonunun 2002/müh/020 projelerinin desteği ile yapılmıştır. 5. REFERANSLAR 1- Bianca Schweitzer, Dino Zanette, Rosangela Itri, BSA plays a role in the size of SDS micelle-like aggregates at the saturation binding:the ionic strenght effect. Colloid and Interface Science, 2004 2- I. Pezron, L. Galet, D. Clausse, Surface Interaction between a Protein Monolayer and Surfactants and its Correlation with Skin Irritation by Surfactants, Short Communications, J. of Colloid and Interface Science, 180 (1996)285-289 3- P.M.M. Schrooyen, P.J.Dijkstra, R.C. Oberthür, A. Bantjes ve J.Feijen, Partially Carboxymethylated Feather Keratins. 1. Properties in Aqueous Systems, J.Agric. Food Chem. 2000,48, 4326-4334 4- Adsorption and the Gibbs Surface Excess, Chattoraj, D.K., Birdi, K.S., Plenum Press, New York, 1984