ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ

ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ HELICOBACTER PYLORI İZOLATLARINDA KLARİTROMİSİN DİRENCİNİ VE caga GENİ VARLIĞINI BİRLİKTE BELİRLEYECEK BİR EŞ-ZAMANLI POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (REAL-TIME PCR) YÖNTEMİNİN GELİŞTİRİLMESİ Peren H. BAĞLAN BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2008 Her hakkı saklıdır

ÖZET Doktora Tezi HELICOBACTER PYLORI İZOLATLARINDA KLARİTROMİSİN DİRENCİNİ VE caga GENİ VARLIĞINI BİRLİKTE BELİRLEYECEK BİR EŞ-ZAMANLI POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (REAL-TİME PCR) YÖNTEMİNİN GELİŞTİRİLMESİ Peren H. BAĞLAN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ H. pylori, aktif kronik gastrit, peptik ülser ve gastrik kanser gelişmesinde önemli etiyolojik rolü olan Gram negatif, 1. sınıf karsinojen bir patojendir. H. pylori aynı zamanda MALT a da (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) neden olur. H. pylori nin eradikasyonunun, peptik ülser nüks oranını düşürdüğü bilinmektedir. Bu nedenle H. pylori nin antimikrobiyal ajanlarla tedavisi ve tedavide meydana gelen antimikrobiyal ajanlara direnç önem taşır. H. pylori nin bazı suşlarıyla uzun süreli enfeksiyon, gastritin ve peptik ülserin temel nedenini ve gastrik kanserin risk faktörünü oluştururken, bazı H. pylori enfeksiyonlarında semptom görülmemektedir. Bu farklılığın nedenlerinden biri, bakterinin patojenite fakötürü olan caga genidir. Çalışmamızın amacı, H. pylori de klaritromisin direnci mutasyonlarını (A2142G, A2143G, A2142C) ve patojeniteyle ilgili olan caga genini, birlikte gösterebileceğimiz bir Eş-zamanlı PZR yöntemi geliştirmektir. Bu çalışmaya gastrik yakınmalar nedeniyle Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Cebeci ve İbn-i Sina Hastanelerine başvuran ve endoskopi ünitesinde endoskopik incelemeleri yapılan 119 hastadan alınan, mide biyopsi örnekleri dahil edildi. Mide biyopsi örneklerinden DNA izolasyonu yapıldıktan sonra caga geni varlığını ve direnç mutasyonlarını birlikte gösteren bir eş-zamanlı PZR yöntemi geliştirildi. CagA geni varlığını saptamak için SYBR Green 1 boyası ve erime eğrisi analizi kullanırken, direnç mutasyonlarını saptamak için hibridizasyon probları kullanıldı ve erime eğrisi analizi yapıldı. Multipleks Eş-zamanlı PZR 23S rrna sonuçları, üreaz, sitoloji, kültür, DNA dizi analizi ile, caga sonuçları ise manuel caga PZR ile karşılaştırıldı. Üreaz sitoloji ve eşzamanlı PZR yöntemleri arasında % 91,9 oranında uyumluluk gözlendi. Ayrıca Kappa istatistiği ile bu 2 yöntemin uyumluluğu analiz edildi. Buna göre kappa değeri 0,825 (p< 0,001) ve 2 yöntem arasındaki uyumluluk mükemmele yakın çıktı. Eş-zamanlı PZR sonuçları ile manuel PZR sonuçları karşılaştırıldığında, yöntemler arasında % 94,1 oranında uyumluluk gözlendi. Yine, Kappa istatistiği sonucuna göre yöntem arasındaki uyumluluk mükemmele yakın çıktı (kappa değeri 0,858, p< 0,001). Geliştirdiğimiz bu yöntem ile hasta, endoskopiye girdiği gün içinde kültüre gerek kalmadan, H. pylori ye sahip olduğunu, klaritromisine dirençli olup olmadığını ve hastalığın patojenitesi ile ilgili bilgiyi tek bir PZR sonucu ile görebilecektir. Hasta, biyopsi örneği laboratuara ulaştıktan 2,5 saat sonra bu sonuçları öğrenebilecektir. Rutin laboratuarları için hızlı sonuç alabilmek önem taşımaktadır. Klinisyen, bu sonuçları değerlendirerek, aynı gün içinde ilaç reçete edebilecek ve gastrik kansere kadar ilerleme olasılığı olan dispeptik yakınmaların, ilerideki patojenitesi hakkında bilgi sahibi olacaktır. 2008, 70 sayfa Anahtar Kelimeler: Helicobacter pylori, klaritromisin, direnç, caga, 23S rrna. i

ABSTRACT Ph.D. Thesis DEVELOPMENT OF A SIMULTANEOUS DETECTION OF THE CLARITHROMYCIN RESISTANCE AND THE CAGA GENE STATUS BY "REAL- TIME POLYMERASE CHAIN REACTION" IN HELICOBACTER PYLORI ISOLATES Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ H. pylori is a gram negative and first class carcinogenic pathogen, which has an important etiologic role in developing active chronic gastritis, peptic ulcer and gastric cancer. H. pylori, also causes MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue). It is recognized that, H. pylori eradication, decreases the ratio of peptic ulcer relapse. For this reason H. pylori eradication with antimicrobial agents, and resistance to antimicrobial agents are important. While long term colonization with some H. pylori strains causes peptic ulcer and gastric cancer, some H. pylori strains show no symptom. This difference is because of the patogenity factor of bacterial caga gene. The aim of this study is, to develop a simultaneous detection of the clarithromycin resistance mutations (A2142G, A2143G, A2142C) and the caga gene status by "Real-time Polymerase Chain Reaction" in H. pylori isolates. In this study, there were 119 patients, who have gastric problems and have been applied to Ankara University Faculty of Medicine Gastroenterology Department. After the DNA isolation from gastric biopsy samples, we developed a Real-time PCR method, which can detect caga gene status and resistance mutations simultaneously. We used SYBR Green 1 dye, hybridization probes and melting curve analysis to determine the caga gene status and resistance mutations respectively. While Multiplex Real-time PCR 23S rrna results have been compared with urease, cytology and DNA sequence analysis, caga gene results have been compared with manual PCR method. There were %91.9 compatibility between, urease, cytology and real-time PCR methods. The compatibility between these two methods have been analysed by Kappa statistics. Kappa value was 0.825 (p< 0,001) and the compatibility was almost perfect. When Real-time PCR caga results have been compared with manual PCR caga results, similar results have been achieved (kappa value was 0.858 (p< 0,001) and the compatibility was almost perfect ). Patients will learn resistance to clarithromycin, and pathogenesis of their disease in one day (in 2.5 hours) by this new technique. Thus the physician can prescribe the drug and learn the pathogenesis of the disease. 2008, 70 pages Key words: Helicobacter pylori, clarithromycin, resistance, caga, 23S rrna ii

TEŞEKKÜR Tez çalışmalarım boyunca bana yardım ve desteğini esirgemeyen, Ankara Üniversitesi Hepatoloji Enstitüsü, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Gastroenteroloji Anabilim Dalı ve Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü ne sonsuz teşekkürlerimi sunarım.. Ankara, 2008 Peren Hatice BAĞAN iii

İÇİNDEKİLER ÖZET.... i ABSTRACT.......ii TEŞEKKÜR....iii SİMGELER DİZİNİ.......vii ŞEKİLLER DİZİNİ.... ix ÇİZELGELER DİZİNİ... x 1. GİRİŞ... 1 1.1 Helicobacter pylori nin Tarihçesi... 1 1.2 Helicobacter pylori nin Morfolojisi... 2 1.3 Helicobacter pylori nin Sınıflandırması... 2 1.3.1 Gastrik Helicobacter türleri... 4 1.3.2 Enterohepatik Helicobacter türleri... 4 1.4 Helicobacter pylori nin Yerleşimi... 6 1.5 Helicobacter pylori nin Epidemiyolojisi... 7 1.5.1 Helicobacter pylori enfeksiyonunun kaynağı... 7 1.5.2 Helicobacter pylori nin görülme sıklığı... 8 1.5.3 Helicobacter pylori geçişi... 9 1.5.4 Helicobacter pylori enfeksiyonunun tekrarı... 10 1.6 Helicobacter pylori nin Patojenitesi... 10 1.6.1 Bakteriyel faktörler... 11 1.7 Helicobacter pylori Genomu... 18 1.8. Helicobacter pylori Tanısı... 20 1.8.1 İnvazif testler... 20 1.8.2 Noninvazif testler... 22 1.9 Helicobacter pylori Tedavisi... 23 1.10 Antimikrobiyal Ajanlara Direnç Genlerinin Kaynağı ve Yayılımı...25 1.11 Helicobacter pylori nin Klaritromisine Direnci... 26 2. KAYNAK ÖZETLERİ... 30 3. GEREÇ VE YÖNTEM... 33 3.1 Gereçler... 33 3.1.1 Hastalar... 33 iv

3.1.2 Kimyasal maddeler... 33 3.1.3 Tampon ve çözeltiler... 34 3.1.4 Aletler... 35 3.1.5 Polimeraz zincir reaksiyonu malzemeleri... 35 3.2 Yöntem... 36 3.2.1 Bakteri kültürü ve saklanması... 37 3.2.3 Bakteri kültüründen genomik DNA ekstraksiyonu... 37 3.2.4 Biyopsi örneklerinin saklanması... 38 3.2.5 Biyopsi örneğinden bakteri genomik DNA ekstraksiyonu... 38 3. 2.6 Klaritromisin direnci mutasyonlarının eş-zamanlı PZR ile belirlenmesi... 39 3.2.7 CagA primerlerinin tasarlanması... 39 3.2.8 CagA geni varlığının Eş-zamanlı PZR ile gösterilmesi... 39 3.2.9 CagA geni ve 23S rrna genlerinin eş-zamanlı PZR ile birlikte belirlenmesi, multipleks (çoklu) PZR... 40 3.2.10 23S rrna geninin DNA dizi analizi... 41 3.2.11 PZR ile caga geni pozitifliğinin saptanması... 43 3.2.12 İstatistiksel analizler... 43 4. BULGULAR... 44 4.1 Hasta Grupları... 44 4.2 Klaritromisin Direnci Mutasyonlarının Eş-zamanlı PZR ile Belirlenmesi Sonuçları... 44 4.3 CagA Geni Varlığının Eş-zamanlı PZR ile Gösterilmesi Sonuçları... 47 4.4 CagA ve 23S rrna Genlerinin Eş-zamanlı PZR ile Birlikte Belirlenmesi, Multipleks PZR Sonuçları... 47 4.5 PZR ile CagA Geni Pozitifliğinin Saptanması Sonuçları... 48 4.6 23S rrna geninin DNA Dizi Analizi Sonuçları... 49 4.7 23S rrna Eş-zamanlı PZR Sonuçları ile Üreaz-Sitoloji Sonuçlarının Karşılaştırılması... 49 4.8 CagA Eş zamanlı PZR Sonuçları ile CagA Manuel PZR Sonuçlarının Karşılaştırılması... 50 5. TARTIŞMA VE SONUÇ... 55 KAYNAKLAR... 60 v

ÖZGEÇMİŞ... 68 vi

SİMGELER DİZİNİ A Adenin ATPaz Adenin Trifosfataz Bç Baz Çifti C Sitozin caga Cytotoxin Associated Gene (sitotoksin ilişkili gen) cag PAI Cytotoxin Associated Gene Patogenicity Island (Sitotoksin İlişkili Gen Patojenite Adası) dntp Deoksiribonükleotitfosfat EDTA Etilendiamintetraasetikasit EF-G Elongation Factor-G FDA Food and Drug Administration G Guanin Gr Gram H. pylori Helicobacter pylori IARC International Agency for Research on Cancer IS Insertion Sequence ( İnsersiyon dizisi ) icea Induced by Contact with Epithelium k Da Kilodalton kb Kilobaz l Litre M Molar MALT Mucosa Associated Lymphoid Tissue mg Miligram MIC Minimal Inhibitor Concentration ml Mililitre C Celsius (Santigrad derece) µ Mikro µg Mikrogram µl Mikrolitre vii

µm Mikrometre NIH National Institutes of Health nm Nanometre NSAID Non Steroidal Anti-Inflamatory Drugs OD Optical Density ORF Open Reading Frame ( Açık okuma çerçevesi) Point of Isoelectric. Aminoasitin Elektriksel Olarak Nötral Olduğu ph pi (İzolektrik nokta) pmol Pikomol PZR Polimeraz Zincir Reaksiyonu rdxa Oksijene Duyarsız NADPH Redüktaz Geni RFLP g Restriction Fragment Length Polymorphism (Restriksiyon Parçacığı Uzunluk Polimorfizmi) rrna Ribozomal Ribonükleik Asit rpm Dakikada Dönme Sayısı rrna Ribozomal RNA SDS Sodyum Dodesil Sülfat T Timin Taq Thermus aquaticus TE Tris-EDTA Tamponu Tris Tris (hidroksimetil) Metilamin Tris-HCl Trizma Hidroklorür U Ünite UV Ultraviyole vaca Vacuolating Cytotoxin (Vakuol Oluşturucu Sitotoksin) VNTR Variable Number of Tandem Repeats (Değişken Sayıdaki Ardışık Tekrarlar) viii

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1.1 16S rrna dizisine dayanarak hazırlanan, geçerli 19 Helicobacter türünü ve 9 geçici türün filogenetik ağacı.........3 Şekil 1.2 H. pylori nin midenin asidik ph ına toleransı....6 Şekil 1.3 H. pylori nin mide epitel tabakasının üzerindeki yerleşimini gösteren elektron mikroskobu görüntüsü....7 Şekil 1.4 Cag patojenite adası.... 16 Şekil 1.5 Cag PAI dan kodlanan 18 proteinin, tip IV sekresyon sisteminin yapı taşları görevindeki şırınga benzeri yapı... 17 Şekil 1.6 H. pylori genomu..19 Şekil 1.7 H. pylori 23 S rrna sında başlıca gözlenen mutasyonlar.....27 Şekil 1.8 Klaritromisinin etki mekanizması....28 Şekil 1.9 H. pylori 23S rrna sı..28 Şekil 4.1 23S rrna Eş-zamanlı PZR ürünlerinin %1 lik agaroz jelde görüntülenmesi......44 Şekil 4.2 Eş-zamanlı 23 rrna PZR ın Erime Eğrisi Analizi Sonuçları.....45 Şekil 4.3 23S rrna Eş-zamanlı PZR ın Miktar Tayini.....46 Şekil 4.4 Multipleks PZR ürünlerinin %1 lik agaroz jelde görüntülenmesi..48 Şekil 4.5 CagA Geni Eş-zamanlı PZR ı Erime Eğrisi Analizi Sonuçları... 51 Şekil 4.6 CagA ve 23S rrna Genlerinin Eş-zamanlı PZR ı nın Erime Eğrisi Analizi Sonuçları.........52 Şekil 4.7 23S rrna DNA dizi analizi, yaban tip sekansı...53 Şekil 4.8 23S rrna DNA dizi analizi, A2142G mutasyonu......53 Şekil 4.9 23S rrna DNA dizi analizi, A2143G mutasyounu...54 ix

ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1.1 Midede yaşan Helicobacter türlerinin sınıflandırılması...3 Çizelge 1.2 Enterohepatik Helicobacter sınıflandırması.......5 Çizelge 1.3 H. pylori nin virulans patojenite özellikleri.....12 Çizelge 2.1 H. pylori de caga ve 23S rrna genleri ile ilgili yapılan çalışmalardan bazı örnekler.....31 Çizelge 3.1 Eş-zamanlı PZR da kullanılan primer ve prob dizileri, çoğalttığı bölgeler ve baz çifti uzunlukları.........39 Çizelge 3.2 23S RNA eş-zamanlı PZR şartları....40 Çizelge 3.3 CagA geni PZR şartları. 41 Çizelge 3.4 Multipleks eş-zamanlı PZR şartları..42 Çizelge 4.1 23S rrna eş-zamanlı PZR ile üreaz ve sitoloji sonuçları karşılaştırılması.....50 Çizelge 4.2 CagA manuel PZR sonuçlarının eş-zamanlı PZR sonuçları ile karşılaştırılması.. 50 x

1. GİRİŞ 1.1 Helicobacter pylori nin Tarihçesi 1979 da, Batı Avustralya nın Perth şehrinde yaşayan bir patolog olan Robin Warren ın, mide biyopsi örneklerinin histolojik çalışmaları sonucunda, sık sık midenin mukus tabakasında, kıvrımlı bakteriler dikkatini çekti. Genç bir gastroenterolog olan Barry Marshall da, Warren ın bu gözlemleriyle ilgilendi ve iki araştırmacı mide biyopsi örneklerinden organizmanın izolasyonu için çalışmalara başladı. Bu organizmalar kıvrımlı ve gram negatif oldukları için araştırmacılar, bakteriyoloji bilim dalında çalışan araştırmacılarla işbirliği yaparak Campylobacter türleri için kullanılan izolasyon yöntemlerini denediler. Birçok Campylobacter türü bu ortam koşulları altında 48 saatte üremekteydi, üreme görülmediğinde ise 3 gün içinde plaklar atılıyordu. Bu şekilde, yaklaşık 30 hastadan alınan kültürler negatif olarak sonuçlandı. Ancak şans eseri, bir kültür Paskalya tatili nedeni ile 5 gün inkübasyonda kaldı ve tatilin sonunda kolonilere rastlandı. Böylece ilk defa, 14.05.1982 tarihinde şu an Helicobacter pylori olarak adlandırdığımız organizma izole edilmiş oldu (Marshall and Warren, 1984). Bu buluşun yayınlanmasından sonra, çok hızlı bir şekilde dünya üzerinde birçok araştırmacı mide mukusunda bu bakterinin varlığını doğruladı ve H. pylori ile ilgili çalışmaların temeli atılmış oldu. Marshall (1984), H. pylori yi izole ettikten sonra, bakteriyi kendi üzerinde denemeye karar verdi ve endoskopi ile mide mukozasının sağlıklı olduğu gözlendikten sonra, peptik ülserli hastanın lezyonundan üretilen bakteri kültüründen hazırlanan süspansiyonu içti. Marshall da bir hafta sonra akut gastrik semptomlar görülmeye başladı. İkinci hafta sonunda ise, mideden alınan biyopsi örneğinde mide mukus tabakası altına yerleşmiş kıvrımlı bakterilere ve endoskopik inceleme sonunda ise inflamasyona rastlandı. Marshall ın bu deneyi sonucunda mide hastalıklarının etiolojisinde H. pylori nin rolü kanıtlanmış oldu (Hopkins and Morris 1994). Marshall tarafından 1984 de bu bakteri ilk olarak Campylobacter pyloridis olarak adlandırıldıktan sonra ancak 1987 de Campylobacter pylori, 1989 da ise 1

Campylobacter cinsinden çıkartılıp, Helicobacter adlı yeni bir cinse dahil edildi ve Helicobacter pylori adı verildi (Goodwin et al. 1989). Son olarak 3-Ekim-2005 tarihinde, Warren ve Marshall H. pylori yi keşfettikleri ve bu bakterinin gastrit ve peptik ülser hastalıklarındaki rolünü gösterdikleri için tıp alanında NOBEL ödülünü kazandılar. 1.2 Helicobacter pylori nin Morfolojisi H. pylori organizması spiral, mikroaerofilik, gram negatif bir bakteridir. Sıvı besiyerinde kültürü yapıldığında bakteri morfolojisi çubuk şeklindedir. Spiral şekildeki bakteriler seyrek ya da hiç yoktur. Mide biyopsi örneklerinde H. pylori, 2,5-5 µm uzunluğunda, 0,5-1 µm genişliğinde, 6 unipolar kılıflı flagellalıdır. Her flagella 30 µm uzunluğunda ve ortalama 2,5 nm kalınlığındadır. Flagella, ucunda flagella kılıfının uzamasının göstergesi olan, karakteristik, ampül şeklinde şişkinlikler ( terminal bulp ) bulunur. Flagella kılıfı, tipik çift katlı membran yapısı gibidir. Bu kılıf Helicobacter cinsini Campylobacter den ayıran önemli bir yapıdır (Dunn et al. 1997). Helikal formdaki bakteri, besin yetersizliği, artan oksijen miktarı, alkalin ph, yüksek sıcaklık, farklı antibiyotiklere maruz kalma ve kültürde uzun süre kalma gibi nedenlerden dolayı kokoid forma döner. Elektron mikroskobu ile bakıldığında, kokoid formlar U şeklinde ve iki kolu membran yapıyla birleşmiş haldedir. Kokoid formlar metabolik olarak aktiftir ancak in vitro ortamda kültürü yapılamaz. Bazı literatürler bakterinin bu 5-20 gün kültüre edilmiş kokoid formunun invitro ortamda tekrar kültüre edilemeyeceğini belirtmiştir (Brenciaglia et al. 2000). Ancak bakterinin kokoid formu membranı ve polifosfat enerji kaynakları bulundurması bakımından canlı olarak kabul edilir (Benaissa et al. 1996, Sorberg et al. 1996, Brenciaglia et al. 2000). Aynı zamanda bakterinin bu formunun enfeksiyonun geçişinden ve antimikrobiyal tedavi nüksünden sorumlu olduğu düşünülmektedir (Brenciaglia et al. 2000). 1.3 Helicobacter pylori nin Sınıflandırması Helicobacter türleri, insanın dışında hayvanların da gastrointestinal sisteminde görülür. H. pylori kültürünün yapılmasının ardından H. pylori nin klinik önemi daha iyi anlaşıldı. Bunu takiben insanların, hayvanların gastrointestinal ve hepatobilier yollar ile 2

ilişkili bakteriler araştırıcıların merak konusu olmuştur. Bu organizmalar insanlardaki ve hayvanlardaki patolojik rolleri ilgi konusu olmaya devam etmektedir. Yeni tanımlanan bazı Helicobacter türlerinin de insanları enfekte ettiği ortaya konmuştur. Helicobacter ailesinin bilinen tek cinsi Helicobacter dir. Bu cinste yer alan diğer bakteriler farklı hayvan türlerine karşı konak tropizmi gösterirler (Çizelge 1.1). Ancak, ilişkilerin tümünde gastrointestinal sistem doku ve organlarına karşı tropizm görülür (Köksal vd. 2002). 16S rrna dizisine dayanarak hazırlanan, geçerli 19 Helicobacter türünü ve 9 geçici türün filogenetik ağacı Şekil 1.1 de verilmiştir. Şekil 1.1 16S rrna dizisine dayanarak hazırlanan, geçerli 19 Helicobacter türünün ve 9 geçici türün filogenetik ağacı (Solnick and Schauer 2001) 3

1.3.1 Gastrik Helicobacter türleri Bugüne kadar, insan ve diğer hayvanların midesinden 8 adet Helicobacter türü kültürü yapılmıştır (Çizelge1.1). Kemirgen barsağında nadiren kolonize olan H. muridarum, midede de gözlenmiştir. Çizelge 1.1 Midede yaşayan Helicobacter türlerinin sınıflandırılması (Solnick and Schauer 2001) a Candidatus Helicobacter suis ile identik olması muhtemel. H. heilmannii tip 1 in 16S rrna sı insanlarda, domuzlarda, insan dışı primatlarda da tanımlanmıştır, konakçı sayısının daha da geniş olduğu düşünülmektedir. Diğer konakçılarda da H. heilmannii morfolojisine benzeyen diğer organizmalar bulunmaktadır ancak bunlar H. bizzozeroni ya da henüz tanımlanmamış diğer Helicobacter türlerini temsil etmektedir. b yayınlanmamış bilgi Takson Doğal Konakçı H. acinonychis Çita H. bizzozeroni Köpek Candidatus Helicobacter bovis Sığır H. felis Kedi, köpek H. heilmannii a İnsan, insan olmayan primatlar Candidatus Helicobacter suis Domuz H. mustelae Yaban gelinciği H. nemestrinae b Makak maymunu H. pylori İnsan, maymun H. salomonis Köpek H. suncus Kır faresi 1.3.2 Enterohepatik Helicobacter türleri Gastrik, spiral şekilli bakterilere ek olarak diğer bir Helicobacter grubu da, insanların, diğer memelilerin ve kuşların barsak ve/veya karaciğerinde yaşayan Helicobacter 4

türleridir (Çizelge 1.2). Bu enterohepatik Helicobacter türleri (EHS) normalde gastrik mukozada kolonize olmamasına rağmen, ultra yapıları ve fizyolojik özellikleri gastrik Helicobacter türlerine benzerdir. EHS lerin gastroenterit, hepatit ve diğer bazı hastalıklara hayvanlarda ve insanlarda neden olduğu bilinmektedir. Çizelge 1.2 Enterohepatik Helicobacter sınıflandırması (Solnick and Schauer 2001) Sınıflandırma Doğal konakçı H. bilis Fare, köpek, insan H. canis Köpek, insan H. cinaedi İnsan, hamster H. cholecystus Hamster H. fennelliae İnsan H. hepaticus Fare H. muridarum Fare, rat H. pamntenis Kuş, domuz H. pullorum Tavuk, insan H. canadensis İnsan H. rodentium Fare H. trogontum Rat H. typhlonicus Fare H. mesocricetorum Hamster Helicobacter sp. flexispira taxon 5 Koyun, köpek, insan, fare H. mainz İnsan H. westmeadii İnsan Helicobacter sp. cottontop Maymun 5

1.4Helicobacter pylori nin Yerleşimi H. pylori mide epiteli olan bölgelere tutunabilir. Erişkinlerde proksimal duodenumda %30 oranında, bölgeye gelecek asit salgısından korunmak için mide epiteli bulunur. Özofagusta da yer yer mide epitelyumu bulunabilir. Böylece H. pylori mide dışında, duodenum ve özofagusta da epitele tutunabilir (Erdem 1999). Tüm bu yerleşim bölgelerinde bakteriler kümeler halinde bulunmaktadırlar. H. pylori nin midenin asidik ph ına toleransı şu şekilde sağlanmaktadır ( Şekil 1.2); 1. Üreaz: Üre CO 2 + NH 3, sonra NH 3 + H + NH + 4, tampon görevi görür. 2. Mukus ve epitel hücrelerde yer alır. 3. Düşük ph da iyonik gradiyent oluşturma kapasitesi vardır. 4. Erken enfeksiyon sırasında, asit salınımının azaltan parietal hücreleri serbest bırakır. H. pylori, insan midesinde, mukus tabaka ile gastrik epitelyum arasına veya duodenal mukozaya yerleşir (Şekil 1.3). Şekil 1.2 H. pylori nin midenin asidik ph ına toleransı (http://aige.org/pdf/prof_kazumasa_miki.pdf., 2007). 6

1.5 Helicobacter pylori nin Epidemiyolojisi H. pylori enfeksiyonuna bağlı gastrit dünyada en sık rastlanan gastrointestinal hastalıktır. Özellikle gelişmekte olan ülkelerde oldukça yaygındır. Batı da gelişmiş ülkelerde enfeksiyon oranı düşmekte, fakat yine de prevelans %25-50 civarında görülmektedir (Dunn et al. 1997). Yüksek görülme sıklığına karşın, H. pylori ile enfekte olan hastaların çoğu asemptomatiktir (Blaser 1997). Ülkemiz de, gelişmekte olan bir ülke olup H. pylori hemen hemen tüm toplumu enfekte etmektedir. Ülkemizde yapılan bir çalışmada 2 yaşındaki çocukların % 14 ünün, 7 yaşındakilerin %76 sinin, 22 yaşındakilerin, %72 sinin, yetişkinlerin ise %85-90 ının H. pylori ile enfekte olduğu görülmüştür (Özden et al. 1992). Şekil 1.3 H. pylori nin mide epitel tabakasının üzerindeki yerleşimini gösteren elektron mikroskobu görüntüsü (www.h.pylori.info/images/h_pylori_ulcer_diagram.jpg., 2007 ) 1.5.1 Helicobacter pylori enfeksiyonunun kaynağı Su: H. pylori nin suda saptanması için yapılan bir çok çalışma vardır (Park et al. 2001, Mazari-Hiriart et al. 2001, Horiuchi et al. 2001, Lu et al. 2002). Üç ayrı çalışmada çeşitli yöntemler kullanılarak bir ya da daha fazla su kaynağında H. pylori DNA sı gösterilmiştir. Bunlar; 1) Japonya da kuyu suyunda (Horiuchi et al. 2001), 2) İskoçya daki belediyeye ait su dağıtma sisteminden alınan içme suyunda (Park et al. 2001), 3) Mexico-City nin etrafını çevreleyen 3 farklı su dağıtma sisteminde yapılan 7

çalışmalardır (Mazari-Hiriart et al. 2001). Ancak tek bir çalışmada sudan H. pylori kültürü yapılabilmiştir. Bu çalışmada Mexico daki işlenmiş atık su kanalından uzun işlemlerden sonra H. pylori izole edilmiştir (Lu et al. 2002). Bu çalışmada, mikroskobik incelemeler, katalaz, oksidaz ve hızlı üreaz testleri sonucunda 37 farklı tip H. pylori izolatı tanımlanmıştır. Çevresel Kaynaklar: Poms and Tatini (2001) tarafından H. pylori nin yiyeceklerde +4 C de canlı kalabileceği gösterilmiştir. Ancak canlı olarak H. pylori hücrelerinin görüldüğü yiyeceklerde ve tekrar izolasyonu mümkün olan süt, salatalık, tavuk gibi yiyeceklerde H. pylori nin artışı gözlenmemiştir. Hayvanlar: Hayvanlar ile yakın temas ve enfeksiyonun kazanımı arasındaki ilişkiyi gösteren pek çok çalışma vardır (Brown et al. 2001, Bazolli et al. 2001, Herbarth et al. 2001). Brown et al. (2001) ın Çin de yaptığı geniş populasyonlu (n=3288) bir çalışmada, evcil hayvan beslemenin ya da hayvanlarla çalışmanın, H. pylori enfeksiyonunu artırmadığı gözlenmiştir. Bazolli et al. nın (2001) yaptığı çalışmada da, evcil hayvanlara maruz kalmanın H. pylori enfeksiyonuna bir etkisi olmadığı gösterilmiş, yani ikisi arasında bir ilişki bulunamamıştır. Ancak Almanya da evcil hemsterlarla yapılan bir çalışmada enfeksiyon riskinin arttığı gözlenmiştir. Herbart et al. (2001) ise, koyun ve koyun sütünün H. pylori transmisyonunda rol oynayabileceğini göstermiş ve sütten başarılı bir H. pylori izolasyonu yapmıştır. 1.5.2 Helicobacter pylori nin görülme sıklığı H. pylori nin görülme sıklığı ülkeler arasında ve ülke içinde, sosyoekonomik düzey ve yaş gruplarıyla ilişkili olarak farklılık gösterir (Mitchell and Megraud 2002). H. pylori enfeksiyonunun çocukluk döneminde kazanıldığı oldukça iyi bilinmesine karşın tam bir yaş bilinmemektedir. Malaty et al. (2001), 224 Amerika lı çocukta yaptığı araştırmada, H. pylori prevelansı 1-3 yaşlarında %8 iken, 18-23 yaşları arasında bu oran %24,5 e çıktığını göstermiştir. Buna göre, görülme sıklığının yaşa paralel olarak arttığı düşünülmektedir. Ülkenin sosyoekonomik durumu H. pylori enfeksiyonunun görülme sıklığı açısından oldukça büyük önem taşır. Gelişmiş ülkelerde sosyoekonomik düzeyin yüksek olması 8

enfeksiyonun yeni kuşaklarda azalmasına yol açmıştır. Bir çok gelişmiş ülkede, H. pylori enfeksiyonu, son yıllarda belirgin bir şekilde düşmektedir. Finlandiya da yapılan bir çalışmada, 1963 1973, 1983 1995 yılları arasında ki dönemde H. pylori enfeksiyonunda, %38 den % 12 ye bir düşüş gözlenmiştir. 1.5.3 Helicobacter pylori geçişi İnsan dışındaki canlılardan H. pylori izole edilememesinden dolayı en sık görülen transmisyon modelinin insandan insana geçiş olduğu düşünülmektedir. H. pylori nin bir bireyin midesinden, diğer bireyin midesine geçiş yolları ile ilgili çeşitli görüşler vardır: İyatrojenik geçiş: Dezenfekte olmamış endoskoplar ve gastrik mukozaya temas eden diğer ekipmanlar bir bireyden diğer bireye geçişe neden olur. Eldivensiz endoskopi yapanlar da yüksek oranda risk altındadır. Bu organizmaya dokunmanın risk olmadığı bilinmektedir ancak yine de laboratuarların bu konuda titizlik göstermesi gerekmektedir (Mitchell and Megraud 2002). Fekal-oral geçiş: En önemlisi fekal-oral transmisyondur. H. pylori ile enfekte insanların feçesinde H. pylori saptanabilmektedir. Fekal yolla kontamine olan sular enfeksiyon kaynağıdır (Thomas et al. 1992). Aile içi ve aileler arası geçiş: H. pylori nin aile içinde ve aileler arasında transmisyonunun olabileceğine dair pek çok çalışma vardır (Daugle et al. 2001, Taneike et al. 2001, Dore et al. 2001). H. pylori enfeksiyonun aile içinde bulaşabileceği Taneike et al. (2001) tarafından kanıtlanmıştır. Japon ailesi ile yapılan çalışmada anne, baba ve iki çocuktan alınan biyopsi örneklerinden izole edilen H. pylori izolatlarıyla ribotyping yapılmıştır. Birinci çocuk ve babanın aynı suşla enfekte olduğu, ikinci çocukla annenin farklı suşlarla enfekte olduğu görülmüştür. Baba ve çocuklara H. pylori tedavisi uygulandıktan 7 hafta sonra H. pylori negatifleşmiştir. Otuz altı hafta sonra 1. çocuğun tekrar enfekte olduğu görülmüş ve buna ribotyping yapıldığında anne ile aynı H. pylori suşuna sahip olduğu anlaşılmıştır. Horizontal geçiş: Malaty et al. (2001) ve Kitagawa et al. (2001) emzirme ile H. pylori transmisyonu arasındaki ilişkiyi araştırmıştır. Malaty et al. (2001) emzirmenin bulaşmada önemli rol oynadığını gösterirken, Kitagawa et al. (2001) emzirmenin 9

temizlik kurallarına uygun olarak yapıldığında (el ve göğüs uçları temizlendiğinde) bulaşmanın olmayacağını göstermiştir. Ancak horizontal transferin, temizlik kurallarına uygun olarak yapılmadığında ortaya çıktığını göstermiştir. H. pylori yi dışkıdan ve ağızdan kültüre edebilmek için yapılan pek çok çalışma olmasına karşın çok az bir kısmında başarılı olunmuştur. Allaker et al. (2002), 100 İngiliz çocuktan aldıkları mide suyu, oral, rektal ve dental plak örnekleri ile çalışmıştır. H. pylori, 3 çocukta mide sıvısından kültüre edilirken, ağızdan, feçesden ve dental plaktan alınan örneklerde kültüre edilememiştir. Ancak H. pylori DNA sı 11 çocuğun mide sıvısından, 36 çocuğun dental plağından, 23 çocuğun ağzından ve 8 çocuğunda feçesinden PZR ile saptanmıştır. Dental plak ve mide sıvısında PZR ile saptanan H. pylori ile midedeki H. pylori nin varlığı arasında ilişki bulunmuş ancak oral ve fekal örnekler için aynı ilişki bulunamamıştır. Bunun nedeninin de PZR da kullanılan primerlerin spesifitesinden kaynaklandığı düşünülmüştür. Şahin et al. (2001) ise mide biyopsi örneklerinde H. pylori DNA sı pozitif olduğu bilinen Türk hastalarında diş plağından H. pylori izole edememişlerdir. 1.5.4 Helicobacter pylori enfeksiyonunun tekrarı Başarılı bir H. pylori eradikasyonundan sonra tekrar oranı gelişmiş ülkelerde düşük oranda görülürken, gelişmemiş ülkelerde durum farklıdır. Duodenal ülserli 105 Bangladeşli hastayla yapılan bir çalışmada başarılı bir tedaviden sonra hastalar takip edilmiş ve nüks oranına bakılmıştır. Buna göre yılda %13 oranında tekrara rastlanmış olup bu oran gelişmiş ülkelerden daha yüksektir (Honda et al. 2001). 1.6 Helicobacter pylori nin Patojenitesi H. pylori nin mide asitlik derecesinde üremesi olanaklı değildir. Mide mukusunun aside geçirgenliği olmadığı gibi aynı zamanda buna karşı bir tampon görevi yaparak mukusun altındaki mukoza epitelyumine yerleşen bakteriyi koruyan etkisi vardır. Mukusun mide lümenindeki tarafında ph:1,0 2,0 iken mukus altında ph:7,4 civarındadır. H. pylori, doğal yaşam ortamı olan mide mukozasında mukus içinde asit ortamdan korunarak yaşamını sürdürür. Spiral şekli ve çok sayıda kirpiği ile mukus içinde hızlı hareket edebilir (Erdem 1999). 10

H. pylori infeksiyonlarının patogenezinde bakteriyel faktörler kadar konağın immun cevabı ve çevresel koşullar da etkilidir. 1.6.1 Bakteriyel faktörler VacA (vakuol oluşturucu sitotoksin ), caga (sitotoksinle ilişkili A geni), icea genleri gibi bazı virulans faktörleri, suşların yalnız bir bölümünde bulunur, bu da yalnız bazı suşların hastalıkla bağlantılı olmasını açıklar. Üreaz, flagella ve adhesinler gibi bazıları ise bütün suşlarda bulunur. Bunlar patogenez ve kolonizasyon için önemli faktörlerdir (Atherton and Covacci 1997, Go and Crowe 2000). Çizelge 1.3 de özetlenmiştir. Flagellin: H. pylori spiral morfoloji ve flagella yardımıyla viskoz ortamda kolayca hareket edebilmektedirler. En önemli virulans faktörü hareket yeteneğidir, flagella kolonizasyonun en önemli aracıdır. Flagella hareketi, ph bağımlıdır, ph: 4,1 in altında hareket durur. Üre ve sodyum bikarbonat hareketi uyararak pozitif kemotaksis özelliği gösterir. Flagella flaa, flab ve flae proteinlerinden oluşur. Hareketten flaa proteini sorumlu iken flae proteini uçlardaki karakteristik terminal soğanı oluşturur. Flagellası olmayan H. pylori mutantları, hayvan modellerindeki çalışmalarda non-virulan bulunmuştur (Atherton and Covacci 1997, Go and Crowe 2000). Adhezinler: H. pylori mide epitel hücrelerine tutunabilmek için en az beş farklı adhezin kullanmaktadır. Bunlardan flagella membranında taşıdığı Hpa A proteini ve dış membranında yer alan Hsp A daha önce belirlenmiştir. Buna ek olarak dış membran yapısında yer alan 19 yeni lipoprotein bulunmuştur. Bunlardan çok azının fonksiyonu belirlenebilmiş, bazılarının ise bakterinin tutunma özelliğine katkı sağladıkları gösterilmiştir (Atherton and Covacci 1997, Go and Crowe 2000). Membran yapısının birçok proteinleri içerisinde yer alan Lewis doku kan grubu antijenleride H. pylori nin mide epitel dokusuna tutunmasında rol oynamaktadır. Süperoksit dismutaz ve katalaz: Bu enzimler, polimorf çekirdekli lökositlerin fagositoz etkilerine karşı H. pylori yi korurlar. Ayrıca katalaz, bakteriyi in vivo toksik O 2 radikallerinin etkisinden korumaktadır. 11

Çizelge 1.3 H. pylori nin virulans patojenite özellikleri (Go and Crowe 2000 ) Özellik Etki Spiral şekli Flagella Lipopolisakkaritler GM3, Gangliozid ve Lewis B antijenlerine özgül bağlanmayı sağlar. Üreaz A ve B Mukus içinde motaliteyi sağlar. Hareketin etkin oluşunu sağlar. Gastrik mukus salgılayan hücrelere selektif kolonizasyon Gastrik ortamda canlı kalabilme (bazı çalışmalarda, amonyağın epitelyum hücresine toksik etkisi gösterilmiş) Katalaz Gastrik ortamda ve muhtemelen de fagositik vakuollerde (H 2 O 2 den korunarak) canlı kalabilmek. Fosfolipaz A ve B Proteaz VacA (Vakoul yapıcı sitotoksin) Düşük molekül ağırlıklı, kemoreaktif proteinler (porinler) Mukusun epitelyal hücre membranının sindirimi, mukusu ıslaklığının artışı. Mukusun epitelyal hücre membranının sindirimi, mukus ıslaklığının artışı. Epitelyum hücresi hasarı. Nötorfil mononükleer hücreleri kendilerine çekerek, reaktif O 2 bileşikleri ve IL lerin salınması. caga (sitotoksin ilişkili gen) proteini Sitotoksin oluşumu ve peptik ülser oluşumuna neden olur. Isı şok proteinler Otoimmünitede rol oynar. 12

H. pylori, proteaz enzimi ile, mide mukozasındaki mukusu parçalar. Böylece, bakterinin kolonizasyonunu kolaylaştırır. Bu bakteri, salgıladığı proteaz, lipaz ve fosfolipaz enzimleri aracılığıyla mukus ve epitelyumde hasar oluşturabilir. Üreaz: Üreaz yaklaşık 540 kda molekül ağırlığında hekzamerik bir moleküldür. Sitoplazmik metalloenzim olan üreazın nikel iyonlarına gereksinimi vardır. Gastrik kolonizasyonunun başlangıç döneminde üreaz aktivitesinin koruyucu rolü önemlidir. Mide mukozasındaki asit ortamda bu bakterinin canlı kalabilmesi yüksek düzeyde üreaz enzimi yapılmasıyla ilgilidir. H. pylori üreaz enziminin etkisiyle üre, amonyak ve karbondioksite parçalanır. Amonyak bir H(+) iyonları akseptörü olduğundan midede lokal ph artar (Atherton and Covacci 1997, Go and Crowe 2000). Yapılan pek çok çalışmada amonyağın mide epitel hücrelerinde morfolojik ve fonksiyonel değişmelere neden olduğu gösterilmiştir. Ayrıca amonyak bakteriyel adezyonu arttırmakta ve koplemanı inaktif hale getirmektedir. H. pylori üreaz aktivitesi, mononükleer hücre aktivasyonu ve inflamatuar sitokin üretiminde güçlü bir uyarıcıdır (Windsor and O Rourke 2000). VacA Geni: VacA geni, vakolule edici sitotoksin üretiminden sorumlu gendir (Nicolas et al. 2001). Her suşta bu gen bulunmasına karşın, bu suşların ancak % 50 sinin aktif toksin ürettiği saptanmıştır (Cover 1996). Bu da, vaca geninin, sinyal (s) ya da orta (m) bölgesindeki diziye bağlıdır. VacA geninin, amino ucu sinyal bölgesi (signal-s) ve orta (middle-m) bölgesinin nükleotit dizilerine göre farklı allelik varyantları tanımlanmıştır (Nicolas et al. 2001). S bölgesi s1a, s2b, s1c veya s2 allellerinden birini içerirken, m bölgesi ise m1, m2a, m2b allellerinden birini içermektedir. Bu farklı s ve m allelleri, suşlar arasında rekombinasyonla bir araya gelerek s1m1, s1m2, s2m2 ve s2m1 genotiplerini oluşturur. Çalışmalar vaca s1m1 suşlarının büyük miktarlarda vakuole edici sitotoksin ürettiğini ve suşların da peptik ülser hastalığı ile ilişkisi olduğunu göstermiştir Diğer taraftan s2m2 suşlarının, sitotoksini ya hiç üretmediği ya da oldukça küçük miktarlarda ürettiği görülmüştür. Bunun da peptik ülserli hastalarda yaygın olmadığı saptanmıştır (van Doorn et al. 1998). VacA geni, 140 kda lık oligomerik yapıda bir protoksin sentezler. Bu protoksin asidik ph da lizize uğrayarak, 37 ve 58 kda luk aktif parçaları oluşturur. Bu toksin sitozolde vakuoler tip ATPaz proton pompasını aktive ederek, ozmotik olarak zayıf bazların 13

endozomlara göçünü ve endozomların da nükleus etrafında birleşerek büyük asidik, vakuoller oluşturmalarını sağlar. Aşırı miktarda hücre içine alınan toksin hücre ölümüne yol açar (Cover et al.1992). icea Geni: H. pylori ile enfekte hastaların bazılarında vaca ve caga genotipleri bulunmasına karşın semptom göstermemektedir. Bu da virulansda ek genlerin olduğunu düşündürmüştür. Peek et al. (1998), bu düşünce ile yola çıkarak başka virulans genleri aramaya başladılar. Mide epiteline tutunmanın, bazı virulans genlerin ifadesini uyarlığını düşündüler. Bu nedenle, tutunma ile uyarılan H. pylori genlerinin ifadesini açıklamak ve genlerin peptik ülser, mukozal interlökin (IL8) düzeyi ve yangı ile ilişkisine bakmak için, mide epitel hücreleriyle maruz kalan ve kalmayan suşlardan elde edilen RNA ların ifadesine baktılar. Böylece ilk defa Peek et al. tarafından H. pylori klinik izolatlarında, mide biyopsilerindeki inflamasyon ve IL-8 ile ilişkisi olan yeni bir gen tanımlandı. icea geni ( induced by contact with epithelium ) olarak tanımlanan bu genin DNA dizisine bakıldığında icea1 ve icea2 olmak üzere 2 gen ailesi olduğu görüldü. Bu genlerin de peptik ülser ve mukozada artmış IL-8 konsantrasyonu ile ilişkisi anlamlı bulundu. icea1 ve icea2 nin invitro ortamda H. pylori tarafından eksprese edildiği görüldü. In vitro ortamda ise mide epitel hücrelerine adheransın, H. pylori nin icea geninin transkripsiyonunu uyardığı görülmüştür. IceA geninin, icea1 ve icea2 olmak üzere 2 gen ailesi olmasına karşın, yalnız icea1 in mide epiteli ile teması sonucu uyarıldığı gösterildi ve peptik ülserle ilişkisi bulundu. icea2 nin ise non-ülser dispepsi li hastalarda daha sık görüldüğü bilinmektedir (Peek et al. 1998). Peek et al. (1998) de icea genini tanımladıktan sonra Figueiredo et al. (2000), farklı coğrafik bölgelerden alınan 19 farklı H. pylori suşunun icea1 ve icea2 geni dizi çözümlemesini yaptı. Buna göre icea1 geni, 315-397 bç arasında değişen uzunlukta varyantlara sahiptir ve G+C içeriği ise % 36 dır. Aynı suşlarda icea2 genine bakıldığında ise icea1 e göre daha kompleks olduğu görüldü. IceA2 nin uzunluğu icea1 de olduğu gibi oldukça çeşitlilik göstermekte (224-338 bç) ve farklı olarak 8bç lik (AAAATACTC veya AAATACTT) değişken sayıdaki ardışık tekrarlar (Variable Number of Tandem Repeats=VNTR) içermektedir. Bu VNTR bölgelerinin 1 kopya dan 15 kopyaya kadar tekrar ettiği gözlenmiştir. IceA2 nin G+C içeriği ise %33 olarak saptanmıştır. IceA bölgesinin G+C içeriğinin H. pylori genomunun G+C 14

içeriğinden daha düşük olması nedeniyle, bu genlerin horizontal transferle başka bakteri türlerinden aktarıldığı ya da nadir görülen diğer H. pylori suşlarından aktarıldığı düşünülmektedir (Figuerido et al. 2000). IceA1 proteinin doğru biyolojik fonksiyonu net olarak bilinmemekteydi. Ancak daha önceki çalışmalarda, mutant icea1 geninin maymun modelinde midede kolonize olmazken, yaban tip icea1 suşunun maymun midesinde uzun süreli kolonizasyonu gözlenmiştir (Dubois et al. 1996). Daha sonra 2002 yılında yayınlanan bir makalede, icea geninin tüm genom dizi analizi yapılmış ve icea1 in CATG ye spesifik restriksiyon endonükleaz nlaiiir kodlayan, Neisseria lactamica nın NlaIII ile homolog olduğu görüldü (Xu et al. 2002). IceA genotiplerinin gastrik hastalıklarla ilişkisini araştırmak amacıyla pek çok çalışma yapılmıştır (Nishiya et al. 2000, Ashour et al. 2001, Kidd et al. 2001, Figueiredo et al. 2001, Godoy et al. 2003). Bazı araştırmacılar icea genotiplerinin peptik ülser, gastrit, mide kanseri gibi gastrik hastalıklarla ilişkili bulurken (Kidd et al. 2001), bazılarıda ilişki bulamamıştır (Yamaoka et al. 1999, Nishiya et al. 2000, Ashour et al. 2001, Figueiredo et al. 2001, Godoy et al. 2003). Thioredoxin (CD 59): H.pylori suşları proteinleri disülfit bağlarından keserek denatüre eden thioredoxin enzimine sahiptir. Bu enzim sayesinde mukus tabakası içerisindeki musinleri ve dahada önemlisi konakta salgılanan nonspesifik ve spesifik Ig leri (IgA, IgG ve IgM) denatüre ederek immun tepkiden korunurlar (Köksal 2002). Cag Patojenite Adası (cag PAI) ve caga Geni: H. pylori enfeksiyonu çoğunlukla kronik atrofik gastrit ile sonlanmasına rağmen, enfekte olmuş hastaların çoğunda başka hiçbir komplikasyon ve klinik belirti gözlenmemektedir (Kusters et al. 2006). Bu da bazı suşların diğer suşlara göre daha virülent olduğunu göstermektedir. İlk araştıcılar, H. pylori suşundaki diferansiyel patojenik özelliklerin, daha virülent suşlardaki morfolojik değişikliklere, vakuolizasyon ve in vitro hücre kültüründe başarılı dejenerasyona neden olduklarını göstermişlerdir. Bu aktiviteyi daha sonra 140 kda luk moleküler ağırlıkta CagA (sitoksin ilişkili gen A) adlı proteinin varlığı ile bağlamışlardır. CagA proteini, caga geni tarafından sentezlenen yüksek derecede immünolojik bir proteindir. Bu gen H. pylori suşlarının ortalama %50-70 inde 15

bulunmaktadır ve PAI varlığının göstergesidir. caga geni yaklaşık 37kb lık bir DNA segmenti olan cag PAI (cag patojenite adası) nın sağ ucunda bulunur (Şekil 1.4). Cag PAI NCTC11638 suşunda transposable element girişi ile ikiye bölünür. cag PAI gen içeriği ve düzenlenmesi bakımından suşlar arasında korunmuştur (Akopyants et al. 1998). Cag PAI taşıyan suşlar (caga + suşlar), CagA proteinine karşı potansiyel antikor titresini indükleyen suşlardır. caga pozitif suşlar ile enfekte Batı toplumundaki hastalar, çoğunlukla yüksek inflamatuar cevaba sahip olurlar ve semptomatik sonuçların (peptik ülser veya gastrik kanser) gelişmesinde yüksek risk altındadırlar. Ancak Asya populasyonlarında farklıdır. caga pozitif suşlar, daha sık gastritle ilişkilendirilmesine rağmen (ve böylece yüksek riskte ülser hastalığı, atrofik gastrit ve mide kanseri ile de) cag PAI olmayan suşlarında, hastalarda düşük oranlarda peptik ülser, gastrik kanser yaptığı gözlenmiştir. Yani caga pozitif suşların çoğu tam ve devamlı cag PAI içerirken, anlamlı bir kısmı da (~%10) eksik ve tamamen fonksiyonel olmayan cag PAI içermektedir. Bu farklılığın hastalığın oluşmasındaki etkisi hala tam olarak aydınlatılmamıştır. Şekil 1.4 Cag patojenite adası. CagA geni cag patojenite adasının 3 ucundadır (Selbach et al. 2002) Cag PAI dan kodlanan 18 protein, tip IV sekresyon sisteminin yapı taşları gibi görev yapmakta ve şırınga benzeri bir yapı oluşturarak (Şekil 1.5) mide epitelyum hücresine penetre olmasını ve CagA proteini, peptidoglikan ve diğer bakteriye ait faktörlerin konak hücreye translokasyonunu sağlar. CagA proteini hücreye aktarıldığında, EPIYA motifindeki tirosin ile Src kinaz ailesi tarafından fosforillenir. Fosforillenmiş caga, bir dizi konak sinyal molekülleri (tirosin fosfotaz SHP 2 gibi) ile etkileşir ve etkileşim epitel hücredeki morfolojik değişim ile sonuçlanır. 16

Şekil 1.5 Cag PAI dan kodlanan 18 proteinin, tip IV sekresyon sisteminin yapı taşları görevindeki şırınga benzeri yapı (Selbach et al. 2002) Cag PAI, T hücrelerinin apoptozisini indükleyerek immün cevabı da etkiler. Tip IV yapısı ile konak hücre arasındaki etkileşim epitelyum hücrelerdeki proinflamatuar sitokinlerin indüksiyonu ile sonuçlanır. Başlarda CagA proteininin kendisinin proinflamatuar sitokinleri indüklediği düşünülüyordu ancak şu an CagA nın aktivasyonda küçük bir rol oynadığı düşünülüyor. IL-8 sinyal yolağının aktivasyonunun bilinmeyen bakteriyel faktörün translokasyonu ile sonuçlandığı tam olarak söylemez. Tirosin fosforilasyonu caga EPİYA motifinde meydana gelir ve CagA nın SHP-2 ye bağlanmasını gerektirir. CagA nın içindeki EPIYA tirosin fosforilasyonu motifi farklı H. pylori izolatlarında önemli varyasyonlar gösterir. CagA nın tirosin fosforilasyonunun miktarı tekrar sayıları ile doğrudan ilişkilidir. CagA proteininde bu tekrarlara çok sayıda sahip olan suşlar kültürü yapılmış epitel hücrelerde daha fazla morfolojik değişikliğe neden olmaktadır ve mide karsinogenez riskide yükselmektedir. CagA aynı zamanda SHP-2 domainleri yolu ile C-terminal Src kinaz ile de etkileşir ve bunun sonucunda C- Src protein tirosin kinazlar inaktive olur. Bu kinazlar CagA nın tirozin fosforilasyonuna aracılık ederken bu inaktivasyon CagA fosforilasyonunun redüklenmesini sağlar. Böylece feedback loop regülasyon CagA aktivitesi sağlanır. Bu konak-patojen çapraz etkileşimi, virülensin kontrolünü ve böylece konağın uzun süreli kolonizasyonuna katkıda bulunabilir (Kusters et al. 2006). Doğu Asya da mide kanseri prevelansı Batı ülkelerinden daha fazladır. H. pylori ler arasında belirgin coğrafik farklılıklar vardır ve caga gen fragmentlerindeki bu büyük 17

sekans farklılıkları, Doğu Asya ve batı suşlarını birbirinden ayırır. İnflamasyonun derecesi, gastritin aktivitesi ve atrofisi Doğu Asya CagA pozitif tipi suşlardan belirgin olarak daha yüksektir. CagA proteininin Doğu Asya ya özgün sekansının SHP-2 ye bağlanması, Batı tip sekansa göre daha güçlü olur. Bu da, Doğu Asya CagA nın virülens faktörü gibi konak hücre fonksiyonlarına zarar verme potansiyelinin Batı CagA ya göre daha yüksek olduğunu gösterir. Bu nedenle Doğu Asya CagA proteinleri, Doğu Asya ülkelerindeki mide kanser prevelansını etkileyebilir ve Doğu Asya CagA pozitif suşları Batı CagA pozitif suşlara göre daha virülenttir (Yamasaki et al. 2005). Ülkemizde yapılan bir çalışmada, H. pylori nin Batı tipi caga olduğu saptanmıştır (Sarıbaşak vd. 2004). 1.7 Helicobacter pylori Genomu İlk defa Tomb et al. ın (1997) de, H. pylori 26695 suşunun tüm genomunun dizi çözümlemesini yapması ile H. pylori biyolojisi hakkında, Honcock et al. nın (1998) de H. pylori J99 suşunun dizi analizini yapması ile de çeşitliliği hakkında önemli bilgiler edinilmiştir. Daha sonra da H. pylori çeşitliliği ile ilgili pek çok çalışma yapılmıştır (Kuipers et al. 2000, Blaser 1997, Blaser and Berg 2001). İlk genom dizi çözümlemesi yapılan Hp 26695 suşu genomunun genel özelliklerine bakacak olursak; suş 1,667,867 bç lik halkasal bir kromozoma sahiptir. G+C kompozisyonu bakımından 5 farklı bölgesi bulunur. 452-478 kb lar arasında bulunan 1.bölge (%33 G+C) IS 605 insersiyon dizisi kopyası, 521 bç lik bir tekrar bölgesi, 5SRNA geni ve virb4 geni içerir. virb4 geni, Agrobacteriım tumefaciens de T- DNA nın transferinden sorumlu bir proteini kodlayan gendir. H. pylori de IS 605 ve IS606 olmak üzere 2 farklı IS elementi vardır. IS606, IS605 ile %50 den daha az benzerlik gösterir. IS605 de 5 tane tüm uzunluklu (full length), daha sonra bulunan IS606 da ise buna ek olarak 2 tane parçalı uzunluklu kopyalar bulunur. Her ikisi de farklı transkripsiyon ürünleri olan TnpA ve TnpB transpozonlarını kodlar. 539-579 kb lar arasında bulunan 2.bölgede (%35 G+C) peptik ülserle ilişkili gen olan cag PAI bulunur. 1,049-1,071 kb lar arasında bulunan 3.bölge, 1.bölgeye benzer olarak IS605, 5SRNA ve 7 tekrar dizisi içerir. G+C içeriği %43 olan, 1,264-1,276 kb lar arasında bulunan 4.bölge, RNA polimerazın alt birimi olan β ve β alt üniteleri kodlayan rpob ve 18

rpoc genlerinden oluşur. FusA geni de bu bölgededir. FusA geni, translasyon uzama faktörü olan EF-G faktörünü kodlar. Son olarak 5. bölge (%33 G+C) de 2 restriksiyonmodifikasyon sistemi içermektedir. H. pylori DNA da benzerliği %97 den büyük olan 8 tekrar ailesi bulunur. Bunlar gen duplikasyonlarının temsil edildiği bölgelerde veya kodlanan dizilerde bulunurlar. Şekil 1.6 H.pylori genomu (Thomb et al. 1997) İlk halka predicted coding region (+) ipliği, 2. halka ( ) ipliği, 3. ve 4. Halka IS (Insertional sequence) elemetleri, tekrar elementleri, 4. ve 5. Halka trna, rrna Tomb et al. (1997), H. pylori 26695 suşu kromozomunun, %91 ini oluşturan 1.590 açık okuma alanı (open reading frame=orf) tanımlamışlardır. 26695 suşundaki %9 oranındaki kodlanmayan bölge 3 sınıfa ayrılır. Kodlanmayan bölgenin %6 sı intergenik dizi, %2.3 ü kodlanmayan tekrarlar, %0.7 stabil RNA dan oluşur. 1.590 ORF den 1.091 inin diğer organizmalardaki karşılığı bulunmuştur ve tahmini biyolojik rolleri anlaşılmıştır. Geriye kalan 499 ORF nin ise veritabanında karşılığı bulunamamıştır. Bunların da H. pylori ye özgül olduğu düşünülmüştür. H. pylori deki öncül proteinlerin izoelektrik noktasına bakıldığında, proteinlerin %70 inin, pi >7 (pi: Bir aminoasitin elektriksel olarak nötral olduğu ph dır.) olduğu 19

görülmektedir (Şekil 1.6). Bu oran H.influenza ve E.coli de %40 dır. H. pylori proteinlerinde H.influenza ve E.coli proteinlerinin 2 kat fazlası kadar temel aminoastilerden bazik aminoasit olan arjinin ve lizin içerirler. Bunun da H. pylori nin mide asiditesine adaptasyon için olduğu düşünülmektedir (Thomb et al. 1997). 1.8 Helicobacter pylori Tanısı H. pylori infeksiyonu tanısında çok sayıda invazif ve non-invazif yöntemler kullanılmaktadır. Testlerin tümünün kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır. Bu yüzden tanı amacıyla birden fazla testin birlikte uygulanması yaygındır. 1.8.1 İnvazif testler Endoskopi sırasında alınan biyopsi örneğinde H. pylori araştırılması temeline dayanan testlerdir. H. pylori aramak ve kültürünü yapmak için endoskopik biyopsi örneği alınacağı zaman bazı kurallara dikkat edilmelidir. Bu kurallar şunlardır: 1. Hastalar herhangi bir nedenle antibiyotik kullanıyorlarsa, biyopsiden önce 5 7 gün antibiyotik alımı kesilmelidir. 2. Hasta müdahaleden önce, simetidin preparatı almış olmamalıdır. 3. İşlemde kullanılacak forseps ve diğer aletler temizlenmeli ve %2 glutaraldehid çözeltisi ile dezenfekte edilmiş olmalı ve dezenfektan kalıntısı kalmamalıdır. 4. Lokal anestezik olarak Lidocaine seçilmelidir. 5. Pilora 3 4 cm uzaklıktaki antrum bölgesinden en az iki biyopsi örneği alınmalıdır (Erdem, 1999). Biyopsi örneklerinde H. pylori şu yöntemlerle aranır: Histopatolojik inceleme: Hem gastrite hemde H. pylori ye tanı konulabilmektedir. Bu bakımdan çok değerlidir. Hızlı ve ucuzdur. Whartin Starry gümüşleme yöntemi, akridin oranj boyaması az sayıda bakteri varsa yararlıdır. Hematoksilen-eosin klasik doku boyasıdır. Giemsa ile doku ve bakteriler görülür. Gram boyama kolay, pratik ve başarılı 20

bir yöntemdir. Biyopsi materyali lam üzerine ezilir, yayılır ve boyanır. Histopatolojinin H. pylori tanısında duyarlılığı %93 99, özgüllüğü %95-99 dur (Erdem 1999). Kültür: En güvenilir yöntemdir ve antibiyotik duyarlılık testlerine olanak verir. Biyopsiden elde edilen örneklerle antibiyotik içeren kültür ortamlarında H. pylori üretilmektedir (Antibiyotikler mide florasının ortamda çoğalmasını engellemek içindir). Bunun için zenginleştirilmiş besiyerleri kullanılır (Skirrow medyumları ve non selektif bir medyum olan çukulata agar, Brain-heart infusion lı kanlı agar kullanılabilir). Materyal 37 C de 3-5-7 gün inkübe edilmelidir. Ortam nemli olmalı ve %5 oranında oksijen, bulunmalıdır. Bunun için ticari gas pack ler kullanılabilir. Kıvrık veya S şeklindeki organizmanın katalaz ve üreaz aktivitesinin olması bize elimizdeki organizmanın H. pylori olduğunu gösterir. Zor ürer ve çevre koşullarından olumsuz etkilenir. Üreme yoksa H. pylori yoktur demek doğru değildir. Özgüllüğü %100 dür, ancak duyarlılığı %77-92 dir (Erdem, 1999, Blaser, 2000). Dışkı örneğinin de kültürü yapılır. Dışkı florası arasından H. pylori yi izole etme şansı düşüktür. Özgüllük %100, duyarlılık %30-50 dir (Erdem 1999). Üreaz Testleri: Biyopsi örneğinin üreaz testi (örneğin CLOCampylobacter like organizm test), H. pylori nin ürettiği üreazın ortamdaki üreyi parçalaması ve oluşan NH 3 ve bikarbonatın ph ı yükseltmesi ve bunun bir indikatör ile gösterilmesine dayanır. Biyopsi örneği Christensen besiyerine, Stuart üre testi solusyonuna veya %10 üre ve %1 fenol kırmızısı solusyonuna konur ve renk değişikliği gözlenir (Erdem 1999). Hızlı üreaz testlerinin özgüllüğü %98, duyarlılığı %93 97 oranındadır (Dunn et al. 1997). Yersinia enterocolitica ve Proteus vulgaris gibi üreazı olan bakterilerin varlığında karışıklık doğabilir. Fakat H. pylori varlığında üreaz testi 1 saat içinde olumlu sonuç verir, diğer bakterilerde ise 12 saat gerekir (Erdem 1999). Antimikrobiyal ajanlara duyarlılığı: H. pylori de antimikrobiyallere duyarlılığını belirlemesinde E-test ve agar dilüsyon metodları önerilmektedir. Polimiksin B ye (300 IU disk) suşların %95 i dirençlidir. Nalidiksik aside (30 mg disk) suşların %86 sı dirençli, sefalotine (30 mikrogram disk) ise % 92 duyarlıdır. Bu özellik Campylobacter ve Helicobacter suşlarının ayırımında kullanılmaktadır. H. pylori, penisilinlere, sefalosporinlere, tetrasikline, eritromisine, aminoglikozidlere ve nitrofurantoine 21