BUĞDAY TARLASI ATIKLARINDAN ALKALİ HİDROLİZ İLE FENOLİK MADDELERİN ÜRETİMİ VE ÜRETİM KOŞULLARININ OPTİMİZASYONU Gülsen USAL Yüksek Lisans Tezi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Doç. Dr. Özlem AKPINAR 2014 Her hakkı saklıdır
T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ BUĞDAY TARLASI ATIKLARINDAN ALKALİ HİDROLİZ İLE FENOLİK MADDELERİN ÜRETİMİ VE ÜRETİM KOŞULLARININ OPTİMİZASYONU Gülsen USAL TOKAT 2014 Her hakkı saklıdır
Qzlenp AKPINA danrgmanh[mda, Giilsen USAL tarafrndan agagdaki jiiri tarafindan oy birlifi ile G ns Tezi olarak kabul edilmigtir. haztlanan Miihend Uye: uye: ulcrrrdaki sonucu onavlanm.
TEZ BEYAI\I olarak hazrrlanan bu tezin na uylr uygu4 eserlerinden v ldulunu, tezin igerdigi yenil d bir verrilerde herhangi bir tahrifat bagka bir iiniversitedeki bagka
ÖZET Yüksek Lisans Tezi BUĞDAY TARLASI ATIKLARINDAN ALKALİ HİDROLİZ İLE FENOLİK BİLEŞİKLERİN ÜRETİMİ VE ÜRETİM KOŞULLARININ OPTİMİZASYONU Gülsen USAL Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Özlem AKPINAR Lignin parçalanma ürünleri; gıda, ilaç ve kozmetik sanayisinde kullanılan fenolik bileşiklerin üretimi için potansiyel bir kaynaktır. Fenolik bileşikler, özellikle insan sağlığına olumlu etkilerinden dolayı son yıllarda oldukça popüler olmuştur. Bu çalışmada, hasat sonrası ortaya çıkan buğday tarlası atıklarının değerlendirilmesi amacıyla, buğday sapları asit ve alkali işlemlerle parçalanmış ve ferulik ve p-kumarik asit gibi fenolik bileşikler üretilmiştir. Buğday saplarında bulunan hemiselülozu uzaklaştırmak amacıyla, önce asit ve sonrasında geride kalan lignin ve selülozu birbirinden ayırmak için de alkali hidrolizi yapılmıştır. Asit hidrolizasyonu ile hemiselüloz kendini oluşturan şekerlere parçalanmış, alkali hidrolizasyonu ile de lignin, fenolik bileşikler halinde çözünür hale geçirilmiştir. Buğday saplarından fenolik bileşiklerin üretimi üzerine sıcaklık, süre ve alkali konsantrasyonunun etkisi araştırılmış ve yüksek miktarda fenolik bileşik üretimi için koşullar tepki yüzey metodu kullanılarak optimize edilmiştir. Optimum koşullar olarak 2,3 M NaOH konsantrasyonunda 120 ºC sıcaklıkta 90 dakika hidrolizasyon süresi bulunmuş ve bu koşullarda yapılan hidrolizasyonda da, 1 g buğday sapından 0,79 mg ferulik asit ve 2,40 mg kumarik asit, 0,55 mg şiringik asit, 0,32 mg vanilik asit, 0,14 mg vanilin, 0,03 mg 3,4- dihidroksibenzaldehit, 0,03 mg p-hidroksibenzoik asit ve 0,002 mg gallik asit üretilmiştir. Optimum koşullardaki antioksidan aktivitesi ölçüldüğünde ise FRAP aktivitesi 1,11 mmol TE/l, TEAC aktivitesi 1,66 mmol TE/l, DPPH aktivitesi de 0,35 mmol TE/l olarak bulunmuştur. Sonuçlar buğday tarlası atıklarından ekonomik ve endüstriyel değeri olan yüksek antioksidan aktiviteye sahip fenolik bileşiklerin üretilebileceğini göstermiştir. 2014, 85 sayfa Anahtar Kelimeler: Lignoselüloz, Lignin, Fenolik asit, Ferulik asit, Kumarik asit i
ABSTRACT M. Sc. Thesis PRODUCTION OF PHENOLIC MATERIALS FROM WHEAT FIELD WASTE BY ALKALINE HYDROLYSIS AND OPTIMIZATION OF THE PRODUCTION CONDITIONS Gülsen USAL Gaziosmanpaşa University Graduate School of Natural and Applied Science Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. Özlem AKPINAR Lignin degradation products can be used to produce phenolic compounds for food, cosmetic and pharmaceutical industries. Phenolic compounds, due to their positive effect on human health, have become popular products in recent years. In this study, to utilize the wheat field waste, wheat straw was treated with acid and alkaline to produce phenolic acid such as ferulic and coumaric acid. To remove hemicellulose, wheat straw was treated with acid, followed by alkaline to seperate lignin and cellulose from each other. With acid hydrolysis, hemicellulose was hydrolyzed to sugars and with alkaline hydrolysis, lignin was solubilized as phenolic compounds. Alkaline treatment was carried out to determine the effect of alkaline concentration, temperature and time on the production of phenolic compounds and alkaline treatment conditions was optimized by using responce surface method to produce the high amount of phenolic compounds. Optimum conditions were determined as 2,3 M NaOH concentration at 120 ºC for 90 minutes and at this conditions from 1 g of wheat straw, 0,79 mg/g ferulic acid, 2,40 mg/g coumaric acid, 0,55 mg/g syringic acid, 0,32 mg/g vanillic acid, 0,14 mg/g vanillin, 0,03 mg/g 3,4-dihydroxybenzaldehyde, 0,03 mg/g p-hydroxybenzoic acid and 0,002 mg/g gallic acid were obtained. Antioxidant activities of the hydrolysate, obtained at the optimimum conditions, were also measured and 1,11 mmol TE/l FRAP, 1,66 mmol TE/l TEAC and 0,35 mmol TE/l DPPH of antioxidant activities were found. The results showed that wheat straw can be used for the production of phenolic compounds with high antioxidant activity that have economic and industrial importance. 2014, 85 pages Key Words: Lignocellulose, Lignin, Phenolic acid, Ferulic acid, Coumaric acid ii
ÖNSÖZ Araştırmanın planlanmasında ve yürütülmesinde emeği olan ve çalışmanın her aşamasında desteğini ve ilgisini hiç esirgemeyen danışman hocam sayın Doç. Dr. Özlem AKPINAR a, tezimi okuyup değerlendirdikleri için değerli jüri üyelerim Prof. Dr. Sefa TARHAN a ve Yrd. Doç. Dr. Mehmet TOKATLI ya, her zaman yanımda olup desteklerini hiç esirgemeyen aileme ve yüksek lisans arkadaşlarım Fatmagül HALICI, Esra TOPALOĞLU, Emel TEMİZ, Burcu SAPCI ve Serdal SABANCI ya sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Projeleri Araştırma Komisyonu (Proje no: 2013/48) tarafından desteklenmiştir. Gülsen USAL Ocak, 2014 iii
İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... i ABSTRACT... ii ÖNSÖZ iii İÇİNDEKİLER iv KISALTMALAR DİZİNİ.. vi ŞEKİLLER DİZİNİ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ viii 1. GİRİŞ...... 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ........ 3 2.1. Tarımsal Atıklar....... 3 2.2. Lignoselülozik Maddeler.. 5 2.2.1. Lignoselülozik Maddelere Uygulanan Ön İşlemler... 6 2.2.2. Selüloz.... 8 2.2.3. Hemiselüloz........ 9 2.2.4. Lignin.... 13 2.3. Fenolik Bileşikler......... 20 2.3.1. Antioksidan Maddeler.... 21 2.3.2. Ferulik Asit..... 23 2.3.3. Kumarik Asit.. 26 2.3.4. Diğer Fenolik Bileşikler. 27 3. MATERYAL ve YÖNTEM... 31 3.1. Materyal... 31 3.2. Yöntem..... 31 3.2.1. Asit Hidrolizi.. 31 3.2.2. Analitik Yöntem.... 31 3.2.3. Alkali Hidrolizi... 32 3.2.4. Deneysel tasarım ve tepki yüzey metodu (Response Surface Methodology RSM) ile hidrolizasyon koşullarının optimizasyonu...... 32 3.2.5. İndirgen Şeker Tayini..... 34 3.2.6. Antioksidan Tayini..... 34 3.2.6.1. Troloks Eşdeğeri Antioksidan Kapasitesi - TEAC.. 34 3.2.6.2. Demir (III) İndirgeme Antioksidan Gücü - FRAP...... 34 3.2.6.3. DPPH Radikal Süpürme Aktivitesi..... 35 3.2.7. Toplam Fenolik Madde Tayini....... 35 3.2.8. Ferulik Asit Tayini........ 36 3.2.9. İnce Tabaka Kromotografisi ile Hidrolizatların Kalitatif Analizi...... 36 3.2.10. HPLC ile Hidrolizatların Kantitatif Analizi..... 36 3.2.11. İstatistiksel Analiz.... 37 4. BULGULAR ve TARTIŞMALAR...... 38 4.1. Buğday Sapının Kompozisyonu... 38 4.2. Alkali Ektraksiyonu...... 41 4.3. Fenolik Asit Üretimi..... 43 4.4. Antioksidan Aktiviteleri...... 51 4.5. İstatistiksel Modelleme..... 54 4.6. Optimizasyon.... 60 iv
5. SONUÇ....... 65 6. KAYNAKLAR... 67 EKLER... 74 EK A... 76 EK B... 77 EK C... 78 EK D. 79 EK E. 80 EK F. 81 EK G. 82 EK H. 84 ÖZGEÇMİŞ. 85 v
KISALTMALAR DİZİNİ Kısaltma AAE ABTS AFEX BS CCD DNS DPPH FRAP GA HPLC TLC RSM TE TEAC TPTZ TUİK X1 X2 X3 Y1 Y2 Açıklama Askorbik asit eşdeğeri 2,2 -Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) Amonyak Lif Patlaması Buğday Sapı Merkezi Birleşik Tasarım (Central Composite Design) Dinitrosalisilik asit 2,2 diphenyl-1-picryhydrazyl Demir İndirgeme Gücü Antioksidan Kapasitesi Gallik asit eşdeğeri Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi İnce Tabaka Kromatografisi Cevap Yüzey Yöntemi (Response Surface Methodology) Troloks Eşdeğeri Troloks Eşdeğeri Antioksidan Kapasitesi 2,4,6-Tris (2-pyridyl)-s-triazine Türkiye İstatistik Kurumu NaOH konsantrasyonu Süre Sıcaklık Ferulik asit miktarı Kumarik asit miktarı vi
ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Lignoselülozik materyalin yapısı. 5 Şekil 2.2. Selülozun molekül yapısı.... 8 Şekil 2.3. Ligninin yapısı. 14 Şekil 2.4. Ligninin yapısındaki p-kumaril, koniferil ve sinapil alkol... 15 Şekil 2.5. Lignin/fenolik/karbonhidrat kompleksleri....... 16 Şekil 2.6. Koniferil alkolün radikal çiftlerinden oluşan lignanlar.... 17 Şekil 2.7. Tarımsal atıkların asit ve alkali hidrolizasyonuyla oluşan parçalanma ürünleri. 18 Şekil 2.8. Ferulik asidin kimyasal yapısı...... 24 Şekil 2.9. p-kumarik asidin kimyasal yapısı... 27 Şekil 2.10. Vanilinin kimyasal yapısı. 28 Şekil 2.11. Vanilik asidin kimyasal yapısı. 29 Şekil 2.12. Şiringik asidin kimyasal yapısı. 29 Şekil 2.13. Gallik asidin kimyasal yapısı 30 Şekil 4.1. Alkali hidrolizasyonu sonrası HPLC ile belirlenen fenolik bileşiklerin miktarları (mg/l hidrolizat) 48 Şekil 4.2. Alkali hidrolizasyonu sonrası HPLC ile belirlenen fenolik bileşiklerin miktarları (mg/g Buğday sapı)... 49 Şekil 4.3. Buğday saplarının alkali hidrolizasyonuyla ferulik asit üretimiyle elde edilen kontur ve yüzey grafikleri. A: 85 ºC sıcaklıkta alkali konsantrasyonu ve sürenin ferulik asit üretimine etkisi. B: 60 dakikada sıcaklık ve konsantrasyon değişiminin ferulik asit üretimine etkisi. C: 2 M NaOH konsantrasyonunda sıcaklık ve süredeki değişimin ferulik asit üretimine etkisi 58 Şekil 4.4. Buğday saplarının alkali hidrolizasyonuyla kumarik asit üretimiyle elde edilen kontur ve yüzey grafikleri. A: 85 ºC sıcaklıkta alkali konsantrasyonu ve sürenin kumarik asit üretimine etkisi. B: 60 dakikada sıcaklık ve konsantrasyon değişiminin kumarik asit üretimine etkisi. C: 2 M NaOH konsantrasyonunda sıcaklık ve süredeki değişimin kumarik asit üretimine etkisi. 59 Şekil 4.5. Optimum koşullarda (2,3 M NaOH, 120 ºC, 90 dk) gerçekleştirilen hidrolizasyonla elde edilen fenolik bileşik miktarları (mg/l lidrolizat) 61 Şekil 4.6. Optimum koşullarda (2,3 M NaOH, 120 ºC, 90 dk) gerçekleştirilen hidrolizasyonla elde edilen fenolik bileşik miktarları (mg/g Buğday sapı).. 62 vii
ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Türkiye de üretilen bazı tarım ürünleri ve oluşturdukları atıklar... 4 Çizelge 2.2. Hemiselüloza etki eden enzimler ve etki durumu.. 11 Çizelge 3.1. Alkali hidrolizasyonunda denenen bağımsız değişkenlerin değerleri.. 33 Çizelge 3.2. HPLC de kullanılan çözgen sistemi... 37 Çizelge 4.1. Buğday sapının asit hidrolizasyonu öncesi ve sonrası kompozisyonu 39 Çizelge 4.2. Buğday sapının asit hidrolizasyonu sonrası sıvı kısmın kompozisyonu 40 Çizelge 4.3. Buğday sapının asit (120 ºC de %4 H 2 SO 4 ve 30 dakika) ve farklı koşullarda alkali hidrolizasonu ile elde edilen selüloz, hemiselüloz ve lignin verimleri. 42 Çizelge 4.4. Alkali hidrolizasyonu sonrası toplam fenolik ve ferulik asit miktarları 45 Çizelge 4.5. Alkali hidrolizasyonu sonrası DNS miktarları... 51 Çizelge 4.6. Alkali hidrolizasyonu sonrası antioksidan aktiviteleri... 52 Çizelge 4.7. Deneysel tasarım ve ön işlem görmüş buğday sapının alkali ile hidrolizasyonu sonucu elde edilen değerler... 55 Çizelge 4.8. Buğday saplarının asit ve alkali hidrolizasyonu sonrasında elde Çizelge 4.9. edilen ferulik asit için ANOVA Çizelgesi.. 56 Buğday saplarının asit ve alkali hidrolizasyonu sonrasında elde edilen kumarik asit için ANOVA Çizelgesi... 56 Çizelge 4.10. Buğday saplarından alkali hidrolizasyonuyla ferulik ve kumarik asit üretiminin optimizasyonu için kullanılan istatistik programı (Design Expert) tarafından önerilen optimum koşulları ve program tarafından tahmin edilen değerler 60 Çizelge 4.11. Optimum koşullarda gerçekleştirilen alkali hidrolizasyonun toplam fenolik, FRAP, TEAC, DPPH ve DNS sonuçları.. 64 viii
1. GİRİŞ Türkiye zengin tarımsal potansiyele sahip bir ülkedir. Geniş tarım alanlarından dolayı da yüksek oranda tarımsal atık açığa çıkmaktadır. Tarımdan daha fazla gelir sağlamak, çevreyi ve doğayı korumak hatta sosyo-ekonomik gelişmeyi sağlayabilmek için bu tarımsal atıkların değerlendirilmesi gerekmektedir. Amerika ve Kanada da "bitkinin bütünsel olarak değerlendirilmesi" yaklaşımı benimsenmiştir (Alkaya ve ark., 2010). Ancak ülkemizde bu yaklaşım yaygın bir uygulama değildir. Ülkemizde yıllık ortaya çıkan tarımsal atıklar verimli bir şekilde değerlendirilememektedir. Bu atıkların toplanması ve imha edilmesi ek maliyetler yaratmakta ve ekonomik bir değere sahip ürüne dönüştürülememekte ve genellikle hayvan yemi olarak kullanılmaktadırlar. Bu kullanımın dışında kalan tarımsal atıklar ise çoğunlukla ya tarlada yakılmakta ya da çürümeye bırakılmaktadır. Atıkların yakılmasıyla ekosistem zarar görmekte, çürümeye bırakılan atıkları da belli parazitler kışları konukçu olarak kullanmakta ve gelecek yıllardaki üretime hastalık taşımaktadırlar (Anonim, 2012a). Tarımsal atıkların geri dönüşümü, karbon döngüsü ve atıkların aşırı birikiminin önlenmesi için önemlidir (Salgado ve ark, 2012). Bu atıklar, fosil kökenli kaynaklar yerine kullanılarak yüksek katma değerli biyoürünlerin üretiminde kullanılabilecek potansiyele sahip maddelerdir. Petrol rafinerilerinin bir benzeri olan biyorafinerileri ile petrol yerine tarımsal atıklar da dahil olmak üzere çeşitli kaynaklar kullanılarak organik asitler, çözücü maddeler, esterler, monomerler, polimerler gibi pek çok kimyasal madde, gübre, lif, biyoplastikler gibi değerli ürünler ve biyogaz, biyodizel, hidrojen, etanol gibi yenilenebilir enerji üretimi son yıllarda hız kazanmıştır (Alkaya ve ark., 2010). Lignoselülozik yapıya sahip tarımsal atıklar selüloz, hemiselüloz ve lignin gibi önemli polimer kaynağıdır ve yapılarında bulundurdukları aromatik bileşikler ve birçok fonksiyonel grup sayesinde çeşitli kimyasalların ve ürünlerin üretimine imkan sağlamaktadır. Lignoselülozik yapılı atıklardan çeşitli şekerler, tatlandırıcılar, fenolik maddeler, etanol, biyodizel, yapıştırıcılar, kozmetik maddeler, kağıt hamuru, çeşitli 1
polimerler, temizleyiciler, deterjan, biyogaz, yapı malzemesi olmak üzere çeşitli maddeler elde edilebilmektedir. Lignoselülozik materyalleri kullanılabilir hale getirmek için, öncelikle bu yapının parçalanması gerekmektedir. Bu amaçla son yıllarda, hemiselülozu uzaklaştırmak için asit ve geride kalan lignin ve selülozu ayırmak için de alkali uygulaması en çok kullanılan yöntemlerdir (Al Arni ve ark., 2007; Mussatto ve ark., 2007; Torre ve ark., 2008; Max ve ark, 2009). Lignin selülozu çevrelediğinden hidrolizini zorlaştırmaktadır ve bu nedenle lignini çözünür hale geçirebilecek işlemler daha çok tercih edilmektedir (Sun ve ark., 1997). Ligninin büyük bir kısmı asitte bile çözünmezken (klason lignin), küçük bir kısmı asitte çözünebilir (asit çözünür lignin) (Castro, 1994) ve hidrolizasyon esnasında fenolik bileşikleri oluşturmaktadır (Akpınar ve ark., 2012). Geride kalan lignini (klason lignin) kullanılabilir hale getirmek için, uygulanan uzaklaştırma yöntemlerinden birisi de alkali muamelesidir. Alkali muamelesinin lignini çözünür hale geçirmede ve fenolik asitlerin üretiminde oldukça etkili bir yöntem olduğu ispatlanmıştır (Al Arni ve ark., 2007). Lignoselülozik yapının bir parçası olan lignin parçalanma ürünleri, gıda, ilaç ve kozmetik sanayisinde kullanılan, fenolik bileşiklerin üretimi için potansiyel bir kaynaktır. Bu fenolik bileşikler, günümüzde önemli bir yere sahip oksidasyonu önleyen ya da geciktiren antioksidan özellik de gösteren maddelerdir ve özellikle insan sağlığına olumlu etkilerinden dolayı son yıllarda oldukça popüler olmuştur (Altuğ, 2009). Bu tezin amacı, hasat sonrası ortaya çıkan buğday tarlası atıklarının sosyal, ekonomik ve çevresel sürdürülebilirliği sağlayabilecek şekilde değerlendirilmesi ve bu atıkların katma değeri yüksek ürünlere dönüştürülmesidir. Bu çalışmada lignoselülozik doğaya sahip buğday tarlası atığı olan buğday saplarından, önce asit ardından da alkali uygulaması ile lignin çözünür hale geçirilerek fenolik madde üretimi yapılmıştır. Alkali hidrolizasyon koşulları, fenolik asitler arasında yüksek miktarda ferulik ve kumarik asit üretimi için optimize edilmiştir. 2
2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1. Tarımsal Atıklar Atık en basit tanımı ile "ihtiyaçlarımızı karşılamak üzere kullandığımız maddelerin, o an için kullanılmayan veya kullanıldıktan sonra atılan kısmıdır" (Anonim, 2011). Bunlar orman ürünleri atıkları, endüstriyel atıklar, tarımsal atıklar ve evsel atıkları içermektedir. Nüfus artışı, kentleşme ve sanayileşmenin ivme kazanması, çevreye gelişigüzel bırakılan atıkların miktarında ve türünde artışa sebep olmuş, böylece katı atıklar günümüzün en önemli çevre sorunlarından biri haline gelmiştir. Tarımsal alanlarda, yoğun bir emek ve yüksek maliyetler ile yetiştirilen bir bitkinin sadece tüketilen kısmının alınıp geri kalanının atılması, emeğin ve girdilerin de çöpe atılması anlamına geldiğinden (Alkaya ve ark., 2010) atıkların değerlendirilmesi konumuzun önemli alanlarından birini içerir. Buğday, pirinç, arpa, mısır, yulaf gibi tahıllardan ve diğer bitkilerden sap, saman, kavuz, kepek, kabuk, küspe gibi tarımsal atıklar oluşmaktadır. Bu ürünler, biyokütle atıklarının toplam yıllık üretiminin önemli bir kısmını oluşturmaktadırlar (Pasha ve ark., 2013). Türkiye de yılda yaklaşık 50 milyon tondan fazla tarımsal atık açığa çıkmaktadır. Çizelge 2.1 de çeşitli tarım ürünlerinin üretimi ve oluşturdukları atık miktarı görülmektedir. Bu verilere bakıldığında ürünlerin üretim miktarlarına oranla oluşan tarım atıklarının oldukça fazla olduğu dikkat çeken bir durumdur (Alkaya ve ark., 2010). Tarım ürünlerinin tamamı düşünüldüğünde, önemli oranda biyokütlenin atık olarak kaldığı söylenebilir. Buğday, ülkemizde en fazla üretilen üründür ve başta İç Anadolu Bölgesi olmak üzere hemen hemen her bölgede yetişebilen, toplam tahıl alanları içinde en fazla ekimi yapılan üründür. Toplam tahıl üretiminde en büyük paya sahip olan buğdayda, yeterlilik derecesi (Yeterlilik derecesi=standart değer/gerçekleşen değer (Anonim, 2013a)) %102,2 olarak, tahıl ürünleri arasında birinci sıradadır (Anonim, 2013b). Türkiye İstatistik Kurumu (TUİK) verilerine göre 2012 yılında 75 296 394 dekar alanda ekimi yapılan buğday 20 100 000 ton üretimle birinci sıradadır. Buğday, çalışmanın yürütüldüğü Tokat ilinde de üretilen tarla ürünleri arasında 89 905 hektar alandan ekilen 3
alanların %35 ini oluşturarak birinci sıradadır (Anonim, 2013b). Üretilen buğday ise, yaklaşık 368 000 tonla (Sabancı, 2012) tarla ürünlerin %58 ini oluşturmakta ve yine ilk sırada gelmektedir (Anonim, 2013b). Çizelge 2.1. Türkiye de üretilen bazı tarım ürünleri ve oluşturdukları atıklar (Anonim, 2007; Anonim, 2012b; Halıcı, 2013). Ürünler Atık Üretim (ton) Alan (ha) Toplam Atık (ton) Buğday Saman 20 100 000 75 296 394 26 130 000* Arpa Saman 7 100 000 27 487 664 8 519 999* Mısır Pamuk Sap, Koçan Sap, Çırçır atığı 4 600 000 622 609 2 320 000 4 884 963 12 307 538* 241 999* 6 391 599 * 487 199* Ayçiçeği Sap 1 370 000 604 616 3 836 001* Pirinç Saman, Kabuk 331 563 59 879 582 555 88 527 Yulaf Saman 322 830 150 459 419 678 Çavdar Saman 253 243 145 907 405 188 Tütün Sap 181 382 222 691 362 763 Yer fıstığı Saman, Kabuk 55 241 25 167 127 054 27 621 Soya Saman 28 795 15 064 60 468 *Anonim 2007 de belirtilen rakamlara göre teorik olarak hesaplanmıştır Referans Anonim, 2012b Anonim, 2012b Anonim, 2012b Anonim, 2012b Anonim, 2012b Anonim, 2007 Anonim, 2007 Anonim, 2007 Anonim, 2007 Anonim, 2007 Anonim, 2007 Buğday işlenmesi sırasında yan ürün olarak önemli miktarda buğday sapı oluşmaktadır. Buğday sapı, bitkinin %60 ını oluşturmakta (Pasha ve ark., 2013) ve 1 kg buğdaydan yaklaşık 1,3-1,4 kg buğday sapı elde edilmektedir (Montane ve ark., 1998). Günümüzde genellikle hayvan yemi olarak kullanılmaktadır ve buğdayın ekonomik dönüşünün yaklaşık %3,2 sini buğday sapı oluşturmaktadır (Pasha ve ark., 2013). Her ne kadar hayvan yemi amacıyla kullanılabilme potansiyeli bulunsa da, özellikle tarlada kalan atıklar, çoğu zaman hasat sonrası açık alanlarda yakılmakta ya da çürümeye 4
bırakılmaktadır. Günümüzde artan çevresel endişeler, araştırmacıların bu tip tarımsal atıkların gıda ve gıda dışı amaçlar için kullanılarak değerlendirilmesi üzerine odaklanmasına sebep olmuştur. 2.2. Lignoselülozik Maddeler Lignoselülozik kütle, yakıt veya kimyasallara dönüştürülebilen polimerlerin yaygın, yenilenebilir ve ucuz bir kaynağıdır (Hasyierah ve ark., 2008). Bu materyaller kaynağına bağlı olarak dört gruba ayrılabilir. Bunlar; orman atıkları, katı atıklar, atık kağıt ve hasat sonrası kalan atıklardır (Balat, 2011). Lignoselülozik kaynakların fiziksel ve mekanik özellikleri gibi kimyasal kompozisyonları da özeldir. Bu materyaller Şekil 2.1 de de gösterildiği gibi başlıca lignin, hemiselüloz ve selülozdan oluşan kompleks bir yapıya sahiptir. Bitkilerdeki kompozisyonları değişebilse de, temel bileşen selüloz %35-50, hemiselüloz %20-35, lignin %25 oranında bulunmaktadır (Hasyierah ve ark., 2008) ve kuru ağırlığın yaklaşık %90 ını oluşturmaktadır (Balat, 2011). Proteinler, yağlar ve kül lignoselülozik kütlenin geri kalan fraksiyonunu oluşturmaktadır (Hasyierah ve ark., 2008). Selüloz Hemiselüloz Lignin Hemiselüloz Selüloz Şekil 2.1. Lignoselülozik materyalin yapısı (Palonen, 2004). 5
2.2.1. Lignoselülozik Maddelere Uygulanan Ön işlemler Lignoselülozik materyallerin yapısı çok karmaşıktır ve genellikle enzimatik hidrolizasyona dirençlidir. Enzimatik hidroliz öncesi, biyokütleye uygulanan ön işlemler çok önemlidir (Saha, 2003). Lignoselülozik materyallerden selüloz, hemiselüloz ve lignin bileşenlerini, birbirinden ayırmak, çözündürmek ve hidrolize etmek için çeşitli ön işlemler vardır (Saha, 2003; Hasyierah ve ark., 2008). Bu ön işlemler fiziksel, fizikokimyasal, kimyasal ve biyolojik olabilir (Saha, 2003). Lignoselülozik materyallere uygulanan ön işlemlerin etkisi uzun zamandır bilinmektedir. Farklı ön işlemlerle, biyokütlenin boyutu küçültülür, fiziksel yapısı açılır, lignin ve hemiselüloz biyokütleden uzaştırılır, selülozun kristalliği azaltılır ve gözenekli yapı artırılır (Hasyierah ve ark., 2008). Fiziksel işlemler; mekanik olarak parçalara ayırma ya da pirolizdir. Lignoselülozik materyallerin fiziksel parçalanmasına uygulanan kuvvet en sonunda istenen parçacık büyüklüğüne ve atık lignoselüzik biyokütlenin karakteristiğine bağlıdır. Piroliz işlemleri ise 300 C den yüksek sıcaklıklarda hammaddenin oksijensiz ortamda yakılmasıdır (Hasyierah ve ark., 2008). Fizikokimyasal ön işlemler üç temel gruba ayrılmaktadır. Bunlar; buhar patlaması (hidroliz), amonyak lif patlaması (AFEX) ve CO 2 patlamasıdır. Buhar patlaması en yaygın kullanılan yöntemdir. Genellikle enzimatik hidrolizin etkinliğini artırmak, inhibitör bileşiklerin üretimini azaltmak ve hemiselülozun tam parçalanmasını sağlamak için H 2 SO 4 ya da CO 2 ile birlikte kullanılmaktadır. Bu yöntemde parçalanmış biyokütle, yüksek basınçta buharla doyurulur ve sonra basınç hızlıca düşürülerek materyalde bir patlama etkisi yaratılmaktadır. AFEX, buhar patlamasıyla çok benzerdir. Buhar patlamasından tek farkı, buhar yerine sıvı amonyak kullanılmasıdır. Bu yöntem birçok lignoselülozik materyalde ön işlem olarak uygulanmaktadır; ancak yüksek lignin içerikli materyallerde fazla etkili değildir. Uygulamadan sonra sıvı amonyağın geri dönüşümünün pahalı olması ve çevreye zarar vermesi bu yöntemin dezavantajıdır. CO 2 patlaması amonyak patlamasına göre daha ucuzdur ayrıca buhar patlamasında olduğu gibi inhibitör bileşik oluşmasına neden olmamaktadır (Hasyierah ve ark., 2008). Süper kritik CO 2 patlaması selülozik mateyalin enzimatik hidroliz öncesinde oldukça etkili bir ön işlemdir (Saha, 2003). 6
Kimyasal ön işlemler beş gruba ayrılmaktadır. Bunlar; ozonlama, asit hidrolizi, alkali hidrolizi, oksidatif delignifikasyon ve organosolvent uygulamalardır. Ozonlama uygulamalarının birçok avantajı vardır. Lignini uzaklaştırması, toksik bileşikler üretmemesi, ozonlama reaksiyonunun oda sıcaklığında ve basıncında gerçekleşebilmesi gibi; ancak fazla miktarda ozon kullanılması, uygulamayı pahalı kılmaktadır (Hasyierah ve ark., 2008). Asit hidrolizinde genellikle, H 2 SO 4 ve HCl gibi asitler kullanılmaktadır. İki türlü asit uygulaması vardır. Bunlar: yüksek sıcaklık seyreltik asit veya düşük sıcaklık konsantre asit uygulamasıdır; ancak konsantre asitler toksik, korozif etkiye sahiptir ve tehlikelidir. Ayrıca reaksiyon sonrasında korozyona neden olan kalıntılar bırakabilmektedir ve asit hidrolizinden sonra enzimatik hidroliz ya da fermantasyon uygulamaları için, ortamın nötralize edilmesi gereklidir (Hasyierah ve ark., 2008). Yüksek sıcaklıkta seyreltik asit uygulamasında; hemiselüloz, ksiloz, arabinoz ve diğer suda çözünür şekerlere hidrolize olurken, selüloz ve ligninin büyük çoğunluğu ise olduğu gibi kalmaktadır (Saha, 2003). Alkali hidrolizinde ise, kullanılan alkaliler lignoselülozik materyalin şişmesine neden olarak, iç yüzey alanında artış sağlamakta, lignin ve karbonhidratlar arasındaki güçlü bağları parçalayarak, ligninin yapısını bozmakta ve polimerlerin polimerizasyon derecesini ve kristalliğini azaltmaktadır. Genellikle alkali olarak seyreltik sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi kullanılmaktadır; ancak bu yöntem %10-18 gibi düşük oranda lignin içeren materyallerde etkilidir. %26 dan fazla oranda lignin içeren materyallerde etkili değildir (Hasyierah ve ark., 2008, Torre ve ark., 2008). Oksidatif delignifikasyon ise, hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ile gerçekleştirilmektedir. Ligninin yaklaşık %50 si ve hemiselülozun büyük kısmı, %2 H 2 O 2 de 30 C sıcaklıkta 8 saatte çözünür hale gelmektedir. Organosolvent uygulamalarında, HCl ya da H 2 SO 4 gibi inorganik asitlerle organik çözücü karışımı, hemiselüloz ve ligninin iç bağlarını kırmak için kullanılır. Bu uygulamada kullanılan organik çözücüler, metanol, aseton, etilen glikol, trietilen glikol ve tetrahidrofurfiril alkoldür; ancak ön işlemden sonra organik çözücüler mikroorganizmalara inhibitör etki gösterdiği için uzaklaştırılması gerekmektedir (Hasyierah ve ark., 2008). Biyolojik ön işlem uygulamalarında; hemiselüloz ve lignini parçalayabilen mikroorganizmalardan yararlanılmaktadır. Phanerochaete chrysosporium gibi beyaz çürükçül küfler lignoselülozik materyallerin biyolojik ön işlemleri için en etkili mikroorganizmadır. Bu mikroorganizma, lignin parçalayıcı enzimler üreterek lignin 7
polimerlerini parçalayıp vanilya, vanilik asit, ferulik asit, koniferil aldehit, gualiasilglikol gibi bileşikler oluşturmaktadır (Hasyierah ve ark., 2008). Bu yöntemin en büyük avantajı, işlemin ılımlı koşullarda gerçekleşmesi ve yüksek enerji girdisine ihtiyaç duymamasıdır; ancak yöntem diğerlerine göre çok daha yavaş ilerlemektedir ve pahalıdır (Sun ve Cheng, 2002). 2.2.2. Selüloz Selüloz, yüksek derecede kristalimsi özellik gösteren β -1,4 bağıyla bağlı D- glikozların düz zincirli polimerleridir (Hasyierah ve ark., 2008). Ana zinciri 10 000 den fazla, kaynağına göre 7 000 ve 15 000 arasında glikoz içermektedir. Glikoz üniteleri sandalye formunda ( 4 C 1 ) bulunmaktadır. Her glikoz ünitesi komşusuna 180º açıyla bakmaktadır. Bu nedenle polimerin tekrarlanan ünitesi glikoz olarak değil sellobiyoz olarak adlandırılmaktadır (Şekil 2.2) (Akpınar, 2003; Palonen, 2004). Sellobiyoz Glikoz İndirgen Uç Şekil 2.2. Selülozun molekül yapısı β-1,4 glikozidik bağıyla D-glikopriranoz monomerlerinden oluşan düz şerit formundaki molekül, molekül içi ve moleküller arası hidrojen bağları ile birbirine bağlıdır (Shelton ve Lee, 2000). Selüloz zincirindeki fonksiyonel grup olan hidroksil grupları birbirleriyle ya da O-, N- ve S- gruplarına hidrojen bağı yaparak etkileşime girebilmektedir. Hidrojen bağları aynı zamanda selüloz ve su moleküllerinin hidroksil grupları arasında bulunabilir. Bu hidroksil grupları selüloz yüzeyini hidrofilik yapmaktadır. Selüloz zincirinin bir ucu indirgen özelliklere sahiptir ve zincir yönünde 8
güçlü hidrojen bağlarıyla stabilizedir. Bitki kaynaklı doğal selülozda zincir, hidrojen bağlarıyla yüksek kristal mikrofibriller oluşturur ve bir tek selüloz kristali paralel yönde onlarca selüloz zinciri içerir (Palonen, 2004). Doğal selüloz, düzenli kristal yapıyla beraber kristal olmayan (amorf) bölgelerden de oluşmuştur (Shelton ve Lee, 2000). Selüloz için; Iα, Iβ, II, III I, III II, IV I ve IV II olarak yedi kristal polimorf tanımlanmıştır. Doğada selülozun α I ve Iβ formları en fazla görülen kristal formlarıdır (Palonen, 2004). Amorf selüloz, suyu hızlı bir şekilde absorbe edebilmektedir. Böylece bitkiye yapısal dayanıklılık ve kırılmalara karşı direnç sağlar. Selüloz, nem çekici bir materyaldir. Suda çözünmez; su, zayıf asit ve birçok çözücüde şişebilir (Shelton ve Lee, 2000). Selüloz dünyada en yaygın bulunan organik polimerdir (Sun ve ark., 1997). Tekstil, kağıt, mobilya, ilaç, kozmetik ve gıda sanayinde kullanılmaktadır. Toz formda dolgu maddesi olarak, diyet gıdalar ve tıbbi tabletlerde bağlayıcı, jel formda viskoziteyi düzenleyici, pasta ve krema gibi ürünlerde emülsifiye edici olarak kullanılmaktadır (Laka ve Chernyavskaya, 2007). Ayrıca selüloz, glikoza hidrolize edilerek mikrobiyal veya kimyasal yöntemlerle çeşitli ürünlere dönüştürülebilmektedir. Bu ürünlere başta etanol olmak üzere bütanol, organik asitler, aseton ve gliserol örnek verilebilir (Howard ve ark., 2003; Sasaki ve ark., 2012). Son dönemlerde selülozdan tuvalet kağıdı üretiminin yapıldığı da görülmektedir (Ruiken ve ark., 2012). 2.2.3. Hemiselüloz Hemiselüloz doğada en yaygın bulunan ikinci polisakkarittir (Saha, 2003; Pasha ve ark., 2013). D-ksiloz ve L-arabinoz gibi pentozlar; D-mannoz, D-glikoz, D-galaktoz gibi hekzozlar ve üronik asitler içeren dallanmış yapılı polimerdir (Saha, 2003; Hasyierah ve ark., 2008). Kimyasal yapısı selüloz gibi homojen değildir (Ramos, 2003; Saha, 2003). Hemiselüloz çeşitli şeker üniteleri (L-arabinoz, D-galaktoz, D-ksiloz, D- glikoz, D-mannoz, 4-O-metil-D-glikuronik asit, D-glikuronik asit ve galaktronik asit) içermesi, daha kısa molekül zincirleri ve asetil ve metil gibi yan gruplar içermesinden dolayı selülozdan farklıdır. Hemiselülozlar suyla etkileşime girerler ve fonksiyonel özellikleri, onların moleküler ağırlıkları ve dallanma dereceleriyle son derece ilgilidir 9
(Pasha ve ark., 2013). Çoğunlukla diğer polisakkaritlere, protein ya da ligninlerle ilişkili ya da çapraz bağlıdır. Çözünürlüğü selülozdan daha fazla olduğundan dolayı, ekstraksiyonla odunsu yapılardan izole edilebilir ve ortalama polimerizasyon derecesi türe bağlı olarak 70 ve 200 Da arasında değişir (Palonen, 2004). Hemiselülozun yapısı bitki tipine bağlı olarak (sert odunsu ve yumuşak odunsu bitkiler) değişmektedir ve kaynağına göre glikomannan ya da ksilan yapısında bulunmaktadır. (Fengel ve Wegener, 1989; Pasha ve ark., 2013). Sert odunsu bitkilerin hemiselülozları çoğunlukla ksilanları içerirken, yumuşak odunsu bitkilerin yapısında bulunan hemiselülozlar çoğunlukla mannanları içermektedir (Saha, 2003). Mannan tipli polisakkaritleri, glikomannan ve galaktomannanlar oluşturur. Yumuşak odunsu galaktoglikomannalar, β -D-glikopiranozil ve β-d-mannopiranozil üniteleriyle birbirlerine β-1-4 bağlı bir omurga oluşturmaktadır. Bu omurgaya D- galaktopiranoz birimleri α-1,6 glukozidik bağı ile bağlanmıştır. Galaktoglikomannanlar suda ve alkalide çözünebilir olarak ikiye ayrılabilir (Palonen, 2004; Girio ve ark., 2010; Peng ve ark., 2012). Ksilanlar heteroksilan ve homoksilan şeklinde ikiye ayrılmaktadır. Homoksilanın β -1,3 veya β-1,3;1,4 glikozidik bağı ile birbirine bağlanmış D- ksilopiranoz ünitelerinden oluşan iskelet kısmı vardır ve sadece deniz yosunlarında görülmektedir (Girio ve ark., 2010). Heteroksilan yapılarında ksiloz, arabinoz, glikuronik asit veya onun 4-O-metil eteri, asetik, ferulik ve p-kumarik asitler ve az da olsa glikomannan bulunmaktadır. Bu yapıların sıklık ve kompozisyonu ksilan kaynağına bağlıdır (Ramos, 2003; Saha, 2003). Yumuşak odunsu ksilanlar asetilleşmeyen arabino-4-o-metilglikoronoksilanlardan oluşmuştur. Sert odunsu ksilanlar ise 4-O-metil-α-D-glikuronik asit ve asetil grupları içeren β -D-ksilopronozil ünitelerinden oluşmuştur (Palonen, 2004). 4-O-metilglikuronik asit, ksilan omurgasına O-(1 2) glikozidik bağla bağlıdır ve asetik asit, C-2 ve/veya C-3 hidroksil grubuna esterleşmiştir (Palonen, 2004). Heteroksilanlar, yapısında bulundurduğu şekerlere bağlı olarak glikuronoksilan, arabinoglikuronoksilan ve glikuronoarabinoksilan olarak adlandırılır. Arabinoglikuronoksilan ve glikuronoarabinoksilan ksiloz ana iskeletinin 2. ve 3. pozisyonlarına sırasıyla 4-O-metil-D-glikuronik asit ve α-l-arabinofuranozun bağlanması ile oluşmaktadır (Girio ve ark., 2010). Bunun yanı sıra α -Larabinofuranozun C-5 pozisyonu ferulik ve p-kumarik gibi fenolik asitlerle esterleşmiş 10
halde de bulunabilir. Her iki yapı birbirine benzer olmasına rağmen glikuronoarabinoksilan yaklaşık on kat daha fazla arabinoz içermektedir. Arabinoglikuronoksilan yapısı daha çok iğne yapraklı bitkilerde görülmektedir ve mısır koçanı ve buğday saplarından elde edilmektedir. Glikuronoarabinoksilan yapısı, mısır, buğday, pirinç kepeği ve tahıl tanelerinin endosperm dışındaki dokularında bulunmaktadır (Girio ve ark., 2010; Peng ve ark., 2012). Enzimler ve çeşitli kimyasallar, hemiselülozları parçalar. Hemiselülozun enzimatik hidrolizi ön işlem, ayırma ve sonrasında nötralizasyon gerektirmeyen bir yöntemdir (Pasha ve ark., 2013). Bununla beraber kompleks yapısından dolayı tamamen hidrolizasyonu için, sinerjist etkide çalışan birkaç enzime ihtiyaç duyulur (Palonen, 2004). Bunlar; endo-β-1,4-ksilanaz, β-ksilosidaz ve α-l-arabinofuranosidaz, α- glikuronidaz, asetilksilan esteraz, ferulik asit esteraz ve p-kumarik asit esteraz enzimleridir (Saha, 2003) (Çizelge 2.2). Çizelge 2.2 de bu enzimlerin hidroliz ettiği substratlar ve bağlar listelenmiştir. Çizelge 2.2. Hemiselüloza etki eden enzimler ve etki durumu (Saha, 2003) Enzim Etki durumu Endoksilanaz Ksilan omurgasındaki β -1,4 ksiloz bağlarını rastgele hidroliz eder Ekzoksilanaz β-1,4 ksiloz bağlarını uçlardan başlayarak hidroliz eder β-ksilosidaz Ksilobiyozdan ve kısa zicirli ksilooligosakkaritlerden ksiloz açığa çıkarır α-arabinofuranosidaz Arabinoksilanlardaki α-arabinofuranozu serbest hale geçirir α-glukuronidaz Glikuronoksilanlardan glikuronik asit açığa çıkarır Asetilan esteraz Asetil ksilanlarda asetil ester bağlarını hidroliz eder Ferulik asit esteraz Ksilanlardaki feruloil ester bağlarını hidroliz eder p-kumarik asit esteraz Ksilanlardaki p-kumaril ester bağlarını hidroliz eder Hemiselüloz biyoetanol, gıda endüstri ürünleri (prebiyotik ksilooligosakkaritler, ksilitol, laktik asit ), biyopolimerler ve aktif madde, yapıştırıcılar ve ilaçlar gibi diğer kimyasalların üretiminde kullanılabilmektedir (Pasha ve ark., 2013). Son yıllarda hemiselülozik kütlenin yakıtlara ve kimyasallara dönüşümü, kağıt pulpunun 11
delignifikasyonu, hayvan yeminin sindirilebilirliğinde artış, meyve suyu klarifikasyonu, bira kıvamının gelişimi gibi çeşitli sanayi uygulamalarında kullanımından dolayı dikkat çekmektedir. Hemiselülozu parçalayan ya da parçalanmaya yardım eden enzimler, ağartıcı özelliklerinden dolayı kağıt ve pulp endüstrisinin ilgi alanındadır (Saha, 2003). Hemiselüloz, biyobozunur bir polimerdir. Bu özelliğinden dolayı çevre dostu plastiklerin üretimi için uygun olduğu düşünülmektedir. Hemiselülozdan üretilen filmler, oksijen geçirebilir yapıda olmasından dolayı gıda ambalajlanmasında ve alışveriş poşetleri yapımında kullanılabilir (Göksu ve ark., 2007; Hansen ve Plackett, 2008; Bahçegül, 2011). Hemiselülozun parçalanması sonucu ksiloz, arabinoz, glikoz, galaktoz, arabinoz, mannoz gibi şekerler açığa çıkmakta ve etil alkol, ksilitol, laktik asit, 2,3-bütilen glikol gibi ürünlerin üretiminde kullanılanılmaktadırlar. Pek çok mikroorganizma, hemiselülozik şekerleri bu ürünlere fermente edebilir. Mikroorganizmalar ortamdaki glikozu çabuk ve etkili şekilde kullanırken, diğer şekerleri kolay kullanamazlar; ancak ksiloz, arabinoz, mannoz gibi hemisellülozik şekerleri de kullanan mikroorganizmalar vardır. Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis, Candida shehatae gibi bazı mayalar hemiselülozdaki ksilozu etanole fermente edebilir (Saha, 2003). Hemiselülozun parçalanmasıyla açığa çıkan şekerleri (özellikle ksiloz, mannoz, galaktoz) Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus pentosus ve Debaryomyces hansenii, laktik asit ve ksilitole fermente edebilir (Max ve ark., 2010). Rhizopus oryzae gibi mayalar da ksilozdan laktik asit üretebilme yeteneğine sahiptir (Saito ve ark., 2012). Corynebacterium ve Enterobacter gibi bazı bakteriler (Parajó ve ark., 1998), Candida guilliermondii ve Candida tropicalis (Sabancı, 2012; Sapcı, 2012) gibi mayalar da ksilozdan ksilitol üretebilen mikroorganizmalardır. Hemiselülozun bir diğer parçalanma ürünü olan ksilooligosakkaritler, ksiloz üniteleri içeren ve prebiyotik etkiye sahip oligomerlerdir. Bu özelliğinden dolayı ksilooligosakkaritler fonksiyonel gıdaların üretiminde kullanılmaktadır (Akpınar ve ark., 2009; Peng ve ark, 2012). 12
2.2.4. Lignin Lignin, doğal bir polimer olarak tüm bitkilerde bulunur (Lu ve Ralph, 2012) ve bitki hücre duvarlarında fazla bulunan doğal kaynaklardan biridir. Selüloz ve hemiselülozdan sonra en yaygın bulunan üçüncü doğal polimerdir (Buranov ve Mazza, 2008) ve önemli bir miktarı da kağıt yapımının bir yan ürünü olarak elde edilmektedir (Zhang ve ark., 2012). Lignin, hücre duvarına dirençlilik ve sağlamlık katan yapısal materyaldir ve biyolojik saldırılara selüloz ve diğer yapısal polisakkaritlerden daha fazla dirençlidir. Bitkilerde; bitki gelişimindeki fonksiyonu, bitkiye mekanik güç sağlaması, degradasyondan koruması gibi farklı alanlarda anahtar bir öneme sahiptir. Temel bir hücre duvarı bileşeni olarak lignin; sertlik, su ve besinlerin iç dolaşımını ve mikroorganizma saldırılarına karşı dayanıklılık sağlamaktadır (Buranov ve Mazza, 2008; Hasyierah ve ark., 2008; Ghaffar ve Fan, 2013). Lignin uzun zincirli, alifatik ve aromatik karboksilik asit gruplarına sahip, çoğunlukla fenilpropan ünitelerinden oluşan heterojenik bir polimerdir (Şekil 2.3) (Hasyierah ve ark., 2008; Zhang ve ark., 2012). Fenilpropanoid yapı birimleri birbirine β-o-4, β-5, β-β gibi bağlarla bağlıdır (Lu ve Ralph, 2012). Dallanmış halde bulunan lignin, hücre duvarı bileşenlerine çapraz bağlanmıştır (Lu ve Ralph, 2012) ve selüloz ve hemiselüloz matriksine gömülmüş halde bulunmaktadır (Hasyierah ve ark., 2008). Hidrofobik ve partükül yapıda bir polimedir, globüler formda yapılar ve amorf bölgeler içerir (Palonen, 2004). Hidroksil ve metoksil grupları, ligninin hidrofobik karakterine rağmen selüloz mikrofibrilleriyle etkileşime girebilir. Optikçe aktif değildir (Lu ve Ralph, 2012) ve yapısında fenolik gruplar bulundurduğundan antioksidan aktiviteye sahiptir (Silva ve ark., 2013). 13
Şekil 2.3. Lignininin yapısı (Anonim, 2014a) Ligninin, hücre duvarında üç boyutlu ağ yapısını, trans-p-kumaril alkol, guasil (koniferil) alkol ve şiringil (sinapil) alkol (Şekil 2.4) olarak adlandırılan üç temel aromatik alkol (monolignol) birimi oluşturmaktadır. Bu aromatik yapılı birimler çeşitli ester, eter ve karbon-karbon bağlarıyla birbirine bağlıdır. En baskın bulunan bağlantı β- O-4 bağlantısıdır. (Castro, 1994; Ghaffar ve Fan, 2013; Pasha ve ark., 2013). 14
Şekil 2.4. Ligninin yapısındaki p-kumaril, koniferil ve sinapil alkol (Anonim, 2014b) Lignin yapısı homojen değildir (Şekil 2.3 ve 2.4) ve yapısının karmaşıklığı ligninin kimyasal ve fiziksel yapısı için belirli bir modelin kabul edilmesini zorlaştırmaktadır (Palonen, 2004), izolasyonu ise zor olsa da mümkündür. Ligninin bileşimi ve yapısı türler arasında önemli ölçüde farklılık göstermektedir (Max ve ark., 2010) ve gymnosperm (yumuşak odunsu), angiosperm (sert odunsu) ve çimensi lignin (odunsuz ya da otsu ürünler) olarak lignin üç gruba ayrılmıştır. Sonrasında, bu sınıflandırmanın tüm bitkilerdeki lignin yapısını kapsamadığından yetersiz kaldığı tespit edilmiştir. Bazı araştırmacılara göre ligninin guasil lignin ve guasil-şiringil lignin olmak üzere iki sınıfa ayrılması gerektiği önerilmiştir (Sun ve ark., 1997; Palonen, 2004; Ghaffar ve Fan, 2013). Yumuşak odunsu bikilerin ligninleri sadece guasil birimlerden, sert odunsu ligninler çoğunlukla guasil ve şiringil ünitelerden oluşmuştur (Sun ve ark., 1997; Palonen, 2004; Sabancı, 2012). Guasil ligninler, koniferil alkol üniteleri, guasilşiringil ligninler ise guasil ve şiringil yapıları ile beraber az miktarda da p-hidroksifenil üniteleri içerir (Palonen, 2004). Tüm ligninler genellikle p-kumaril alkol içermektedir; fakat çimensi lignindeki p-kumaril alkol miktarı, sert odunsu bitkilerideki ligninden daha fazladır (Ghaffar ve Fan, 2013). 15
Lignin yapısında fenolik asitler, hidroksisinamik ve hidroksibenzoik türevleri halinde bulunmaktadır. Hidroksisinamik asitler, hem alkali çözünür (ester) hem de asit çözünür (eter) bağlarla lignoselülozik maddelerde bulunmaktadır. Lignin her zaman hemiselülozla kompleks haldedir (Şekil 2.5). Sadece fiziksel olarak değil, aynı zamanda kovalent bağlarla da bağlıdır (Buranov ve Mazza, 2008). Baskın hidroksisinamik asitlerinden ferulik asit lignine eter ve ester, polisakkaritlere ise ester bağlarıyla; p- kumarik asit ise lignine ve polisakkaritlere ester bağlarıyla bağlıdır (Sun ve ark., 1997). Lignin ve polisakkaritler arasındaki bağlantıda lignin, temel olarak ksilan yan zincirindeki arabinoza ester bağıyla bağlıdır (Şekil 2.5) (Sun ve ark., 1997; Buranov ve Mazza, 2008; Ghaffar ve Fan, 2013). Şekil 2.5. Lignin/fenolik/karbonhidrat kompleksleri (Buranov ve Mazza, 2008) Monolignollerin (p-kumaril, koniferil ve sinapil alkol) dimerleşmeşiyle lignanlar (Şekil 2.6) oluşmaktadır. Lignanlar bitkilerde doğal savucular olarak dağılmışlardır. Ligninin aksine lignanlar optikçe aktiftir. Antibakteriyel ve antioksidan aktivite gibi çeşitli biyolojik aktivitelere sahiptirler. 7-hidroksimatairesinol ve şiringaresinol baskın iki tahıl lignanınıdır. Keten tohumu ve susam lignanların en zengin kaynağıdır (Buranov ve Mazza, 2008). 16
Şekil 2.6. Koniferil alkolün radikal çiftlerinden oluşan lignanlar (Buranov ve Mazza, 2008) Biyokütlenin kullanımındaki temel engel, lignin-karbonhidrat kompleksidir. Biyokütlenin biyoürün ve biyoyakıt üretimi için enzimatik parçalanabilirliği çoğunlukla lignin miktarına bağlıdır; bu nedenle lignin, dünyada biyobazlı ekonomi için ürünlerin üretiminde önemli bir rol oynamaktadır (Buranov ve Mazza, 2008). Ligninin aromatik yapısından dolayı, ligninden pek çok kimyasal üretilebilmektedir. Yüksek molekül ağırlıklı lignin; karbon lifler, polimer tamamlayıcı, yapıştırıcı ve reçine üretiminde kullanılabilir (Silva ve ark., 2013). Parçalanma ürünleri ise gıda, ilaç, kozmetik sanayisinde kullanılan fenolik bileşiklerin üretimi için potansiyel bir kaynaktır. Fenolik bileşikler özellikle insan sağlığına olumlu etkilerinden dolayı son yıllarda oldukça popüler olmuştur (Buranov ve Mazza, 2008). Bütün bu özelliklere rağmen, bu polimer yeterli düzeyde kullanılmamaktadır (Silva ve ark., 2013). Lignoselülozik yapının parçalanması ve kendini oluşturan bileşenlere (lignin, selüloz ve hemiselüloz) ayrılması için son yıllarda en çok kullanılan yöntemlerden birisi asit ve bunu takiben alkali uygulamasıdır (Al Arni ve ark., 2007; Mussatto ve ark., 2007; Torre ve ark., 2008; Max ve ark, 2009). Böylece lignin, hemiselüloz ve selüloz polimerlerinin birbirinden ayrılması sağlanır. Seyreltik asit uygulaması lignoselülozik materyallerde bulunan hemiselülozu monosakkaritlerine parçalayarak çözünür hale geçirirken, selüloz ve ligninin büyük bir kısmını olduğu gibi bırakır (Şekil 2.7). Asit hidrolizi ile parçalanan hemiselüloz, yapısında barındırdığı şekerlerden dolayı ksilooligosakkarit, ksiloz, ksilitol gibi gıda amaçlı çeşitli kimyasalların üretiminde kullanılmaktadır (Akpınar ve ark, 2011a, 2011b, 2012). Selülozu ise kendini oluşturan şekerlere (glikoz) hidroliz edebilmek (asit veya enzim yoluyla) ve bu şekerlerden 17
fermantasyon ile farklı ürünler oluşturabilmek (etanol, laktik asit) için öncelikle ligninin uzaklaştırılması gerekmektedir. Bu amaçla lignini çözünür hale geçirebilecek işlemler, daha çok tercih edilmektedir. Ligninin büyük bir kısmı asitte bile çözünmezken (klason lignin), küçük bir kısmı asitte çözünebilir (asit çözünür lignin) (Castro, 1994) ve hidrolizasyon esnasında fenolik bileşikleri oluşturur (Akpınar ve ark., 2012); ancak büyük bir kısmı çözünmeden geride kalır (klason lignin). Geride kalan lignini uzaklaştırma yöntemlerinden birisi de alkali muamelesidir. Alkali muamelesinin lignini çözünür hale geçirmede ve fenolik asitlerin üretiminde oldukça etkili bir yöntem olduğu ispatlanmıştır (Al Arni ve ark., 2007). Şekil 2.7 de lignoselülozik materyalin asit ve alkali hidrolizi sonucu parçalanma ürünleri şematik olarak gösterilmiştir. Şekil 2.7. Tarımsal atıkların asit ve alkali hidrolizasyonuyla oluşan parçalanma ürünleri Literatürde şimdiye kadar yapılan çalışmalarda çeşitli lignoselülozik materyallerden farklı yöntemlerle lignin çözünür hale geçirilmeye çalışılmış ve fenolik bileşikler elde edilmiştir. Akpınar ve ark. (2010, 2012), lignoselülozik materyalin otohidroliz ve asitle muamelesi sonucu ligninin asitte çözünen kısmından az da olsa fenolik bileşiklerin oluştuğunu saptamışlardır; ancak ligninin büyük bir kısmı geride yan ürün olarak kalmıştır. 18
Katma değeri yüksek ürünler üretmek için lignin yapısında bulunan bağların parçalanması gerekmektedir. Permanganat oksidasyonu, alkali-nitrobenzen oksidayonu, alkali muamelesi ve thioasidoliz gibi yöntemlerle lignin kendini oluşturan birimlere parçalanabilir. Ticari olarak ligninin alkali reaksiyonuna dayalı lignin parçalama yöntemi, daha çok tercih edilmektedir. Genellikle bu amaçla sodyum hidroksit kullanılmaktadır (Buranov ve Mazza, 2008). Alkali hidrolizasyonundan önce, lignindeki eter bağları otohidroliz veya asit hidroliz yöntemleri ile parçalanır daha sonra da alkali ile ester bağları parçalanır. Otohidroliz, hidrolitik ajan olarak kimyasalların kullanıldığı işlemlerden daha fazla çevre dostudur ve reaksiyon sonunda alkoller, aldehitler, ketonlar, benzoik asitler ve sinamik asitler ortaya çıkan başlıca fenolik bileşiklerdir. Otohidroliz yönteminin uygulandığı tarımsal atıklarla ilgili çalışmalar (arpa kavuzu, çam, zeytin ağacı budama atıkları) literatürde bulunmaktadır (Conde ve ark., 2011). Otohidroliz yöntemi ile Felizon ve ark. (2000) zeytin atıklarından, Garrote ve ark. (2003) okaliptüs ve mısır koçanından, Moure ve ark. (2005) çam odunundan, Amendola ve ark. (2011) asma sürgünlerinin budanmasıyla açığa çıkan asma dallarından, Egüés ve ark. (2012) mısır atıklarından; asit hidroliz yöntemi ile Li ve ark. (2008) pirinç kepeğinden, Gonzalez ve ark. (2004) okaliptüs odunundan, Akpınar ve ark. (2012) buğday saplarından, lignindeki eter bağlarını parçalayarak ligninin asitte çözünen kısmından, fenolik bileşikler üretmişlerdir. Alkali hidroliz yöntemi ile de Sun ve ark. (2001) buğday, pirinç, çavdar ve arpa saplarından, mısır gövdesinden, kavak odunundan, Kim ve ark. (2006) buğday kepeğinden, Mussato ve ark. (2007) bira maltından, Ou ve ark. (2009) şeker kamışı küspesinden, Max ve ark. (2009) ve Mohd Salleh ve ark. (2011) çeltik sapından ferulik/kumarik asit gibi fenolik bileşikler üretmişlerdir. Biyolojik işlemler, çevreye zarar veren kimyasal yöntemlere alternatif lignoselülozun sakkarafiyasyonu için kullanılan cazip bir alternatiftir (Sarangi ve Sahoo, 2010). Biyolojik uygulamalar ligninin lignoselülozdan ayrılmasında daha güvenlidir ve daha az çevreye zararlıdır; ancak diğer yöntemlere göre oldukça uzun zaman gerektirir ve pahalıdır. Bitki hücre duvarlarının, mikroorganizmalar tarafından üretilen ferulolil esteraz ile parçalanması ve ferulik asit üretimi ile ilgili çeşitli araştırmalar literatürde bulunmaktadır. Ferulolil esterazlar, esterleşmiş ferulik asit içeren oligosakkarit ve polisakkaritlerden ferulik asit üretimini gerçekleştirebilen 19
karboksilesterazların bir alt grubudur. Bu enzimler Aspergillus niger, Pycnoporus cinnabarinus, Streptomyces avermitilis, Clostridium thermocellum, Basillus spp, Lactobacilli, Pseudomanas fluorences ve Brettanomyces anomalus gibi bakteri, maya ve küfler tarafından salgılanır. Ferulik asit üretitiminde, sıcaklık ve ph gibi enzimlerin karakteristiğini ve stabilitelerini etkileyen faktörler, enzim üretimindeki çeşitli faktörlerin (karbon, azot kaynağı) etkisi ve enzim saflaştırılması araştırılmış ve çalışılmıştır (Hasyierah ve ark., 2008). 2.3. Fenolik Bileşikler Fenolik bileşikler (polifenoller) doğal antioksidanlar olup bitkilerin önemli sekonder aromatik metabolitleridir (Acar ve Gökmen, 2005). Fenolik bileşikler, tüm bitkilerde büyük oranda dağılmıştır. Bu yüzden insan beslenmesinin, tamamlayıcı bir bölümüdür. Yapıları genel olarak bir ya da daha fazla hidroksil grubu içeren ve en azından bir aromatik halkaya sahip bileşiklerden oluşmuştur. Şimdiye kadar, birçok bitkisel fenolik bileşik izole edilip tanımlanmıştır. Fenolik bileşikler fenolik asitler ve flavonoidler olmak üzere iki gruba ayrılmaktadır (Cemeroğlu, 2009). Diyetlerimizde yer alan mikrobesin ögesi olarak kabul edilen fenolik bileşiklerin sağlık açısından önemi gün geçtikçe artmaktadır (Cemeroğlu, 2009). Gıda fenoliklerine olan ilgi, onların antioksidan özellikleri ve serbest radikalleri temizleme yeteneği sayesinde insan sağlığı üzerindeki potansiyel etkisinden dolayı artmıştır. Fenoliklerin antioksidan aktivesinin yanında, metal iyonlarını şelatlama, detoksifiye enzimleri uyararak tümor gelişimini başlatan ve destekleyen transkripsiyon faktörlerini inhibe etme yetenekleri vardır (Verma ve ark., 2009). Bu bileşikler; dejenaratif hastalıkları önleyici, antialerjenik, anti-inflamatuvar, antimikrobiyal, antioksidan, antitrombotik, kardioproktif ve vasodilatuvar ajan olarak görev yapmaktadır (Cemeroğlu, 2009). Aynı zamanda bitkileri UV ışınlarından korumada, patojenleri inhibe etmede ve hücre duvarında yapısal bütünlüğü sağlamada başlıca rol oynar (Verma ve ark., 2009). Lignoselülozik materyallerden elde edilen fenoliklerin gıda katkı maddesi olarak, sağlık alanında ve kozmetik ürünlerinde kullanılabilme potansiyeli bulunmaktadır. Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda, çeşitli lignoselülozik materyal 20