ALIÇ (Crataegus sp.) IN İN VİTRO MİKROÇOĞALTIMI

T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ALIÇ (Crataegus sp.) IN İN VİTRO MİKROÇOĞALTIMI YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMANMARAŞ KASIM - 2007

T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ALIÇ (Crataegus sp.) IN İN VİTRO MİKROÇOĞALTIMI YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMANMARAŞ KASIM - 2007

T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ALIÇ (Crataegus sp.) IN İN VİTRO MİKROÇOĞALTIMI YÜKSEK LİSANS TEZİ Kod No : Bu Tez 13/11/2007 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oy Birliği ile Kabul Edilmiştir... Doç.Dr. Mehmet Nuri NAS Prof.Dr. Bekir Erol AK Yrd.Doç.Dr. Mürüvvet ILGIN DANIŞMAN ÜYE ÜYE Yukarıdaki imzaların adı geçen öğretim üyelerine ait olduğunu onaylarım. Prof.Dr. Özden GÖRÜCÜ Enstitü Müdürü Proje No: Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

İÇİNDEKİLER _ İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER... I ÖZET... II ABSTRACT... III ÖNSÖZ... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... V ŞEKİLLER DİZİNİ... VI SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... VII 1. GİRİŞ... 1 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR... 3 3. MATERYAL VE METOT... 7 3.1. Materyal... 7 3.2. Metot... 7 3.2.1. Aşama 0 (Eksplant Kaynağının Kültür İçin Hazırlanması). 7 3.2.2. Aşama I (Külltüre Başlangıç).. 8 3.2.3. Aşama II (Kültürlerin Stabilizasyonu, Uygun BA Konsantrasyonunun Belirlenmesi ve Mikroçoğaltım). 11 3.2.4. Aşama III (Köklendirme). 11 3.2.5. Aşama IV (Pişkinleştirme ve Dış Ortama Aktarma). 11 4. BULGULAR VE TARTIŞMA... 13 4.1. Genel Gözlemler... 13 4.2. Genotip, Benzyladenine (BA) ve Altkültür Sayısının Kültürlerin Stabilizasyonu ve Gelişimi Üzerine Etkisi 16 4.3. Mikrosürgünlerin Köklendirilmesi ve Dış Ortama Aktarılması 26 5. SONUÇ VE ÖNERİLER... 29 KAYNAKLAR... 30 ÖZGEÇMİŞ... 32 I

ÖZET T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANA BİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ ÖZET ALIÇ (Crataegus sp.) IN İN VİTRO MİKROÇOĞALTIMI DANIŞMAN: Doç. Dr. Mehmet Nuri NAS Yıl: 2007 Sayfa: 42 Jüri: Doç. Dr. Mehmet Nuri NAS Prof. Dr. Bekir Erol AK Yrd. Doç. Dr. Mürüvvet ILGIN Bu araştırmada ihmal edilmiş bir tür olan alıç (Crataegus sp.) için in vitro mikroçoğaltım protokolünün geliştirilmesi amaçlanmıştır. Dinlenme döneminde (kışın) damızlık bitkilerden alınan odun çelikleri sürdürme (forsing) solusyonuna konularak sürmeleri sağlanmış ve meydana gelen yeni sürgünler eksplant kaynağı olarak kullanılmıştır. Kültürlerin in vitro da sürdürülebilirliğini, stabililazyonunu ve en iyi mikroçoğaltım katsayısını sağlayacak N-6 Benzyladenine (BA) konsantrasyonunu belirlemek amacıyla, eksplantlar 0, 0.5, 1.0 veya 1.5 mg l -1 BA + 0.01 mg l -1 indole-3-butyric acid (IBA) + 6 g l -1 agar içeren NMR ortamı üzerinde, 23 C ± 2 sıcaklık ve 16/8 saat (aydınlık/karanlık) fotoperiyotta, iklim odasında kültüre alınmışlardır. Ayrıca, genotip ve altkültür sayısının kültürlerin sürdürülebilirliği ve çoğalma üzerine etkileri araştırılmıştır. Çalışmada bir eksplantten meydana gelen sürgün sayısı, bir sürgünde bulunan boğum sayısı ve ortalama sürgün uzunluğu değerlendirilmiştir. BA içermeyen ortam üzerinde kültürlerin sürdürülebilirliği mümkün olmamıştır. Ortamda bulunan BA konsantrasyonu arttıkça bir eksplantten meydana gelen sürgün sayısında artış gözlenmiştir. BA nın boğum sayısı ve sürgün uzunluğu üzerine etkisi ise önemsiz bulunmuştur. Sürgün kalitesi ve çoğaltım katsayısı dikkate alındığında en uygun BA konsantrasyonun 1.0 mg.l -1 olduğu görülmüştür. Genotipin kültürlerin reaksiyonları üzerine etkileri önemsiz bulunmuştur. Altkültür sayısının sürgün sayısı ve boğum sayısı üzerine etkileri önemli fakat sürgün uzunluğu üzerine etkisi önemsiz bulunmuştur. Dördüncü altkültürdeki sürgün ve boğum sayıları sekizinci altkültürdeki sürgün ve boğum sayılarından daha yüksek bulunmuştur. Genotip x Altkültür sayısı x BA üçlü interaksiyonunun sürgün sayısı, boğum sayısı ve sürgün uzunluğu üzerine etkisi önemli bulunmuştur. Mikrosürgünlerin düşük köklenme oranı başarıyı kısıtlayan önemli bir faktör olmuştur. Anahtar kelimeler: Alıç, Crataegus sp., in vitro, mikroçoğaltım, klonal çoğaltma. II

ABSTRACT KAHRAMANMARAS SUTCU IMAM UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE DEPARTMENT OF HORTICULTURE MSc THESIS ABSTRACT IN VITRO MICROPROPAGATION OF HAWTHORN (Crataegus sp.) Leyla GÖKBUNAR SUPERVISOR: Assoc. Prof. Dr. Mehmet Nuri NAS Year: 2007 Pages : 42 Jury: Assoc. Prof. Dr. Mehmet Nuri NAS Prof. Dr. Bekir Erol AK Assist. Prof. Dr. Mürüvvet ILGIN Dormant woody cuttings taken from wild-grown trees of hawthorn (Cretagus sp.) in winter were forced to sprout. Buds from newly developed shoots were cultured in vitro on Nas and Read (2004a) medium containing 0, 0.5, 1.0 or 1.5 mg l -1 N-6 Benzyladenine (BA) + 0.01 mg l -1 indole-3-butyric acid (IBA) + 6 g l -1 agar. Cultures were grown in a growth room at 23 ± 2 C temperature and 16/8 h (light / dark) photo period. On medium containing no BA, cultures could not be sustained. The numbers of shoots per explant obtained on medium containing high levels of BA were significantly higher than that obtained on medium containing low levels of BA. However, the effect of BA on the number of nodes per shoot and on mean shoot length was insignificant. The effects of genotype on morfogenic reactions of explants were in significant. The number of subcultures significantly affected mean shoot number per explant and mean node number per shoot, but not shoot length. The rooting percentage of microshoots was low and seems to limit microppagation of hawthorn from no preculture-treated field-grown trees. Key Words: Hawthorn, Crataegus sp., in vitro, micropropagation, clonal propagation. III

ÖNSÖZ ÖNSÖZ İhmal edilmiş bir tür olan alıç (Crataegus sp.) için in vitro mikroçoğaltım protokolünün geliştirilmesi amacıyla yapmış olduğum çalışmalarımın her aşamasında yakın ilgi ve değerli yardımlarını gördüğüm, maddi manevi desteğini benden esirgemeyen, denemelerin kurulmasında ve yürütülmesinde bana yol gösteren ve yardımcı olan danışman hocam Sayın Doç. Dr. Mehmet Nuri NAS a en içten dileklerimle teşekkürlerimi sunarım. Laboratuar çalışmalarım sırasında hep yanımda olan değerli dostlarım; Zeynep AĞCA ya ve Cihan PINAR a teşekkür ederim. Verdikleri destek ve hoşgörüyü tezimin her aşamasında hissettiğim ve bu günlerimi borçlu olduğum değerli aileme teşekkür ederim. Yüksek lisans çalışmamı başarılı bir şekilde tamamlamam konusunda maddi, manevi desteğini hiçbir zaman eksik etmeyen değerli eşim Sayın Muhammet Ali GÖKBUNAR a teşekkürlerimi bir borç bilirim. Kasım 2007 KAHRAMANMARAŞ IV

ÇİZELGELER DİZİNİ ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 3.1. Nas ve Read Ortamının (NRM) kimyasal bileşimi 10 Çizelge 4.1. Genotip, Altkültür sayısı ve BA nın sürgün sayısı üzerine etkisinin varyans (GLM) analizi...... 17 Çizelge 4.2. Genotip, Altkültür sayısı ve BA nın boğum sayısı üzerine etkisinin varyans (GLM) analizi.. 18 Çizelge 4.3. Genotip, Altkültür sayısı ve BA nın sürgün uzunluğu üzerine etkisinin varyans (GLM) analizi.. 18 V

ŞEKİLLER DİZİNİ ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Taxonların coğrafi dağlımını gösteren karelere bölünmüş Türkiye haritası. 6 Şekil 3.1. Sürdürme solusyonuna konulan odun çeliklerinin sürmesiyle meydana gelen ve eksplant olarak kullanılan yeşil çelikler... 8 Şekil 3.2. Yüzeysel sterilizasyon işleminden sonra yeşil çeliklerin kesilmesiyle meydana gelen tek-boğum ve sürgün-ucu Şekil 4.1. eksplantler... 9 Kültüre alındıktan sonra eksplantlerde meydana gelen kararma ve mikrobiyal bulaşma... 14 Şekil 4.2. Hiperhidrife olmuş (camlaşmış) mikrosürgünler..... 15 Şekil 4.3. Üçüncü altkültürün sonunda eksplantlerin 0, 0.5, 1.0 ve 1.5 mg l -1 BA içeren ortam üzerindeki gelişmeleri 16 Şekil 4.4. G1 ve G2 genotiplerinde bir eksplantten meydana gelen sürgün sayısı... 19 Şekil 4.5. G1 ve G2 genotiplerinde bir sürgünde bulunan boğum sayısı.. 19 Şekil 4.6. G1 ve G2 genotiplerinin ortalama sürgün uzunlukları.. 20 Şekil 4.7. Altkültür sayısına bağlı olarak bir eksplantten meydana gelen sürgün sayısı... 21 Şekil 4.8. Altkültür sayısına bağlı olarak bir bir sürgünde bulunan boğum sayısı... 21 Şekil 4.9. Altkültür sayısına göre ortalama sürgün uzunlukları... 22 Şekil 4.10. BA nın bir eksplantten meydana gelen sürgün sayısı üzerine etkisi... 23 Şekil 4.11. BA nın bir sürgünde bulunan boğum sayısı üzerine etkisi 23 Şekil 4.12. BA nın ortalama sürgün uzunluğ üzerine etkisi 24 Şekil 4.13. Şekil 4.14. Şekil 4.15. Şekil 4.16. Şekil 4.17. Genotip x Altkültür sayısı x BA interaksiyonunun bir eksplantten meydana gelen sürgün sayısı üzerine etkisi... 25 Genotip x Altkültür sayısı x BA interaksiyonunun bir sürgünde bulunan boğum sayısı üzerine etkisi... 25 Genotip x Altkültür sayısı x BA interaksiyonunun ortalama sürgün uzunluğu üzerine etkisi 26 Köklendirme muamelesinden sonra mikrosürgünlerde meydana gelen kökler... 27 İn vitro köklendirilen ve akklimatize edildikten sonra dış ortama aktarılan mikrosürgünler... 28 VI

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ BA : Benziladenin (N 6 Benzyladenine) GA 3 : Gibberelik asit (Giberallic Acid 3) IBA : İndolbütirik asit (Indole 3-butyric Acid) VII

GİRİŞ 1. GİRİŞ Meyve yetiştiriciliği bakımından dünya ülkeleri arasında Türkiye önemli bir konuma sahiptir. Kültüre alınmış meyve türlerinin önemli bir kısmı ülkemizde ticari olarak yetiştirilebilmekte, geriye kalanların büyük bir kısmı ticari olarak yetiştirilebilme potansiyeline sahip olmaktadır. Ayrıca, kültüre alınıp yetiştirilen meyve türlerinin yanında, ülkemizin farklı bölgelerinde birçok yabani meyve türü doğal olarak yetişmektedir. Bu yabani meyve türlerinin çoğu halkımız tarafından farklı amaçlarla kullanılmaktadır. Değişik kullanım alanlarına sahip bu meyve türlerinden birisi alıç olmaktadır. Alıç, sistematik olarak, Rosaceae familyasının Crataegus cinsi altında yer almaktadır (Ağaoğlu ve ark.,1995). Alıcın kuzey yarım kürede yayılış gösteren 50, ülkemizde ise 17 türü bulunmaktadır. Doğal olarak en fazla yayılış gösteren tür Crataegus monogyna olmaktadır. Crataegus orientalis, Crataegus oxyacantha, ve Crataegus aronia türleri de yaygın olarak bulunmaktadır. Alıç, ülkemizde halk arasında, yemişen, alıç, aluç veya ekşi muşmula gibi farklı isimlerle bilinmektedir (Karadeniz, 2004). Alıç, kışın yaprağını döken, dikenli ağaç veya çalı formunda bir meyve türüdür. Yaprakları basit veya loplu, meyveleri sarı, kırmızı, mor veya siyah renkli olabilmektedir (Seçmen ve ark., 1989). Bahçe kültürleri dikkate alındığında, alıcın önemli bazı yumuşak çekirdekli meyve türleri için anaç olarak kullanma potansiyeline sahip olduğu ancak bu potansiyelin henüz yeterince değerlendirilmediği görülmektedir. Ülkemizin farklı bölgelerinde doğal olarak yetişen alıçlar çoğu kez çevirme aşılarıyla armut ve bazen de elmaya dönüştürülmektedir (M.N. Nas, kişisel gör., 2007). Alıç, derinliği az, kurak, kumlu ve taşlı topraklarda, yetiştirilecek armutlar için iyi bir anaç özelliği taşımaktadır. Alıç anacına aşılanan armutlar bodur kalmakta ve fazla büyümemektedir (Özbek, 1978). Alıç, ayrıca elma için de anaç olarak kullanılma potansiyeline sahiptir. Yaşlı alıç ağaçlarına aşılanan elmaların iyi bir performans göstermesi bu konudaki çalışmaların önemini ortaya koymaktadır (M.N. Nas, kişisel gör., 2007). Diğer taraftan, pek yaygın olmamakla beraber, alıcın ayva için de anaç olarak kullanıldığı bildirilmektedir. Alıç, anaç olarak kullanıldığında ayva kuru-kumlu topraklarda yetiştirilebilmektedir. Ancak bu gibi şartlarda ağaçların büyümesi zayıf ve verimleri düşük olmaktadır (Anonim, 2007). Alıç aynı zamanda önemli tıbbi bitkiler arasında yer almaktadır. Alıcın meyve ve çiçeklerinde antioksidant özellikteki flavonoidler (flavanlar), vitaminler (özellikle C vitamini), saponin, organik asitler, eter yağı ve şekerler başta olmak üzere insan sağlığı bakımından faydalı birçok madde bulunmaktadır. Alıç ağacının yaprak, çiçek ve meyveleri kalbin düzenli çalışmasını desteklemek ve kalp-damar sistemi fonksiyonlarını normalize etmek için kullanılmaktadır (Karadeniz, 2004). Alıç meyvesinin içerdiği antioksidantlar serbest radikal oluşumunu engelleyerek kalbin düzenli çalışmasını olumlu yönde etkilemektedir. Bunun yanı sıra kalp ve beyine olan kan akışını arttırarak kalbi düzensiz atışlara karşı korumakta, kalbin kasılma gücünü ve kalp basıncını dengelemektedir. Alıcın kurutulmuş çiçek ve meyveleri çay gibi hazırlanarak boğaz iltihabına, öksürüğe, kalp faaliyeti zayıflığına, kalp ağrılarına, kalp 1

GİRİŞ çarpıntısına, böbrek hastalıklarına, damar sertliğine ve karaciğer ağrılarına karşı kullanılmaktadır (Karadeniz, 2004). Alıç meyvesinin en önemli özelliklerinden birisi de oldukça yüksek miktarlarda mineral madde içermesidir. Meyveler başta Ca, P, K, Mg ve Fe olmak üzere yüksek miktarda mineral madde içermektedir. Ayrıca, meyveler karbonhidrat, şeker ve vitamin (özellikle C vitamini) bakımından oldukça zengindir (Özcan ve ark., 2005). Son yıllarda, farklı ülkelerde çoğunlukla doğadan toplanan alıç meyvelerinin özellikle kimyasal içeriği ve pomolojik özellikleri üzerine çok sayıda araştırmanın yapıldığı görülmektedir. Ayrıca tıp alanında, alıç meyvelerinin içerdiği maddelerin insan sağlığı üzerine yaptığı etkileri araştıran çalışmaların sayısı her geçen gün artmaktadır. Tıp alanında yapılan çalışmalar özellikle kalp sağlığı üzerine alıç meyvesinin olumlu etkiler yaptığını göstermektedir. İnsan sağlığına yararlı olan doğal ürünlere yönelimin artması yakın gelecekte bu yabani meyve türünün ticari kültürüne olan ihtiyacı ortaya koymaktadır. Bu nedenle, alıç dahil olmak üzere, ülkemizde doğal olarak yetişen ve farklı kullanım alanları olan türlerin araştırılması ve çoğaltılması önem kazanmaktadır. Potansiyel kullanım alanlarına ve bilinen faydalarına rağmen, alıç henüz hakkettiği ilgiyi yeterince görmeyen ve ihmal edilmiş olan bir tür durumundadır. Ağaç şekli ve güzel çiçeklerinden dolayı süs bitkisi olarak kullanılmasının dışında genellikle yabani bir tür olarak bilinmektedir. Gerek ülkemizde gerekse diğer ülkelerde alıcın ticari yetiştiriciliği pek yapılmamaktadır (M.N. Nas, kişisel gör, 2007). Bu nedenlerden dolayı meyveler genellikle doğal popülasyonlardan toplanarak değerlendirilmektedir. Bütün özellikleri dikkate alındığı zaman, alıç meyvelerinin insan sağlığı bakımından oldukça önemli olduğu, bitkisinin önemli bazı yumuşak çekirdekli meyve türleri için anaç olarak kullanılma potansiyeli taşıdığı, güzel bir süs bitkisi olarak peyzajda geniş bir kullanım alanına sahip olduğu görülmektedir. Ayrıca, yaban hayatının sürdürülebilirliği bakımından alıç önemli bir tür olmaktadır (M.N. Nas, 2007. kişisel gör.). İçeriğinin İnsan sağlığı üzerine olan yararlı etkilerinden dolayı alıç meyvelerinin tüketimi önerilmekte ve alıç meyvelerinden elde edilen ekstraktların kullanımı birçok ülkenin sağlık bakanlığınca onaylanmış bulunmaktadır (Anonım, 2006). Yakın gelecekte gıda sanayinde alıç meyvelerine bir talebin olacağı beklenmektedir. Küresel ısınma ve kuraklaşmaya paralel olarak, kurağa dayanıklı anaç ve daha az sulama gerektiren süs bitkilerinin kullanımının önemi her geçen gün artmaktadır. Bu durumda alıç gibi kurağa dayanıklı türlerin değerlendirilmesi önemli olmakta ve yakın gelecekte bu yönde bir talebin artacağı düşünülmektedir. Ancak, yetiştiriciliği, uygun tipler (çeşitler) ve özellikle çoğaltılması üzerine yeterli araştırma yapılmamış olduğundan, alıç bitkilerine olması beklenen talebin kısa sürede karşılanması mümkün olmayacaktır. Bu durumda, seleksiyon aşamasından sonra, yabani türlerin kültüre alınmasının en önemli adımlarından birisi etkili bir vejetatif çoğaltma metodunun geliştirilmesi olacaktır (M.N. Nas, kişisel gör, 2007). Diğer vejetatif çoğaltma metotları ile karşılaştırıldığında in vitro mikroçoğaltım en etkili çoğaltma metodu olmaktadır (Nas ve ark., 2008). Bu nedenlerden dolayı, ülkemizin doğal bir türü olan alıcın in vitro mikroçoğaltım olanakları bu çalışmada araştırılmıştır. 2

ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Türkiye, meyve yetiştiriciliği bakımından dünya ülkeleri arasında önemli bir konuma sahiptir. Ticari olarak yetiştiriciliği yapılan birçok meyve türünün yanında, Türkiye, aynı zamanda birçok yabani türün doğal yayılış ve çeşitlilik alanı durumundadır. Tarih boyunca, Anadolu da yaşamış milletler kültür meyvelerinin yanında çevrelerinde doğal olarak yetişen yabani meyve türlerinden de farklı amaçlar için yararlanmışlardır. Günümüzde yabani meyve türlerinden yararlanma geleneği hala devam etmekte, fakat bu kullanım şekilleri daha düzenli ve bilinçli olmaktadır. Elde edilen bilgiler sonucunda yabani türlerden bazıları daha fazla kullanım alanı bulmakta veya çeşitli nedenlerden dolayı diğerlerine göre daha fazla önem kazanmaktadır. Günümüzde farklı kullanım alanlarıyla öne çıkan yabani meyve türlerinden birisi alıç olmaktadır. Alıç, sistematik olarak, Rosaceae familyasının Crataegus cinsi altında yer almaktadır (Ağaoğlu ve ark.,1995). Alıç ın kuzey yarım kürede yayılış gösteren 50, ülkemizde ise 17 türünün bulunduğu bildirilmektedir. TÜBİVES (Türkiye Bitkileri Veri Servisi) e göre, Türkiye nin B10 ve C10 kareleri (Şekil 2.1.) dışında kalan diğer bütün bölgeleri Cretaegus cinsinin doğal yayılış alanına girmektedir. (http://wwweski.tubitak.gov.tr/tubives/index.php?com=11610). Alıç, ülkemizde genellikle dağlık alanlarda, çalılıklarda ve kayalıklarda doğal olarak yetişmekte ve bu doğal bitkilere herhangi bir kültürel işlem yapılmamaktadır. Türkiye de alıç seleksiyonu üzerine sınırlı sayıda çalışma olmasına rağmen (Karadeniz ve Kalkışım, 1996), çoğaltımı üzerine herhangi bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Benzer durum diğer ülkeler için de söz konusudur. Tohumla çoğaltma üzerine az sayıda çalışmanın yapıldığı bildirilmekte (Borkowska, 2002; Person ve ark., 2006), vejetatif çoğaltma üzerine yapılan çalışmaların ise çok daha sınırlı olduğu görülmektedir (Piccioni ve Standardi, 1995; Dai ve ark., 2007). Potansiyel kullanım alanlarına ve bilinen faydalarına rağmen, alıç henüz hakkettiği ilgiyi yeterince görmeyen ve ihmal edilmiş olan bir tür olmaktadır. Ağaç şekli ve güzel çiçeklerinden dolayı süs bitkisi olarak kullanılmasının dışında genellikle yabani bir tür olarak bilinmektedir. Gerek ülkemizde gerekse diğer ülkelerde alıcın ticari yetiştiriciliği pek yapılmamaktadır (M.N. Nas, kişisel gör, 2007). Bu nedenlerden dolayı meyveler genellikle doğal popülasyonlardan toplanarak değerlendirilmektedir. Karadeniz ve Kalkışım (1996), Van ilinin Edremit ve Gevaş ilçelerinde yetişen alıçlar arasından yapmış oldukları seleksiyon çalışmasında verim ve kalite bakımından üstün özellik gösteren 14 tipi belirlemişlerdir. Yapılan değerlendirme sonucunda bu tiplerde, meyve ağırlıkları 0.81-2.14 g, SÇKM oranı %12.20-27.20, ph 3.47-4.45, et oranları %70.27-82.83, çekirdek ağırlıkları 0.17-0.55 g, meyve eni 10.74-17.06 mm ve meyve boyunun 10.65-15.49 mm arasında değişim gösterdikleri bildirilmiştir. Asma ve Birhanlı (2003), Malatya nın Hekimhan ve Yazıhan ilçelerinde doğal olarak yetişen alıç popülasyonlarında meyve kalitesi yüksek tipleri seçmek amacıyla yapmış oldukları çalışmada, pomolojik ölçümleri her ağaçtan topladıkları 25 meyve üzerinden yapmışlardır. Bu çalışmada, ortalama meyve ağırlığı 7.58-2.16 g, suda çözünür 3

ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR kuru madde miktarı %18.83-12.80, et/çekirdek oranı 6.86-2.55, çekirdek ağırlığı 1.16-0.77 g ve toplam asitlik 1.69-1.29 g/100 ml olarak belirlenmiştir. Özcan ve ark. (2005) nın, alıç meyvelerinin bazı fiziksel ve kimyasal özellikleri üzerine yapmış oldukları araştırmada bütün meyvelerin yüksek miktarda Ca, K, Mg, Na ve P içerdiği belirlenmiştir. Bu değerler sırası ile 3046.37 ppm, 13531.96 ppm, 1502.55 ppm, 312.18 ppm, 1477.88 ppm ve 431307.29 ppm olarak bulunmuştur. Meyve eti, tohum ağırlığı, uzunluğu, çapı, kütlesi, hacmi, geometrik esas çapı sırasıyla 2.16 g, 0.87 g, 14.39 mm, 19.34 mm, 3.03 g, 3083.3 mm³, 17.52 mm, 1.22 ve 4.19 cm² olarak bulunmuştur. Alıç meyvelerinin enerji, protein, selüloz, yağ, kül, asitlik, suda çözünen kuru madde içeriği ise sırasıyla 34.02 kcal/g, %2.48, %4.67, %0.87, %2.28, %1.98 ve 32.31 olarak bildirilmiştir. Alıç tohumlarında dinlenmenin ortadan kaldırılması üzerine Borkowska (2002) nın, yapmış olduğu çalışmada tohum amacıyla alıç meyvelerinin en iyi toplanma zamanının Ekim ayı olduğu bildirilmiştir. Meyve etinden çıkarıldıktan sonra tohumların oda sıcaklığında %10 nem sağlanıncaya kadar kurutulması gerektiği bildirilmiştir. Katlandıktan sonra sülfürik asit ile aşındırılan tohumların çimlenme oranına karşın katlama sonrası herhangi bir aşındırma muamelesi uygulanmadan 25 C de ekilen tohumlarda çimlenme oranının daha yüksek olduğu görülmüştür. Ülkemizde birçok odunsu tür üzerine doku kültürü çalışmalarının gerçekleştirildiği görülmektedir: Soylu ve Ertürk (1999), bazı kestane çeşitlerinin klonal çoğaltımı için koltuk tomurcuğu ve sürgün ucu kültürünü uygulamışlardır. Ancak bu çalışmada başarı sınırlı kalmış ve özellikle yaşlı ağaçlardan alınan eksplantlerle çalışmanın daha güç olduğu bildirilmiştir. Hepaksoy ve Tanrısever (2004), bazı kiraz anaçlarının mikroçoğaltımı üzerine yapmış oldukları çalışmada Gisela 6 kiraz anacının mikrosürgünlerinde köklenme oranının Gisela 5 e göre daha yüksek olduğunu belirtmişlerdir. Köklendirme ortamına 2 g l -1 aktif kömür ilavesinin köklenme oranını %8.33 33.33 ten %25 50 ye yükselttiği görülmüştür. Yalçın ve arkadaşları (2003), kültür ortamına 0.3 mg l -1 IBA ilave ederek Hayward kivi çeşidinin mikrosürgünlerinde %93 civarında köklenme elde etmişlerdir. Benzer şekilde, mikrosürgün diplerinin 5 saniye süreyle 400 mg l -1 IBA solüsyonuna bandırılmasıyla %95 civarında ex vitro köklenme oranı elde edilmiştir. Yukarıda bildirilen odunsu türlerdeki doku kültürü çalışmalarına rağmen ülkemizde alıç üzerine yapılan herhangi bir araştırmaya rastlanılmamıştır. Bu durum diğer ülkeler için de benzer görünmektedir. Sürgün ucu kültürü (Piccioni ve Standardi, 1995) ve sürgün regenerasyonu (Dai ve ark., 2007) ile ilgili bir-kaç çalışma bildirilmiş olmakla beraber alıçla ilgili doku kültürü çalışmalarının çok sınırlı olduğu anlaşılmaktadır. Regenerasyon başarısının genotipler arasında farklılık gösterdiği ve iki aşamalı bir köklendirme protokolü (yüksek konsantrasyonda IBA içeren ortam üzerinde kültüre alındıktan sonra mikrosürgünlerin hormonsuz ortam üzerinde köklendirilmesi) ile regenerasyon yoluyla 4

ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR elde edilen mikrosürgünlerde %50 oranında bir köklenmenin sağlandığı bildirilmiştir (Dai ve ark., 2007). 5

ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şekil 2.1. Taxonların coğrafi dağlımını gösteren karelere bölünmüş Türkiye haritası. Türkiye Bitkileri Veri Servisi ne göre, B10 ve C10 kareleri dışında kalan diğer bütün bölgeler Cretaegus cinsinin doğal yayılış alananı girmektedir (http://wwweski.tubitak.gov.tr/tubives/index.php?com=11100; 01.09.2007). 6

MATERYAL VE METOT 3. MATERYAL VE METOT Bu araştırma, 2006 2007 yıllarında Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Bölümü laboratuarında yürütülmüştür. Çalışmada alıcın (Crataegus sp.) in vitro mikro çoğaltımı araştırılmıştır. 3.1. Materyal Çalışmada eksplant kaynağı olarak dört alıç genotipinin yeşil çelikleri kullanılmıştır. Kullanılan genotipler G1, G2, G3 ve Kültür-1 olarak isimlendirilmiştir. G1, G2 ve G3 genotipler Kahramanmaraş ilinin farklı yörelerinde (Ahır Dağı Bertiz) doğal olarak yetişen yabani alıç populasyonundaki meyve veren yetişkin ağaçlar arasından herhangi bir değerlendirme yapılmadan seçilmiştir. Dolayısıyla bu üç genotipin hangi özelliklere sahip olduğu bilinmemektedir. Kültür-1 genotipi ise halk arasında aşı alıcı veya kültür alıcı olarak tanımlanan, iri meyveli bir alıç tipi olup sınırlı da olsa aşı yoluyla çoğaltılmaktadır. 3.2. Metot Bilindiği gibi herhangi bir mikroçoğaltım çalışmasında gerçekleştirilmesi gereken genel kabul gören beş aşama (Aşama 0, I, II, II, ve IV) bulunmaktadır (Nas ver ark., 2008). Araştırma kapsamında, mikroçoğaltım aşamaları (Aşama 0 IV) özetle aşağıdaki şekilde gerçekleştirilmiştir: 3.2.1. Aşama 0 (Eksplant Kaynağının Kültür İçin Hazırlanması) Odunsu türlerin mikroçoğaltımlarında, mikroçoğaltımdaki ilk aşama (Aşama 0) eksplant kaynağı olarak kullanılan damızlık bitkinin derin budanması ve özel şartlar altında yetiştirilmesi gibi çeşitli muameleleri ifade eder. Ancak, yukarıda belirtildiği gibi, denemede kullanılan genotiplerin meyve veren ağaçları doğadaki ağaçlar arasından seçilmiş ve daha önce herhangi bir kültürel muameleye tabi tutulmamıştır. Damızlık bitkilerin yaşlı olmalarından kaynaklanan in vitro da karşılaşılan problemleri hafifletmek ve eksplantlerin morfogenik potansiyellerini arttırmak amacıyla, damızlık bitkiler yerine, damızlık ağaçlardan alınan odun çelikleri kültür öncesi muameleye tabi tutulmuşlardır. G1 ve G2 genotiplerinin damızlık bitkilerden 31 Ekim 2005 tarihinde alınan ve eksplant kaynağı olarak kullanılan odun çelikleri 6 Nisan 2006 tarihine kadar (yaklaşık 160 gün) soğuk hava deposunda (4 C) tutulmuştur. G3 ve Kültür 1 genotiplerinin ise doğrudan damızlık bitkilerden alınan yeşil çelikleri kullanılmıştır. Soğuk hava deposundan çıkartılan G1 ve G2 genotiplerine ait durgun haldeki odunsu çelikler ilk önce akan çeşme suyu altında yıkanmış ve daha sonra yüzeysel sterilizasyona tabi tutulmuştur. Yüzeysel sterilizasyon amacıyla çelikler; litreye 10 damla Tween-20 ilave edilerek hazırlanan %30 luk ticari çamaşır suyunda (orijinal ambalajda %5 aktif klorin) 10 dakika bekletildikten sonra akan çeşme suyu altında durulanmıştır. Yüzeysel sterilizasyon ve durulama işlemlerinden sonra odun çeliklerinin alt ve üst kısımları 0.5 1.0 cm kadar kesilmiş ve daha sonra tomurcuk dormansisini kırmak amacıyla çeliklerin dip kısımları cam kavanozlardaki sürdürme solusyonuna (Read ve Yang, 1987) konulmuştur. Her kavanoza (200 ml sürdürme solusyonu) 25 35 cm 7

MATERYAL VE METOT uzunlukta 10 15 adet çelik konulmuştur. Çeliklerin sürdürülmesinde kullanılan sürdürme solusyonu litreye 200 mg 8-Hydroxyquinoline citrate, 20 g sukroz ve 10 mg gibberellic acid (GA 3 ) içermektedir. Bu sürdürme solusyonunun kullanılmasıyla normal vejetasyon mevsiminin dışında aktif büyüyen, taze sürgünler oluşmakta ve böylece morfogenik potansiyeli daha yüksek eksplantler elde edilebilmektedir. Sürdürme solusyonuna konulan çelikler cam kenarına yerleştirilerek ışık altında sürmeye bırakılmıştır. Sürdürme solusyonu dört-günde-bir yenilenmiş ve çeliklerin solusyona batan alt kısımları yıkandıktan sonra 0.5 cm kadar kesilip tekrar solusyona konulmuştur. Solusyon yenileme işlemi 4 5 kez tekrarlanmıştır. Durgun gözlerden çıkan yeni sürgünler aşağıda belirtildiği gibi eksplant olarak kullanılmıştır. 3.2.2. Aşama I (Kültüre Başlangıç) Sürdürme solusyonuna konulan odun çeliklerinin sürmesiyle meydana gelen yeni sürgünler (Şekil 3.1.) eksplant olarak kullanılmıştır. Meydana gelen yeni sürgünler çeliklerin solusyona konulmasından yaklaşık üç hafta sonra (tomurcuk patlamasından 10 15 gün sonra) 26 Nisan 2006 tarihinde odun çeliklerinden kesilmişlerdir. Yeni çeliklerin alınma zamanının belirlenmesinde aktif büyümenin yavaşlaması fakat yeni sürgünlerin henüz solmaya başlamamış olması kriter olarak değerlendirilmiştir. Şekil 3.1. Sürdürme solüsyonuna konulan odun çeliklerinin sürmesiyle meydana gelen ve eksplant olarak kullanılan yeni sürgünler (yeşil çelikler). 8

MATERYAL VE METOT Sürdürme solusyonu kullanılarak elde edilen yeni sürgünler (G1 ve G2) ve doğrudan damızlık bitkilerden alınan yeşil çelikler (G3 ve Kültür-1) yaprakları kesildikten sonra yüzeysel sterilizasyona (disinfestasyona) tabi tutulmuşlardır. Yaprak kesiminden sonra yapılan bütün işlemler steril kabin içerisinde gerçekleştirilmiştir. Yüzeysel sterilizasyon amacıyla yaprakları kesilmiş yeşil çelikler ilk önce %70 etil alkol (EtOH) içerisinde yaklaşık 20 saniye süreyle bekletildikten sonra steril saf su ile iki kez durulanmışlardır. Daha sonra yeşil çelikler litreye 10 damla Tween-20 içeren %20 lik ticari çamaşır suyu solusyonu içerisinde ara-sıra karıştırılarak 15 dakika bekletildikten sonra üç kez saf su ile durulanmışlardır. Yüzeysel sterilizasyon işleminden sonra yeşil çelikler boğum aralarından kesilmiştir. Tek-boğum veya sürgün-ucundan oluşan eksplantler (Şekil 3.2.) 25 x 150 mm lik cam tüpler içerisinde 1.0 mg l -1 Benzyladenine (BA) + 0.01 mg l -1 Indole-3- butyric acid + 20 g l -1 sukroz içeren sıvı NRM (Nas ve Read, 2004a) ortamı (Çizelge 3.1.) üzerinde kültüre alınmışlardır. Şekil 3.2. Yüzeysel sterilizasyon işleminden sonra yeşil çeliklerin boğum aralarından kesilmesiyle meydana gelen tek-boğum ve sürgün-ucu eksplantlar 25 x 150 mm lik cam tüpler içerisinde 1.0 mg l -1 Benzyladenine (BA) + 0.01 mg l -1 Indole-3- butyric acid + 20 g l -1 sukroz içeren sıvı Nas ve Read (NRM) ortamı üzerinde kültüre alınmışlardır. 9

MATERYAL VE METOT Çizelge 3.1. Nas ve Read Ortamının (NRM) kimyasal bileşimi (Nas ve Read, 2004a). Mineraller Miktarı (mg l -1 ) NH 4 NO 3 530 Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O 700 CaCl 2 2H 2 O 90 MgSO 4 7H 2 O 1600 KNO 3 550 KH 2 PO 4 1300 H 3 BO 3 6.2 CuSO 4 5H 2 O 2.5 MnSO 4 H 2 O 20 Na 2 MoO 4 2H 2 O 2.5 ZnSO 4 7H 2 O 8.8 Sequestrene 138 Fe 100 Organikler Miktarı (mg l- 1 ) Thiamine (B1) 0.60 Riboflavin (B2) 0.21 Nicotinic acid (B3) 1.15 Pyrodoxine (B6) 0.60 Vitamin E ( -tocopherol) 20.0 vitamin C (Ascorbic acid) 1.0 Glycine 0.85 Myo-inositol 200 Sucrose (g L-1) 30 ph 5.5 5.8 Agar (g L-1) 5 6.. Eksplantların sıvı ortama batmasını engellemek amacıyla tıbbi pamuk tampon (köprü) olarak kullanılmıştır. Tüplere aktarılan eksplantler (kültürler) 23 ± 2 C sıcaklığa sahip iklim odasında büyümeye bırakılmışlardır. İn vitro ya alındıktan sonra, kültürler her gün kontrol edilerek meydana gelen eksplant ölümleri, kararma ve mikrobiyal bulaşmalar belirlenmiştir. Üç hafta sonunda, mikrobiyal bulaşmadan ari ve sağlıklı görünen eksplantlar alt kültüre alınmışlardır. Aşama II için mikrobiyal bulaşmadan arî yeterli sayıda ekplant elde etmek ve kültürlerin sürdürülebilirliğini sağlayan en iyi BA konsantrasyonunu belirlemek için eksplantler daha sonra her dört-haftada-bir altkültüre alınmışlardır. Bu işlem yaklaşık 4 altkültür boyunca devam etmiştir. 10

MATERYAL VE METOT 3.2.3. Aşama II (Kültürlerin Stabilizasyonu, Uygun BA Konsantrasyonunun Belirlenmesi ve Mikroçoğaltım) Kültürlerin in vitro da sürdürülebilirliğini, stabilizasyonunu ve en iyi mikroçoğaltım katsayısını sağlayacak sitokinin (BA) konsantrasyonunu belirlemek amacıyla, ilk altkültürün sonunda (üç hafta sonra) herhangi bir mikrobiyal bulaşma göstermeyen eksplantlar 0, 0.5, 1.0 veya 1.5 mg l -1 BA + 0.01 mg l -1 IBA + 6 g l -1 agar (Sigma A7921) içeren NMR ortamı üzerinde alt-kültüre alınmışlardır. Altkültüre alındıktan iki hafta sonra tüplere 1 ml steril saf su ilave edilmiştir. Kültürlerin büyümesinde stabilizasyon (göz kararıyla düzenli büyüme) sağlanıncaya kadar (4 altkültür süresince) bu işleme devam edilmiş ve 4-haftalık her altkültür süresinin sonunda eksplantler aynı konsantrasyonda BA içeren yeni hazırlanmış ortam üzerine aktarılmışlardır. Beşinci alt kültürden başlamak üzere BA içermeyen (0 kontrol) ortam kullanımından vazgeçilmiştir (bkz. Bulgular ve Tartışma). Kültürlerin gelişmesiyle ilgili veriler dördüncü ve sekizinci altkültürlerin sonunda toplanmıştır. En uygun BA konsantrasyonunun seçiminde kardeşlenme sayısı (çoğaltım katsayısı) ve mikrosürgünlerin kalitesi (uzunluk, kalınlık, renk, kallus durumu, nekroz, uç kuruması ve eksplant canlılığı) temel ölçütler olarak değerlendirilmiştir. Araştırma tesadüf parselleri deneme desenine göre düzenlenmiş ve her altkültürde her muamele için 12 16 tekerrür (bir eksplant içeren tüp) kullanılmıştır. 3.2.4. Aşama III (Köklendirme) Yukarıda belirtilen kriterlere göre en iyi mikroçoğaltımı sağlayan BA konsantrasyonunun belirlenmesinden sonra (bkz. Bulgular ve Tartışma), eksplantler yalnızca 1.0 mg l -1 BA + 0.01 mg l -1 IBA içeren ortam üzerinde altkültüre alınmışlardır. Yeterli köklenmenin sağlanması için bu işleme 18 altkültür devam edilmiştir. Mikrosürgünlerin köklenme kabiliyetlerini (% köklenme ve sürgün başına kök sayısı) belirlemek için Aşama II nin 5, 9, ve 18. altkültürlerinden (Nas ve Read, 2004b) alınan mikrosürgünlerin bir kısmı 0.1 mg l -1 IBA içeren ortam üzerinde kültüre alınmış, diğer bir kısmının ise dip kısımları 1.0 g l -1 IBA solusyonuna yaklaşık 10 saniye süreyle bandırıldıktan sonra büyüme düzenleyici içermeyen ortam üzerinde 4 hafta süreyle kültüre alınmıştır. Köklendirme denemesi tesadüf parselleri deneme desenine göre düzenlenmiş, her muamele için en az dört tekerrür ve her tekerrürde beş mikrosürgün (tüp) kullanılmıştır. 3.2.5. Aşama IV (Pişkinleştirme ve Dış Ortama Aktarma) Pişkinleştirme ve dış ortama aktarma işlemleri büyük ölçüde Nas ve Read (2004b) e göre yapılmıştır. Köklendirme denemesinin sonunda, in vitro dan çıkartılan mikrosürgünlerin kökleri akan çeşme suyu altında yıkanarak ortam ve agardan temizlenmiştir. Kök yıkama işleminden sonra mikro sürgünler 1:1 oranında torf ve perlit içeren köpük bardaklara şaşırtılmış ve şeffaf pet bardak ile üzerleri kapatılarak yüksek 11

MATERYAL VE METOT nisbi nem sağlanmıştır. İklim odasına (23 ± 2 C, 16 /8 (ışık/karanlık)) konulan bitkilerin pişkinleşmesi için ikinci haftadan sonra pet bardak gevşetilerek nisbi nemin tedrici olarak düşmesi sağlanmış ve yaklaşık bir ay sonra pet bardak tamamen kaldırılarak bitkinin oda koşullarında büyümesi sağlanmıştır. Bütün aşamalardaki (Aşama II Aşama IV) veriler SAS istatistik programı kullanılarak General Linear Model (GLM) ile (p = 0.05) varyans analizine tabi tutulmuş ve ortalamalar arasındaki farkların belirlenmesinde Fisher Asgari Önemli Fark (LSD) testi kullanılmıştır. 12

BULGULAR VE TARTIŞMA 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Genel Gözlemler Sürdürme solüsyonuna konulan odun çelikleri üzerinde bulunan tomurcuklar yaklaşık bir hafta sonra sürmeye başlamıştır. Tomurcuklardan süren yeni sürgünlerin büyümeleri iki hafta sonra yavaşlamaya başlamıştır. Yaklaşık bir ay kadar büyümeye bırakılan sürgünler canlılığını muhafaza etmiş ancak bu sürgünlerin büyümeleri tamamen durmuştur. Bir aydan daha uzun süre bekletilen sürgünler ise solmaya başlamış ve sonuçta ölmüştür. Bu nedenle yeni sürgünlerin kültüre alınması için en uygun zamanın tomurcuk patlamasından yaklaşık iki hafta sonra olduğu kararına varılmıştır. Tomurcuk patlamasından iki hafta sonra alınan yeni sürgünler canlı bir görünüme sahip olmaktadır (Şekil 3.1.). Bu sürgünlerin büyümeleri hala devam ettiğinden kültüre alındıklarında eksplantlerin canlı kalmaları ve daha iyi bir reaksiyon göstermeleri beklenmektedir. Eksplantlar kültüre ilk alındıktan bir kaç gün sonra mikrobiyal bulaşma (kontaminasyon) görülmeye başlamış ancak mikrobiyal kontaminasyon oranı genelde önemsiz sayılacak kadar düşük bulunmuştur. Bu bulgular izlenen yüzeysel sterilizasyon işleminin etkin olduğunu göstermektedir. Daha sonraki altkültürlerde mikrobiyal (fungal) bulaşmalar nadiren görülmüştür. Bu bulaşıklıkların çalışma hatalarından kaynaklandığı ve kullanılan alıç genotiplerinde endogen (içsel) mikroorganizmaların bulunmadığı sonucuna varılmıştır. Düşük oranda gözlenen mikrobiyal bulaşmalara karşın, doğrudan açık araziden alınan G3 genotipinin eksplantlerinde ortaya çıkan kararma ve buna bağlı eksplant ölümleri daha ciddi problem oluşturmuştur (Şekil 4.1.). 13

BULGULAR VE TARTIŞMA Şekil 4.1. Kültüre alındıktan sonra eksplantlerde meydana gelen kararma (solda) ve mikrobiyal bulaşma (sağda). Kararma (oksidasyon) ve eksplant ölümlerinden dolayı üç altkültürden sonra G3 genotipinin kültürüne devam edilememiştir. Buna benzer bir durum Kültür 1 genotipinde görülmüştür. Kültür 1 genotipinin yeşil çeliklerinden alınan eksplantlar üç altkültür süresince in vitro da herhangi bir gelişme göstermemiştir. Bunun üzerine tomurcuk dormansisini kırmak için bu genotipin kültürleri bir ay boyunca buzdolabında (4 C) tutulmuştur (Kyte ve Kleyn, 1996). Buzdolabında bir ay bekletilen kültürler daha sonra normal iklim odası sıcaklığında (23 ± 2 C) tutulmuş ve 8. altkültüre kadar bu işleme devam edilmiştir. Ancak buna rağmen eksplantlerde (tomurcuklarda) herhangi bir sürme veya gelişme görülmemiştir. Bu nedenle Kültür 1 genotipinin kültürüne de son verilmiştir. Kültüre başlangıç aşamasında karşılaşılan kontaminasyon, eksplant kararması ve tomurcukların sürmemesi gibi sorunlar odunsu türlerin mikroçoğaltımını sınırlayan faktörlerden bazılarıdır. Bu çalışmada eksplant elde etmek amacıyla G1 ve G2 genotiplerinin odun çeliklerinin sürdürülmesinde kullanılan forsing solusyonu yukarıda tartışılan bazı problemlerin hafifletilmesinde etkili olabilmektedir. G1 ve G2 genotipinin kültürlerinin sürdürülebilir hale gelmesinde, en azından kısmen, kullanılan sürdürme 14

BULGULAR VE TARTIŞMA solusyonunun rol oynadığı düşünülmektedir. Benzer odunsu türlerde, özellikle normal vejetasyon mevsiminin dışında, eksplant elde etmek için etkin bir yöntem olarak sürdürme solusyonunun kullanılması tavsiye edilmektedir. Odunsu türlerin in vitro kültüründe karşılaşılan problemlerden birisi de hiperhidrasyondur (Nas ve ark., 2008). Hiperhidrasyona uğramış dokular genellikle camsı ve bol sulu bir görünüm sergiler ve in vitro çalışmaların başarısını sınırlayabilirler. Camlaşma veya vitrifikasyon olarak da bilinen hiperhidrasyon bu nedenle mümkün olduğu kadar engellenmesi gereken fizyolojik bir bozukluk olarak bilinmektedir. Hiperhidrasyonun ortaya çıkmasında birçok faktör rol oynamaktadır. Kullanılan büyüme düzenleyicilerin türü, konsantrasyonu ve kültür ortamının kimyasal bileşimi hiperhidrasyonun ortaya çıkmasında rol oynayan faktörlerden bazılarıdır. Bu çalışmada hiperhidrasyona uğramış dokular gözlemlenmiştir (Şekil 4.2.), fakat beklenilenin aksine hiperhidrasyona uğramış kültürlerin oranı ve hiperhidrasyon şiddeti düşük olmuştur. Bu gözlem ve bulgular kullanılan kültür ortamının bileşimi ile büyüme düzenleyicilerin konsantrasyonunun genelde uygun olduğunu göstermektedir. Şekil 4.2. İn vitro da hiperhidrife olmuş (camlaşmış) mikrosürgünler. Soldaki sürgünde hiperhidrasyon sağdaki sürgüne göre daha şiddetli olmaktadır. 15

BULGULAR VE TARTIŞMA 4.2. Genotip, Benzyladenine (BA) ve Altkültür Sayısının Kültürlerin Stabilizasyonu ve Gelişimi Üzerine Etkisi Kültürlerin in vitro da sürdürülebilirliğini, stabililazyonunu ve en iyi mikroçoğaltım katsayısını sağlayacak BA konsantrasyonunu belirlemek amacıyla, ilk altkültürün sonunda (üç hafta sonra) eksplantlar 0, 0.5, 1.0 veya 1.5 mg l -1 BA + 0.01 mg l -1 IBA + 6 g l -1 agar (Sigma A7921) içeren NMR ortamı üzerinde altkültüre alınmışlardır. Bilindiği gibi odunsu türlerin kültürleri özellikle in vitro ya alındıktan sonraki ilk bir kaç altkültürde çok düzensiz (değişken) bir büyüme ve gelişme gösterirler (McCown ve McCown, 1987). Bu nedenle ilk altkültürlerde herhangi bir veri toplanmamış ve kültürlerin düzenli büyüme göstermeleri amaçlanmıştır. İlk alt kültürden başlamak üzere BA içermeyen ortam üzerindeki kültürlerde sürekli ölümler gözlenmiştir (Şekil 4.3.). Sürekli devam eden kültür ölümlerinden dolayı ilk dört altkültürün sonunda BA içermeyen (kontrol) ortam üzerindeki kültürlerin sürdürülmesi mümkün olmamıştır. Bu nedenle BA içermeyen ortam kullanımından vazgeçilmiştir. Şekil 4.3. (Soldan Sağa) Üçüncü altkültürün sonunda eksplantlerin 0, 0.5, 1.0 ve 1.5 mg l -1 BA içeren ortam üzerindeki gelişmeleri. 16

BULGULAR VE TARTIŞMA Genotip, BA ve altkültür sayısının kültürlerin gelişimi üzerine olan etkilerinin istatiksel olarak analiz edilmesi için dördüncü ve sekizinci altkültürlerin sonunda veriler toplanmıştır. İstatiksel analizde, bir eksplantten meydana gelen sürgün sayısı (çoğalma veya kardeşlenme katsayısı), bir sürgünde bulunan tomurcuk (yaprak veya boğum) sayısı ve meydana gelen sürgünlerin uzunlukları değerlendirilmiştir. Sürgün sayısı incelendiğinde; altkültür sayısı, BA ve Genotip x Altkültür sayısı x BA interaksiyonu önemli bulunmuştur. Genotip, Genotip x Altkültür sayısı ve Genotip x BA interaksiyonu etkilerinin sürgün sayısı üzerine olan etkileri ise önemsiz bulunmuştur (Çizelge 4.1.). Çizelge 4.1. Genotip, altkültür sayısı ve BA nın sürgün sayısı üzerine etkisinin varyans(glm) analizi.. Varyasyon Kaynağı SD KT KO F Genotip 1 0.98 0.98 1.83 Ö.D. Altkültür 1 42.26 42.26 78.72**** BA 2 4.37 2.18 4.07** Gen. x Altk. 1 0.30 0.30 0.56 Ö.D. Gen. X BA 2 1.77 0.88 1.64 Ö.D. Gen.x Altk.x BA 4 6.07 1.52 2.83** Ö.D.: Ortalamalar arasındaki fark p= 0.05 seviyesinde önemli değil; **, ***: ortalamalar arasındaki fark, sırasıyla, p= 0.05 ve p= 0.005 seviyesinde önemli... Sürgün başına düşen boğum (yaprak) sayısı incelendiğinde; Altkültür sayısı ve Genotip x Altkültür x BA interaksiyonu önemli bulunmuştur. Genotip, BA, Genotip x Altkültür ve Genotip x BA interaksiyonu etkilerinin yaprak sayısı üzerine olan etkileri ise önemsiz bulunmuştur (Çizelge 4.2.). 17

BULGULAR VE TARTIŞMA Çizelge 4.2. Genotip, Altkültür sayısı ve BA nın boğum sayısı üzerine etkisinin varyans (GLM) analizi.. Varyasyon Kaynağı SD KT KO F Genotip 1 1.92 1.92 0.32 Ö.D. Altkültür 1 120.52 120.52 20.24**** BA 2 18.45 9.22 1.55 Ö.D. Gen. x Altk. 1 3.55 3.55 0.60 Ö.D. Gen. X BA 2 3.85 1.92 0.32 Ö.D. Gen.x Altk.x BA 4 65.82 16.50 2.76** Ö.D.: Ortalamalar arasındaki fark p= 0.05 seviyesinde önemli değil; **, ***: ortalamalar arasındaki fark, sırasıyla, p= 0.05 ve p= 0.005 seviyesinde önemli... Sürgün uzunluğu incelendiğinde; yalnız Genotip x Altkültür sayısı x BA üçlü interaksiyonu önemli bulunmuştur. Genotip, BA, Altkültür sayısı ve bunların ikili interaksiyonlarının sürgün uzunluğu üzerine olan etkileri önemsiz bulunmuştur (Çizelge 4.3.). Çizelge 4.3. Genotip, Altkültür sayısı ve BA nın sürgün uzunluğu üzerine etkisinin varyans (GLM) analizi.. Varyasyon Kaynağı SD KT KO F Genotip 1 2.65 2.65 0.66 Ö.D. Altkültür 1 1.40 1.40 0.35 Ö.D. BA 2 3.22 1.60 0.40 Ö.D. Gen. x Altk. 1 1.21 1.21 0.30 Ö.D. Gen. X BA 2 4.85 2.43 0.61 Ö.D. Gen.x Altk.x BA 4 105.44 26.36 6.61**** Ö.D.: Ortalamalar arasındaki fark p= 0.05 seviyesinde önemli değil; **, ***: ortalamalar arasındaki fark, sırasıyla, p= 0.05 ve p= 0.005 seviyesinde önemli... Eksplant başına meydana gelen sürgün sayısı, sürgün başına düşen boğum sayısı ve ortalama sürgün uzunluğu bakımından G1 ve G2 genotipi arasındaki farklar önemsiz bulunmuştur. Bir eksplantten meydana gelen ortalama sürgün sayısı G1 genotipi için 1.7 ve G2 genotipi için 1.6 (Şekil 4.4.); bir sürgünde bulunan ortalama boğum sayısı G1 genotipi için 4.74 ve G2 genotipi için 4.53 (Şekil 4.5.); ortalama sürgün uzunluğu ise G1 genotipi için 3.2 cm ve G2 genotipi için 3.0 cm (Şekil 4.6.) olmuştur. 18

BULGULAR VE TARTIŞMA 2.0 Sürgün Sayısı / Eksplant 1.5 1.0 0.5 0.0 G1 G2 Genotip Şekil 4.4. G1 ve G2 genotiplerinde bir eksplantten meydana gelen sürgün sayısı. 5.0 Boğum Sayısı / Sürgün 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 G1 G2 Genotip Şekil 4.5. G1 ve G2 genotiplerinde bir sürgünde bulunan boğum sayısı. 19

BULGULAR VE TARTIŞMA 3.5 3.0 Sürgün Uzunluğu (cm) 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 G1 Genotip G2 Şekil 4.6. G1 ve G2 genotiplerinin ortalama sürgün uzunlukları. İstisnalar olmakla beraber, bir genel kural olarak, in vitro çalışmalarda kullanılan bitkinin türü ve genetik yapısı (genotipi) eksplantlerin morfogenik reaksiyonlarını en çok etkileyen faktörlerden birisi olarak bilinmektedir. Bu çalışmada ise kullanılan genotiplerin sürgün sayısı, boğum sayısı ve sürgün uzunluğu üzerine etkileri önemsiz bulunmuştur. Bu durumun, genotiplerin bir birine yakın yerlerden alınmış olmalarından ve dolayısıyla genetik bakımdan bir birine yakın olmalarından kaynaklandığı düşünülmektedir. Bir eksplantten meydana gelen ortalama sürgün sayısı ve bir sürgünde bulunan ortalama boğum sayısı bakımından altkültür sayısının etkisi önemli bulunmuştur. Altkültür sayısının sürgün uzunluğu üzerine etkisi ise önemsiz bulunmuştur. Bir eksplantten meydana gelen ortalama sürgün sayısı dördüncü altkültür (K-4) için 2.1 ve sekizinci altkültür için (K-8) için 1.2 (Şekil 4.7.); bir sürgünde bulunan ortalama boğum sayısı K-4 için 5.4 ve K-8 için 3.8 (Şekil 4.8.); ortalama sürgün uzunluğu ise K-4 için 3.0 cm ve K-8 için 3.1 cm (Şekil 4.9.) olmuştur. 20

BULGULAR VE TARTIŞMA 2.5 Sürgün Sayısı / Eksplant 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 4 8 Altkültür Sayısı Şekil 4.7. Altkültür sayısına bağlı olarak bir eksplantten meydana gelen sürgün sayısı. 6.0 Boğum Sayısı / Sürgün 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 4 8 Altkültür Sayısı Şekil 4.8. Altkültür sayısına bağlı olarak bir sürgünde bulunan boğum sayısı. 21

BULGULAR VE TARTIŞMA 3.5 3.0 Sürgün Uzunluğu (cm) 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 4 8 Altkültür Sayısı Şekil 4.9. Meydana gelen sürgünlerin altkültür sayısına göre uzunlukları. Gözlenen çoğalma katsayısı (sürgün sayısı) ilk bakışta arzulanan seviyenin çok altında görülmektedir. Ancak bazı odunsu türlerde görülen alt tomurcukların sürmemesi (kardeşlenmenin düşük olması) mikroçoğaltımın başarısını sınırlandırmamaktadır. Çünkü bu durumlarda, mikrosürgün yerine, mikrosürgünlerin boğumlardan kesilmesiyle elde edilen tek-boğum eksplantler kullanılmakta ve böylece potansiyel çoğaltım katsayısı yeterince yüksek olmaktadır (Nas ve Read, 2004a). Buna göre; bu çalışmada çoğaltım katsayısı dörtten (4) daha yüksek bir değer olmaktadır. Altkültür sayısına bağlı olarak değişkenlik gösteren sürgün sayısı ve boğum sayıları beklenen olaylardır. Çünkü in vitro kültür süresi ve altkültür sayısının kültürlerin düzenli büyümelerini etkilediği bilinmektedir (McCown ve McCown, 1987). Altkültür sayısının sürgün uzunluğu üzerine etkisinin önemsiz bulunmuş olması aslında bu etkinin önemsiz olduğunu göstermemektedir. Bu sonuçlar daha ziyade bir eksplantten meydana gelen birden fazla sürgünden yalnızca en uzun olanın ölçülüp değerlendirilmeye alınmasına bağlanmalıdır. Aksi takdirde, bir eksplantten meydana gelen sürgün sayısının düşüş gösterdiği K-8 için sürgün uzunluğunun K-4 e göre daha yüksek çıkması beklenebilir. BA nın bir eksplantten meydana gelen sürgün sayısı üzerine olan etkisi önemli (Şekil 4.10.), bir sürgünde bulunan boğum sayısı (Şekil 4.11.) ve ortalama sürgün uzunluğu üzerine etkisi (Şekil 4.12.) ise önemsiz bulunmuştur. Beklenildiği gibi, ortamda bulunan BA nın konsantrasyonuna paralel olarak meydana gelen sürgün sayısında bir artış olmuştur. Kültür ortamının içerdiği 0.5, 1.0 veya 1.5 mg l -1 BA konsantrasyonuna göre sürgün sayısı, sırasıyla, 1.4, 1.7 ve 1.8 olmuştur. En düşük (0.5 mg l -1 ) ve en yüksek (1.5 mg l -1 ) BA konsantrasyonu içeren ortam üzerinde elde edilen sürgün sayıları arasındaki fark istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. Sitokininlerin (BA) lateral tomurcukların sürmesi ve sürgün regenerasyonu üzerine olan etkileri çok iyi bilinmektedir. Elde edilen sonuçlar bu bakımdan BA nın bilinen etkileriyle uyum içindedir. 22

BULGULAR VE TARTIŞMA Şekil 4.10. BA nın bir eksplantten meydana gelen sürgün sayısı üzerine etkisi. Şekil 4.11. BA nın bir sürgünde meydana gelen boğum sayısı üzerine etkisi. 23

BULGULAR VE TARTIŞMA Şekil 4.12. BA nın ortalama sürgün uzunluğu üzerine etkisi. Bir eksplantten meydana gelen sürgün sayısı, bir sürgünde bulunan ortalama boğum sayısı ve ortalama sürgün uzunluğu üzerine ikili interaksiyonların etkisi önemsiz fakat üçlü interaksiyonların (Genotip x Altkültür sayısı x BA) etkisi önemli bulunmuştur. Özellikle genotip sayısının çok fazla olduğu durumlarda çoklu interaksiyonların yorumlanması güç olmaktadır. Ancak bu tür interaksiyonlar, doğru yorumlanabilirlerse çoğaltım programının ileriki safhalarını belirlemek bakımından önemli bilgiler sağlamaktadır. Kültürlerin kalitesi ve yüksek büyüme düzenleyici konsantrasyonu kullanılacağı zaman meydana gelmesi muhtemel mutasyonlar göz önüne alınarak, Şekil 4.13., Şekil 4.14. ve Şekil 4.15. incelendiğinde uzun süreli kültürler için en uygun BA konsantrasyonunun 1.0 mg l -1 olacağı görülmektedir. Bu nedenle, sekizinci altkültürden sonra BA nın diğer konsantrasyonlarının kullanımından vazgeçilmiş ve yalnız 1.0 mg l -1 BA içeren ortam kullanılmıştır. 24

BULGULAR VE TARTIŞMA Sürgün Sayısı / Eksplant 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 G1-K4 G1-K8 G2-K4 G2-K8 0.0 0.5 1.0 1.5 BA (mg ml -1 ) Şekil 4.13. Genotip x Altkültür sayısı x BA interaksiyonunun bir eksplantten meydana gelen sürgün sayısı üzerine etkisi (G: Genotip; K: Altkültür sayısını belirtmektedir). 7.0 Boğum Sayısı / Sürgün 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 0.5 1.0 1.5 BA (mg ml -1 ) G1-K4 G1-K8 G2-4 G2-K8 Şekil 4.14. Genotip x Altkültür sayısı x BA interaksiyonunun bir sürgünde bulunan boğum sayısı üzerine etkisi. (G: Genotip; K: Altkültür sayısını belirtmektedir). 25

BULGULAR VE TARTIŞMA Sürgün Uzunluğu (cm) 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 BA (mg ml -1 ) G1-K4 G1-K8 G2-K4 G2-K8 Şekil 4.15. Genotip x Altkültür sayısı x BA interaksiyonunun ortalama sürgün uzunluğu üzerine etkisi. (G: Genotip; K: Altkültür sayısını belirtmektedir). 4.3. Mikrosürgünlerin Köklendirilmesi ve Dış Ortama Aktarılması Mikrosürgünler 5, 9, ve 18. altkültürlerin sonunda köklendirme muamelesine tabi tutulmuşlardır. Köklendirme muamelesinden yaklaşık bir ay sonra köklenme meydana gelmiştir (Şekil 4.16.). Ancak, hem 0.1 mg l -1 IBA içeren ortam üzerinde kültüre alınan mikrosürgünlerin hem de dip kısımları 1.0 g l -1 IBA solusyonuna bandırıldıktan sonra büyüme düzenleyici içermeyen ortam üzerinde kültüre alınan mikrosürgünlerin köklenme oranı (%5 ten az) ve kök sayısı çok düşük olmuştur. Köklenen mikrosürgünler tedrici olarak akklimatize edildikten sonra başarıyla dış ortama aktarılabilmiştir (Şekil 4.17.). 26

BULGULAR VE TARTIŞMA Şekil 4.16. Köklendirme muamelesinden yaklaşık 30 gün sonra mikrosürgünlerde meydana gelen kökler. 27

BULGULAR VE TARTIŞMA Şekil 4.17. İn vitro köklendirilen ve akklimatize edildikten sonra dış ortama aktarılan mikrosürgünler. Elde edilen köklenme sonuçları başarılı bir mikroçoğaltım proğramı için yetersiz kalmakta ve aynı zamanda alıcın zor köklenen bir tür olduğunu göstermektedir. Benzer sonuçlar zor köklenen diğer bazı türler için de bildirilmiştir. Zor köklenen türlerde ortam koşullarının iyileştirilmesiyle beraber altkültür sayısının arttırılması ile iyi bir köklenmenin sağlanabildiği bildirilmiştir. Örneğin Nas ve Read (2004b) ortam optimizasyonundan sonra altkültür sayısını arttırarak zor köklenen fındık mikrosürgünlerinde %95 in üzerinde bir köklenme elde etmişlerdir. Alıç mikrosürgünlerinde daha iyi bir köklenmenin sağlanması için ortam şartlarının optimize edilmesi ve buna bağlı olarak çalışmaların devam etmesi gerekmektedir. Bundan sonra yapılacak çalışmalarda, Dai ver ark. (2007) nin kullandığı iki aşamalı köklendirme protokolu uygulanması ve Hepaksoy ve Tanrısever (2004) in köklendirme ortamına aktif kömür ilavesi gibi muamelerlerin araştırılması önemli olmaktadır. 28