1 DNA ` nın Yapısı Yrd. Doç.Dr. Seda Örenay Boyacıoğlu 15 Ekim 2014 Çarşamba
Gen-Genetik Kod-Genetik bilgi 2 Nukleus Kromozom Kromozom Ge n Gen 15 Ekim 2014 Çarşamba
DNA Transkripsiyon Ribozom Translasyon Protein Genetik materyalin dört özelliği: 3 Replikasyon-kendini eşleyebilmesi Bilgi depolama Bilgiyi ifade etme Mutasyonlarla varyasyon gösterme Santral doğma trna Replikasyon rrna mrna 15 Ekim 2014 Çarşamba
Genetik materyal Protein mi? Nükleik asit mi? 4 Fried Miescher (1868): Lökosit çekirdeği-somon balığı sperm hücrelerinüklein: asidik DNA+bazik proteinler;fosfor ;Sülfür - Nüklein in hücre kalıtımı ile ilgili olabileceği fikri 15 Ekim 2014 Çarşamba
Genetik Materyal: DNA nın 5 keşfi- Fred Griffith (1927-8) İlk transformasyon deneyleri Diplococcus (Streptococcus) pneumoniae Isı ile öldürülmüşs hücreleri ve canlı R hücrelerii karışımı CanlıS hücreleri (kontrol) virülent Canlı R hücreleri (kontrol) avirülent Isı ile öldürülmüş S hücreleri SONUÇLAR Fare ölür Fare sağlıklı Fare sağlıklı Mouse ölür Transformasyon sebebi ilke Kalıtımı kontrol eden bir molekül mevcuttur Kan örneklerinde canlı S hücreleri bulundu 15 Ekim 2014 Çarşamba
6 DNA nın keşfi-oswald T. Avery, Macleod, McCarty (1944) Transformasyon sebebi ilke- Griffith in sonuçlarından sorumlu olan genetik materyal DNA olduğu kanıtlandı. S suşuna ait filtrat (DNA ve RNA protein karışımı) S suşuna ait filtrat RNaz ilavesi DNaz ilavesi Proteaz ilavesi S suşuna ait filtrat Sadece DNA ve protein kalır SadeceRNA ve protein kalır R bakterilerine DNA nın eklenmesi R bakterilerine RNA nın eklenmesi DNA-RNA kalır kalır R bakterilerine DNA-RNA nın eklenmesi Besiyerine ekim yapılır Besiyerine ekim yapılır Besiyerine ekim yapılır 15 Ekim 2014 Çarşamba S transformantı ürer R hücreleri ürer S transformantı üremez Sadece R ürer S transformantı ürer R hücresi ürer
LİTİK DÖNGÜ 7 DNA nın keşfi-virülent T2 fajının yaşam döngüsü) Bakteri hücre duvarının Enzimlerle parçalanmasıyla yeni nesil fajların dışarı çıkması Progeny faj partiküllerinin biraraya getirilmesi Faj kromozomu Faj kafasının oluşması Fajın E. coli ye tutunması, ve faj kromozomunu enjeksiyonu Konak E. coli hücresi Faj parçaları Bakteri (konak) kromozomu Fajın yapısal içeriğinin üretilmesi için faj genlerinin ekspresyonu 15 Ekim 2014 Çarşamba Fajıa özgün enzimlerle Bakteri kromozomunun parçalanması Faj kromozomu Bakteri kromozomu tamamen parçalanır Faj kromozomlar ı Bakteri materyallerinin Ve faj enzimlerinin kullanılarak faj kromozomunun replikasyonu
8 DNA nın keşfi- Hershey-Chase Deneyleri (1952) Yeni faj partiküllerinin sentezlenebilmesi için gerekli bilgiyi taşıyan ve bakteri hücresine aktarılan molekül DNA P 32 S 35 DNA Protein kılıf (metiyonin sistein) Faj Bacterial cell Radioaktif protein Boş protein kılıf Sıvıda Radyoaktivite, (faj proteini) 1: Sulfur ( 35 S) DNA Faj DNA Santrifüj Radyoaktif DNA Pellet (bakteri hücreleri ve içerikleri) 2: Fosfor ( 32 P) Santrifüj Pellet Radyoaktivite (faj DNA) in pellet 15 Ekim 2014 Çarşamba
Nükleik asit Kimyası 9 Nükleotitler: Nükleik asitlerin yapı taşları Fosfa t Pürin ya da pirimidin bazı Pentoz = Nitrojen Baz + Pentoz Şeker + Fosfat grup Pürinler (9 üyeli çift halkalı) Adenin &Guanin Pirimidinler (6 üyeli tek halkalı Timin&Sitozin&Urasil 15 Ekim 2014 Çarşamba
10 Nükleik asitlerin bileşenleri (Nitrojen bazları-azotlu bazlar) Pürin Adenin (A) Pürinler Guanin (G) Pirimidin Timin (T) Sitozin (C) Urasil (U) (DNA) (DNA, RNA) (RNA) Pirimidinler DNA 15 Ekim 2014 Çarşamba
Nükleik asitlerin bileşenleri 11 (Pentoz şekerler) Ribonükleotitlerde 2 -OH RNA da bulunur Deoxyribonükleotitlerde a 2 -H DNA da bulunur Şekerler azot bazlardan ayırtedilebilmeleri için numaralandırılmış karbon atomları içerirler Riboz Deoksiriboz Bu karbonda oksijen atomu bulunmaz 15 Ekim 2014 Çarşamba
Nükleik asit Kimyası 12 Nükleozitler = Baz + Şeker Nükleozit Nükleotit NMP = nükleozit + 1 PO 4 NDP = nükleozit +2 PO 4 NTP = nükleozit + 3 PO 4 Nükleik asitlerin yapı taşıdır özel NTPs: ATP & GTP Nükleozitlerin isimlendirilmeleri ve genel yapıl 15 Ekim 2014 Çarşamba
Nükleozit ve Nükleotit isimlendirilmeleri Baz Nükleozitler Nükleotitler
Nükleik asit oluşumundaki 14 bağlar Şekerin C-1 atomu nitrojen bazla kimyasal bağ yapar Şeker pürin bazının N-9 atomuna kovalent bağ yapar Şeker pirimidin bazının N-1 atomuna kovalent bağ yapar Nukleotitler şekerin C-2, C-3 ve C-5 atomlarına bağlanabilirler Ancak, C-5 konfigürasyonu biyolojik sistemlerdeki en yaygın olan, DNA ve RNA da bulunan mevcut formdur. 15 Ekim 2014 Çarşamba
Nükleozit Difosfatlar ve trifosfatlar, AMP, ADP ve ATP Ek fosfat grupları nüklozit 5 - monofosfatlara eklenebilir ve difosfatlar and trifosfatlar oluşur ATP hücre aktiviteleri için en önemli enerji kaynağıdır 5 -monofosfat 5 -difosfat Adenozin 5 -monofosfat (AMP) Adenozin 5 -difosfat (ADP) Adenozin 5 -trifosfat (ATP)
Polinükleotitler 16 İki mononükletit arasında bağ yapısında, iki şekere bağlı fosfat grubu yer alır oluşan bağ fosfodiester bağıdır, çünkü fosforik asit her iki taraftaki alkol grubu ( iki şekerdeki OH grubu ) ile ester bağı yapar. Aynı bağ, RNA da da bulunur. dinukleotitler & trinükleotitler oligonükleotitler (<20) polinükleotitler (>20) 15 Ekim 2014 Çarşamba
17 Fosfodiester bağları DNA nın kovalent iskeleti Şeker-fosfat iskeleti 5 uç 5' 1' 4' 2' 3' BAZlar Fosfodiester bağları 4' 5' 3' 2' 1' 5' 4' 2' 1' 3' 3 uç 4' 5' 2' 1' Fosfa 3' t Şeker (deoksiriboz) 15 Ekim 2014 Çarşamba DNA nükleoti di
7. DNA Modeli: James D. 18 Watson & Francis H. Crick DNA nın double helix modelinin sunulması Bilginin esas iki kaynağı: 1. Hidrolize olmuş DNA örneğinin baz kompozisyon analizi Chargaff Kuralı : #A#T and #G#C. A strange but possibly meaningless phenomenon. 2. X-ray kırınım çalışmaları: Rosalind Franklin & Maurice H. F. Wilkins 15 Ekim 2014 Çarşamba
Chargaff Kuralları (Erwin Chargaff 19 1949-1953) DNA nın baz içeriği bir türden diğerine değişiklik göstermektedir DNA nın baz içeriği bir türün farklı bireylerinde ya da bireyin farklı dokularında değişiklik göstermez DNA nın baz içeriği zamanla değişmez DNA nın baz içeriği beslenme, yaş, çevre faktörler vb. nedeniyle değişmez, Herhangi bir türe ait DNA nın nükleotidlerine parçalandığında serbest kalan nukleotidlerde Adenin (A) moleküllerinin sayısı timin (T) molekülleri sayısına, guanin (G) moleküllerinin sayısı sitozin (C) moleküllerinin sayısına eşittir %A = %T ve %G = %C (A/T=1 ve G/C=1) Pürin sayısı=pirimidin sayısı (A+G)=(T+C) GC oranı türler arasında farklılık göstermekte ve bu oran organizmaya bağlı olarak %22- %76 arasında değişmektedir. % G+C oranının %A+T oranına eşit olması gerekmez İşte Watson ve Crick bu bulguları değerlendirerek böyle özelliklere sahip DNA makro molekülünün sekonder yapısına ait bir model geliştirdiler. 15 Ekim 2014 Çarşamba
X-ışını kırınım Analizi 20 DNA zincirleri X-ışını bombardımanına tutulur ve molekülün atomik yapısına göre saçtığı ışınlar belirlenir. Buna göre; 1947- William Astbury DNA da 3.4 A aralıklarla tekrarlayan yapıların varlığını doğrulamış ve DNA nın bir çeşit sarmal yapıda olduğunu ileri sürmüştür. 1950-1953- Rosalind Franklin 3.4 A aralıklarla tekrarlayan yapıların varlığını doğrulamış (William Astbury tarafından önerilen) ve DNA nın bir çeşit sarmal yapıda olduğunu daha saf örnekler kullanara gösterebilmiştir. 1 nm=10 A 0 15 Ekim 2014 Çarşamba
Watson-Crick Modeli İki uzun polinükleotit zinciri bir merkez eksen etrafında kıvrılarak, sağ-el ikili sarmal yapısını oluşturur İki zincir birbirine antiparaleldir; iki zincirin C-5 ucundan C-3 ucuna doğru olan yönleri birbirine göre terstir. Her iki zincirin bazları düzlemsel yapıda olup düzlemlere eksene diktir. Bazlar arasındaki mesafe 3.4 A olup birbiri üzerine istiflenmiş durumdadırlar ve sarmal içerisinde yer alırlar. Karşı zincirdeki azotlu bazlar hidrojen bağları ile birbirileri ile eşleşirler. DNA da sadece A=T ve G C eşleşmesi olabilir (komplementerlik). Sarmalın her bir tam dönüşü 34 A (3.4 nm) dir. Her bir zincirde bir dönüşte 10 baz yer alır. Molekülün herhangi bir bölümünde, eksen boyunca sıra ile daha geniş olan büyük (majör) oluklar ve daha dar olan (küçük) minör) oluklar görülmektedir. Sarmal 20 A (2 nm) çapındadır. Bir tam dönüş 34 A o Büyük oluk DNA sarmalı Çap 20 A o Küçük oluk şeker-fosfat iskeleti Baz çifti Baz, şeker ve fosfat durumu, Hbağlar 3.4 A o 15 Ekim 2014 Çarşamba Merkezi eksen 5 3 3 5 Bazların yatay istiflenmesi
DNA sarmalı 22 15 Ekim 2014 Çarşamba
DNA sarmalı 23 DNA daki baz eşleşmesi modelin genetik açıdan en önemli özelliğidir. Bu yerleşim nedeniyle eksen boyunca büyük ve küçük oluklar ortaya çıkar. Sağ el sarmalının uzaydaki konformasyonu, Watson Crick in verilerine en uygun olanıdır. 15 Ekim 2014 Çarşamba
1962: Fizyoloji ve Medicine Nobel Ödülü Watson, J.D. and F.H. Crick, Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxynucleic Acids. Nature 171 (1953), p. 738. James D. Watson Francis H. Crick Maurice H. F. Wilkins Peki? Rosalind Franklin 24 15 Ekim 2014 Çarşamba
DNA nın formları 25 Tek-kristal-X-ışını analizi çalışmaları ile 5 A luk çözünürlük 1 A a kadar düşürülmüştür. A-DNA right handed (11 baz/ 1 tam dönüş/çap 23 Å) yüksek tuz kons. Yada dehidrasyon koşullarında baskındır. B-DNA right handed (normal, 10 baz/dönüş, çap 20 Å) C-DNA right handed (dehydrated, 9.3 baz/dönüş,19å) D-DNA right handed (no guanine, 8 baz/dönüş) E-DNA right handed (no guanine, 7.5 baz/dönüş) Z-DNA left handed (hepsi GC, 12 baz/dönüş, 18 Å) (1979) Büyük oluk neredeyse yok denilebilir P-DNA DNA yapay şekilde uzatılırsa bu formu alır, fosfat grupları iç kısımda azotlu bazlar sarmalın dış yüzünde Fizyolojik koşullarda rasgele bir DNA dizesinde en stabil form B formudur. A formu su dışında birçok çözeltide oluşan bir formdur. Z formu: sola doğru dönen heliks yapısındadır. Z formu bazı genlerin ekspresyonlarının regulasyonunda rol alabilir. 15 Ekim 2014 Çarşamba
DNA nın formları 26 Sarma l Tipi Dönüşbaşı na baz çifti Baz çifti baına dönüş Sarmal çapı A 11 +34.7 O 23 A O B 10 +34.0 O 19 A O Z 12-30.0 O 18 A O 15 Ekim 2014 Çarşamba
Büyük DNA moleküller hücre içerisinde super coiller oluşturarak bulunurlar Relaks, gevşek supercoiled
Çıkarımlar.. 28 Bazı virüsler haricinde DNA dünyadaki tüm yaşayan organizmaların genetik materyalidir Watson-Crick modeline göre; DNA right handeddouble heliks formunda bulunur Double heliksin zincirleri komplementer nitrojen bazları arasındaki hidrojen bağı ile birarada tutulurlar DNA yapısı genetik bilginin saklanmasını ve ifade edilmesini sağlar 15 Ekim 2014 Çarşamba
DNA İZOLASYONU Yrd.Doç.Dr. Seda Örenay Boyacıoğlu
DNA İZOLASYONU DNA hücrede serbest bir molekül halinde değildir. Bazı proteinler( histonlar, histon olmayan proteinler vb.) ve RNA ile bir kompleks halinde bulunur. Virüsler gibi canlılarda da bir protein kılıf içinde yer alır.dna izolasyonu değişik hatta aynı organizma gruplarında bile farklılık gösterir.
DNA İZOLASYONU DNA izolasyonun başarısı çalışılan organizmanın çoğaltılmasıyla ilgilidir.örn: bakterilerdeki DNA izolasyonunda en önemli sorun yeterli miktarlarda DNA elde edilememesidir.bu sorun özellikle plasmid izolasyonunda öne çıkmaktadır.
DNA İZOLASYONU plasmidler dışında replikasyonu büyük Yüksek kopya sayısına ulaşabilen ölçüde genomik DNA nın kontrolü altında olan plasmidlerin ( Ör: pbr322) DNA sının elde etmek zorlaşır.bu durumda bakteri kültürleri kloramfenikol uygulamasına bırakılarak bakteri replikasyonu engellenerek plasmid sayısı arttırılabilir.
DNA İZOLASYONU DNA İzolasyonu temelde 3 aşamadan meydana gelir: 1- Hücre duvarının parçalanması 2- DNA- Protein kompleksinin çözülmesi 3- DNA nın ortamdaki diğer moleküllerden ayrılması
1- HÜCRE DUVARININ PARÇALANMASI A- FİZİKSEL OLARAK Mekanik işlemler Osmatik şok Dondurup çözme Ultrasonifikasyon v.b. En çok kullanılan dondurup-çözme yöntemidir.
1- HÜCRE DUVARININ PARÇALANMASI Dondurup çözme: Hücrelerin çok düşük sıcaklık derecelerinde (ör:-20c da) tutulup sonra yeniden ısıtılarak çözdürülmesi ve işlemin birkaç tekrarlanması parçalamaya yol açar.işlemin temel prensibi donan su moleküllerinin hacminin genişlemesi ve hücrelerde oluşan buz kristallerinin hücre zarına zarar vererek parçalanmayı sağlamasıdır.
1- HÜCRE DUVARININ PARÇALANMASI 2- KİMYASAL OLARAK Çözücülerin kullanılması: Bu uygulamalrın prensibi,hücre zarındaki bileşiklerin çözündüğü uygun bir çözücü yardımıyla zar yapısının eritilmesidir.
1- HÜCRE DUVARININ PARÇALANMASI 2- KİMYASAL OLARAK Organik çözücüler( Etil asetat, toluen v.b.) zardaki lipidleri çözerek yapıyı bozarlar. Bazik Çözücüler PH= 11-12,5 aralığında uygulanır.hücre duvarının hidrolizine yol açarlar.
1- HÜCRE DUVARININ PARÇALANMASI 2- KİMYASAL OLARAK Deterjanlar,uygun PH da zardaki lipoproteinlerle etklileşime girerek etkili olur..
1- HÜCRE DUVARININ PARÇALANMASI
1- HÜCRE DUVARININ PARÇALANMASI Enzimlerin kullanılması:bu amaçla kullanılan litik enzimler özellikle mikroorganizmalar için uygundur. Lizozim; bakteri hücre duvarındaki peptidoglikan tabakasındaki glikozidik bağları hidroliz eder. Tripsin, proteinaz K ve zimoliyaz (mayalar için) bu amaçla kullanılır.
Çeşitli materyallere Uygulanacak Bazı Parçalama Tipleri Ozmatik Şok Enzim Uygulaması Deterjan Uygulaması El Homojenizatörü Doğrama Ultrasonifikasyon Bilyeli mil Lökositler Bakteriler, mayalar Doku kültürü hücresi Karaciğer v.b. Yumuşak dokular Kas v.b. Dokular Hücre süspansiyonları Hücre süspansiyonları
2-DNA-PROTEİN KOMPLEKSİNİN ÇÖZÜLMESİ DNA nın denatürasyon işlemine dayanır. Bu amaçlada çoğunlukla fenol ekstraksiyonu işlemi kullanılır.fenolle proteinler ve DNA fragmentleri denatüre edilerek ortamdan uzaklaştırılması sağlanır.
2-DNA DNA-PROTEİN 2-DNA-PROTEİN KOMPLEKSİNİN KOMPLEKSİNİN ÇÖZÜLMESİ ÇÖZÜLMESİ aqueous phase (nucleic acids) phenol phase (proteins)
2-DNA-PROTEİN KOMPLEKSİNİN ÇÖZÜLMESİ Amonyum sülfat ve sodyum sülfat ile proteinler çöker.
3- DNA NIN ORTAMDAKİ DİĞER MOLEKÜLLERDEN AYRILMASI PH= 12-12,5 aralığında plasmid DNA ile genomik DNA yı birbirinden ayırırız. Bu iki yapı farklı bazik ortamda farklı reaksiyon verir.bu koşullarda genom DNA sı denatüre olurken plasmid DNA sı olmaz.
3- DNA NIN ORTAMDAKİ DİĞER MOLEKÜLLERDEN AYRILMASI Son aşama DNA nın diğer moleküllerden fiziksel ve kimyasal etkilere maruz bırakılması ile ayrılmasıdır. Kimyasal olarak etanol ve izopropanol uygulaması ile DNA çöktürelebilir. Fiziksel uygulmada ise santrifüjleme yapılır.
3- DNA NIN ORTAMDAKİ DİĞER MOLEKÜLLERDEN AYRILMASI
En çok kullanılan santrifüjleme yöntemi Cs-Cl-etidiyum bromür (EB) gradienti denge santrifüjlemesidir.eb, DNA ya bazlar arasına girerek bağlanır ve çift sarmalın çözülmesine neden olur.bu da doğrusal DNA molekülünün boyunun uzamasına ve plasmidlerde süper sarmal dönümlerin oluşmasına yol açar. 3- DNA NIN ORTAMDAKİ DİĞER MOLEKÜLLERDEN AYRILMASI
3- DNA NIN ORTAMDAKİ DİĞER MOLEKÜLLERDEN AYRILMASI Sonuçta süper sarmal dönümlerin yoğunluğundaki büyük artışla EB nin girişi engellenirken, doğrusal DNA molekülleri doygunluğa ulaşıncaya kadar EB yi almaya devam eder. EB nin değişik oranda bağlanması sonucu oluşan yoğunluk farklılığı iki molekülün farklı çökelmesine neden olur.
3- DNA NIN ORTAMDAKİ DİĞER MOLEKÜLLERDEN AYRILMASI Cs-Cl Cl Gradiyenti Cs-Cl Cl Gradiyenti
İNSAN KANINDAN DNA İZOLASYONU( Yüksek Tuz Konsantrasyonunda) DNA,10 ml lik EDTA lı kandan izole edilir. 10 ml lik kan 50ml lik EDTA lı tübe alınır ve üzerine 40ml soğuk steril distile su ilave edilerek ve 2-3 dakika hızla çalkalanarak eritrositlerin parçalanması sağlanır. 2500 rpm de oda temparatüründe santrifüj edilir ve süpernatan kısmı
İNSAN KANINDAN DNA İZOLASYONU( Yüksek Tuz Konsantrasyonunda) Bu yıkama işlemi iki kez tekrarlandıktan sonra (böylece eritrositler uzaklaştırılır) pellet( lökosit içerir) üzerine nüklei lizis tamponu, SDS ve proteinaz K eklenerek (Lökositlerin parçalanması sağlanır)37 derecelik etüvde bir gece bekletildi. Etüvden çıkarılan tüplere amonyum asetat eklenerek hızla çalkalanır.
İNSAN KANINDAN DNA İZOLASYONU( Yüksek Tuz Konsantrasyonunda) Süpernatan temiz tüpe alınır ve etanol eklenir. Tüp alt-üst edilerek DNA görünür hale getirilir. Toplanan DNA % 70 lik etanolle yıkanır ve alkol uçurulur. DNA TE içeren tüpe alınır ve çözülür. Bu şekilde saklanır.
İNSAN KANINDAN DNA İZOLASYONU( Yüksek Tuz Konsantrasyonunda) İzole edilen DNA ların 1/50 dilisyonları hazırlanarak, 260 nm dalga boyundaki absorbans değerleri okunur. Okunan absorbans değerlerinden örneklerdeki DNA konsantrasyonu hesaplanır.