Genel İdentifikasyon Testleri 1

Genel İdentifikasyon Testleri 1 01. Saf Kültür İzolasyonu 02. Gram Boyama 03. Katalaz Testi 04. Oksidaz Testi 05. İndol Testi 06. Metil red (MR) Testi 07. Voges Proskauer Testi 08. Sitrat Testi 09. Hareketlilik Testi 09.01. Yumuşak Dik Agarlı Besiyerinde Hareketlilik Testi 09.02. Yaş Preparasyon Tekniği 09.03. Flagella Boyama Yöntemi İle Mikroskobik Hareketlilik Testi 10. Karbohidrat Fermantasyon Testi 11. Hemoliz Testi 12. Lisin Dekarboksilaz Testi 13. ONPG (β-galaktozidaz) Testi 14. Üre Testi 01. Saf Kültür İzolasyonu İncelenecek örnekten, petri kutusundaki uygun agarlı bir besiyerine tek koloni düşürme tekniği ya da yayma tekniği kullanılarak ekim yapılır. Petri kutuları uygun sıcaklık ve sürede inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonrası petri kutularında oluşan, birbirine temas etmeyen ve izole edilmek istenen mikroorganizmanın özelliklerine uygun olan koloni öze, kürdan veya aşı iğnesi yardımı ile sıvı bir besiyerine aktarılır. İnkübasyonun ardından izolatın saf olup olmadığını incelemek amacıyla saflık kontrolü yapılır. Saflık kontrolü için petri kutusundaki agarlı besiyerine sürme yapılarak inkübasyon sonrası burada oluşacak koloninin şekil, büyüklük, yapı, renk gibi özellikleri incelenir. Farklı özelliğe sahip koloni varlığı gözlendiğinde, bu durum kültürün karışık olması anlamına gelir ve tekrar tek koloni alınarak saflık kontrolüne kadar işlemler tekrarlanır. Besiyerinde aynı tip koloni gözlense bile tek koloni alınarak reizolasyon işlemi yapılması da genel olarak önerilmektedir. 02. Gram Boyama Christian Gram tarafından 1884 yılında geliştirilmiş diferansiyel bir boyama tekniği olan Gram boyama ile bakterilerin Gram reaksiyonu incelenir. Tanımlamada önemli bir aşama olan Gram reaksiyonuna göre bakteriler Gram pozitif ve Gram negatif olmak üzere ikiye ayrılırlar. Ancak Mycobacterium gibi bazı bakterileri bu şekilde gruplandırma imkanı yoktur. 1 Kaynak : Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları ; Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü

Preparat hazırlığı başlıca dört aşamadan oluşmaktadır; öncelikle incelenecek olan kültürden bir öze dolusu lam üzerine aktarılır ve lamın üzerine ince bir film tabakası halinde yayılır. Havada iyice kurumasının ardından bakterilerin lam üzerine tespiti yani fiksasyon işlemi yapılır. Son aşama olan fiksasyon için genellikle lamın alt yüzü üç kez Bunzen beki alevinden geçirilir. Preparat 18 24 saatlik kültürden hazırlanmalıdır. Daha yaşlı kültür kullanıldığı taktirde yanlış sonuç alınabilir. Gram varyabl olan yani Gram reaksiyonu değişken olan bazı Gram pozitif bakteriler Gram negatifmiş gibi değerlendirilebilir. Ayrıca Bacillus subtilis, B. anthracis gibi bazı bakteriler de 2-3 saatlik kültürlerinde Gram negatif özellik gösterdikleri halde zamanla Gram pozitif özelliğe sahip olmaktadır. Gram boyama yapmak için hazırlanmış preparatın üzerine kristal viyole boyası damlatılıp 1 dakika beklenir ve iyot-lugol çözeltisi ile yıkanarak kristal viyole uzaklaştırılır. Preparata tekrar iyot-lugol çözeltisi damlatılarak 1-2 dakika bekletilip, distile su ile yıkanarak iyotlugol çözeltisi uzaklaştırılır. Preparatın üzerine %96 'lık etil alkol veya eter aseton çözeltisi damlatılarak 10 15 saniye beklenir, distile su ile yıkanır ve karşıt boya olarak safranin damlatılır ve 20-30 saniye bekletilir. Preparat distile su ile yıkanarak havada kendi halinde kurumaya bırakılır, preparata immersiyon yağı damlatılır ve 100 'lük objektifle incelenir. Mor renkli bakteriler Gram pozitif, pembe-kırmızı renkli bakteriler ise Gram negatif olarak değerlendirilir. Gram boyama için gerekli olan tüm çözeltiler hazır ticari kitler halinde de pazarlanmaktadır. - Kristal viyole boyası : Kristal violet (gentian violet) 0,5 g ; Distile su 100 ml bileşimindedir. Boya distile su içinde çözüldükten sonra kaba filtre kağıdından süzülür. - İyot-Lugol çözeltisi : Potasyum iyodür 2 g ; İyot kristali 1 g ; Distile su 300 ml bileşimindedir. Potasyum iyodür distile su içerisinde iyice çözüldükten sonra iyice ezilmiş iyot kristali ilave edilir. Tam bir çözünme sağlanana kadar karıştırılır. - Safranin : Safranin 0,5 g ; Etil alkol (%95) 10 ml ; Distile su 100 ml bileşimindedir. Safranin etil alkol içinde çözündürüldükten sonra distile su ile karıştırılır. 03. Katalaz Testi Genellikle aerobik ve fakültatif anaerobik mikroorganizmaların sahip olduğu katalaz enzimi, ortamdaki hidrojen peroksiti su ve oksijene ayrıştırır. Sıvı veya katı besiyerinde geliştirilen bakteri kültürüne H 2 O 2 ilave edildiğinde, serbest oksijenin gaz kabarcıkları halinde gözlenebilmesi, hidrojen peroksitin ayrışmasını, dolayısıyla katalaz enziminin varlığını gösterir. Test üç farklı şekilde uygulanabilir; - Tüp veya petri kutusundaki agarlı kültür yüzeyine 1 ml %3 'lük H 2 O 2 ilave edilerek gaz çıkışı olup olmadığı incelenir. - İncelenecek kültürden öze ile örnek alınarak temiz bir lam üzerinde distile su ile süspanse edilir. Bunun üzerine bir öze dolusu %30 'luk H 2 O 2 ilave edilerek karıştırılır. Hava kabarcıklarının çıkışı testin pozitif olduğunu gösterir. - Temiz bir test tüpüne %30 'luk H 2 O 2 aktarılarak üzerine 1 ml kültür ilave edilir. Gaz çıkışı olup olmadığı gözlenerek sonuç değerlendirilir.

04. Oksidaz Testi Tetrametil p fenilendiamin kullanılabilir ; dihidroklorür kullanılarak yapılan bu testte iki yöntem - Bir parça filtre kağıdı %1 'lik tetrametil-p-fenilendiamin dihidroklorür veya oksalat ile ıslatılır. Filtre kağıdının mavi renk vermiyor olmasına dikkat edilmelidir. Temiz bir platin öze yardımıyla petri kutusu veya yatık agardaki aktif kültürden bir miktar alınarak filtre kağıdının üzerine yayılır. 10 saniye içinde gözlenen mavi renk oluşumu oksidaz pozitif olarak değerlendirilir. Yaşlı kültürlerle yapılan test güvenilir sonuç vermemektedir. - Bakteri kültürleri Nutrient Yatık Agar besiyerinde optimum sıcaklıkta 24-48 saat inkübe edilir. İnkübasyonun ardından, oluşan kolonilerin üzerine %1 'lik p-aminodimetilanilin okzalat ve %1 'lik etanol içinde hazırlanmış α-naftol çözeltilerinin her birinden birkaç damla ilave edilir. Mavi renk oluşumu pozitif sonuç olarak değerlendirilir. 05. İndol Testi Triptofan bulunan bir besiyerinde geliştirilen bakterilerin, triptofanı enzimatik hidrolize uğratarak indol oluşturup oluşturmadıklarını belirlemek amacı ile yapılan bir testtir. 5 ml Triptofan besiyeri içeren tüplere inokülasyon yapılarak optimum sıcaklıkta 72 saat (3 gün) inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonrası 0,2-0,3 ml Kovacs ayıracı ilave edilir. Üst kısımda kırmızı halka oluşumu pozitif reaksiyonun, sarı-kahverengi ise negatif reaksiyonun göstergesidir. Kovaks çözeltisi ; p-dimetilaminobenzaldehit 5 g ; İzo- veya normal amil alkol 75 ml ; konsantre HCl 25 ml bileşimindedir. Amil alkolün ph 'sı 6,0 'dan daha az, çözelti hazırlandıktan sonra rengi sarı olmalıdır. Çözelti kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır. Kovaks çözeltisi, hazır ticari çözelti olarak da satılmaktadır. 06. Metil red (MR) Testi Bazı bakteriler, ortamda bulunan glikozu kullanarak çeşitli organik asitleri oluştururlar ve sonuçta ortamın ph 'sı düşer. Bu özellikten faydalanarak bakterilerin glikozdan asit oluşturup oluşturmadığını belirleyebilmek amacı ile metil red testi yapılır. Bu testte kullanılan metil red indikatörü ph 6,2 'de sarı, ph 4,2 ve altında ise kırmızı bir renk oluşturur. Metil Red ve Voges Proskauer testleri çoğu analizde beraberce uygulanır. Bu amaçla MR-VP gibi bir besiyerine ekilen kültürün bir kısmı metil red testi için, diğer kısmı VP testi için kullanılır. 10 ml Glikoz Fosfat Pepton ya da MR-VP besiyeri öze ile inoküle edilerek optimum sıcaklıkta 96 saat (4 gün) inkübe edilir. İnkübasyon sonrası (VP testi de yapılacaksa kültür ikiye bölünerek birinin) üzerine birkaç damla metil kırmızısı ilave edilerek karıştırılır. Belirgin bir kırmızı renk oluşumu pozitif olarak değerlendirilir. Renk değişimi olmazsa sonuç negatiftir. Metil red indikatörü ; Metil red 0,1 g ; %96 'lık etil alkol 300 ml ; distile su 200 ml bileşimindedir. İndikatör önce alkol içerisinde çözülür, sonra distile su ilave edilir.

07. Voges Proskauer Testi Bazı bakteriler glikoz bulunan ortamda glikozu kullanarak asetoin, 2,3-bütilen glikol gibi çeşitli nötral ürünler oluştururlar. Bunlardan asetoin, ortama alkali bir madde eklendiğinde okside olarak diasetil 'e dönüşür. Bu madde ise peptondaki kreatin, arjinin veya kreatinin ile birleşerek pembe kırmızı bir renk oluşumuna neden olur. Metil Red ve Voges Proskauer testleri beraberce uygulanacak ise MR-VP gibi bir besiyerine ekilen kültürün bir kısmı metil red testi için, diğer kısmı VP testi için kullanılır. 10 ml Glikoz Fosfat Pepton ya da MR-VP besiyeri öze ile inoküle edilerek optimum sıcaklıkta 96 saat (4 gün) inkübe edilir. İnkübasyon sonrası (metil red testi de yapılacaksa kültür ikiye bölünerek birinin) üzerine 5 ml %40 'lık potasyum hidroksit (KOH) ya da NaOH solüsyonu ilave edilerek karıştırılır. Böylece ortamdaki diasetil asetoine okside olur. Bunun üzerine çok az miktarda toz haldeki kreatin ve / veya α-naftol çözeltisi (0,6 ml /ml kültür süspansiyonu) damlatılarak karıştırılır. 15 dakika içinde üst kısımda pembeden parlak kırmızıya kadar değişen halka oluşumu pozitif, halka oluşmaması ise negatif reaksiyon olarak değerlendirilir. α-naftol çözeltisi ; α-naftol 5 g ; alkol (%96) 100 ml bileşimindedir. Çözelti kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır. 08. Sitrat Testi Bazı bakteriler karbon ve enerji kaynağı olarak sitratları kullanabilirler. Sitrat testi, bakterinin tek karbon kaynağı olarak sitratı kullanıp kullanmadığını belirlemek amacı ile yapılır. Kültür süspansiyonundan, Simon's Sitrat yatık Agar besiyerine öze ile sürme yapılarak optimum sıcaklıkta 2 7 gün süre ile inkübasyona bırakılır. Organik madde aktarımını önlemek amacı ile çok fazla miktarda inokulum alınmamasına dikkat edilmelidir. Orijinal rengi yeşil olan ve indikatör olarak %0,2 Bromo timol mavisi kullanılan besiyerinde, besiyeri renginin maviye dönüşmesi ve ekim hattı boyunca üreme gözlenmesi pozitif sonuç olarak değerlendirilir. Besiyeri rengi değişmemişse sonuç negatiftir. Simmon' s Sitrat Agar besiyeri pek çok firma tarafından üretilip hazır besiyeri olarak pazarlanmaktadır. 09. Hareketlilik Testi Bazı bakteriler, flagella adı verilen hücre organelleri sayesinde aktif hareket yeteneğine sahiptirler. Bakterilerde hareket daha çok flagella varlığının belirlenmesi değil, hareketin gösterilmesi şeklinde ortaya konmaktadır. Makroskobik ve mikroskobik olarak yapılabilen hareketlilik testinde, uygun koşullarda geliştirilmiş 18-24 saatlik genç kültürlere ihtiyaç vardır. Özellikle mikroskobik hareket testinde flagellaların bakteriden kopup ayrılmamasına dikkat edilmelidir. 09.01. Yumuşak Dik Agarlı Besiyerinde Hareketlilik Testi

Pek çok fakültatif anaerob, çok hareketli olan bakteriler için önerilen yumuşak dik agarlı besiyerinde yapılan makroskobik hareket testinde, incelenecek bakteri Triptik Soy Yeast Ekstrakt Broth besiyerinde optimum sıcaklıkta 18 24 saat süre ile inkübasyona bırakılır. Listeria 'da 25 o C 'ın üzerindeki inkübasyon sıcaklığı bakterinin hareket yeteneğinin kaybolmasına neden olabilir. Tüplere dağıtılan yumuşak agarlı besiyerinin, sterilizasyondan sonra dik olarak donması sağlanır. Bu besiyerine genç bakteri kültüründen aşı iğnesi ile aşılama yapılır. Optimum sıcaklıkta 48 saatlik inkübasyon sonunda inokülasyon hattının yanlarına doğru yayılmış, bulanıklık şeklinde gözlenen sonuç bakterinin hareketli olduğu, sadece inokülasyon hattında gözlenen bakteri gelişimi ise hareketsiz olduğunu gösterir. 09.02. Yaş Preparasyon Tekniği Normal bir lam üzerine, 2 3 öze dolusu bakteri kültürü aktarılır. Lam üzerindeki bu kültür sıvısının kenar kısmından, yaklaşık 45 o 'lik bir eğimle bir lamel temas ettirilerek yavaşça lam üzerine kapatılır. Bu aşamada lam ile lamel arasında meydana gelebilecek hava kabarcıklarının engellenmesine dikkat edilmelidir. Bu şekilde hazırlanan preparatta, lamel üzerine immersiyon yağı damlatılarak hiç bekletilmeden, mikroskopta 100 'lük objektif kullanılarak incelenir. Bu yöntem, tercihen çukur lam kullanılarak asılı damla testi ile yapılmalıdır. Asılı damla yönteminde kenarlarına ince bir hat ile vazelin sürülmüş lamelin üzerine 1 damla kültür konulur. Çukur lamın çukur kısmı bu damla üzerine gelecek şekilde kapatılır ve vazelin lam ile lamelin yapışmasını sağlar. Lam yavaşça ters çevrilir ve lamel üzerine 1 damla sedir yağı damlatılıp immersiyon objektifi ile incelenir. 09.03. Flagella Boyama Yöntemi İle Mikroskobik Hareketlilik Testi Flagella sayısı ve dizilişi hakkında bilgi sahibi olmak amacı ile flagella boyaması yapılır. Bu yöntemde kullanılacak lamlar çok temiz olmalıdır. Bunun için önce sıcak deterjanlı su ile yıkanır. Ardından kuvvetli NaOH veya KOH çözeltisinde bekletilir. Sonra zayıf HCl ile yıkanarak saf sudan geçirilir ve etil alkol içerisinde kullanılana kadar bekletilir. Kullanılacağı zaman, bir pens yardımı ile alınarak alevde yakılır ve boya sehpasına konularak soğutulur. 18-24 saatlik genç ve hareketli bakteri kültüründen pastör pipeti ile bir damla alınıp lam üzerine aktarılır ve örnek lam sağa sola hareket ettirilmek suretiyle yayılır. Yayma işlemi sırasında kesinlikle öze kullanılmamalıdır. Preparat havada kendi halinde kurutulur ve Gray 'ın mordan çözeltisi damlatılarak 10 dakika süre ile bekletilir. Mordan boyanın mikroorganizmaya daha iyi nüfuz etmesini sağlayan bir maddedir. Daha sonra lam hafifçe eğilerek su ile yıkanır, Karbol fuksin damlatılarak 5 dakika süre ile boyanır. Su ile dikkatlice yıkanarak havada kurutulur. İmmersiyon yağı damlatılır ve 100 'lük objektifte incelenir. Flagella mikroskopta kırmızı olarak görülür. Gray 'ın Mordan Çözeltisi ; Potasyum şapı (suda doymuş çözeltisinden) 5 ml ; Tannik asit (%20 'lik çözelti) 2 ml ; Civa klorid (suda doymuş çözeltisinden) 2 ml bileşimindedir. Bu maddelerin tamamı karıştırılarak hazırlanır. 10. Karbohidrat Fermantasyon Testi

Fermantasyon, anaerobik, fakültatif anaerobik ve mikroaerofilik bazı mikroorganizmalar tarafından gerçekleştirilen anaerobik bir biyolojik oksidasyondur. Mikroorganizmalar, ortamda bulunan çeşitli organik maddeleri değişik şekillerde fermente ederek, geliştikleri ortamda hem okside hem de redükte bazı son ürünler oluştururlar. Bakteriler belirli karbohidratları belirli şekillerde metabolize ederler. Bunun sonucunda fermantasyon ürünü olarak çeşitli asitler, nötral ürünler ve gazlar çıkabilir. Karbohidrat fermantasyon testlerinde, test edilecek karbohidratlar eklenerek hazırlanmış olan Karbohidrat Broth Base hazır besiyerinden yararlanılır. 5 'er ml olacak şekilde tüplere dağıtılan besiyeri sterilize edildikten sonra, 0,1 ml 'lik karbohidrat çözeltisi ilave edilerek hazırlanır. Karbohidrat çözeltisi 2,5 g / 10 ml konsantrasyonunda hazırlanarak filtrasyon ile sterilize edilmelidir. Tanımlanacak bakteri kültüründen öze ile hazırlanmış olan besiyerine aşılama yapılarak optimum sıcaklıkta 5 güne kadar inkübe edilir. Besiyeri renginin değişmesi asit oluşumunu yani test edilen karbohidratın kullanıldığını gösterir. Reaksiyon genellikle ilk 24 48 saat içinde tamamlanır. Karbohidrat testlerinde reaksiyon her gün izlenmeli ve pozitif sonuç alındığında analize son verilmelidir. Bazı bakterilerin denenmekte olan karbohidratları kullanma aktivitelerinin yanı sıra, proteolitik aktiviteleri de çok yüksektir. Bunlar karbohidratları çok kısa bir sürede kullanarak besiyeri ph 'sını hızla düşürürler. ph indikatörü olan fenol red kullanımı nedeniyle kırmızı olan besiyeri rengi, ph 'nın düşmesi nedeni ile sarıya döner. Karbohidratın tüketiminden sonra besiyeri bileşimindeki peptonların kullanımına bağlı olarak bu kez ph yükselir ve renk tekrar kırmızıya döner. Bu sahte sonuçlardan sakınmak için karbohidrat fermantasyon testlerinde reaksiyon sık sık kontrol edilmelidir. 11. Hemoliz Testi Bazı bakteriler sahip oldukları çeşitli tipteki hemolizin enzimleri ile, kandaki hemoglobini farklı derecelerde hemoliz etme yani parçalama yeteneğine sahiptirler. Bakterilerin hemoliz yeteneği kanlı agar besiyeri kullanılarak test edilebilmektedir. Hemoliz testi, daha çok streptokok ve stafilokokları kendi içlerinde ayırmak için kullanılmaktadır. Streptokoklar Kanlı Agar besiyerinde α-, β- ve γ-hemolitik reaksiyon verirler. α-hemolitik streptokokların kanlı agar besiyerinde oluşturdukları kolonilerin etrafında, kenarları keskin hatlı olmayan, bulanık ve yeşilimsi bir zon oluşur. β- hemolitik streptokoklar, aynı besiyerinde tam hemoliz yaparak, kolonilerin etrafında düzgün bir hatla çevrilmiş temiz ve berrak bir hemoliz zonu oluşturur. γ-hemolitik streptokoklar ise hemolizin enzimine sahip olmayan, kanlı agar besiyerinde hemoliz oluşturmayan streptokoklardır. 18 24 saatlik bakteri kültüründen kanlı agar besiyerine tek koloni düşürülecek şekilde öze ile sürülerek ekim yapılır ve optimum sıcaklıkta 1 7 gün süre ile inkübe edilir. Besiyerinde gelişen koloniler, etrafında oluşturduğu hemoliz zonu yönünden her gün incelenir. 12. Lisin Dekarboksilaz Testi

Lisin Dekarboksilaz Broth besiyeri ve kontrol olarak hazırlanan, lisin içermeyen aynı besiyerine bir öze dolusu kültür aşılanarak optimum sıcaklıkta 48 saat inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonunda kontrol amaçlı hazırlanan besiyerinin sarı, Lisin Dekarboksilaz Broth besiyerinin viyole rengi olması lisin dekarboksilasyonu pozitif, her iki besiyerinin de sarı olması ise lisin dekarboksilasyonu negatif olarak değerlendirilir. Aynı deneme Lisin Iron Agar besiyeri kullanılarak da yapılabilir. Lisin Iron Agar besiyerine ekim, yatık agar yüzeyine sürme ve dibine daldırma şeklinde yapılır. İnokülasyon sonrası tüplere 1' er ml steril sıvı parafin ilave edilir. Optimum sıcaklıkta 24 saat inkübasyon sonunda oluşabilecek reaksiyonlar aşağıda verilmiştir. Yatık Agarın dip kısmında meydana gelen reaksiyonlar: Sarı : Lisin dekarboksilasyonu negatif Viyole : Lisin dekarboksilasyonu pozitif Siyah : Hidrojen sülfür oluşumu Yatık Agarın yüzey kısmında meydana gelen reaksiyonlar: Kırmızıkahverengi : Lisin deaminasyonu (Providencia, Proteus ssp.) Ticari Moller besiyeri kullanılarak lisin yanında ornitin ve arjinin dekarboksilasyon testleri de yapılabilir. Aktif kültür ile aşılanan besiyeri optimum sıcaklıkta 24-96 saat süreyle inkübasyona bırakılarak inkübasyon sonrası oluşan reaksiyon incelenir. Besiyerinin rengi menekşe-mor ise dekarboksilaz pozitif, sarı ise negatif olarak değerlendirilir. 13. ONPG (β-galaktozidaz) Testi Laktozlu bir besiyerinde geliştirilmiş olan kültürden bir öze dolusu alınarak 0,25 ml fizyolojik tuzlu su ile süspanse edilir. Bu süspansiyonun üzerine 0,25 ml Ortho Nitrofenol β-d- Galaktopronosid (ONPG) Peptonlu Su besiyeri ilave edilerek optimum sıcaklıkta 3-4 saat inkübasyona bırakılır. Bu sürenin sonunda tüplerde sarı rengin meydana gelmesi pozitif, renk değişikliğinin olmaması ise negatif olarak değerlendirilir. ONPG, enterik bakterilerde β-galaktozidaz varlığının belirlenmesi amacı ile kullanılır. Özellikle laktozu fermente edebilen Salmonella arizonae ve Citrobacter 'in diğer Salmonella türlerinden hızlı bir şekilde ayrımında faydalanılır. Salmonella arizonae β-galaktozidaz pozitif, diğer Salmonella türleri ise negatiftir. ONPG Peptonlu Su hazırlamak için (a) çözeltisi olarak ; 100 ml distile su içinde 10,0 g Tripton ve 5,0 g NaCl eritilerek ph 7,5 'e ayarlanır ve 121 o C 'da 15 dakika süre ile sterilize edilir. (b) çözeltisi ise O-Nitrophenyl-β-D-Galaktopyranosid 'den 0,6 gram alınarak 100 ml 0,01 M Sodyum Fosfat Tampon (ph 7,5) da çözülür. 0,45 µm porlu filtreden geçirilerek sterilize edilir. Daha sonra 30 ml (a) ve 10 ml (b) çözeltisinden alınarak karıştırılarak aseptik koşullar altında steril tüplere 2 'şer ml dağıtılır. 14. Üre Testi Üre Broth besiyerine öze ile inokülasyon yapılarak, optimum sıcaklıkta 24 saat süre ile inkübasyona bırakılır. Besiyeri rengi hafif kırmızıdan siklamen pembeye dönerse pozitif, bir

değişiklik olmazsa negatif olarak değerlendirilir. Üre testi sırasında bir başka Üre Broth besiyerine pozitif kontrol olarak Proteus, bir başka besiyerine de negatif kontrol olarak E. coli inoküle edilir, ayrıca bir tüp Üre Broth besiyeri şahit olarak kullanılır. İnkübasyon sonunda 4 tüpün rengi kontrol edilir. Şahit tüp sarımsı kırmızı renkte, pozitif kontrol kırmızı renkte, negatif kontrol sarı renkte olmalıdır.