ÖZEL YÖNTEMLERLE SAPTANAN PARAZİTLER Prof. Dr. SİBEL ERGÜVEN H.Ü.T.F Tıbbi Mikrobiyoloji AD
Cryptosporidium parvum 1907 Tyzzer farelerde İnsandan ve birçok hayvandan izole İlk insan Cryptosporidiosis i 1976 yılında AIDS le birlikte önemi
10-50 ookist enfeksiyon yapabilir Genotip 1: insan-insan geçişi ( C. hominis) Genotip 2: zoonotik geçiş (C. parvum) Ookistler konaktan atıldığında enfektif.
Ookistler tatlı su tuzlu su Aylarca enfektif (ph:3-10) Göl dere yüzme havuzlarında yüzme İlk besin kaynaklı salgın: Kontamine elma suyu tüketimi (elmaların toplanma sırasında dışkıyla kontaminasyonu) Tavuk salatası Deniz kabukluları kaynak mı?
Su Kaynaklı Salgınlar Milwaukee Mart-Nisan 1993 400.000 kişi 69 ölüm
Şehir şebeke suyundan kaynaklanan salgın İmmün yetmezlikte ağır klinik tablo C.parvum genotip I (C.hominis) sorumlu Su kaynaklı epidemilerin sebebi; -Parazitin kaynak sularındaki prevalansının yüksek olması, -Klora dirençli olması, -İçme suyu filtrelerinden geçebilmesi, -Çok az sayıda parazitin bile enfeksiyona neden olabilmesidir. İçme suyunda kabul edilebilir ookist 1/10lt
C.parvum,diğer hücre içi parazitlerden farklı olarak mide ve barsak mukozal epitel hücrelerinin mikrovillus (apikal)bölgelerinde yaşar. Parazitin yerleştiği ve konak hücre orjinli bu bölgeye parazitofor vakuol denir.
İmmün sistemi baskılanmış kişilerde: Asemptomatik Geçici infeksiyon Kronik diyare Fulminant infeksiyon İmmün sistemi normal kişilerde: Asemptomatik Akut self-limited diyare Persistan
Ekstraintestinal tutulum CD 4 + T hücre: >200 hücre / mm 3 Spontan rezolüsyon <100 hücre / mm 3 Kronik ve ekstraintestinal <50 hücre / mm 3 Fulminant
Cryptosporidium parvum Tanı Mikroskobik inceleme Formol-eter çöktürme (500g-10 dakika) * en sık Sheather in şeker sol. yüzdürme Modifiye aside dirençli boyama Kinyoun aside dirençli boyama Safranin Fluoresan boyalar( Auramine-Rhodamin) Dışkı (sulu dışkıda daha fazla ookist) Duodenal sıvı Biyopsi Dışkıda antijen arama testleri (ELISA, DFA, İmmünokromotografik yöntemler) Doğrulama testi Triage Parazit Panel (E. histolytica, G. intestinalis, C. parvum) Moleküler yöntemler ( Entamoeba, Giardia, Cryptosporidium, Dientamoeba- Real Time PCR)
Modifiye Aside Dirençli Ziehl-Neelsen Boyama Yöntemi Etil-asetat çöktürme yöntemi sonrası yayma Karbol fuksin 5 dakika Lamlar 5 dakika boyunca alev yardımıyla alttan ısıtılır Boyanın fazlası dökülüp çeşme suyu ile yıkanır. %5 lik sülfürik asit ile 30-60 saniye dekolarizasyon yapılır. Çeşme suyu ile yıkanır. Loeffler in metilen mavisi ile 1 dakika boyanır.
4-5 µm. çapında, yuvarlak, içlerinde koyu granüller bulunan yapılar.
Kinyoun Aside Dirençli Boyama Yöntemi Etil-asetat çöktürme yöntemi sonrası yayma Saf metanol ile 1 dakika fiksasyon Kinyoun karbol fuksin 5 dakika %50 etanol 3-5 saniye %1 lik sülfürik asit 2 dakika Loeffler in metilen mavisi 1 dakika
Safranin boyama yöntemi
Direkt Floresan Antikor Testi Monoklonal antikorlar ile reaksiyona giren parazit antijeninin floresansının saptanması ile tanı konmaktadır. Yüksek duyarlılık, özgüllük referans test Cryptosporidium/Giardia DFA Kit -Hızlı, 30 dakikada sonuç -Boyama yöntemlerinden ve EIA den daha duyarlı
Direkt Floresan Antikor Testi Sarı ok Cryptosporidium Kırmızı Giardia
Cyclospora cayetanensis 1979 (Ashford) Mavi yeşil alg benzeri organizma Cyanobacterium benzeri organizma Büyük Cryptosporidium Enterositlerin supranükleer bölgesinde intrasitoplazmik parazitofor vakuolde yerleşir Dışkıyla sporlanmamış ookistler (8 10 µm) atılır. 7 13 günde infeksiyöz hale gelir.
Seyahat diyaresi (Nepal, Haiti, Peru, Pakistan, Meksika, Endonezya, Hindistan) İmmün sistemi sağlam ve baskılanmış kişilerde diyare
Bulaş: Fekal-oral İnk per: 2-11 gün Ookistlerin eksistasyonu, sporozoitlerin ince barsak epitel hücrelerine girişi İnsidans; mevsimsel özellik yağmurlu ve sıcak havada artış
Besin Kaynaklı Salgın Guatemala dan ithal ahududuya bağlı salgın (1994 te ilk, 1400 kişi) - Kontamine suyla insektisid hazırlama - Sulama Salata, çilek, fesleğen, marul
Geç bahar ve yaz
Su Kaynaklı İlk Salgın Chicago Hastane yurdunda kalan doktorlar arasında Su dağıtan tankerdeki pompa kaynaklı Nepal Şehir şebeke suyu kaynaklı (klora rağmen)
Sulu diyare sekretuar yapıda (1-3 hafta) AIDS te (12 haftaya kadar süren diyare, ekstraintestinal tutulum) Kabızlık Yorgunluk Bulantı-kusma Abdominal kramp Düşük ateş Kilo kaybı İnce barsağın proksimal kısmı D-ksiloz emilim bozukluğu
50 yaş kadın Tr. J. Med. Scien. 1998; 28: 557-558
30 yaş kadın MAF, Otofloresans 62 yaş erkek
31 yaş erkek Uzun süren diyare, hafif ateş Alerji nedeniyletmp-smx tedavisi almamış. Albendazol Cyclospora, Reiter Sendromunda tetiği çeken neden mi??
58 yaş erkek Diyare, hafif ateş Tüm ailede diyare Guatemala dan gelmiş ahududu ile yapılmış tatlı yeme öyküsü Cyclosporanın indüklediği immün cevap, GBS a yol açmış olabilir mi?
Çoklu dışkı örneği, duodenal aspirat, biyopsi MAF Konsantrasyon Santrifüj (10 dk 500x g) Dekolarizasyon (%1 H 2 SO 4 ) Sarı ok: Cyclospora Kırmızı ok: Cryptosporidium
Safranin Turuncu-kırmızı boyanma Otofloresans 450-490 nm yeşil 365 nm mavi
Moleküler Tanı PCR Sporlanmış ve sporlanmamış ookistleri ayırt edemediğinden Epidemiyolojik çalışmalarda kullanım kısıtlı Eimeria ile çapraz amplifikasyon RT-PCR
Cystoisospora belli İlk kez 1860 (Virchow) Tropikal ve subtropikal bölgeler Distal duodenumun ve proksimal jejunumun epitelyal hücrelerinde gelişim. Dışkıda immatür ookist Elipsoidal ookist (20 30 µm uzunluk, 10 19 µm genişlik)
Olgun ookistler ile fekaloral bulaş İnk per: 6-7 gün Epitel hücrelerinde aseksüel ve seksüel üreme Dışkı ile atılan ookist 24-48 saat infektif değil
Normal bireylerde hafif gastrointestinal semptomlar Seyahat diyaresi Sulu diyare Karın ağrısı Kilo kaybı Malabsorbsiyonu Steatore (Giardiasisi taklit) Periferal eozinofili AIDS te şiddetli ilerleyici tipte enterokolit, ekstraintestinal tutulum (Lenf nodu, safra kesesi) Kronik intermitan enfeksiyonlarda eozinofili varlığında akla gelmeli!
Intestinal protozoa and helminths in the peoples of Western (Anatolia) Turkey. Kuntz RE, Lawless DK, Langbehn HR Am J Trop Med Hyg. 1958 May;7(3):298-301 349 asker dışkısında araştırılmış Yurdumuzda ilk defa rastladığımız iki Isosporiasis belli vakası Töreci K, Büget E İst Tıp Fak Mecm 1976 39: 578-580 7 yaş Akc tbc olgu 12 yaş diyare
32 yaş erkek, 10 yıl önce transplant 27 yaş erkek, 5 yıl önce transplant
12 yaş, erkek Köy taraması sırasında saptanmış
Dışkı (Çoğaltma) Biyopsi materyali Bazen dışkı (-), biyopsi (+) MAF ile ookistler Otofloresans Charcot-Leyden kristalleri
Microsporidia
Microsporidia İlk insan enfeksiyonu 1959 1959-1985 arası 10 olgu bildirilmiş Zorunlu intraselüler Basit ökaryotik organizma? Mitokondri,golgi membranı, peroksizom yok Mantarlara daha yakın
İntestinal infeksiyonlara yol açan cinsler: Enterocytozoon Enterocytozoon bieneusi İnce barsakta enterositleri infekte eder sitoplazmada çoğalır Encephalitozoon Encephalitozoon intestinalis Epitelyal, endotelyal hücreler, fibroblast, makrofajları infekte eder. Parazitofor vakuolde çoğalır.
AIDS li hastalarda ; Kansız, mukussuz şiddetli diyare Kilo kaybı D-ksiloz, Vitamin B12 malabsorbsiyonu Bağırsak epitel hücrelerin altına invazyon ekstraintestinal enfeksiyon CD 4 < 100 hücre /mm 3 Cryptosporidium ile birlikte kronik diyare Latent infeksiyonun reaktivasyonu?
Sindirim yolu ile sporların (1.5 2 µm) alınması İnhalasyon? İnfektif sporların polar tübül aracılığı ile konak hücre sitoplazmasına girişi İnfektif sporların dışkı ile atılması
Enterocytozoon bieneusi Encephalitozoon intestinalis (septata intestinalis) Su ve besin kaynaklı salgınlar
33 yaş, erkek Şiddetli diyare, solunum sistemi şikayetleri Dışkıda Microsporidia sporları, Cryptosporidium ookistleri (MAF, Modifiye Trikrom) Balgamda Cryptosporidium ookistleri Kardiyopulmoner arrest
Microsporidia Tanı Mikroskobik inceleme Weber in Modifiye Trichrome Boyama yöntemi Ryan Modifiye Trichrome Boyası Asit-Fast Trichrome boyası Gram-Chromotrope Fluoresan boyalar (Calcofluor beyazı,uvitex2b) Dışkı için birden fazla tanı yöntemi uygulanmalıdır. Dışkıda antijen aranması ( ELISA, IFAT) TEM Moleküler tanı
Microsporidia Tanı Zenginleştirme yöntemi taze dışkıda tercih edilmez spor sayısında azalmaya yol açar %5-10 formollü dışkı 10 dakika 500g de santrifüj spor saptanma olasılığını arttırır Santrifüj öncesi mukolitik ajan 1:1 %10 KOH kromotrop 2R boyanma duyarlılığında artış
Weber in Modifiye Trichrome Boyası Boya sporlara çok zor girdiği için yoğun Chromotrope 2R kullanılır. Saf metanol 5 dakika Chromotrope 2R 90 dakika Asit-alkol 10 saniye %95 lik etanol 5 dakika %100 lük etanol 10 dakika %100 lük etanol 10 dakika Saf ksilen 10 dakika
Fluoresan Boyalar Calcofluor White Uvitex 2B Spor duvarının endospor tabakasındaki kitine bağlanarak mavi-beyaz fluoresan verir. Kitin içeren diğer mikroorganizmalar, özellikle mantar sporları da bu boyalarla boyanabildiklerinden ayırıcı tanı önemlidir.
Calcofluor White Boyama Yöntemi Etil-asetat çöktürme yöntemi sonrası yayma Saf metanol 10 dakika fiksasyon 1 damla Calcofluor 5 dakika PBS ile 1-2 saniye yıkanır Evans Blue 30 saniye Modifiye trikrom veya TEM ile doğrulama önerilir.
IFA (indirect immunofluorescence assay) anti-enterocytozoon bieneusi monoclonal antikor anti-encephalitozoon intestinalis monoclonal antikor Dışkıda antijen aranması Enterocytozoon bieneusi Encephalitozoon intestinalis
Strongyloides stercoralis
Strongyloides stercoralis İlk kez 1876 yılında Vietnam dan dönen ishalli askerlerin dışkılarında Tropikal bölgelerde daha sık Strongyloidosis e sebep olan intestinal bir nematod 30-100 milyon kişi enfekte Özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde ölüme neden olabilir.
kontamine toprakta ya da sularda bulunan enfektif larvaların deriden vücuda girmesi
Strongyloides stercoralis Klinik : Asemptomatik * en sık İştahsızlık, diyare, abdominal ağrı vs. Malabsorbsiyon, obstrüksiyon Larvaların akciğer göçü Pulmoner semptomlar (Löffler Sendromu) Deriye penetre olduğu bölgelerde kaşıntılı ve papüler eritematöz döküntüler, larva currens Eozinofili *tek bulgu olabilir
Strongyloides stercoralis İmmünitesi baskılanmış kişilerde dissemine enfeksiyona ve hiperenfeksiyon sendromuna yol açabilir Hiperenfeksiyon sendromu bağırsak içindeki filariform larvaların sayısının aşırı artışı, başta akciğerler olmak üzere bağırsak dışı organlara göçü Dissemine enfeksiyon larvaların beyin gibi normal yaşam döngüsü dışındaki organlara göçü Bağışıklığı baskılayacak ilaç kullanılan her hastada önceden Strongyloides araştırılmalıdır.
Strongyloides stercoralis Tanı : İnatçı diyare Eozinofili Dışkı, duodenum sıvısı, balgam larvaların görülmesi
Strongyloides stercoralis tanı Dışkıda larva gözlenmesi (yumurta nadiren izlenir) Kancalı kurt larvaları ile morfolojik olarak benzerlik gösterir
Strongyloides stercoralis Tanı : Ardışık 3 dışkı örneği Duyarlılık %50 Ardışık 7 dışkı örneği Duyarlılık ~%100 Özel yoğunlaştırma yöntemleri uygulanabilir (Baerman, Haradi-Mori ) Agar kültür yöntemi
Baermann Tekniği Az sayıda parazit içeren dışkı ve toprakta larva incelenmesinde kullanılır. Huni içerisine yerleştirilen taze dışkıda bulunan larvalar dışkıyı terkedip alt kısımda toplanırlar. Fazla miktar dışkı kullanılabilir, Az larva bulunan hafif enfeksiyonlarda larva saptama şansı yüksektir
Harado-Mori Filtre Yöntemi Tüpte filtre kağıdı yöntemi Taze dışkı gerekir Dışkı ilave edilen filtre kağıdı ve kağıdın konduğu dibinde su bulunan tüp kullanılır Nematod yumurtaları açılarak larvalar gelişir ve suya ilerler
Agar Plak Kültür Yöntemi Diğer yöntemlerden daha duyarlıdır. Taze dışkı, agar plağına ekilerek iki gün oda sıcaklığında tutulur. Larva agar üzerinde hareket ederken bakterileri de taşır ve görünür izler oluşur. Mikroskopla incelenerek larva varlığı gözlenir Doğrulama için, plaklar %10 formalinle yıkanır ve sediment ıslak preparat şeklinde incelenir
Duodenal aspirasyon String kapsül metodu (enterotest) Dissemine enfeksiyonda balgam ya da BAL örneği
TEŞEKKÜRLER