YÜKSEK LİSANS TEZİ BAZI BİTKİ ÖRNEKLERİNDE ANTİOKSİDAN KAPASİTENİN SPEKTROFOTOMETRİK VE KROMATOGRAFİK TAYİNİ

Transkript

1 İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAZI BİTKİ ÖRNEKLERİNDE ANTİOKSİDAN KAPASİTENİN SPEKTROFOTOMETRİK VE KROMATOGRAFİK TAYİNİ Leyla YILDIZ Kimya Anabilim Dalı Analitik Kimya Programı Danışman Yrd. Doç. Dr. Kevser SÖZGEN BAŞKAN II. Danışman Prof. Dr. Reşat APAK Haziran, 2007 İSTANBUL

2 İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAZI BİTKİ ÖRNEKLERİNDE ANTİOKSİDAN KAPASİTENİN SPEKTROFOTOMETRİK VE KROMATOGRAFİK TAYİNİ Leyla YILDIZ Kimya Anabilim Dalı Analitik Kimya Programı Danışman Yrd. Doç. Dr. Kevser SÖZGEN BAŞKAN II. Danışman Prof. Dr. Reşat APAK Haziran, 2007 İSTANBUL

3

4 Bu çalışma İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Yürütücü Sekreterliğinin T919/ numaralı projesi ile desteklenmiştir.

5 ÖNSÖZ Yüksek lisans öğrenimim boyunca birikimlerini benimle paylaşan ve olumlu düşünceleriyle beni teşviklendiren tez danışmanım Yrd. Doç. Dr. Kevser Sözgen BAŞKAN a, ulusal ve uluslararası kimya alanında önemli bir yere sahip olan değerli hocalarım, ikinci danışmanım Prof. Dr. Reşat APAK a ve Prof. Dr. Esma TÜTEM e, aynı süre boyunca desteklerini, yardımlarını esirgemeyen ve özellikle lisans öğrenim boyunca deneysel uygulamalarda önemli bir tecrübe kazandığım Doç. Dr. Erol ERÇAĞ ve Ar. Gör. Ayşem ARDA ya, birlikte çok şey paylaştığımız değerli arkadaşım ve meslektaşım Şeyda KARAMAN a ve daha ismini sayamadığım sevgili hocalarıma, arkadaşlarıma ve değerli aileme en içten dileklerimle teşekkür ederim. Tezimle aynı ismi taşıyan T919/ sayılı projeme maddi destek sağlayan İ.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Yürütücü Sekreterliği ne teşekkür ederim. 105T402 nolu, Antioksidanlar ve PolinitroAromatikler için Spektrofotometrik Yöntem Tasarımı isimli araştırma projesi ile, tezim sırasında bana burs sağlayan TÜBİTAK a teşekkür ederim. Haziran, 2007 Leyla YILDIZ i

6 İÇİNDEKİLER ÖNSÖZ... i İÇİNDEKİLER... ii ŞEKİL LİSTESİ... vi TABLO LİSTESİ...x SEMBOL LİSTESİ... xii ÖZET... xiii SUMMARY...xv 1. GİRİŞ GENEL KISIMLAR SERBEST RADİKALLER VE ANTİOKSİDANLAR DOĞAL ANTİOKSİDANLAR C Vitamini E Vitamini Karotenoidler Polifenolik Bileşikler Flavonoidler Fenolik Asitler Fenolik Polimerler (Tanenler) ÇALIŞILAN BİTKİLERİN SAĞLIK ÜZERİNDEKİ ŞİFALI ETKİLERİ VE ETKEN BİLEŞİKLERİ Civanperçemi ( Achillea millefolium ) Arslanpençesi ( Alchemilla xantochlora ) Dereotu ( Anethum graveolens ) Kereviz ( Apium graveolens ) Nane ( Mentha piperita )...21 ii

7 Mercanköşk ( Origanum sp. ) Maydanoz ( Petroselinum crispum ) Adaçayı ( Salvia triloba ) Kekik ( Thymus sp. ) Ihlamur ( Tilia sp. ) Isırgan ( Urtica sp. ) TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİN YÖNTEMLERİ CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity; Cu(II) İyonu İndirgeme Antioksidan Kapasite) Yöntemi TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity; Troloks Eşdeğeri Antioksidan Kapasitesi) / ABTS Yöntemi FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power; Demir(III) İyonu İndirgeyici Antioksidan Gücü) Yöntemi Folin Ciocalteu Yöntemi TRAP (Total Radical Trapping Parameter; Toplam Radikal Tutma Parametresi) Yöntemi Luminol Yöntemi Diklorofloresindiasetat (DCFHDA) Yöntemi Fikoeritrin (PE) Esaslı Yöntemler Krosin Yöntemi DPPH Yöntemi ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity; Oksijen Radikal Absorbans Kapasitesi) Yöntemi TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity; Toplam Oksiradikal Süpürme Kapasitesi) Yöntemi Siklik Voltametri Yöntemi BİTKİLERDE TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİNİNDE KULLANILMIŞ OLAN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER VE HPLC UYGULAMALARI MALZEME VE YÖNTEM KULLANILAN CİHAZLAR KİMYASAL MADDELER...39 iii

8 Çözeltilerin Hazırlanması BİTKİ ÖRNEKLERİNİN ANALİZE HAZIRLANMASI Bitki Örneklerinin Kurutulması Bitki Örneklerinin Ekstraksiyonu Kurutulmuş Bitki Örneklerinin Ekstraksiyonu Yaş Maydanozda C Vitamini Analizi İçin Ekstraksiyon Bitki Örneklerinin İnfüzyonu (Demlenmesi) Bitki Örneklerinin Hidrolizi Bitki Ekstraktlarının Hidrolizi Katı Bitki Örneklerinin Hidrolizi Demlenmiş Bitkilerin Hidrolizi SENTETİK KARIŞIMLARIN HAZIRLANMASI Sentetik Karışım Sentetik Karışım UYGULANAN YÖNTEMLER Spektrofotometrik Yöntemler CUPRAC Yöntemi ABTSPersülfat Yöntemi Kromatografik Analizler HPLC Analizi BULGULAR BAZI ANTİOKSİDANLARIN KALİBRASYON DOĞRULARI VE Cu(I)Nc KELATININ GÖRÜNÜR BÖLGE SPEKTRUMLARI Mirisetin İzokuersitrin Luteolin Kamferol Apigenin Rozmarinik Asit BAZI ANTİOKSİDANLARIN MOLAR ABSORPLAMA KATSAYILARI VE TEAC DEĞERLERİ...54 iv

9 4.3. HPLC İLE ANTİOKSİDANLARIN KALİBRASYON DOĞRULARININ OLUŞTURULMASI BİTKİ ANALİZLERİNİN SONUÇLARI Maydanoz ( Petroselinum sativum ) Kereviz Yaprağı ( Apium graveolens ) Nane ( Mentha piperita ) Isırgan ( Urtica dioica ) Adaçayı ( Salvia triloba ) Ihlamur ( Tilia rubra ) Arslanpençesi ( Alchemilla xantochlora ) Dereotu ( Anethum graveolens ) Civanperçemi ( Achillea millefolium ) Mercanköşk ( Origanum majorona ) Kekik ( Thymus vulgaris ) SENTETİK KARIŞIMLARIN ANALİZ SONUÇLARI Sentetik Karışım Sentetik Karışım TARTIŞMA VE SONUÇ...94 KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ v

10 ŞEKİL LİSTESİ Şekil 2.1 : Reaktif oksijen türlerinin çeşitli doku, organlarda neden olduğu hastalıklar ve hasarlar...5 Şekil 2.2 : Askorbik asitte meydana gelen redoks reaksiyonları...6 Şekil 2.3 : αtokoferol ün kimyasal yapısı...7 Şekil 2.4 : βkaroten, likopen ve lutein in kimyasal yapıları...8 Şekil 2.5 : Flavonoidlerin genel yapısı...10 Şekil 2.6 : Flavonol, flavon, flavanon, flavanol, izoflavon ve antosiyanidin in kimyasal yapıları...11 Şekil 2.7 : Kuersetin, rutin, izokuersitrin, kamferol, mirisetin ve izoramnetin in kimyasal yapıları...11 Şekil 2.8 : Apigenin, luteolin ve krisin in kimyasal yapıları...12 Şekil 2.9 : Kateşin, epikateşin, epigallokateşin, epikateşin gallat ve epigallokateşin gallat ın kimyasal yapıları...12 Şekil 2.10 : Naringin, naringenin, hesperidin, hesperetin ve eriodiktol ün kimyasal yapıları...13 Şekil 2.11 : Daidzein ve genistein in kimyasal yapıları...13 Şekil 2.12 : Siyanidin, malvidin, apigenidin ve delfinidin in kimyasal yapıları...14 Şekil 2.13 : Hidroksi sinnamik asitlerin yapıları ve biyosentetik ilişkileri...18 Şekil 2.14 : Rozmarinik asit in kimyasal yapısı...18 Şekil 2.15 : Gallik, protokateşik, vanilik asit in kimyasal yapıları...19 Şekil 2.16 : Fenolik polimerin kimyasal yapısı...20 Şekil 2.17 : Kekik, ıhlamur, ısırgan ve nane bitkilerinin resimleri...24 Şekil 2.18 : Civanperçemi, mercanköşk, dereotu ve adaçayı bitkilerinin resimleri...25 Şekil 2.19 : ABTS.+ radikal katyonunun yapısı...27 Şekil 2.20 : ABTS.+ radikal katyonunun absorbsiyon spektrumu...27 Şekil 4.1 : Mirisetinin kalibrasyon doğrusu...48 Şekil 4.2 : Mirisetinin CUPRAC N spektrumu...48 Şekil 4.3 : İzokuersitrinin kalibrasyon doğrusu...49 Şekil 4.4 : İzokuersitrinin CUPRAC N spektrumu...49 Şekil 4.5 : Luteolinin kalibrasyon doğrusu...50 Şekil 4.6 : Luteolinin CUPRAC N spektrumu...50 Şekil 4.7 : Kamferolün kalibrasyon doğrusu...51 Şekil 4.8 : Kamferolün CUPRAC N spektrumu...51 Şekil 4.9 : Apigeninin kalibrasyon doğrusu...52 Şekil 4.10 : Apigeninin CUPRAC İ spektrumu...52 Şekil 4.11 : Rozmarinik asitin kalibrasyon doğrusu...53 Şekil 4.12 : Rozmarinik asitin CUPRAC N spektrumu...53 Şekil 4.13 : Çeşitli standart antioksidanları içeren sentetik karışımın kromatogramı...57 Şekil 4.14 : Rozmarinik asit standartının kromatogramı...57 vi

11 Şekil 4.15 : Mirisetin standartının kromatogramı...58 Şekil 4.16 : Askorbik asit standartının kromatogramı...58 Şekil 4.17 : Metanolün farklı oranları ve sadece bidistile su ile ekstrakte edilmiş maydanoz örneklerinin spektrumu...60 Şekil 4.18 : Etanolün farklı oranları ile ekstrakte edilmiş maydanoz örneklerinin spektrumu...60 Şekil 4.19 : Asetonun farklı oranları ile ekstrakte edilmiş maydanoz örneklerinin spektrumu...60 Şekil 4.20 : %100 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı...61 Şekil 4.21 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı...61 Şekil 4.22 : % 50 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı...61 Şekil 4.23 : % 100 bidistile su ile ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı...62 Şekil 4.24 : % 100 etanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı...62 Şekil 4.25 : % 70 etanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı...62 Şekil 4.26 : % 50 etanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı...63 Şekil 4.27 : % 70 metanollü maydanoz ekstraktının 2 ve 4 saat hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramları...63 Şekil 4.28 : Kurutulmuş maydanoz örneklerine uygulanan 2 ve 4 saat hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramları...64 Şekil 4.29 : Yaş maydanozda askorbik asit analizi sonucu elde edilen kromatogram...64 Şekil 4.30 : Çeşitli çözücü ve oranları ile ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı örneklerinin spektrumu...65 Şekil 4.31 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı...66 Şekil 4.32 : % 50 metanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı...66 Şekil 4.33 : % 50 etanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı...66 Şekil 4.34 : Kereviz yaprağı ekstrakt hidrolizatlarının ve kurutulmuş örnek hidrolizatının spektrumu...67 Şekil 4.35 : % 70 metanollü kereviz yaprağı ekstraktının 4 saat hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...67 Şekil 4.36 : Kurutulmuş kereviz yaprağına doğrudan uygulanan 4 saat hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...68 Şekil 4.37 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş nane kromatogramı...69 Şekil 4.38 : Kurutulmuş naneye doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...69 Şekil 4.39 : Nane ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu...70 Şekil 4.40 : Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin kromatogramı...70 Şekil 4.41 : Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin sadece asit ile hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...71 Şekil 4.42 : Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin asit+metanol ile hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...71 Şekil 4.43 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş ısırgan kromatogramı...72 Şekil 4.44 : Kurutulmuş ısırgana doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...72 Şekil 4.45 : Isırgan ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu...73 Şekil 4.46 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş adaçayı kromatogramı...74 vii

12 Şekil 4.47 : Kurutulmuş adaçayına doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...74 Şekil 4.48 : Adaçayı ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu...75 Şekil 4.49 : Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin kromatogramı...75 Şekil 4.50 : Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin sadece asit ile hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...76 Şekil 4.51 : Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin asit+metanol ile hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...76 Şekil 4.52 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş ıhlamur kromatogramı...77 Şekil 4.53 : Kurutulmuş ıhlamura doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...77 Şekil 4.54 : Ihlamur ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu...78 Şekil 4.55 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş arslanpençesi kromatogramı...79 Şekil 4.56 : Kurutulmuş arslanpençesine doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...79 Şekil 4.57 : Arslanpençesi ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu...80 Şekil 4.58 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş dereotu kromatogramı...81 Şekil 4.59 : Kurutulmuş dereotuna doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...81 Şekil 4.60 : Dereotu ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu...82 Şekil 4.61 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş civanperçemi kromatogramı...82 Şekil 4.62 : Kurutulmuş civanperçemine doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...83 Şekil 4.63 : Civanperçemi ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu...83 Şekil 4.64 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş mercanköşk kromatogramı...84 Şekil 4.65 : Kurutulmuş mercanköşke doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...85 Şekil 4.66 : Mercanköşk ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu...85 Şekil 4.67 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş kekik kromatogramı...86 Şekil 4.68 : Kurutulmuş kekiğe doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...86 Şekil 4.69 : Kekik ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu...87 Şekil 4.70 : Sentetik Karışım1 in kromatogramı...88 Şekil 4.71 : Sentetik Karışım1 in 2 saat hidrolizi sonucunda elde edilen hidrolizat kromatogramı...88 Şekil 4.72 : Sentetik Karışım1 in 4 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...88 Şekil 4.73 : Sentetik Karışım2 in kromatogramı...89 Şekil 4.74 : Sentetik Karışım2 in 2 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...90 Şekil 4.75 : Sentetik Karışım2 in 4 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...90 viii

13 Şekil 5.1 : Rozmarinik asit standartının 2 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...96 Şekil 5.2 : % 70 metanolde hazırlanan tannik asit çözeltisinin kromatogramı...97 Şekil 5.3 : % 70 metanolde hazırlanan tannik asit çözeltisinin 2 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı...98 ix

14 TABLO LİSTESİ Tablo 2.1 : Flavonoid sınıflarına ait bileşikler, sübstitüsyon konumları ve besin kaynakları...15 Tablo 4.1 : Mirisetin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri...48 Tablo 4.2 : İzokuersitrin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri...49 Tablo 4.3 : Luteolin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri...50 Tablo 4.4 : Kamferol için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri...51 Tablo 4.5 : Apigenin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri...52 Tablo 4.6 : Rozmarinik asit için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri...53 Tablo 4.7 : Çeşitli antioksidanların CUPRAC yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları...54 Tablo 4.8 : Çeşitli antioksidanların ABTS yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları...55 Tablo 4.9 : Çeşitli antioksidanların CUPRAC ve ABTS yöntemlerine göre elde edilen TEAC değerleri...55 Tablo 4.10 : Çeşitli antioksidanların HPLC ile elde edilen doğru denklemleri ve alıkonma zamanları...56 Tablo 4.11 : Maydanoz örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)...65 Tablo 4.12 : Kereviz yaprağı örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)...68 Tablo 4.13 : Nane örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)...71 Tablo 4.14 : Isırgan örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)...73 Tablo 4.15 : Adaçayı örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)...76 Tablo 4.16 : Ihlamur örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)...78 Tablo 4.17 : Arslanpençesi örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)...80 Tablo 4.18 : Dereotu örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)...82 Tablo 4.19 : Civanperçemi örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)...84 x

15 Tablo 4.20 : Mercanköşk örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)...85 Tablo 4.21 : Kekik örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)...87 Tablo 4.22 : Sentetik karışım1 ve hidrolizatlarının toplam antioksidan kapasite değerleri (mm TReşdeğeri)...89 Tablo 4.23 : Sentetik karışım2 ve hidrolizatlarının toplam antioksidan kapasite değerleri (mm TReşdeğeri)...90 Tablo 4.24 : Bitki örneklerinin ve sentetik karışımların toplam antioksidan kapasitesinin HPLC yardımıyla belirlenebilen % si...91 xi

16 SEMBOL LİSTESİ ROS CUPRAC ABTS TEAC HPLC Cu(II)Nc Cu(I)Nc ABTS.+ FRAP TPTZ FCR TRAP AAPH DCFHDA DCF PE DPPH ORAC AUC KMBA CUPRAC N CUPRAC i TR ε t R M v/v w/v eks. hid. met. eta. dem. çöz. : reaktif oksijen türleri : bakır(ii) iyonu indirgeme antioksidan kapasitesi : 2,2 azinobis(3etilbenzotiazolin6sulfonat) : troloks eşdeğeri antioksidan kapasite : yüksek performanslı sıvı kromatografisi : bakır(ii)neokuproin : bakır(i)neokuproin : ABTS radikal katyonu : demir(iii) iyonu indirgeyici antioksidan gücü : tripridiltriazin : Folin Ciocalteu reaktifi : toplam radikal tutma parametresi : azobis (2amido propan)dihidroklorür : diklorofloresindiasetat : diklorofloresin : fikoeritrin : 1,1difenil2pikrilhidrazil : oksijen radikal absorbans kapasitesi : eğri altında kalan alan : αketoγ metiolbutirik asit : normal CUPRAC yöntemi : inkübasyonlu CUPRAC yöntemi : troloks : molar absorplama katsayısı : alıkonma zamanı : molar derişim : hacim/hacim : ağırlık/hacim : ekstrakt : hidrolizat : metanol : etanol : demleme : çözelti xii

17 ÖZET BAZI BİTKİ ÖRNEKLERİNDE ANTİOKSİDAN KAPASİTENİN SPEKTROFOTOMETRİK VE KROMATOGRAFİK TAYİNİ Vücutta çeşitli metabolik reaksiyonlar sonucu oluşan ve bir veya daha fazla eşleşmemiş elektronu olması sebebiyle oldukça reaktif olan serbest radikallerin aşırı miktarları bir çok doku, organ ve sistemlerde hasarlara neden olmaktadır. Bu hasarı sınırlandırmak için vücutta birçok savunma mekanizması geliştirilmiştir ve genellikle besinlerle alınan C ve E vitaminleri, selenyum, βkaroten, likopen, lutein ve diğer karotenoidler de bu savunmaya yardımcı antioksidanlar olarak rol almaktadır. Bunlara ilave olarak flavonoidler gibi ikincil bitki metabolitleri ve terpenoidler de sayılabilir. Bu da antioksidan bileşikler içeren meyve ve sebzelerin yanı sıra geleneksel olarak tıbbi amaçla kullanılan ve antioksidan bileşikler bakımından zengin olan şifalı bitkilerin insan sağlığı açısından önemini ortaya koymaktadır. Son yıllarda, şifalı bitkiler ve bunlardan elde edilen aktif maddeler üzerindeki çalışmalar yoğunlaşmıştır. Bu çalışmada, insanlar tarafından yiyecek veya içecek olarak tüketildiği gibi çeşitli hastalıkların tedavisinde de kullanılan adaçayı, arslanpençesi, civanperçemi, dereotu, ıhlamur, ısırgan, kekik, kereviz yaprağı, maydanoz, mercanköşk ve nane bitkilerinde bulunan antioksidan özelliğe sahip olan temel bileşiklerin ve bunların neden olduğu toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışma üç aşamadan oluşmaktadır. Spektrofotometrik olarak toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesinde Cu(II)neocuproin (2,9dimetil1,10fenantrolin) reaktifinin kullanıldığı, maliyeti düşük, uygulanması basit olan ve kısa sürede gerçekleştirilen genel adı bakır(ii) iyonu indirgeme antioksidan kapasite tayini kısaca CUPRAC yöntemi, karşılaştırma yöntemi olarak ise antioksidan kapasitenin belirlenmesinde yaygın kullanımı olan ABTS/persülfat yöntemi kullanılmıştır. Antioksidan kapasiteye neden olan temel türlerin belirlenmesi ise yine antioksidan özelliğe sahip pek çok bileşiğin tanınmasında kullanılan HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi) yönteminden yararlanılarak yapılmıştır. Bir bitki ekstraktında mevcut antioksidanların tümü belirlenirse, bunların derişimleri denel olarak saptanmış TEAC (troloks eşdeğeri antioksidan kapasite) katsayıları ile çarpılarak ve bu çarpımlar toplanarak ekstraktın kuramsal olarak beklenen toplam antioksidan kapasitesi hesaplanabilir. Eğer HPLC kromatogramından tüm antioksidanlar saptanmış ise bu yolla bulunan kapasite, denel olarak ölçülen antioksidan kapasite ile bağdaşmalıdır. Çalışılan bitki örneklerinin HPLC ile elde edilen kapasite değerleri; CUPRAC yöntemi ile belirlenen kapasite değerlerinin ısırgan ekstraktında % 82 lik; maydanozun farklı hidrolizatlarında % 6077; nane ekstraktında % 63; mercanköşk ekstraktında % 61; kereviz yaprağının farklı hidrolizatlarında % 4157 lik kısmına karşılık gelmektedir. Kromatogramlarda belirlenemeyen türlerin bu sonuca yol açtığı düşünülmektedir. xiii

18 Çalışılan bitki örneklerinin ekstraktlarında CUPRAC yöntemi ile belirlenmiş olan toplam antioksidan kapasitesi sıralaması; arslanpençesi > kekik > ıhlamur > mercanköşk > adaçayı > nane > civanperçemi > kereviz yaprağı> dereotu > ısırgan > maydanoz şeklindedir. xiv

19 SUMMARY SPECTROPHOTOMETRIC AND CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OF ANTIOXIDANT CAPACITY IN SOME PLANT SAMPLES Excessive amounts of free radicals that are produced from various metabolic reactions in the organism and are highly reactive due to their unpaired electrons cause significant damage in tissues, organs and physiological systems. The organism has developed a great many defence mechanisms for restricting this damage, and the foodingested C and E vitamins, selenium, βcarotene, lycopene, lutein and other carotenoids act as antioxidants aiding this defence. Flavonoids as secondary plant metabolites and terpenoids may be considered as additional defense elements. This signifies the importance for human health of the antioxidantrich fruits and vegetables as well as of traditionally used medicinal plants also bearing these antioxidants. In recent years, studies focusing on therapeutic plants and the active principles isolated from them have intensified. In this study, it has been aimed to identify the essential compounds having antioxidant properties contained in a number of food and medicinal plants such as sage, lady s mantle, yarrow, dill, linden, nettle, thyme, celery leaves, parsley, oregano and mint, and to determine the total antioxidant capacity caused by these compounds. The study consists of three parts. For determining total antioxidant capacity, the cupric ion reducing antioxidant capacity assay (abbreviated as the CUPRAC method) that is low cost, easily applied, and rapid, utilizing the copper(ii)neocuproine (2,9dimethyl 1,10phenanthroline) reagent was used, and the results were compared to those found by the ABTS/persulfate assay, the widely used method for antioxidant capacity measurement. For identification and individual quantitation of basic species giving rise to antioxidant capacity, the HPLC (High Performance Liquid Chromatography) method that has also found wide use in the identification of various antioxidant compounds was selected. If all the antioxidants in a plant extract are identified, then the theoretically expected total antioxidant capacity can be calculated by multiplying the concentration of each antioxidant with its TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity) coefficient and summing up the described products. In case when all the antioxidants were successfully identified, from the HPLC chromatogram, then the so calculated theoretically expected capacity should be in accord with the experimentally found antioxidant capacity. The theoretically calculatedwith the aid of HPLCcapacity values of the tested plant samples compensated for the experimentally found CUPRAC capacities at the following percentages: nettle extract 82 %, different hydrolyzates of parsley 6077 %, mint extract 63 %, oregano extract 61 %, and different hydrolyzates of celery leaves 41 xv

20 57 %. It was thought that unestimated species in the chromatograms were responsible for this case. The order of plant samples with respect to CUPRAC total antioxidant capacity was: lady s mantle > thyme > linden > oregano > sage > mint > yarrow > celery leaves > dill nettle > parsley. xvi

21 1 1. GİRİŞ İnsan sağlığı açısından büyük risk oluşturan başta kanser olmak üzere kalp ve damar hastalıkları gibi pek çok hastalığın ortaya çıkma riskini azaltan veya olumlu etkiler gösteren antioksidanlar, günümüzde oldukça ilgi çeken ve üzerinde pek çok araştırmalar yapılan bir konudur [13]. Vücutta çeşitli metabolik reaksiyonlar sonucu oluşan ve bir veya daha fazla eşleşmemiş elektronu olması sebebiyle oldukça reaktif olan serbest radikallerin aşırı miktarları (reaktif oksijen türleri üretiminin, tüketiminden fazla olması oksidatif stres olarak adlandırılır) bir çok doku, organ ve sistemlerde hasarlara neden olur [46]. ROS (Reaktif Oksijen Türleri) düzeylerini ve bunların meydana getirdiği hasarı sınırlandırmak için vücutta birçok savunma mekanizması geliştirilmiştir. Süperoksit dismutaz, katalaz ve glutatyon peroksidaz gibi enzimlerin serbest radikallere karşı savunmada önemli rolleri vardır. C vitamini, E vitamini, selenyum, βkaroten, likopen, lutein ve diğer karotenoidler de yardımcı antioksidanlar olarak kullanılmaktadır. Bunların haricinde flavonoidler gibi ikincil bitki metabolitleri ve terpenoidler de sayılabilir [7,8]. Bu da antioksidan bileşikler içeren meyve ve sebzelerin yanı sıra geleneksel olarak tıbbi amaçla kullanılan ve şifalı bitkiler olarak bilinen bitki türlerinin insan sağlığı açısından önemini ortaya koymaktadır. Bu bitkiler, günümüzde tıbbın tamamlayıcısı olarak ya da alternatif tıpta oldukça geniş kullanım alanı bulmaktadır. En önemli üstünlükleri, ucuz olmaları, kolaylıkla elde edilebilmeleri ve ham olarak ya da basit preparatları halinde kullanılabilmeleridir. Şifalı bitkilerin değişik kısımları (kökleri, yaprakları, dalları/gövdeleri, kabukları, çiçekleri ve meyveleri) genellikle fenolik bileşikler (flavonoidler, fenolik asitler, stilbenler, tanninler, kumarinler, lignanlar ve ligninler) bakımından zengindir. Bunlar antioksidan aktivite de dahil olmak üzere pek çok biyolojik etkiye sahiptir [9].

22 2 İnsan sağlığı açısından önemli olan bu antioksidan bileşiklerin biyolojik sıvı, gıda ve saf bileşiklerde antioksidan kapasitelerini ölçmek amacıyla birçok yöntem geliştirilmiştir [1030]. Bu çalışmada ise daha önce biyolojik bakımdan önemli indirgenler [31], sistein [32], E vitamini [33], C vitamini [34] ve proteinlerin [35] spektrofotometrik tayini için kullanılan, bakır(ii)neokuproin (2,9dimetil1,10fenantrolin) reaktifinin, spektrofotometrik yolla bitki örneklerinin toplam antioksidan kapasitesinin belirlenmesine uyarlandığı maliyeti düşük, uygulanması basit ve kısa sürede gerçekleştirilen [36] ve bazı bitkisel çay ve kayısı örneklerinde [37,38] ve insan serumunda [39] uygulanmış genel adı bakır(ii) iyonu indirgeme antioksidan kapasite tayini kısaca CUPRAC yöntemi, karşılaştırma yöntemi olarak ise antioksidan kapasitenin belirlenmesinde yaygın kullanımı olan ABTS/persülfat yöntemi [40] kullanılmıştır. HPLC ile çok sayıda antioksidan bileşenin mümkün olan en kısa sürede ayrılması ve belirlenebilmesi için uygun sabit faz ve hareketli faz bileşimi öncelikle antioksidan yapay örnekleri kullanılarak saptanmış ve her bir bileşen için ayrı kalibrasyon grafikleri oluşturulduktan sonra bunlardan yararlanarak bitki örneklerindeki antioksidan bileşiklerin kalitatif ve kantitatif değerlendirilmesi yapılmıştır. Sonuç olarak HPLC yöntemi ile belirlenen antioksidan bileşenlerin derişimlerinin troloks eşdeğeri antioksidan kapasite (TEAC) katsayıları (Bir antioksidanın TEAC katsayısı, o antioksidanın 1 mm'lık çözeltisinin indirgeme gücü bakımından eşdeğer olduğu troloks çözeltisinin mm derişimidir) ile çarpılması ile elde edilen toplam antioksidan kapasite, CUPRAC ve ABTS/persülfat yöntemleri ile elde edilen toplam antioksidan kapasite değerleri ile karşılaştırılmıştır.

23 3 2. GENEL KISIMLAR 2.1. SERBEST RADİKALLER VE ANTİOKSİDANLAR Bir veya birden fazla eşleşmemiş elektronu bulunan atom ya da moleküllere serbest radikaller denir. Bu tip maddeler, eşleşmemiş elektronu olması sebebiyle oldukça reaktiftirler. Biyolojik sistemlerde serbest radikaller önemli role sahiptir. Serbest radikaller herhangi bir etkileşime girerek elektron alırlar veya elektron verirler. Bu nedenle, pozitif, negatif veya nötral olabilirler. Oksijen türevi serbest radikaller proteinlere, yağlara, karbonhidratlara ve nükleik asitlere zarar verebilir. Plazma membranları, serbest radikal reaksiyonlarının en önemli hedefidir. Antioksidanlar ise radikal oluşumunun sınırlandırılması, radikal reaksiyonlarının sona erdirilmesi, oluşan radikallerin etkisiz hale getirilmesi ve hasarlı moleküllerin ortadan kaldırılmasından sorumlu moleküllerdir. Reaktif oksijen türlerinin üretimi ve çeşitli antioksidan savunmaları arasındaki dengesizlik, antioksidanların yetersizliğinden ve/veya reaktif oksijen türlerin artan oluşumundan çıkan oksidatif stresle sonuçlanır [41]. Antioksidanlar, yiyecek veya vücutta düşük konsantrasyonlarda bulunduğu zaman, oksidasyonu önemli derecede engelleyen veya geciktiren maddelerdir [42]. Gıda üreticileri gıdaların bozunmasını önlemek ve gıdanın besin değerini korumak amacıyla sentetik gıda koruyucu antioksidanları kullanırlar. Antioksidanlar, biokimyacıların ve sağlık uzmanlarının ilgi konusudur, çünkü reaktif oksijen türlerinin ve dejeneratif hastalıkların neden olduğu zararlara karşı vücudu korumaktadırlar. Antioksidanların yağ moleküllerinin farklı oksidatif kademelerinde rol oynadığı bilinmektedir. Antioksidanlar; oksijen derişimini azaltmada, singlet oksijeni durdurmada, hidroksil radikali gibi başlatıcı radikalleri süpürerek birinci başlatıcı zinciri engellemede, reaktif oksijen türlerinin üretim katalizleyicisi metal iyonlarını bağlamada,

24 4 radikal olmayan bileşiklerin temel ürünlerini bozundurmada ve substratlardan hidrojen alınmasını önlemek amacıyla zincir kırmada görev alırlar. Yağların yükseltgenme derecesi, yağ asidlerinin kimyasal yapısına bağlı olduğu kadar, gıdaların saklanma koşulları ve reaksiyon ortamına da bağlıdır [43]. Besinlerde otoksidasyon ve acılaşmanın oluşma prosesi; başlama, ilerleme ve sonlanma kademeleri ile yürümektedir [44]. Başlama kademesinde radikal üretilir, ilerleme kademesinde molekülden hidrojen atomu çıkışı ile radikal, doymamış yağ asidi ile reaksiyona girer. Sonlanma reaksiyonuna kadar ilerleme kademesinde bir zincir reaksiyonu devam eder. Başlama; LH L. (2.1) İlerleme; L. + O 2 LOO. (2.2) LOO. + LH LOOH + L. (2.3) Sonlanma; LOO. + LOO. Radikal olmayan ürünler (2.4) LOO. + L. Radikal olmayan ürünler (2.5) L. + L. Radikal olmayan ürünler (2.6) Antioksidanlar (AH), yukarıdaki oluşumu aşağıda gösterilen reaksiyonlarla doymamış yağlardan oluşan radikallere bir hidrojen atomu veya elektron vererek bozarlar. LOO. + AH LOOH + A. (2.7)

25 5 A. + LOO. Radikal olmayan ürünler (2.8) A. + A. Radikal olmayan ürünler (2.9) Oksidan ve radikaller; triplet oksijen, su ve doymamış yağ moleküllerinden oluşan oldukça reaktif türlerdir. Bundan dolayı, lipid peroksidasyonu sadece yenilebilen yağ ve gıda endüstrisi için değil aynı zamanda insan sağlığı için de bir problemdir. Şekil 2.1 de reaktif oksijen türlerinin çeşitli doku, organlarda neden olduğu hastalıklar ve hasarlar görülmektedir [45]. İltihap Kireçlenme Şok Soğuk kızarması Atheroskleroz İskemik; beyin,kalp Reaktif oksijen türleri Diabet Kanser Bulaşıcı: sıtma,aids Parkinson Radyasyon Hasarı Yaşlanma Şekil 2.1: Reaktif oksijen türlerinin çeşitli doku, organlarda neden olduğu hastalıklar ve hasarlar 2.2. DOĞAL ANTİOKSİDANLAR C Vitamini C vitamini (askorbik asit, askorbat) bitkilerde yaygın olarak bulunan, suda çözünen bir vitamindir. Altı karbonlu lakton yapısına sahiptir [45]. Çoğu hayvanın karaciğer veya böbreklerinde glikozdan, bitkilerde ise yaprak kısımlarında özellikle kloroplastlarında [46] sentezlenir. İnsanlar bu vitamini vücutta sentezleyemezler [47]. Bundan dolayı bu ihtiyaçlarını taze sebze ve meyvelerden karşılarlar [48]. Özellikle çilek, papaya, portakal, kivi, greyfurt, kavun, mango gibi meyvelerde, brokoli, brüksel lahanası, kırmızı veya yeşil biber, domates, lahana, patates, karnıbahar gibi sebzelerde, portakal suyu, domates suyu gibi meyve sularında bol miktarda bulunmaktadır [45].

26 6 C vitamini, reaktif oksijen (süperoksit, peroksil radikalleri, singlet oksijen, ozon), reaktif azot (peroksinitrit, azot dioksit) ve reaktif klor (hipoklorik asit) türlerini kolayca süpürür ve bu suretle diğer substratları oksidatif hasardan korur [49]. Hem askorbik asit hem de bunun bir elektron yükseltgenmiş hali olan askorbil radikali düşük redüksiyon potansiyeline sahiptir [50]. Böylece ilgili radikal ve oksidanlarla reaksiyona girebilir. Askorbil radikali, eşleşmemiş elektronun rezonans kararlılığı nedeniyle düşük redüksiyon potansiyeli gösterir ve kolayca askorbat ve dehidroaskorbik asite dönüşür [51]. Bununla birlikte, askorbik asit, hem askorbil radikalinden hem de dehidroaskorbik asitten enzimatik veya enzimatik olmayan yollarla kolaylıkla üretilir. Bu özelliklerinden dolayı askorbik asit etkili bir antioksidandır [45]. Askorbat ( AH ) Askorbil Radikali ( A. ) Dihidroaskorbik Asit (DHA) Şekil 2.2: Askorbik asitte meydana gelen redoks reaksiyonları E Vitamini E vitamini α, β, γ, δ tokoferolleri ve tokotrienolleri içeren grubu kapsamaktadır. α tokoferol, özellikle Dαtokoferol, (Şekil 2.3) en yüksek biyolojik aktiviteye sahip tokoferoldür [52,53]. E vitamini dokularda önemli zincir kırıcı bir antioksidandır ve

27 7 lipid peroksidasyonuna karşı savunma etkisinin olduğu, hücre membranlarını serbest radikal saldırısına karşı koruduğu düşünülmektedir [54,55]. Yağca zengin bitkiler, E vitaminin temel doğal kaynaklarıdır. Tokotrienoller, palm yağında ve pirinç kepeğinde yüksek miktarda, hindistan cevizi yağı, kakao yağı, soya fasülyesi, arpa, buğday, kırmızı et ve yumurtada bulunmaktadır. Ayçiçeği, yer fıstığı, ceviz, susam ve zeytin yağı ise sadece tokoferol içermektedir [56,57]. CH 3 HO CH 3 CH 3 CH 3 H 3 C CH 3 O CH 3 CH 3 Şekil 2.3: αtokoferol ün kimyasal yapısı Karotenoidler Doğal pigmentler olan karotenoidler bitkilerde ve çoğu mikroorganizmalarda sentezlenir. Şimdiye kadar doğal kaynaklardan 600 ü aşkın karotenoid izole edilmiştir [58]. Çoğu çiçek ve meyvelerin renkleri gibi birçok kuş, böcek ve deniz hayvanlarının renklerinden de sorumludurlar. Karotenoidler, yağda çözünen poliizoprenoid bileşiklerdir ve 2 ana gruba ayrılırlar. (a): Karotenler veya sadece hidrojen ve karbon içeren hidrokarbon karotenoidler (b): Hidroksi, keto, epoksi, metoksi veya karboksilik asit grubu gibi en az bir oksijen grubu taşıyan oksijenlenmiş hidrokarbon türevleri olan ksantofiller [59]. Likopen, βkaroten ve αkaroten, karotenler olarak adlandırılan; βkriptoksantin, lutein ve zeaksantin, ksantofiller olarak adlandırılan karotenoid sınıfına örnek olarak verilmektedir [45]. Yapılarındaki konjuge çift bağlar, kimyasal, biyokimyasal ve fiziksel özelliklerini etkiler [59].

28 8 βkaroten Likopen Lutein Şekil 2.4: βkaroten, likopen ve lutein in kimyasal yapıları Bu farklı yapı polien zinciri boyunca etkili bir elektron delokalizasyonuna yol açar. Likopende açık zincir veya asiklik polien yapısı görülürken, βkaroten molekülün her iki ucunda βiyonon halkasına sahip disiklik yapı göstermektedir [45]. Hidroksil grubu taşıyan karotenoidler (ksantofiller) doğada genellikle glikozidleri veya uzun zincirli yağ asidleri ile esterleşmiş haliyle bulunurlar ve daha hidrofobik özellik gösterirler [60]. Yapılarındaki konjuge çift bağlar sebebiyle yüksek antioksidan aktivite gösterirler. Bu yapısal özellikleri, bazı molekülleri süpürme veya etkisiz hale getirmeye olanak sağlar. Sonuç olarak, karotenoidler singlet oksijen türlerini giderme ve doğrudan serbest radikalleri süpürme etkisine sahiptirler [61,62]. Konjuge çifte bağ sistemine sahip karotenoidlerin bazı koşullar altında prooksidan (lipid ve benzeri substratların oksidasyonunu hızlandırıcı) aktivite de gösterdiği düşünülmektedir [63]. βkaroten fizyolojik koşullarda, düşük oksijen kısmi basıncı altında serbest radikalleri süpürme özelliği gösterirken, yüksek oksijen basıncında ve özellikle yüksek derişimlerde prooksidan etki göstermektedir [45].

29 Polifenolik Bileşikler Polifenoller, fitokimyasalların en geniş sınıflarından biri olup bitki aleminde geniş çapta yer almaktadırlar [45]. Polifenoller güçlü antioksidanlardır ve aktiviteleri kimyasal yapılarına bağlıdır [19,64,65]. Bitki polifenolleri çok fonksiyonlu olup hidrojen atomu verici, singlet oksijeni süpürücü ve indirgeyici olarak davranır [45]. Bazı polifenoller ise antioksidan özelliklerini metal iyonlarını kelatlama özelliklerine borçludurlar [66]. Bir polifenolun antioksidan olarak tanımlanabilmesi için iki temel özelliğin sağlanması gerekmektedir [45]. Bunlar, a) Okside olabilen substratlara oranla düşük konsantrasyonlarda bulunduklarında, otooksidasyonu veya serbest radikal merkezli oksidasyonu erteleyebilmeli, geciktirebilmeli veya önleyebilmelidir. b) Süpürme sonunda oluşan radikal, oksidasyon zincir reaksiyonunu kesmekte kararlı olmalıdır. Polifenolik antioksidanlar (PPH), peroksil radikaline (ROO. ) hızlı bir şekilde hidrojen atomu vererek denklem 2.10 da görüldüğü gibi onları alkil hidroperoksit (ROOH) yapısına dönüştürerek lipid peroksidasyonunu inhibe eder. ROO. + PPH ROOH + PP. (2.10) Oluşan polifenol fenoksil radikali bir başka hidrojen atomu vererek ve kinonların oluşumu ile kararlı hale gelmekte veya başka fenoksil radikali gibi bir radikal ile reaksiyona girerek yeni bir zincir reaksiyonu başlanmadan kesilmektedir. Besin fenolikleri; flavonoidler, fenolik asitler, fenolik polimerler (tanenler) olmak üzere üç sınıfa ayrılır Flavonoidler Bitki fenollerinin en geniş sınıfını difenilpropan (C 6 C 3 C 6 ) iskeletine sahip flavonoidler oluşturmaktadır. Şu ana kadar bitkilerin yaprak, tohum, kabuk ve çiçek kısımlarında 4000 in üzerinde farklı yapıda flavonoid belirlenmiştir. Molekül yapısı; aromatik A halkası yanında bulunan heterosiklik C halkası ve bu halkaya bağlı ikinci aromatik B

30 10 halkasından oluşmaktadır. Bu halkalara bağlanan çeşitli fenolik hidroksil grupları, bu yapıların antioksidan aktivite göstermelerini sağlar. Farklı türdeki bitkilerde veya aynı bitkinin değişik kısımlarında bulunan flavonoidlerin büyük yapısal farklılıkları vardır [45]. Çoğu flavonoid doğada Dglikoz, Lramnoz, glukoramnoz, galaktoz, lignin ve arabinoz gibi şekerli bileşikleri (glikozidleri) şeklinde bulunur [67]. Bağırsaklarda hidrolizlenerek biyolojik bakımdan aktif aglikonlara dönüşürler [68]. İnsan ve hayvanlarda midebağırsak sisteminden emilirler veya değişmeden ya da metabolitleri halinde idrar ve dışkı ile atılırlar. Lipid peroksidasyonunu inhibe eden flavonoidler etkili antioksidan, serbest radikal süpürücü, metal kelatlayıcıdır [69]. Şekil 2.5: Flavonoidlerin genel yapısı Flavonoidler; antosiyaninler ve antoksantinler şeklinde sınıflandırılır. Antoksantinler ise renksiz veya beyazdan sarıya dönük renkte olurlar ve flavonol, flavanol, flavon, flavanon ve izoflavonlar olarak sınıflandırılırlar. Antosiyaninler, antosiyanidinlerin glikozidleri olup çiçeklere ve meyvelere kırmızı, mavi ve mor renkleri veren, suda çözülebilen en önemli bitki pigment sınıfıdır [45]. Flavanonlar ve flavonlar çoğunlukla birlikte bulunur ve belirli enzimlerle bağlıdırlar. Çoğu bitki familyasında, flavonlar ve flavonoller arasında karşılıklı bir dışlama vardır ve flavanonca zengin bitkilerde antosiyaninler neredeyse hiç yoktur [70].

31 11 Flavonol Flavon Flavanon Flavanol İzoflavon Antosiyanidin Şekil 2.6 : Flavonol, flavon, flavanon, flavanol, izoflavon ve antosiyanidin in kimyasal yapıları Flavonoidlerin en yaygın sınıfı flavonollerdir ve en önemli bileşikleri kuersetin, kuersetin glikoziti rutin, kamferol, mirisetin, izoramnetindir. Kuersetin bitkilerin en temel flavonollerindendir ve soğan, elma, lahana ve çayda yüksek miktarda bulunmaktadır. Kuersetin Rutin İzokuersitrin Kamferol Mirisetin İzoramnetin Şekil 2.7: Kuersetin, rutin, izokuersitrin, kamferol, mirisetin ve izoramnetin in kimyasal yapıları

32 12 Flavon sınıfına ait temel bileşikler apigenin, luteolin ve krisindir. Maydanoz, kereviz ve zeytinde bol miktarda bulunmaktadırlar. Apigenin Luteolin Krisin Şekil 2.8: Apigenin, luteolin ve krisin in kimyasal yapıları Flavanoller ise flavonların indirgenmiş türevleridir. En önemlileri kateşin ve epikateşin dir. Kateşin ve epikateşinin gallik asitle kombinasyonları sonucu kateşin ve epikateşin gallatlar meydana gelir. Bu bileşikler çoğunlukla yeşil çay, kırmızı şarap, şeftalide fazla miktarda, ayrıca beyaz şarap ve elmada bulunurlar. Kateşin Epikateşin Epigallokateşin Epikateşin gallat Epigallokateşin gallat Şekil 2.9: Kateşin, epikateşin, epigallokateşin, epikateşin gallat ve epigallokateşin gallat ın kimyasal yapıları

33 13 Flavonların dihidro türevleri ise flavanonlardır. En önemlileri eriodiktol, naringenin, naringin, hesperidin ve hesperetin dir. Naringin naringenin in, hesperidin hesperetin in glikozitidir. Greyfurt ve portakalda bol miktarda bulunurlar. Naringin Naringenin Eriodiktol Hesperidin Hesperetin Şekil 2.10: Naringin, naringenin, hesperidin, hesperetin ve eriodiktol ün kimyasal yapıları Flavonların izomeri olan izoflavonların en bilinen bileşikleri genistein ve daidzein olup baklagil ve soya fasülyesinde fazla miktarda bulunmaktadırlar. Daidzein Genistein Şekil 2.11: Daidzein ve genistein in kimyasal yapıları Antosiyaninler, antosiyanidinlerin glikozidleri olup çiçeklere ve meyvelere kırmızı, mavi ve mor renkleri veren, suda çözülebilen en önemli bitki pigment sınıfıdır. En önemlileri; apigenidin, siyanidin, malvidin ve delfinidin dir.

34 14 Siyanidin Malvidin Apigenidin Delfinidin Şekil 2.12: Siyanidin, malvidin, apigenidin ve delfinidin in kimyasal yapıları Flavonoid sınıfına ait bileşiklerin sübstitüsyon konumları ve yaygın olarak bulundukları besin kaynakları Tablo 2.1 de [71] özetlenmiştir.

35 15 Tablo 2.1: Flavonoid sınıflarına ait bileşikler, sübstitüsyon konumları ve besin kaynakları SINIFI Flavanol ADI (+)Kateşin ()Epikateşin Epigallokateşin gallat SÜBSTİTÜSYON KONUMLARI 3,5,7,3,4 OH 3,5,7,3,4 OH 3,5,7,3,4,5 OH,3gallat BESİN KAYNAKLARI Çay Çay Çay Flavon Krisin Apigenin Luteolin 5,7OH 5,7,4 OH 5,7,3,4 OH Meyve kabuğu Maydonoz, kereviz Kırmızı biber Flavonol Kamferol Kuersetin Mirisetin Rutin 3,5,7,4 OH 3,5,7,3,4 OH 3,5,7,3,4,5 OH 5,7,3,4 OH, 3rutinoz Pırasa, brokoli, hindiba, greyfurt, siyah çay Soğan, marul,brokoli,, çay, k.şarap, mor meyveler, zeytinyağı, elma kabuğu Yabanmersini,üzüm,k. şarap K.şarap, kara buğday, domates kabuğu, turunçgiller Flavanon Naringin Naringenin Taksifolin Hesperidin Eriodiktol 5,4 OH, 7ramnoglukoz 5,7,4 OH 3,5,7,3,4 OH 3,5,3 OH,4 OMe,7rutinoz 5,7,3,4 OH Turunçgiller, greyfurt Turunçgiller Turunçgiller Portakal Limon İzoflavon Genistin Genistein Daidzin Daidzein 5,4 OH,7glukoz 5,7,4 OH 4 OH, 7glukoz 7,4 OH Soya fasulyesi Soya fasulyesi Soya fasulyesi Soya fasulyesi Antosiyanidin Apigenidin Siyanidin 5,7,4 OH 3,5,7,4 OH,3,5OMe Renkli meyveler Kiraz, ahududu, çilek Aşağıdaki özelliklerden bir ya da daha fazlasına sahip yapıda olan flavonoidler oldukça yüksek antioksidan etki gösterirler [19]. a) Radikal formun daha yüksek kararlılığını sağlayan ve elektron delokalizasyonuna katılan, B halkasındaki odihidroksi yapısı (aynı zamanda bu yapıdan kararlı 3,4 dikinonlar oluşur) b) 2. ve 3. karbon atomları arasındaki çifte bağ, C halkasının 4. karbon atomunda keto grubunun oluşmasını sağlar ve bu da B halkasında radikalin elektron delokalizasyonunu artırır. Antioksidan güç, aromatik çekirdeğin elektron delokalizasyonuna bağlıdır. Bu bileşikler serbest radikallerle reaksiyona

36 16 girdiğinde üretilen fenoksil radikalleri aromatik çekirdeğin rezonans etkisiyle kararlı hale getirilir. 2,3çifte bağı, tüm moleküldeki rezonansı arttırır. c) C halkasının 4. karbon atomunda keto grubu ile beraber C ve A halkalarındaki 3. ve 5. pozisyondaki hidroksil grupları maksimum radikalsüpürme potansiyeli için gereklidir. Aynı zamanda 5hidroksi4keto grubu güçlü bir metal kelatlayıcı olarak da antioksidan etkinliğe katkıda bulunur. Lipid peroksidasyonu inhibisyonunda flavonoidlerin yapıaktivite ilişkisi incelendiğinde [69]; a) C halkasındaki 3. karbon atomu üzerinde hidroksil grubunun varlığı; Bu yapıya sahip fisetin, (+)kateşin (Şekil 2.9), kuersetin, mirisetin (Şekil 2.7) ve morin lipid peroksidasyonunu, C3. karbon atomu üzerinde hidroksil grubu taşımayan diosmetin, apigenin (Şekil 2.8), hesperetin ve naringenine (Şekil 2.10) göre daha kuvvetli inhibe eder. b) C halkasındaki 2. ve 3. karbon atomları arasındaki çifte bağın varlığı; Bu bağın hidrojenlenmesi antiperoksidatif etkiyi azaltır. c) Hidroksil gruplarının sayısı; A ve B halkalarında polihidroksillenmiş yapıların önemi, kuersetin, mirisetin, mirisetrin, filoretin, (+)kateşin, morin ve fisetinin, apigenin, hesperetin, hesperidin, naringenin, naringin, krisin ve 3hidroksiflavona göre karşılaştırılmasıyla belirlenmeye çalışılmıştır. İlk gruptakiler 46 arasında, ikinci gruptakiler 13 arasında hidroksil taşıyan flavonoidlerdir. Flavonoidlerin hidroksil radikali süpürme aktivitesi, B halkasındaki hidroksil grupları sayısıyla (özellikle C3 konumunda) artar ve hidroksil grupları sayısının azalmasıyla hızlı bir şekilde azalır. Mirisetinin (Şekil 2.7) (Hidroksil konumları: 3,5,7,3,4,5 ) hidroksil radikali süpürme aktivitesi kamferolden (Hidroksil konumları: 3,5,7,4 ) daha kuvvetlidir. d) Hidroksil konumları; A halkasındaki C5 ve C7, B halkasındaki C3 ve C4 ve C halkasındaki C3 konumundaki hidroksil gruplarının varlığı lipid peroksidasyonun inhibisyonuna katkıda bulunur. Flavonoller, antiperoksidatif aktivite için C2 konumunda bir hidroksil grubu ve pirogallol grubuna (C3, C4, C5 ) gereksinim duyarlar.

37 17 e) Şeker yapısının varlığı; Genelde flavonoid glikozidler, tekabül eden aglikon türlerinden daha az antioksidan aktiftir. Malondialdehit üretiminin inhibisyonunda apigenin, naringenin, hesperetin, diosmetin, kuersetin, filoretin ve mirisetin karşılık gelen glikozidlerine göre daha etkilidir. Şeker yapısı, sterik engellemeden ötürü çok bitişik konumda bulunan hidroksil gruplarının antiperoksidasyon verimini azaltır. f) Metoksi gruplarının varlığı; Sterik engellemeden dolayı flavonoidlerin antiperoksidatif verimini azaltır. Ancak aynı sayıda hidroksil grubu içeren flavonoidlerde OH e göre orto ve para konumundaki OMe grupları, elektron desteğiyle aril oksi radikallerini stabilize edeceğinden sonuçta antioksidan aktiviteyi arttırırlar. g) Rutin ve kuersetin gibi (Şekil 2.7) C4 konumunda karbonil grubu ve C3 veya C5 konumunda hidroksil grubu taşıyan flavonoidler, demir iyonlarıyla kelat oluşturur. Flavanoidler demir iyonlarıyla kompleks oluşturduktan sonra da serbest radikal süpürme aktivitelerini yitirmezler Fenolik Asitler Fenolik asitler hidroksi benzoik asit ve hidroksi sinnamik asit olarak adlandırılan farklı iki sınıftan oluşmaktadır [45]. Fenolik asitlerin ve esterlerinin antioksidan aktiviteleri, sterik engelleme ile güçlenen moleküldeki hidroksil gruplarının sayısına bağlıdır [72]. Benzoik asidlerde karboksilat grubunun elektronçekme özelliği, hidroksi benzoatların hidrojen atomu verme yeteneklerine negatif etki yapar. Hidroksi sinnamik asitler eşdeğer benzoatlarından daha etkilidirler [19]. Hidroksi sinnamik asitler, (fenilpropanoidler), bitkilerin fenolik metabolizmasında temel rol oynayan ve fenil alaninden biyosentetik olarak türeyen fenolik bileşiklerdir [73,74]. Bitkilerin hücre duvarı yapısına katılırlar ve flavonoidlerin biyosentetik öncüsüdürler [74]. Genellikle bu tür fenolik asitler, bitkilerde şeker, organik asit veya yağlarla birleşmiş veya esterleri halinde bulunurlar ve aralarında etkili bir dönüşüm görülmektedir [75] (Şekil 2.13). Meyve, sebze, çiçek, tohum ve şarap, çay, kahve, zeytin yağı gibi bitki türevli ürünlerde bulunmaktadırlar [44,76]. Kafeik asit, onun kuinik ester türevi klorojenik asit, pkumarik asit bitkilerde en fazla bulunan hidroksi sinnamik asitlerdir. Klorojenik asidin, kafeik asidin depolanmış türü olduğu

38 18 düşünülmektedir, çünkü klorojenik asidin biyosentezi sırasında kuinik asit çiftinin kafeik kısma olan dönüşümü tersinirdir [77,78]. İki aromatik halkada ikişer tane hidroksil grubu taşıyan, rozmarinik asit ise kafeik asit ve 3,4dihidroksifenillaktik asitin esteridir. Hidroksi sinnamik asidler, doğada trans konumunda olduklarında daha kararlıdırlar ama ultraviyole ve görünür ışığa maruz kaldıklarında, yavaş yavaş ciskonumuna izomerize olurlar [79]. Tirozin Fenil Alanin Sinnamik Asit pkumarik Asit Kafeik Asit Ferulik Asit Sinapik Asit Klorojenik Asit Şekil 2.13: Hidroksi sinnamik asitlerin yapıları ve biyosentetik ilişkileri Şekil 2.14: Rozmarinik asit in kimyasal yapısı

39 19 Hidroksi Benzoik Asitler, monohidroksi benzoik asidler, orto ve para konumlarında antioksidan aktivite göstermezken, mhidroksi asit TEAC katsayısı = 0.84 mm aktivite gösterir. Fenolik halka ile karboksilat grubu arasına metilen grubu girmesiyle oluşan fenil asetik asitlerde orto ve meta hidroksi türevleri TEAC katsayısı = 1 mm a yakın antioksidan aktivite gösterirken, phidroksi fenil asetik asidin aktivitesinde küçük bir artış olur. Dihidroksi benzoik asit türevlerinin antioksidan aktiviteleri hidroksil gruplarının pozisyonlarına bağlı olup, o ve m pozisyonlarında aktivite yüksek olurken (2,3dihidroksi benzoik asit gibi), mp pozisyonlarına sahip olanlarda (3,4dihidroksi benzoik asitprotokateşik asit gibi) aktivite düşer. Gallik asit, üç hidroksil grubuna sahip olmasından dolayı en fazla aktivite gösteren hidroksi benzoik asittir. Ancak karboksilat grubu esterlendiğinde aktivite düşer [19]. Gallik Asit Protokateşik Asit Vanilik Asit Şekil 2.15: Gallik, protokateşik, vanilik asit in kimyasal yapıları Fenolik Polimerler (Tanenler) Polimerik yapıdaki yüksek molekül tartısına sahip tanenler kondanse ve hidrolizlenebilir olmak üzere iki alt sınıfa ayrılır [80]. Kondanse tanenler polimerik flavonoidlerdir [81]. Hidrolizlenebilir tanenler, gallik asit ve benzer bileşiklerin karbonhidratlara esterlenmiş yapılarıdır [80]. Bu bileşikler çay, kırmızı şarap, meyve, baklagil ve tahıllarda bol miktarda bulunmaktadırlar [45].

40 20 Şekil 2.16: Fenolik polimerin kimyasal yapısı 2.3. ÇALIŞILAN BİTKİLERİN SAĞLIK ÜZERİNDEKİ ŞİFALI ETKİLERİ VE ETKEN BİLEŞİKLERİ Civanperçemi ( Achillea millefolium ) Antienflamatuar 1, antispazmodik 2, etkilidir. Damar hastalıkları, safra ve idrar söktürücü, hemoroid, safra salgısı yetersizliği ve romatizmada etkilidir. Özellikle sikatrizan 3 olarak kullanılır. Etken bileşikleri; azulen taşıyan uçucu yağ, flavonlar (apigenin ve luteolin türevleri), seskiterpen laktonlardır Arslanpençesi ( Alchemilla xantochlora ) Tanenlerden dolayı astrenjandır 4. Kanama ve ishale karşı yara iyileştirici etkisi bulunmaktadır. Bazı bitkisel ilaçların bileşimine girerek kadın hastalıklarında kanamalara ve alt batının zayıflığına karşı, ayrıca böbrek ve idrar yollarındaki taş düşürücü olarak kullanılır. Etken bileşikleri; tanen (% 68 gallotanenler) ve flavonoidler (kuersetin3oβdglukuronit) dir. 1 İltihap giderici madde 2 Spazmları dindirmek için kullanılan madde 3 Yaraların iyileşmesini kolaylaştıran madde 4 Kan durdurucu

41 Dereotu ( Anethum graveolens ) Aromatik, antispazmodik, galaktagog 5 ve bakteriostatik 6 etkilidir. Koliklerde 7 (özellikle bebeklerde), öksürük, soğuk algınlığı ve gripte yararlıdır. Antispazmodiklerle (örneğin Viburnum opulus gilaburu) kullanılırsa ağrı dindirir. Emziren annelerde sütü arttırır. İştahsızlıklarda, ağız yaralarında ve mide bulantılarında kullanılır. Etken bileşikleri; meyvalarda %5 uçucu yağ (% 4363 karvon ayrıca limonen), sabit yağ, flavonoid, kumarin, ksanton, tanen, reçine, triterpen ve glikanlardır Kereviz ( Apium graveolens ) İdrar yolları temizleyicisi, kan sulandırıcı, romatizmal hastalıklar, zayıflama kürleri sonunda oluşan sinirlilik hallerinde rahatlatıcı etki gösterir. İdrar söktürücü, adet düzenleyici, salgı organları düzenleyicisi, zayıflama kürlerinde sinirsel bozukluğu giderici olarak, ayrıca iştahsızlık ve bitkinliklerde kullanılır. Etken bileşikleri; meyvalar % 23 uçucu yağ, selerin, furanokumarin, furanokumarin glikozit, apigravin, selereoin, apiumosit gibi kumarin bileşikleri, luteolin7oapiosilglikozit ile krisoeriyol, apigenin ve izokuersitrin gibi flavonlar taşımaktadır. Uçucu yağ başlıca %6 limonen, %10 selinen ve psimen, βterpineol, αsantalol, dihidrokarvon içermektedir. Kökler, % arasında uçucu yağ (papiol, miristisin, limonen, terpinolen vb.), % 1.6 kadar flavon (başlıca apiin) ve furanokumarinler (bergapten, imperatorin vb.), ligustilid ve butiftalid benzeri ftalitler ile poliasetilen türevi falkarinonol, falkarinol adlı bileşikleri taşımaktadır Nane ( Mentha piperita ) Yapraklar taşıdığı uçucu yağdaki mentolden dolayı antibakteriyel, spazmolitik, kolagog 8 etkilidir. Antispazmodik etki özellikle midebağırsak sistemi üzerinde belirgindir. Mide bulantısına karşı ve diğer mide şikayetleri, akut ve kronik gastrit 9 ve enteritte 10 etkilidir. Uçucu yağ midebağırsak kaslarına spazmolitik etkilidir. Bronşları yumuşatıcı etki de göstermektedir. Cilde ve mukozaya sürüldüğünde serinlikferahlık 5 Süt salgılanmasına yardımcı madde 6 Bakterileri öldürmeden çoğalmasını engelleyen madde 7 Bir kasılmadan dolayı ileri gelen her çeşit karın ağrısı 8 Safra kesesinde ve safra yollarında bulunan safranın onikiparmak bağırsağına akmasını kolaylaştıran madde 9 Mide mukozasının iltihaplanması 10 Bağırsak mukozasının iltihaplanması

42 22 hissi uyandırır. Dahilen mide spazmlarında, mide bulantısını engelleme, ayrıca soğuk algınlığında üst solunum yolları antiseptiği 11 olarak kullanılır. Etken bileşikleri; yapraklar % 0.84 oranında uçucu yağ ile flavonlar, rozmarinik asit, kafeik ve klorojenik asit ve triterpenik maddeler taşımaktadır. Uçucu yağ: % 4550 mentol, % 5 20 mentol esterleri (mentil asetat ve mentil izovalerat) ile daha az miktarlarda menton, mentofuran ökaliptol, () limonen ve () βkaryofillen içermektedir Mercanköşk ( Origanum sp. ) Uçucu yağların bileşimindeki fenolik maddeler timol ve izomeri karvakrolün salgı arttırıcı, bronş spazmını çözücü ve antimikrobiyal etkileri nedeniyle, soğuk algınlığı öksürüklerinin tedavisinde kullanılır. Düz kaslar üzerine gevşetici etkileri vardır. Uçucu yağlar cilde sürüldüğünde kızartıcı, yakıcı etki göstermektedir. Soğukalgınlığı şikayetlerinde, iştahsızlık, hazımsızlık hallerinde kullanılmaktadır. Halk arasında şeker hastalığına karşı da kullanılmaktaysa da bu etkisi henüz araştırma aşamasındadır. Etken bileşikleri; türlere ve toplanma yerlerine göre miktarları değişen uçucu yağ, flavonlar, başta ursolik asit ve oleanolik asit olmak üzere triterpenik maddeler ve Labiatae tanenleri taşırlar Maydanoz ( Petroselinum crispum ) Kuvvetli idrar söktürücüdür, tahriş edici etkisi de vardır. Apiol ve miristisinden dolayı spazmolitik ve rahim düzenleyicidir. İdrar yolları antiseptiği, ayrıca halk arasında adet bozukluklarında, safra söktürücü olarak ve haricen saç diplerine de kullanılmaktadır. Etken bileşikleri; tohumlar % 16 uçucu yağ taşır, uçucu yağın başlıca maddeleri fenil propan türevi olan papiol, miristisin ve 1allil 2,3,4,5tetrametoksibenzol, ayrıca α ve βpinen, limonen, βfelladrendir. Tohumlar % 25 kadar sabit yağ, flavonlar (apiin ve benzeri) ve bazı furanokumarinler de içermektedir. Kökler, % arasında uçucu yağ (papiol, miristisin, limonen, terpinolen vb.), flavonlar (başlıca apigenin) ve furanokumarinler (bergapten, imperatorin vb.), ligustilid ve butilftalid benzeri ftalitler ile poliasetilen türevi falkarinonol, falkarinol adlı bileşikleri taşımaktadır. 11 Vücut içinde yada dışında, özellikle sindirim borusunda bulunan mikropları yok edebilen ya da onlara karşı koruyan madde

43 Adaçayı ( Salvia triloba ) Ağız ve boğaz mukazasında antiflojistik 12 etkilidir, gargara olarak kullanılır. Soğuk algınlığı ve mide bulantısı şikayetlerinde etkilidir. Etken bileşikleri; yapraklar % 23 uçucu yağ, % 5 rozmarinik asit, tanen bileşikleri, flavonlar (salvigenin, luteolin, hispiludin) ile karnosol gibi diterpenler ve ursolik asit ve benzeri triterpenler içerir. Uçucu yağ, % 6064 civarında ökaliptol (1,8sineol), % 8.2 kafur ve % 5 in altında tuyon türevleri taşımaktadır Kekik ( Thymus sp. ) İştah açıcı, hazım kolaylaştırıcı etkileri bulunmaktadır. Solunum yolları enfeksiyonlarında, soğuk algınlığında, kuru ve balgamlı öksürüklerde çay veya ekstrelerinden hazırlanmış bitkisel ilaçlardan yararlanılmaktadır. Etken bileşikleri; tıbbi amaçla kullanılacakların % oranında uçucu yağ taşıdıkları, bu uçucu yağın da en az % 20 (timolkarvakrol) fenolik madde içermesi gerektiği kayıtlıdır. Drogda ayrıca flavonoid bileşikler ve başta ursolik, oleanolik asit olmak üzere triterpenik maddeler ve Labiatae tanenleri bulunmaktadır Ihlamur ( Tilia sp. ) Solunum yolları yumuşatıcısı, gıcık kesici ve ateşli soğuk algınlığı rahatsızlıklarında kullanılır. Fenil etil alkol esterleri sedatif etkilidir. Uçucu yağ ve flavonoidleri nedeniyle antispazmodik ve idrar söktürücü etkisi vardır. Etken bileşikleri; flavonlar, özellikle kamferol ve kuersetin türevleri, % 2 civarında tanen ve lökoantosiyanidin, % oranında uçucu yağ taşımaktadır. Uçucu yağın bileşiminde eikozan, trikozan gibi hidrokarbürler yanında eser miktarda linalol, geraniol gibi monoterpenik bileşikler ile fenil etil alkol ve esterleri (etil ve benzoil esterleri) yer almaktadır Isırgan ( Urtica sp. ) Topraküstü kısımları idrar söktürücü, kökler miksiyon 13 bozukluklarında etkilidir. Topraküstü kısımlar, dahilen idrar yolları iltihapları, haricen romatizma; kökler prostat adenomlarının 14 I ve II kademelerindeki miksiyon bozukluklarında kullanılır. Etken bileşikleri; topraküstü kısımlarında özellikle kalsiyum, potasyum ve silisik asit tuzları, 12 İltihaplarla savaşan madde 13 İdrara çıkma 14 Bir salgı bezinde gelişen tehlikesiz epitelyum uru

44 24 yaprak tüylerinde histamin ve serotonin gibi biyojenik aminler ve köklerde serbest ve glikozidik βsitosterol ve skopoletin içermektedir [82]. Kekik Ihlamur Isırgan Nane Şekil 2.17: Kekik, ıhlamur, ısırgan ve nane bitkilerinin resimleri

45 25 Civanperçemi Mercanköşk Dereotu Adaçayı Şekil 2.18: Civanperçemi, mercanköşk, dereotu ve adaçayı bitkilerinin resimleri

46 TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİN YÖNTEMLERİ CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity; Cu(II) İyonu İndirgeme Antioksidan Kapasite) Yöntemi Apak ve arkadaşlarının [36] geliştirdiği bu yöntemde, 2,9dimetil1,10fenantrolin (NeocuproinNc) in Cu(II) ile oluşturduğu bakır(ii)neokuproin kompleksinin (Cu(II) Nc), 450 nm de maksimum absorbans veren bakır(i)neokuproin [Cu(I)Nc] kelatına indirgenme yeteneğinden yararlanarak antioksidan kapasitesi hesaplanmaktadır. Bu özellikten yola çıkarak geliştirilen antioksidan kapasite yöntemine bakır(ii) iyonu indirgeme antioksidan kapasite yöntemi denilmiştir ve kısaca CUPRAC metodu olarak adlandırılmıştır. Yöntem; sulu Cu(II) klorür çözeltisi, alkolde hazırlanmış neokuproin çözeltisi ve sulu amonyum asetat (ph 7 tamponu) çözeltilerinin karıştırılmasından sonra, üzerine tayin edilecek herhangi bir antioksidan çözeltisinin ilave edilmesi ve bunu takip eden 30 dakika sonunda, içerisinde antioksidan bulunmayan referansa karşı 450 nm de absorbanslarının ölçülmesinden ibarettir. Askorbik asit, gallik asit ve kuersetin için renk oluşumu hızlı olurken naringin, naringenin gibi yavaş reaksiyona giren antioksidanlar için 50 o C de 20 dakika inkübasyon işlemi uygulanmaktadır. Flavonoid glikozidlerine % 50 metanol içeren son çözeltide 1.2 M HCl ile hidroliz işlemi uygulanarak, maksimum indirgeme güçlerini daha fazla gösterdikleri aglikon haline dönüşmeleri sağlanarak yöntem uygulanmıştır n Cu(Nc) 2 + Ar(OH) n n Cu(Nc) 2 + Ar(=O) n + n H + (2.11) Yöntem hem hidrofilik hem de lipofilik antioksidanlara uygulanabilir TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity; Troloks Eşdeğeri Antioksidan Kapasitesi) / ABTS Yöntemi Troloks eşdeğeri antioksidan kapasitesi olarak ifade edilen TEAC/ABTS yöntemi, ilk olarak Miller ve arkadaşları [10,20] tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntem; 2,2 azinobis(3etilbenzotiazolin6sulfonat) (ABTS) kromojen radikal katyonunun absorbansının, antioksidanlar tarafından inhibisyonunu temel alır. Antioksidanlar varlığında ABTS.+ radikal katyonunun (Şekil 2.19) absorbansında belirli bir süre içindeki azalmadan yararlanarak toplam antioksidan kapasitesi troloks cinsinden

47 27 bulunur. Bu nedenle bu yönteme troloks eşdeğeri antioksidan kapasite yöntemi (ABTS/TEAC) adı da verilir. Şekil 2.19: ABTS.+ radikal katyonunun yapısı 660, 734 ve 820 nm de maksimum veren ABTS.+ radikal katyonu metmiyoglobinin H 2 O 2 ile aktivasyonu ile üretilen ferrilmiyoglobin radikal türlerinin ABTS ile etkileşiminden meydana gelmektedir. ABTS.+ katyon radikalini oluşturmak için, ABTS; myoglobin ve H 2 O 2 ile inkübe edilir [83]. HXFe ııı + H 2 O 2 X[Fe ıv (O] + H 2 O (2.12) ABTS + X[Fe ıv (O] ABTS.+ + HXFe ııı (2.13) (HXFe ııı = myoglobin; X[ Fe IV (O] =ferrilmyoglobin) Orijinal TEAC denemesinin bağıl standart sapma değerleri, gün içi denemeler için % , günler arası denemeler için % olarak bulunmuştur [20]. Şekil 2.20: ABTS.+ radikal katyonunun absorbsiyon spektrumu

48 28 Re ve arkadaşları [40] tarafından modifiye edilmiş ve geliştirilmiş TEAC yönteminde potasyum persülfatla ABTS in oksidasyonu sonucu üretilen ABTS.+ radikal katyonları kullanılır. Üretilen bu ABTS radikalleri oda sıcaklığında karanlıkta beklediği zaman 2 gün kararlıdır. Geliştirilen bu yöntem, hem lipofilik hem de hidrofilik sistemlerde kullanılabilmektedir FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power; Demir(III) İyonu İndirgeyici Antioksidan Gücü) Yöntemi Benzie ve Strain tarafından geliştirilen bu yöntemde [22] demir(iii) in indirgenme kapasitesi yoluyla antioksidanların toplam miktar tayini yapılmaktadır. Düşük ph larda oluşan Fe(III) ün, kısa adı TPTZ olan tripiridiltriazin ile reaksiyonu sonucu oluşan [Fe(III)TPTZ] kompleksi antioksidanların etkisiyle Fe(II)tripiridiltriazin [Fe(II) TPTZ] kompleksine indirgenmektedir. Meydana gelen Fe(II)TPTZ kompleksinin rengi koyu mavidir ve 593 nm de maksimum absorbans vermektedir Folin Ciocalteu Yöntemi Bu yöntem Singleton ve arkadaşları [28,29] tarafından antioksidanların toplam fenolik içeriğini ölçmek için geliştirilmiştir. Yöntemde kullanılan CuSO 4 (bakır(ii) sülfat) alkali ortamda protein veya antioksidanla kompleks yapar. Folin fenol reaktifi (fosfomolibdikfosfotungstik asit) eklendiğinde, folin reaktifi proteine bağlanır. Protein veya antioksidanla Cu(II) nin reaksiyonundan açığa çıkan Cu(I) olasılıkla molibdatotungstat reaktifini heteropoli mavisine indirger ve rengi sarıdan maviye dönüşür. Reaksiyon tamamlanınca 750 nm de örnek absorbansları ölçülür. Bu denemede, ard arda geri dönüşümlü bir veya iki elektron indirgeme reaksiyonları, P(MoW 11 O 40 ) 4 olması muhtemel mavi türlerin oluşumunu sağlar. Esasen, molibdenin kompleks içinde indirgenmesinin daha kolay olduğuna ve elektrontransfer reaksiyonunun indirgenler ve Mo(VI) arasında gerçekleştiğine inanılır. Mo(VI) + e Mo(V) (2.14) Fenolik bileşikler FCR (Folin Ciocalteu reaktifi) ile sadece bazik ortamlarda reaksiyon verirler. (Sodyum karbonat çözeltisi ile ph 10 a ayarlanır). Fenolik protonun

49 29 dissosiasyonu, reaktifi indirgeme yeteneği bu nedenle artan fenolat anyonunun oluşumunu sağlar TRAP (Total Radical Trapping Parameter ; Toplam Radikal Tutma Parametresi) Yöntemi Wayner ve arkadaşları [14] tarafından geliştirilen bu metodda; plazma ve diğer biyolojik sıvılarda bulunan peroksitlenebilen maddelerden ve 2,2 azobis (2amido propan) dihidroklorürden (AAPH) meydana gelen peroksil radikalleri kullanılır. Plazmaya AAPH ün ilavesinden sonra, yükseltgenebilen maddelerin oksidasyonu, reaksiyon sırasında tüketilen oksijenin ölçülmesi ile belirlenir. Plazma içerisinde bulunan antioksidanlar oksidasyon reaksiyonunun yavaş gerçekleşmesine sebep olur. Reaksiyonun gecikme zamanı ölçülerek plazmadaki toplam antioksidan kapasitesi, iç standart olarak kullanılan troloks eşdeğeri cinsinden hesaplanmaktadır. Wayner ve arkadaşları [82] peroksil radikalleri tarafından oksidasyon başlatılmadan önce, plazma örneğine linoleik asit ilavesi yaparak yöntemi modifiye etmişlerdir. Bu yöntemin dezavantajı, oksijen elektrodunun son noktasının tam olarak tespit edilememesi ve oksijen elektrodunun gereken zaman dilimi içinde kararlılığını koruyamamasıdır [20] Luminol Yöntemi MetsäKetelä ve arkadaşları tarafından 1991 de geliştirilen ve yayınlanan kemiluminesans esaslı TRAP yöntemi daha sonra Alho ve Leinonen tarafından detaylı şekilde ifade edilmiştir [26]. AAPH dan üretilen peroksil radikallerinin luminolü yükseltgemesi sonucu ışık yayan luminol radikalleri meydana gelmektedir. Yayılan ışık luminometre cihazı ile ölçülür. Örnek içindeki antioksidanlar, kemiluminesans ışımasının oluşumunu belli bir zaman için engeller. Gecikme zamanı bir örnekteki toplam antioksidan potansiyeli ile doğrudan orantılıdır. Elde edilen sonuçlar troloks eşdeğeri cinsinden hesaplanmaktadır. Whitehead ve arkadaşları [11] 1992 yılında bu kemilüminesans yöntemini biyolojik sıvılarda antioksidan kapasitenin ölçümü için geliştirmişlerdir. Geliştirilen bu yöntemde luminol AAPH yerine, H 2 O 2 veya perborat ile yükseltgenerek luminol radikallerini

50 30 oluşturur. Reaksiyonu daha hızlı gerçekleştirebilmek için katalizör olarak horseradish peroksidaz kullanılmış ve böylece ışık yayılması daha çabuk olmuştur. Normal şartlar altında bu reaksiyon, hızla azalan düşük şiddetli bir ışık yayılması olarak gerçekleşir. Ortama piyodofenol ilave edildiği zaman ışık emisyonu daha şiddetli, uzun süreli ve kararlı hale gelir. Işığın luminol radikalleri tarafından yayılması için ortamdaki bütün antioksidanların tüketilmesi gerekmektedir Diklorofloresindiasetat (DCFHDA) Yöntemi TRAP yöntemini temel alan başka bir yöntem ise Valkonen ve Kuusi nin geliştirdiği Diklorofloresindiasetat (DCFHDA) yöntemidir. Bu yöntemde AAPH peroksil radikalini oluşturmak için, DCFHDA ise yükseltgenebilen substrat olarak kullanılmıştır. Peroksil radikali ile DCFHDA arasındaki oksidasyon reaksiyonu sonucu oluşan diklorofloresin (DCF) yüksek floresans özelliğine sahip olmaktadır. DCF 480 nm de uyarılıp 526 nm de emisyon yapmaktadır. 504 nm de maksimum absorbsiyon göstermektedir. Bu bakımdan hem floresans yöntemi hem de spektrofotometrik yöntem kullanılarak DCF miktarı ve buna bağlı olarak toplam antioksidan kapasitesi hesaplanmaktadır. Bu yöntemde toplam antioksidan kapasitesi iki kademede bulunmaktadır. İlk kademede örnek içindeki antioksidanların kapasitesi gecikme zamanı cinsinden hesaplanmaktadır. Sonra aynı örnek üzerine miktarı bilinen troloks çözeltisi ilave edilmektedir. Troloks çözeltisi serbest radikaller tarafından tüketildikten sonra ikinci gecikme zamanı hesaplanır. Bu iki gecikme zamanı arasındaki farktan yararlanarak troloks cinsinden toplam antioksidan kapasitesi hesaplanmaktadır. Gecikme zamanlarının belirlenmesini sağlayan TRAP esaslı bu yöntemin gün içi ve günler arası bağıl standart sapma değerlerinin sırasıyla % 3.4 ve 4.6 olduğu ifade edilmiştir [23] Fikoeritrin (PE) Esaslı Yöntemler Ghiselli ve arkadaşları [13] tarafından 1994 yılında yayınlanan bu yöntem, peroksil radikallerinin kullanıldığı ve 1990 yılında yayınlanan Glazer çalışmasının [16] temelde bir benzeridir. Glazer, peroksil radikallerini oluşturmak için AAPH, hidroksil radikallerini oluşturmak için Cu(II)askorbat, yükseltgenebilir substrat olarak B veya RPE kullanmıştır. B veya RPE substratının peroksil veya hidroksil radikalleri

51 31 varlığında gösterdiği floresansın zamanla lineer olarak azaldığı belirtilmiştir. B veya RPE nin peroksil veya hidroksil radikallerine karşı sağladığı gecikme zamanının uzunluğu troloksun sağladığı gecikme zamanına oranlanarak örneğin antioksidan kapasitesi troloks eşdeğeri cinsinden belirlenir. Ama, PE fluoresans sönümünün kinetikleri, peroksil veya hidroksil radikalleri varlığında lineer değildir. Ayrıca analiz edilen örnek, plazma veya serum olduğu zaman gecikme zamanını belirlemek genellikle zordur [85]. Yeni bir yöntem olarak yayınlanan Ghiselli nin yönteminde Glazer ın geliştirmiş olduğu yönteme atıf yapılmamıştır. Ayrıca yapılan çalışmada RPE fluoresansının yaklaşık % 80 in söndürülmesine kadar RPE fluoresansının zamanla lineer olarak azaldığı belirtilmiştir. Ancak bu çalışma farklı kişiler tarafından tekrarlandığında aynı sonuçlar alınamamıştır [12,21]. Ayrıca, yöntemin plazmanın toplam antioksidan kapasitesini ölçmeye yönelik bir yöntem olduğu belirtilse de yöntemde, yapay plazma örnekleri kullanılmıştır ve % 0.96 bağıl standart sapma değeri yapay serum örnekleri için oldukça düşüktür [85] Krosin Yöntemi Tubaro ve arkadaşlarının geliştirdiği bu yöntemde kinetik parametreler karşılaştırılarak plazma içindeki antioksidan kapasitesi ölçülmektedir. Bu yöntem; AAPH tarafından oluşturulan peroksil radikallerinin krosini yükseltgemesi (rengini gidermesi) esasına dayanmaktadır Krosinin peroksil radikalleri ile yükseltgenme reaksiyonunda antioksidanların olmadığı durumdaki hızı (V 0 ) ve antioksidanların olduğu durumdaki hızı ise (V), 10 dakika içinde ölçülmektedir. Bu ölçülen hızların oranı (V 0 / V) x eksenini, antioksidan konsantrasyonunun [A] krosin konsantrasyonuna [C] oranı y eksenini oluşturacak şekilde bir grafik oluşturulmaktadır. Oluşan bu lineer grafiğin eğimi k a / k c oranını yani peroksil radikalleri ile etkileşen bileşiğin göreceli kapasitesini belirtir. k a ; antioksidanlar ile peroksil radikalleri arasındaki reaksiyon hız sabiti, k c ; krosin ile peroksil radikalleri arasındaki arasındaki reaksiyon hız sabitidir. Bulunan k a / k c oranı, daha önceden troloks ile hesaplanan k a / k c oranına bölünerek sonuçlar troloks cinsinden hesaplanmaktadır. Bu yöntemde iki antioksidanın peroksil radikalleriyle etkileşimleri kıyaslanabilmektedir.

52 32 Gün içi denemelerin bağıl standart sapma değerlerinin % 8 den az olduğunu belirten Tubaro ve arkadaşları, bu kinetik yaklaşım sayesinde antioksidan koruma etkinliğinin kesin olarak değerlendirilebileceğine inanmaktadırlar [27]. Ancak bu metod bir antioksidanın diğer bir antioksidana karşı yarışma yeteneğini ölçmektedir. Ayrıca kullanılan krosinin konsantrasyonu sabittir (10 µm) fakat analizlenecek olan bileşiğin farklı konsantrasyonlarının kullanılması için farklı krosin konsantrasyonları gerekmektedir. [85] DPPH Yöntemi Bu yöntem; antioksidanların kararlı bir organik azot radikali olan DPPH (1,1difenil2 pikrilhidrazil) radikalini süpürücü etkilerini ölçmeye dayalı bir yöntemdir. Bu radikal hidrojen donörlerle etkileştiğinde hidrazine indirgenir. Kırmızı renkli DPPH radikali 515 nm de maksimum absorbsiyon verir. DPPH çözeltisine antioksidanın ilave edilmesiyle absorbansta düşüş meydana gelir ve antioksidanların varlığıyla radikalin rengi kırmızıdan sarıya döner. Bu yöntem antioksidanların radikal süpürme kabiliyetlerini değerlendiren kolay ve geçerli bir yöntem olarak bilinmektedir [25]. N N. + AH N NH (2.15) O2 N NO 2 O2 N NO 2 NO 2 NO 2 Yöntem hızlı ve basittir. Ancak, bazı bileşenlerin (özellikle karotenoidler) 515 nm de DPPH ile çakışık spektrum vermesi analizin yorumunu güçleştirir. Ayrıca çoğu antioksidan sterik engellemeden dolayı DPPH ile yavaş reaksiyona girer. Bundan dolayı yöntem; DPPH. ile reaksiyona giren antioksidanların antioksidan kapasitesi hakkında doğru bir değerlendirme vermez. Bunlara ek olarak DPPH ın rengi, ışık, hava oksijeni, rutubet ve ph'a fazlaca duyarlı olduğundan tekrarlanabilir sonuçlar eldesi güçtür.

53 ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity; Oksijen Radikal Absorbans Kapasitesi) Yöntemi ORAC yöntemi [12,21,86]; büyük oranda Glazer [16] tarafından yayınlanan çalışmayı esas alır. Peroksil radikalini oluşturmak için AAPH, hidroksil radikalini oluşturmak için Cu(II) H 2 O 2 ve yükseltgenebilen protein substratı olarak fikoeritrin kullanılmaktadır. Oluşturulan radikaller ile fikoeritrin arasındaki yükseltgenme reaksiyonu sonucunda, fikoeritrinin floresansındaki zamana bağlı düşüş ölçülerek toplam antioksidan kapasitesi hesaplanmaktadır. Serbest radikal etkisini inceleyen ve miktar tayininde eğri altında kalan alan (area under curveauc) tekniğini kullanan bu yöntem, antioksidanların serbest radikalleri hem inhibe etme yüzdesini ve hem de inhibe etme süresini tek bir değer olarak ifade edebilen bir yöntemdir [85]. Net AUC, antioksidan miktarıyla orantılıdır TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity; Toplam Oksiradikal Süpürme Kapasitesi) Yöntemi Winston ve arkadaşları tarafından geliştirilmiş olan bu yöntem; AAPH bileşiğinden elde edilen peroksil radikallerinin αketoγ metiolbutirik asiti (KMBA) etilene yükseltgemesini esas alır [24]. Antioksidanlar varlığında kısmen engellenen etilen gaz kromatografisi ile ölçülmektedir. Toplam kapasiteyi elde etmek için aşağıdaki denklem kullanılmaktadır. Denklemde örnek reaksiyon eğrisinden integre edilen alan ( SA) ve kontrol reaksiyon eğrisinden integre edilen alan ( CA) kullanılarak işlem yapılır: TOSC = 100 ( SA / CA 100) (2.16) Antioksidan veya TOSC değerleri 0100 arasında verilmiştir. TOSC yönteminde, gün içi ve günler arası denemelerin bağıl standart sapma değerlerinin sırasıyla % 2 ve 6 olarak belirtilmiştir [24]. Bu durum kullanılan alan integrallerine göre açık bir sistemdir, çünkü KMBA sınırlayıcı bir faktör olmazsa, antioksidanların tüketimi sonrasında KBMA dan etilen üretimi artabilir [85] Siklik Voltametri Yöntemi Kohen ve arkadaşları [87,88] tarafından geliştirilen bu yöntem, biyolojik sıvılarda veya doku homojenatlarındaki düşük molekül ağırlıklı antioksidanların toplam indirgeme güçlerini değerlendiren bir yöntemdir. Bu yöntemde örnek hazırlama işlemini takiben,

54 34 örnek camsı karbon bir çalışma elektrodu, Ag/AgCl den oluşan referans elektrot ve platin telden oluşan yardımcı elektrot olmak üzere üç elektrotlu bir sistem içine yerleştirilir. Çalışma elektroduna sabit bir hızla (100 mv/dk) pozitif (indirgeme cinsinden değerlendirme) ve negatif (yükseltgeme cinsinden değerlendirme) potansiyeller uygulanmaktadır. Bu işlem sırasında potansiyel akım eğrisi (çevrimsel voltamogram) elde edilir. Örneğin indirgeme gücü, pik potansiyeli olan [ E p (a)] ve anodik akım olan (AC) ye bağlıdır. E p (a) akımın yarı artışında ölçülür ve yarı dalga potansiyeli (E 1/2 ) olarak ifade edilir ; bu indirgenlerin türüne bağlıdır. Yarı dalga potansiyelinin düşük olması durumunda, analizlenen bileşiklerin çalışma elektroduna elektron verme yeteneği daha yüksektir. Ancak bazı antioksidanlar camsı karbon elektroduna elektronlarını yeterli miktarda vermez. Örneğin tiyol yapısında glutatyon camsı karbon elektrodu ile tayin edilemez (Bunun yerine Au/Hg gibi elektrodlara ihtiyaç duyulur) [87] BİTKİLERDE TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİNİNDE KULLANILMIŞ OLAN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER VE HPLC UYGULAMALARI Surveswaran ve arkadaşlarının [7] yaptığı çalışmada, Hindistan daki 133 tane tıbbi bitkinin antioksidan kapasitesi ABTS, DPPH ve FRAP yöntemleri ile değerlendirilmiş ve toplam fenolik içerikleri FolinCiocalteu yöntemi ile hesaplanmıştır. Bu bitkilerin antioksidan aktiviteleri, ABTS yönteminde mmol TEAC/100 g kuru ağırlık arasında değişen geniş bir aralık göstermektedir. Antioksidan aktivite değerleri DPPH ve FRAP yöntemlerinde benzer şekilde değişmektedir. Toplam antioksidan kapasite ve toplam fenolik içerik arasında önemli ve pozitif doğrusal korelasyon bulunmuştur. Bu durum, analizlenen tıbbi bitkilerdeki baskın antioksidan bileşenlerin fenolik yapılar olduğunu göstermektedir. Seçilmiş 83 bitkinin tersfaz HPLC ile yapılan analizlerinde, temel fenolik bileşiklerin; fenolik asitler, tanenler, flavonoidler, kurkuminoidler, kumarinler, lignanlar ve kuininler olduğu belirlenmiştir. Iqbal ve arkadaşlarının [89] yaptığı çalışmada Pakistan da yetişen 5 buğday türünün kepek ekstraklarının antioksidan aktiviteleri değerlendirilmiştir. Tüm kepek ekstraktları, önemli miktarda toplam fenolik içerik ( mg gallik asit eşdeğeri/ g kepek),

55 35 toplam flavonoid içerik (epikateşin eşdeğeri µg/g kepek), kelatlama aktivitesi (etilendiamintetraasetikasit eşdeğeri µg/g kepek), DPPH aktivitesi (% 5179) göstermektedir. ABTS kapasitesi 2736 µmol/g; ORAC kapasitesi µmol/g ve toplam antosiyanin içeriği 3038 mg/kg kepek olarak bulunmuştur. Tokoferol (2226 ppm) ve tokotrienol içerikleri (5974 ppm) ters fazhplc ile değerlendirilmiştir. Oszmianski ve arkadaşları [90] yaptıkları bir çalışmada, Rosaceae familyasından bazı bitki köklerinde antioksidan tanenleri belirlemeye çalışmışlardır. Polifenoller, proantosiyanidin polimerlerinin tiyoasidoliz, fenolik asit esterlerinin asit hidrolizinden sonra analizlenmiştir. Aruncus Silvester ve Potentilla alba köklerinin en baskın prosiyanidin birimleri ()epikateşin ve Geum rivale ve Waldsteinia geoides köklerinde ise (+) kateşin olarak bulunmuştur. En yüksek proantosiyanidin derişimleri, Potentilla alba (80 g/kg) ve Waldsteinia geoides (64 g/kg) köklerinde belirlenmiştir. G. Rivale (2.68 g/kg) ve W. geoides (2.75 g/kg) kuru köklerinde yüksek miktarda ellagik asit bulunmuştur. DPPH yöntemi ile antioksidan aktivite, bitkilerin türüne göre 0.72 (Filipendula vulgaris) ile 4.40 (W.geoides) mm troloks eşdeğeri/kg kuru kök, ABTS yönteminde ise mm troloks eşdeğeri/kg kuru kök arasında değişmektedir. Chun ve arkadaşlarının [91] yaptığı bir çalışmada, mercanköşk (oregano) doku kültürlerinden yüksek antioksidan aktivite ve antimikrobiyal potansiyel gösteren, birkaç fenolik ve rozmarinik asit izole edilmiştir. Araştırmada, fenolik içeriği zengin mercanköşk ekstraktlarının antioksidan aktivitesi ve antimikrobiyal aktivitesi Helicobacter pylori kaynaklı ülsere karşı değerlendirilmiştir. Ekstraktlar farklı bölgelerden sağlanmış ticari mercanköşklerle karşılaştırılmıştır. Toplam fenolik içeriği %60 etanol ekstraktlarında en yüksek bulunmuştur. Çalışmada uygulanan ABTS + yöntemi ile toplam fenolik miktarı arasında korelasyon vardır. Mercanköşk ekstraktlarının fenolik profilleri (protokateşuik asit, kafeik asit, kumarik asit, rozmarinik asit, kuersetin) HPLC ile analizlenmiştir. C 6 C 1 COOH fenolik ve C 6 C 3 COOH hidroksisinnamik asitlerin fizikokimyasal özellikleri arasındaki farklılığın H.pylori gelişmesini engellediği varsayılmaktadır. Apak ve arkadaşlarının [37] yaptığı çalışmada, demlenerek hazırlanan bazı endemik bitki örneklerinin toplam antioksidan kapasitesi, bakır(ii) iyonu indirgeme antioksidan

56 36 kapasite tayini olarak kısaltılan CUPRAC yöntemiyle belirlenmiştir. Türkiye nin yerel marketlerinden temin edilen bitkilerden siyah çay dışındaki en yüksek antioksidan kapasite, fare kulağıçuha çiçeği (Anagallis arvensis), fesleğen (Ocimum basilicum), yeşil çay (Camellia sinensis) ve oğulotu (Melissa officinalis) bitkilerinde sırasıyla; 1.63, 1.18, 1.07, ve 0.99 mmol Troloks eşdeğeri (TR)/g kapasite ile belirlenmiştir. Demlenerek hazırlanan, hazır poşet çay örneklerinde en yüksek CUPRAC değerleri, Ceylon harmanlanmış klasik çay (4.41), limonlu yeşil çay (1.61), klasik İngiliz çayı (1.26) ve yeşil çay (0.94) saptanmıştır. Adaçayı, kekik, kişniş, öksürük otu, böğürtlen ve altın otunun kapasite değerleri ise 0.5 mmol TR/g civarında belirlenmiştir. Bitkisel çayların Folin yöntemiyle bulunan toplam fenolik içerikleri, CUPRAC ve ABTS toplam antioksidan kapasite yöntemleri ile sırasıyla ve korelasyon katsayıları ile doğrusallık göstermektedir. Güçlü ve arkadaşlarının [38] yaptığı çalışmada, Malatya nın 5 farklı bölgesinden temin edilen taze, güneşte ve sülfitlenerek kurutulmuş kayısı örneklerinin antioksidan kapasitesi, CUPRAC, ABTS ve toplam polifenol ölçümleri Folin yöntemleri ile yapılmıştır. CUPRAC yöntemi ile renk veren sülfit, kuvvetli bazik anyon değiştirici reçinede ph 3 te HSO 3 formunda toplanarak ayrılmıştır. CUPRAC yönteminin ABTS ve Folin yöntemleri ile korelasyonu (0.93) uygun bulunmuştur. Saf flavonoidlerin ve standart katkı yapılmış kayısı ekstraktlarının kalibrasyon doğruları paralellik göstermektedir. CUPRAC yöntemi ile yapılan bu çalışma, hem toplam antioksidan kapasite hem de çeşitli kayısı örneklerinin sülfit miktarını belirlemektedir. Toker ve arkadaşları [92], Tilia platyphyllos (ıhlamur) türlerinin, çiçek, taç yaprak ve yapraklarının flavonoid bileşimini, geliştirdikleri ters fazhplc yöntemi ile değerlendirmişlerdir. Sonuçlar, Türkiye de yetişen iki ıhlamur türünün (Tilia rubra ve Tilia argentea ) belirtilen kısımlarında karşılaştırılmıştır. Her iki türün yapılan HPLC analizleri sonucu, çiçek kısımlarında kuersetin3,7diramnozid, izokuersitrin+rutin, kuersitrin ve astragallin, taç yaprak ve yaprak kısımlarında ayrıca kamferol3,7 diramnozid belirlenmiştir. Tilia argentea türünün çiçek, taç yaprak ve yaprak kısımlarında farklı miktarlarda tiliozid saptanmıştır.

57 37 Exarchou ve arkadaşlarının [93] yaptığı çalışmada, eczacılıkta kullanılan bazı metanollü bitki ekstaktlarında, antioksidanların hızlı bir şekilde belirlenmesi için birleştirilmiş kromatografik yöntemlerden yararlanılmıştır. Tilia europea (ıhlamur), Urtica dioica (ısırgan), Lonicera periclymenum (hanımeli) ve Hypericum perforatum (sarı kantaron) un metanollü ekstraktlarındaki antioksidan bileşenler öncelikle online DPPH ve ABTS radikal süpürme yöntemleri ile görüntülenmiştir. Analitlerin yapısal yorumu LCMS ve LCMSSPENMR ile belirlenmiştir. UV, NMR ve MS uygulama esaslı çalışmada, ekstraktların antioksidan bileşenleri olarak hem flavonoid glikozidleri hem de mono ve dikaffeoilkuinik asitler bulunmuştur. Urbonavičiūtė ve arkadaşlarının [94] yaptığı çalışmada, alıç (Crataegus monogyna Jacq.) adlı bitkinin yaprak ve filiz kısımlarının sulu etanol ekstraktları kapiler bölge elektroforezi ile analizlenmiştir. Ekstraktın kalitatif bileşimi ve flavonoid miktarı üzerinde bitki örtüsünün etkisi incelenmiştir. Farklı sulu etanol derişimleri (% 4096) ile ekstraksiyon yapılarak örnek hazırlanmış ve flavonoidlerin geri kazanımında ekstraktant bileşiminin etkisi araştırılmıştır. Kapiler bölge elektroforezi ile elde edilen sonuçlar, spektrofotometrik ve HPLC analizleri ile karşılaştırılmış ve etanollü alıç ekstraktlarında; rutin, viteksin2 Oramnozid, viteksin, hiperosid, klorojenik asid belirlenmiştir. Flavonoidlerin bozunmasında ekstraktın saklanma koşullarının etkisi de (güneş ışığı, sıcaklık, saklama süresi) incelenmiştir. Justesen ve arkadaşlarının [95] yaptığı çalışmada bazı meyve, sebze ve içeceklerdeki flavonol, flavon, ve flavononları miktarlandırmak ve belirlemek için, fotodiyot array ve kütle spektrometrik dedeksiyonlu yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayırma yöntemi geliştirilmiştir. Dondurularak kurutulmuş gıdaların asit hidrolizinden sonra, bileşikler aglikon olarak analizlenmiştir. Gıda bileşimindeki flavonoidler, ticari standartların alıkonma zamanları, UV ve kütle spektrumları ile karşılaştırılmış ve flavonoid içerikleri pik alanları ile hesaplanmıştır. Çalışmada analizlenen kereviz yaprağında apigenin ve luteolin; ıhlamurda hesperetin, naringenin ve kuersetin; maydanozda apigenin, kamferol ve luteolin belirlenmiş ve miktarlandırılmıştır. Justesen ve arkadaşlarının [96] yaptığı başka bir çalışmada, sıklıkla tüketilen 15 taze bitkinin flavonoid miktarı belirlenmeye çalışılmıştır. Bu amaçla, fesleğen, frenk soğanı,

58 38 kişniş, tere, dereotu, oğulotu, selamotu, mercanköşk, maydanoz, biberiye, adaçayı, nane, tarhun, kekik ve su teresi taze bitkileri HPLC ve kütle spektrometrisi ile analizlenmiştir. Asit hidrolizinden sonra, 5 temel aglikon flavonoid olarak apigenin, izoramnetin, kamferol, luteolin ve kuersetin belirlenmiş ve miktarlandırılmıştır. En yüksek flavonoid miktarları, maydanozda ( mg apigenin/100 g), selamotunda (170 mg kuersetin/100 g), nanede (18100 mg apigenin/100 g, ayrıca luteolin) ve dereotunda ( mg kuersetin/100 g, ayrıca kamferol ve izoramnetin) belirlenmiştir. Areias ve arkadaşları [97] yaptıkları çalışmada, nanede 10 fenolik bileşiği (eriodiktol7 Orutinozid, eriodiktol7oglikozid, luteolin7orutinozid, luteolin7oglikozid, hesperetin7orutinozid, apigenin7orutinozid, rozmarinik asit, 5,6dihidroksi 7,8,3,4 tetrametoksiflavon, pebrellin ve gardenin B) belirlemek için bir tersfaz yüksek performanslı sıvı kromatografisi yöntemi geliştirmişlerdir. Ekstraksiyon için farklı organik çözücüler denenmiş, etanolün kalitatif ve kantitatif değerlendirme için en uygun çözücü olduğuna karar verilmiştir. HPLC de en iyi ayrım, sufosforik asit (999:1) ve asetonitril ikili çözücü sisteminin gradienti ile elde edilmiştir. Geliştirilen yöntem 14 nane örneğine uygulanmıştır. Karakaya ve arkadaşlarının [98] yaptığı çalışmada, ısırgan (Urtica sp.), kuşburnu (Rosa cannina), adaçayı (Salvia officinalis), ıhlamur çiçeği (Tilia platyphyllos), siyah çay, şalgam suyu (Daucus carota L. spp sativus), üzüm pekmezi, bal ve tarhana örneklerinin kuersetin, luteolin, apigenin ve kamferol içerikleri HPLC ile belirlenmiştir. Siyah çay ve ıhlamur çiçeğinde kuersetin ve kamferol; adaçayında kuersetin ve luteolin, kuşburnu, şalgam suyu, tarhana ve üzüm pekmezinde kuersetin; balda apigenin ve kamferol; ısırganda kuersetin ve apigenin temel bileşenler olarak belirlenmiştir.

59 39 3. MALZEME VE YÖNTEM 3.1. KULLANILAN CİHAZLAR Bu çalışmada kullanılan cihazlar; kimyasal madde ve bitki örneklerini tartmak için ShimadzuAX 200 analitik terazi, ph ölçümleri için Metrohm Herisau E512 ph metre, ekstraksiyon işlemleri ve kimyasal maddelerin çözünmesine yardımcı olmak için Bransonic 221 ultrasonik banyo, inkübasyon işlemleri için 10 kademeli Clifton su banyosu, hidroliz işlemleri için HB4 basic KIKAWERKE su banyosu, çözeltileri karıştırmak için Elektromag girdap karıştırıcı, bitki örneklerinin kurutulmasında Telstar Cryodos freezedryer, bidistile su temini için Millipore Simpak 1 Synergy 185 bidistile su sistemi, absorbans ölçümleri için Cary 1E UVVis spektrofotometre, HPLC ayrımları için Perkin Elmer Series 200 UVVis dedektör, Perkin Elmer Series 200 pompa, Perkin Elmer Series 200 vakum degazer, Perkin Elmer 600 Series Link Chromatography ara yüzey (interface) ve Hamilton marka 250 x 4.6 mm, HxSil 5 µm C18 HPLC kolonudur KİMYASAL MADDELER Kullanılan kimyasal maddeler; gallik asit (Fluka), kateşin (Fluka), klorojenik asit (Sigma), kafeik asit (Aldrich), ferulik asit (Aldrich), pkumarik asit (Aldrich), naringin (Aldrich), naringenin (Sigma), hesperidin (Fluka), hesperetin (Sigma), rutin (Sigma), izokuersitrin (Fluka), kuersetin (Fluka), mirisetin (Acros Organics), rozmarinik asit (Fluka), kamferol (AppliChem), luteolin (Alfa Aesar), apigenin (Alfa Aesar), askorbik asit (SigmaAldrich), bakır(ii)klorür dihidrat (CuCl 2.2H 2 O) (Merck), amonyum asetat (Riedelde Haën), neocuproin (2,9dimetil1,10fenantrolin) (SigmaAldrich), ABTS (2,2 azinobis[3etilbenzotiazolin6sulfonat]) (Fluka), potasyum persülfat (K 2 S 2 O 8 ) (Merck), % 96 lık etanol (Riedelde Haën), metanol (Merck), aseton (Riedelde Haën), % 37 lik hidroklorik asit (Merck), mfosforik asit (Sigma), ofosforik asit (Merck), potasyum hidroksit (Merck), sodyum hidroksit (Merck) ve tannik asittir (General Chemical Company).

60 Çözeltilerin Hazırlanması Gallik asit, kateşin, klorojenik asit, kafeik asit, ferulik asit, pkumarik asit, naringin, naringenin, hesperetin, rutin, izokuersitrin, kuersetin, mirisetin ve luteolin stok çözeltileri metanolde; rozmarinik asit ve kamferol stok çözeltileri etanolde; apigenin (bazik ortamda çözündüğünden) stok çözeltisi KOH ve etanol karışımında; hesperidin (bazik ortamda çözündüğünden) KOH ve bidistile su karışımında; askorbik asit % 1 lik mfosforik asitte; tannik asit % 70 metanolde çözüldü. Tüm stok antioksidan çözeltileri 20 o C de saklanarak kullanıldı. CUPRAC yönteminde; 1.0 x 10 2 M Cu(II) klorür çözeltisi ve 1 M amonyum asetat tampon (ph 7) çözeltisi distile suda, 7.5 x 10 3 M neokuproin çözeltisi % 96 lık etanolde hazırlandı. ABTS yönteminde; ABTS radikal çözeltisi 7 mm ABTS ve 2.45 mm potasyum persülfat içerecek şekilde suda hazırlanıp 1216 saat karanlıkta ve oda sıcaklığında bekletilerek kullanıldı BİTKİ ÖRNEKLERİNİN ANALİZE HAZIRLANMASI Bitki Örneklerinin Kurutulması Yaş maydanoz, kereviz, dereotu, nane, ısırgan örnekleri semt pazarlarından temin edilerek yaprak kısımları freezedryer da 40 o C de 814 saat süreyle kurutuldu. Ihlamur, kekik, mercanköşk, civanperçemi, arslanpençesi, adaçayı örnekleri kurutulmuş haliyle yerel marketlerden temin edildi. Tüm bitki örnekleri karanlıkta, oda sıcaklığında ve ağızları kapalı cam erlenler içerisinde saklandı. Analizleri öncesinde porselen havan ve tokmak kullanarak, ince toz haline gelinceye kadar öğütülüp analizlendi Bitki Örneklerinin Ekstraksiyonu Kurutulmuş Bitki Örneklerinin Ekstraksiyonu Maydanoz yaprakları metanol, etanol ve asetonun % 100; 70; 50 (v/v) oranları ve sadece bidistile su ile, kurutulmuş kereviz yaprakları ise % 70 ve 50 metanol; %50 etanol ile ekstrakte edildi. Diğer bitki örnekleri % 70 metanol ile ekstrakte edildi. Bunun için yaklaşık 1 g tartılan kurutulmuş örnekler önce çözücünün 15 ml si ile 45

61 41 dakika, 5 ml daha ilave edilerek ikinci bir 45 dakika ve en son 5 ml daha çözücü ilavesi ile 15 dakika (toplam 105 dakika) ultrasonik banyoda, ağızları kapalı cam erlenler içinde ekstrakte edildi. Bitki ekstraktları önce süzgeç kağıdından, daha sonra GF/PET (Glass fiber/polietilentereftalat) 1.0/0.45 µm lik enjektör uçlu mikro filtreden geçiririlerek analizlendi. Çalışılan tüm bitki ekstraktlarının (kendi çözücüleri ile 50 veya 100 kat seyreltilerek) aynı çözücülere karşı nm arasında spektrumu alındı Yaş Maydanozda C Vitamini Analizi İçin Ekstraksiyon Maydanoz yaprakları önce mutfak robotundan geçirilip daha sonra porselen havanda dövüldü. Bu örnekten yaklaşık 5 g alınarak % 1 lik (w/v) mfosforik asitin 25 ml si ile 45 dakika ultrasonik banyoda ağzı kapalı cam erlen içerinde ekstrakte edildi [99]. Ekstrakte edilen kısım alınarak, katı örnek üzerine tekrar bir 25 ml % 1 lik mfosforik asit ilavesi yapıldı. 45 dakika daha ekstraksiyona aynı şekilde devam edilip (toplam 90 dakika) toplanan ekstraktlar önce % 1 lik mfosforik asit ile ıslatılmış süzgeç kağıdından daha sonra mikro filtreden geçirilerek analizlendi Bitki Örneklerinin İnfüzyonu (Demlenmesi) Yaklaşık 1 g olarak tartılmış kurutulmuş adaçayı, ısırgan ve nane bitkileri 50 ml bidistile kaynar su içinde 5 dakika infüze edildi (demlendi). Demlenmiş örnekler önce süzgeç kağıdından daha sonra mikro filtreden geçirilerek analizlendi Bitki Örneklerinin Hidrolizi Bitki Ekstraktlarının Hidrolizi Bunun için % 70 ve 50 metanollü maydanoz yaprak ekstraktları ve % 70; 50 metanollü ve % 50 etanollü kereviz yaprak ekstraktları son derişimi % 50 metanol ve 1.2 M HCl olacak şekilde 80 o C de 4 saat hidroliz edildi [100]. Diğer bitki örneklerinin % 70 metanollü ekstraktları ısırgan ve kekik örnekleri için 80 o C de 4 saat; ıhlamur, nane, mercanköşk, arslanpençesi, adaçayı, civanperçemi ve dereotu örnekleri için 80 o C de 2 saat, son derişimi % 50 metanol ve 1.2 M HCl olacak şekilde hidroliz edildi. % 70 metanollü bitki ekstraktların hidrolizinde; [ 6 ml % 70 metanollü ekstrakt + 5,8 ml metanol + 2 ml derişik HCl + 6,2 ml bidistile su ] içeren karışım hidroliz edildi (son derişim % 50 metanol ve 1.2 M HCl). Hidroliz sonunda hidrolizat hacmi hidroliz balonunu yıkamak suretiyle 25 ml ye metanolle tamamlandı, mikro filtreden süzülerek analizlendi.

62 42 Çalışılan tüm bitki ekstrakt hidrolizatlarının (% 50 metanol ile 50 veya 100 kat seyreltilerek) % 50 metanole karşı nm arasında spektrumu alındı Katı Bitki Örneklerinin Hidrolizi Yaklaşık 0,2 g olarak tartılmış kurutulmuş bitki örneğine 16 ml % 62.5 metanol ve 4 ml 6 M HCl ilave edilerek (son derişim % 50 metanol ve 1.2 M HCl) 80 o C de maydanoz, kereviz yaprağı, ısırgan ve kekik bitkileri için 4 saat; adaçayı, arslanpençesi, civanperçemi, dereotu, ıhlamur, mercanköşk ve nane bitkileri için 2 saat hidroliz işlemi uygulandı. Hidroliz sonunda hidrolizat önce metanolle ıslatılmış süzgeç kağıdından süzülüp katı örnek ve hidroliz balonunu metanolle yıkamak suretiyle hacmi 25 ml ye metanolle tamamlandı, mikro filtreden süzülerek analizlendi. Çalışılan tüm katı bitki örnek hidrolizatlarının (% 50 metanol ile 50 veya 100 kat seyreltilerek) % 50 metanole karşı nm arasında spektrumu alındı Demlenmiş Bitkilerin Hidrolizi Nane, adaçayı ve ısırganın demlenme ile hazırlanmış çözeltilerinin hidrolizi; sadece asit ile (son derişim 1.2 M HCl olacak şekilde ) ve asit + metanol (son derişimde % 50 metanol ve 1.2 M HCl) ile olmak üzere iki şekilde gerçekleştirildi. Sadece asit ile yapılan hidrolizde; 12 ml demlenmiş bitki çözeltisi + 4 ml 12 M HCl + 24 ml su içeren karışım 80 o C de 2 saat hidroliz edildi. Son hacim 50 ml ye bidistile su ile tamamlandı. Mikro filtreden geçirilerek analizlendi. Asit + metanol ile yapılan hidrolizde; 12 ml demlenmiş bitki çözeltisi + 20 ml metanol + 4 ml 12 M HCl + 4 ml su içeren karışım 80 o C de 2 saat hidroliz edildi. Son hacim 50 ml ye metanolle tamamlandı. Mikro filtreden geçirilerek analizlendi SENTETİK KARIŞIMLARIN HAZIRLANMASI Sentetik Karışım1 Mirisetin, izokuersitrin, luteolin, kamferol, apigenin, rozmarinik asit stok çözeltilerinden belirli hacimler alınarak son derişimleri 2 x 10 4 M olacak şekilde 50 ml lik sentetik karışım1 çözeltisi hazırlandı. Karışımdan 5 ml alınarak; üzerine 10 ml metanol, 2 ml derişik HCl ve 3 ml su (son derişimi % 50 metanol ve 1.2 M HCl)

63 43 ilavesi yapıldı. Bu şekilde hazırlanan hidroliz karışımı 2 saat ve 4 saat 80 o C de hidroliz edildi. Son hacim 25 ml ye metanolle tamamlandı Sentetik Karışım2 Mirisetin, izokuersitrin, luteolin, kamferol ve apigenin stok çözeltilerinden belirli hacimler alınarak son derişimleri 2 x 10 4 M olacak şekilde 25 ml lik sentetik karışım2 çözeltisi hazırlandı. Karışımdan 8 ml alınarak; üzerine 10 ml metanol ve 2 ml derişik HCl (son derişimi % 50 metanol ve 1.2 M HCl) ilavesi yapıldı. Bu şekilde hazırlanan hidroliz karışımı 2 saat ve 4 saat 80 o C de hidroliz edildi. Son hacim 25 ml ye metanolle tamamlandı UYGULANAN YÖNTEMLER Spektrofotometrik Yöntemler CUPRAC Yöntemi Normal Metod Bir deney tübü içerisine sırasıyla 1 ml 1.0 x 10 2 M Cu(II) klorür çözeltisi, 1 ml 1 M amonyum asetat tampon (ph 7) çözeltisi, 1 ml 7.5 x 10 3 M neokuproin çözeltisi ilave edildi. Daha sonra x ml antioksidan çözeltisinden ve son olarak (1,1 x) ml distile su ilave edilerek çözeltiler karıştırıldı. Tüpler oda sıcaklığında ağzı kapalı olarak 30 dakika bekletildi. Süre sonunda çözeltilerin içinde örnek bulunmayan referans çözeltiye karşı 450 nm deki absorbansları ölçüldü [36]. Mirisetin için 3.66 x 10 6 M 1.34 x 10 5 M, izokuersitrin için 1.83 x 10 6 M 1.65 x 10 5 M, luteolin için 2.33 x 10 6 M 2.09 x 10 5 M, kamferol için 4.88 x 10 6 M 4.39 x 10 5 M, apigenin için 1.83 x 10 5 M 6.70 x 10 5 M, rozmarinik asit için 1.83 x 10 6 M 6.70 x 10 6 M, kuersetin için 1.95 x 10 6 M 9.76 x 10 6 M, askorbik asit için 9.76 x 10 6 M 4.88 x 10 5 M derişim aralığında çalışılarak normal metod uygulandı. Kalibrasyon doğruları oluşturulup, molar absorplama katsayıları hesaplandı. Sentetik karışım1, sentetik karışım2 çözeltilerine ve bunların 2 saat ile 4 saat hidroliz işlemi uygulanmış çözeltilerine yöntem uygulanıp antioksidan kapasite değerleri hesaplandı.

64 44 Bitki ekstraktları ve demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltileri % 50 etanol ile uygun oranlarda seyreltilerek; bitki ekstrakt hidrolizatları, katı bitki hidrolizatları ve demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltilerinin hidrolizatlarından antioksidan kapasitesi düşük olanlar (maydanoz, kereviz yaprağı, ısırgan) 2 M NaOH ile nötralleştirildikten sonra % 50 etanol ile, kapasitesi yüksek olanlar ise (kekik, ıhlamur, nane, mercanköşk, arslanpençesi, adaçayı, civanperçemi ve dereotu) doğrudan % 50 etanol ile uygun oranlarda seyreltilerek normal metod uygulandı ve toplam antioksidan kapasiteleri hesaplandı. İnkübasyonlu Metod Normal metoda göre hazırlanmış çözeltiler ağızları kapatılarak 50 o C lik su banyosunda 20 dakika bekletilerek inkübe edildi. Süre sonunda tüpler soğuk su içinde birkaç dakika soğutuldu. Tüplerin ağızları açılıp tekrar karıştırıldıktan sonra içinde örnek bulunmayan referans çözeltiye karşı 450 nm deki absorbansları ölçüldü [36] ABTSPersülfat Yöntemi Bir deney tübü içerisine sırasıyla; (4 x) ml etanol ve x ml antioksidan çözeltisinden ilave edildi. Bu şekilde hazırlanan örnek çözeltileri ve sadece 4 ml etanol içeren çözelti üzerine (radikal çözeltisi) 15 şer saniye aralıklarla 1 ml 1:10 oranında etanolle seyreltilmiş ABTS radikal çözeltisinden katıldı. Çözeltiler karıştırılıp, 6. dakika sonunda etanole karşı 734 nm deki absorbansları ölçüldü. Radikal çözeltisinin absorbansından, örnek içeren çözeltinin absorbansı çıkarılarak A absorbans değerleri hesaplandı [40]. Mirisetin için 2.00 x 10 6 M 1.00 x 10 5 M, izokuersitrin için 6.00 x 10 6 M 3.00 x 10 5 M, luteolin için 3.82 x 10 6 M 1.91 x 10 5 M, kamferol için 8.00 x 10 6 M 4.00 x 10 5 M, apigenin için 1.00 x 10 5 M 5.00 x 10 5 M, rozmarinik asit için 4.00 x 10 6 M 2.00 x 10 5 M, kuersetin için 1.60 x 10 6 M 8.00 x 10 6 M, askorbik asit için 8.00 x 10 6 M 4.00 x 10 5 M derişim aralığında ABTS yöntemi uygulanıp, derişime karşı A değerleri kaydedilmek suretiyle kalibrasyon doğruları oluşturularak molar absorbsiyon katsayıları hesaplandı.

65 45 Sentetik karışım1, sentetik karışım2 çözeltilerine ve bunların 2 saat ile 4 saat hidroliz işlemi uygulanmış çözeltilerine yöntem uygulanıp antioksidan kapasite değerleri hesaplandı. Bitki ekstraktları, demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltileri, bitki ekstrakt hidrolizatları, katı bitki hidrolizatları ve demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltilerinin hidrolizatlarından % 50 etanol ile uygun oranlarda seyreltilerek yöntem uygulandı ve toplam antioksidan kapasiteleri hesaplandı Kromatografik Analizler HPLC Analizi HPLC analizlerinde iki elüsyon programı kullanıldı. Polifenolik bileşiklerin analizi için geliştirilen HPLC metodunda; Metanol (A) ve % 0.2 oh 3 PO 4 içeren bidistile su (B) ikili çözücü sisteminden oluşan hareketli fazın gradient elüsyonu uygulandı. Bunun için 280 nm de pik dedeksiyonuyla ve 1 ml/dakika akış hızıyla; 8 dakika % 7 (A), eğim (0.0); 813 dakika % 30 (A), eğim ( 4.0); 1348 dakika % 66 (A), eğim (1.0); 4855 dakika % 75 (A), eğim ( 4.0) gradient elüsyon kullanıldı. Bu elüsyon metodu ile, Gallik asit, kateşin, klorojenik asit, kafeik asit, ferulik asit, pkumarik asit, naringin, naringenin, hesperidin, hesperetin, rutin, kuersetin, mirisetin, rozmarinik asit, kamferol, luteolin, ve apigenin için 4 x x 10 4 M; izokuersitrin için 4 x x 10 4 M derişim aralığında çalışılarak kalibrasyon doğruları oluşturuldu. % 70 metanolde çözülerek hazırlanan tannik asit çözeltisi, bu çözeltinin 80 o C de 2 saat hidroliz edilen çözeltisi ve 1.5 x 10 3 M 80 o C de 2 saat hidroliz edilen rozmarinik asit çözeltisi analizlendi. Bitki ekstraktları, demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltileri, bitki ekstrakt hidrolizatları, katı bitki hidrolizatları ve demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltilerinin hidrolizatları analizlendi, kalitatif ve kantitatif değerlendirmeleri yapıldı.

66 46 Askorbik asit analizi için; Metanol (A) ve % 0.2 oh 3 PO 4 içeren bidistile su (B) ikili çözücü sisteminden oluşan hareketli fazın izokratik elüsyonu uygulandı. 215 nm de 1 ml/dakika akış hızıyla; 8 dakika % 7 (A), eğim (0.0) izokratik elüsyonu kullanıldı. Bu elüsyon metodu ile; 1 x x 10 3 M derişim aralığında çalışılarak askorbik asit kalibrasyonu oluşturuldu. Yaş maydanozun mfosforik asitli ekstraktında askorbik asit analizi yapıldı. Çalışılan her bitki örneğinin enjeksiyonu öncesinde 10 dakika metanolle kolonu yıkama ve 10 dakika % 7 (A): % 93 (B) ile kolonu dengeleme işlemi gerçekleştirildi.

67 47 4. BULGULAR 4.1. BAZI ANTİOKSİDANLARIN KALİBRASYON DOĞRULARI VE Cu(I)Nc KELATININ GÖRÜNÜR BÖLGE SPEKTRUMLARI CUPRAC yöntemi ile daha önceden çalışılmamış mirisetin, izokuersitrin, luteolin, kamferol, apigenin ve rozmarinik asit standart antioksidanlarına normal metod ve inkübasyonlu metod uygulanarak doğru denklemleri oluşturulmuş ve CUPRAC normal yöntemle kalibrasyon doğruları çizilmiştir. Ayrıca mirisetin, izokuersitrin, luteolin, kamferol ve rozmarinik asit için normal yöntemle, apigenin için inkübasyonlu yöntemle elde edilen Cu(I)Nc kelatının görünür bölge spektrumları çizilerek aşağıda gösterilmiştir. Doğru denklemlerinde verilen; x: derişim, y: absorbans ve r: korelasyon katsayısı karşılığını ifade etmektedir.

68 Mirisetin Tablo 4.1. Mirisetin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri DERİŞİM (mol L 1 ) CUPRAC N ABSORBANSI CUPRAC İ ABSORBANSI 3.66 x x x x x (CUPRAC N ) Doğru Denklemi: y = 7.14 x 10 4 x r = (CUPRAC İ ) Doğru Denklemi: y = 8.91 x 10 4 x r = ,8 Absorbans 0,6 0,4 0, Derişim x 10 6 M Şekil 4.1: Mirisetinin kalibrasyon doğrusu Şekil 4.2: Mirisetinin CUPRAC N spektrumu

69 İzokuersitrin Tablo 4.2: İzokuersitrin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri DERİŞİM (mol L 1 ) CUPRAC N ABSORBANSI CUPRAC İ ABSORBANSI 1.83 x x x x x (CUPRAC N ) Doğru Denklemi: y = 5.24 x 10 4 x r = (CUPRAC İ ) Doğru Denklemi: y = 6.69 x 10 4 x r = ,8 Absorbans 0,6 0,4 0, Derişim x 10 6 M Şekil 4.3: İzokuersitrinin kalibrasyon doğrusu Şekil 4.4: İzokuersitrinin CUPRAC N spektrumu

70 Luteolin Tablo 4.3: Luteolin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri DERİŞİM (mol L 1 ) CUPRAC N ABSORBANSI CUPRAC İ ABSORBANSI 2.33 x x x x x (CUPRAC N ) Doğru Denklemi: y = 4.84 x 10 4 x r = (CUPRAC İ ) Doğru Denklemi: y = 5.85 x 10 4 x r = Absorbans 0,8 0,6 0,4 0, Derişim x 10 6 M Şekil 4.5: Luteolinin kalibrasyon doğrusu Şekil 4.6: Luteolinin CUPRAC N spektrumu

71 Kamferol Tablo 4.4: Kamferol için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri DERİŞİM (mol L 1 ) CUPRAC N ABSORBANSI CUPRAC İ ABSORBANSI 4.88 x x x x x (CUPRAC N ) Doğru Denklemi: y = 2.46 x 10 4 x r = (CUPRAC İ ) Doğru Denklemi: y = 3.57 x 10 4 x r = ,2 Absorbans 0,9 0,6 0, Derişim x 10 5 M Şekil 4.7: Kamferolün kalibrasyon doğrusu Şekil 4.8: Kamferolün CUPRAC N spektrumu

72 Apigenin Tablo 4.5: Apigenin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri DERİŞİM (mol L 1 ) CUPRAC N ABSORBANSI CUPRAC İ ABSORBANSI 1.83 x x x x x (CUPRAC N ) Doğru Denklemi: y = 4.59 x 10 3 x r = (CUPRAC İ ) Doğru Denklemi: y = 1.52 x 10 4 x r = ,4 Absorbans 0,3 0,2 0, Derişim x 10 5 M Şekil 4.9: Apigeninin kalibrasyon doğrusu Şekil 4.10: Apigeninin CUPRAC İ spektrumu

73 Rozmarinik Asit Tablo 4.6: Rozmarinik asit için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri DERİŞİM (mol L 1 ) CUPRAC N ABSORBANSI CUPRAC N ABSORBANSI 1.83 x x x x x (CUPRAC N ) Doğru Denklemi: y = 9.43 x 10 4 x r = (CUPRAC İ ) Doğru Denklemi: y = 1.12 x 10 5 x r = ,6 Absorbans 0,4 0, Derişim x 10 6 M Şekil 4.11: Rozmarinik asitin kalibrasyon doğrusu Şekil 4.12: Rozmarinik asitin CUPRAC N spektrumu

74 BAZI ANTİOKSİDANLARIN MOLAR ABSORPLAMA KATSAYILARI VE TEAC DEĞERLERİ Mirisetin, izokuersitrin, luteolin, kamferol, apigenin, rozmarinik asit, kuersetin ve askorbik asit standart antioksidanlarına uygulanan CUPRAC normal ve inkübasyonlu yöntem ve ABTSPersülfatlı yöntem sonrasında, absorbans ve derişim arasında çizilen kalibrasyon grafiğinin eğiminden molar absorplama katsayıları (ε) bulunarak, bu değerin troloksun molar absorplama katsayısına bölünmesiyle elde edilen troloks eşdeğeri antioksidan kapasiteleri (TEAC) hesaplanmıştır. Yöntemde daha önceden çalışılan troloks, gallik asit, kateşin, klorojenik asit, kafeik asit, pkumarik asit, ferulik asit, naringin, naringenin, hesperidin, hesperetin, rutin için hesaplanan molar absorplama katsayıları ve TEAC değerleri kullanılmıştır [36]. Tablo 4.7 de çeşitli antioksidanların CUPRAC yöntemi ile elde edilen, Tablo 4.8 de ABTS yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları ve Tablo 4.9 da çeşitli antioksidanların CUPRAC ve ABTS yöntemlerine göre elde edilen TEAC değerleri görülmektedir. Tablo 4.7: Çeşitli antioksidanların CUPRAC yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları ANTİOKSİDAN MOLAR ABSORPLAMA KATSAYISI (ε) Lmol 1 cm 1 DOĞRUSAL ARALIK (mol L 1 ) CUPRAC N CUPRAC İ Troloks 1.67 x x x x 10 5 Mirisetin 7.14 x x x x 10 5 Luteolin 4.84 x x x x 10 5 Kamferol 2.46 x x x x 10 5 Apigenin 4.59 x x x x 10 5 İzokuersitrin 5.24 x x x x 10 5 Rozmarinik Asit 9.43 x x x x 10 6

75 55 Tablo 4.8: Çeşitli antioksidanların ABTS yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları ANTİOKSİDAN MOLAR ABSORPLAMA KATSAYISI DOĞRUSAL ARALIK (mol L 1 ) (ε) Lmol 1 cm 1 Troloks 2.60 x x x 10 5 Mirisetin 8.93 x x x 10 5 Luteolin 2.63 x x x 10 5 Kamferol 2.25 x x x 10 5 Apigenin 1.69 x x x 10 5 İzokuersitrin 2.63 x x x 10 5 Rozmarinik Asit 5.99 x x x 10 5 Tablo 4.9: Çeşitli antioksidanların CUPRAC ve ABTS yöntemlerine göre elde edilen TEAC değerleri ANTİOKSİDAN TEAC CUPRAC TEAC N TEAC I TEAC ABTS Mirisetin Kuersetin Kamferol Rutin İzokuersitrin Apigenin Luteolin Kateşin Naringin Naringenin Hesperidin Hesperetin Gallik asit Rozmarinik Asit Ferulik asid pkumarik asid Kafeik asid Klorojenik asid Askorbik asid

76 HPLC İLE ANTİOKSİDANLARIN KALİBRASYON DOĞRULARININ OLUŞTURULMASI Tablo 4.10 da belirtilen standart antioksidanların HPLC de geliştirilen metodla elde edilen alıkonma zamanları ve pik alanları ile derişim arasında çizilen doğru denklemleri görülmektedir. Tabloda verilen t R : Alıkonma Zamanı, y: Pik Alanı, c: Derişim ve r: Korelasyon katsayısını ifade etmektedir. Tablo 4.10: Çeşitli antioksidanların HPLC ile elde edilen doğru denklemleri ve alıkonma zamanları Antioksidan t R (dakika) Doğrusal Aralık (mol L 1 ) Doğru Denklemi Askorbik Asit x x 10 3 y = 3.16 x 10 9 c Gallik Asit x x 10 4 y = 9.04 x 10 9 c Kateşin x x 10 4 y = 3.79 x 10 9 c Klorojenik Asit x x 10 4 y = 9.00 x 10 9 c Kafeik Asit x x 10 4 y = 9.44 x 10 9 c pkumarik Asit x x 10 4 y = 1.48 x c Ferulik Asit x x 10 4 y = 1.05 x c Rozmarinik Asit x x 10 4 y = 9.49 x 10 9 c Naringin x x 10 4 y = 1.69 x c Hesperidin x x 10 4 y = 1.65 x c Rutin x x 10 4 y = 8.79 x 10 9 c İzokuersitrin x x 10 4 y = 6.43 x 10 9 c Mirisetin x x 10 4 y = 5.93 x 10 9 c Naringenin x x 10 4 y = 1.47 x c Hesperetin x x 10 4 y = 1.43 x c Kuersetin x x 10 4 y = 9.12 x 10 9 c Luteolin x x 10 4 y = 9.02 x 10 9 c Kamferol x x 10 4 y = 7.23 x 10 9 c Apigenin x x 10 4 y = 1.04 x c (r)

77 57 Şekil 4.13: Çeşitli standart antioksidanları içeren sentetik karışımın kromatogramı 1. pik: Askorbik Asit; 2.pik: Gallik Asit; 3. pik: Kateşin; 4. pik: Klorojenik Asit; 5.pik: Epikateşin; 6. pik: Kafeik Asit ; 7. pik: p kumarik Asit; 8. pik: Ferulik asit + Sinapik Asit; 9. pik: Naringin; 10. pik: Hesperidin; 11. pik: Rutin + İzokuersitrin; 12. pik: Naringenin; 13. pik: Hesperetin; 14. pik: Kuersetin; 15. pik: Luteolin; 16 pik: Kamferol; 17. pik: Apigenin Şekil 4.14: Rozmarinik asit standartının kromatogramı

78 58 Şekil 4.15: Mirisetin standartının kromatogramı Şekil 4.15 de mirisetin standartının kromatogramı görülmektedir. Kalibrasyon doğrusu 1 numara ile gösterilen pike göre oluşturulmuştur. Şekil 4.16: Askorbik asit standartının kromatogramı Şekil 4.16 da görülen kromatogramda 1 numara ile belirtilen pik askorbik asite aittir. Öncesinde gelen pik askorbik asitin çözünmesinde kullanılan mfosforik asitin pikidir.

79 BİTKİ ANALİZLERİNİN SONUÇLARI Bitki ekstraktları, ekstrakt hidrolizatları, katı bitki hidrolizatları, demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltileri, demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltilerinin hidrolizatlarından antioksidan kapasitesi spektrofotometrik olarak CUPRACnormal, CUPRACinkübasyonlu ve ABTS yöntemleri ile, antioksidan bileşenleri ise HPLC uygulaması ile belirlenmiştir. HPLC de pik alanlarıyla madde derişimleri arasında çizilen kalibrasyon doğruları yardımıyla, bitki örneklerinin bireysel antioksidan içerikleri bulunmuştur. Derişimler bileşenlerin TEAC değerleri ile çarpılmış ve örnek içinde bileşenlerin kuramsal olarak göstermesi gereken kapasiteler belirlenmiştir. Bileşenlerin hesaplanan kapasiteleri toplanarak, bitkinin toplam antioksidan kapasitesi hesaplanmıştır. Bu şekilde HPLC verilerinden toplam antioksidan kapasite hesabına geçilmiştir. Tablo de gösterilen HPLCCUPRAC N, HPLCCUPRAC İ ve HPLCABTS ifadeleri HPLC de belirlenen derişimlerin sırasıyla CUPRACnormal, CUPRACinkübasyonlu ve ABTS yöntemindeki TEAC katsayıları kullanılarak hesaplanan kapasiteyi ifade etmektedir. Hesaplanan bu kapasite değerleri hem kromatografik hem de spektrofotometrik verilere dayandığından bunları ifade ederken her iki enstrümental tekniğin sembolleri kullanılmıştır. (Antioksidan Kapasite) Toplam = n C i i=1 TEAC i (2.17) (c i : i bileşeninin HPLC yoluyla bulunan derişimini; TEAC i : i bileşeninin seçilen kapasite ölçüm yöntemine göre TEAC katsayısını ifade etmektedir.) Maydanoz ( Petroselinum sativum ) Şekil olarak belirtilen spektrumlarda; çeşitli çözücü ve oranları ile ekstrakte edilen maydanoz örneklerinin spektrumları görülmektedir.

80 60 Şekil 4.17: Metanolün farklı oranları ve sadece bidistile su ile ekstrakte edilmiş maydanoz örneklerinin spektrumu Şekil 4.18: Etanolün farklı oranları ile ekstrakte edilmiş maydanoz örneklerinin spektrumu Şekil 4.19: Asetonun farklı oranları ile ekstrakte edilmiş maydanoz örneklerinin spektrumu