Dr. Zeynep Karakaş Dr. Salih Kozan, Dr. Ali Öztuna. İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, e-posta:

Transkript

1 TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ 2014: 4 2 Dr. Zeynep Karakaş Dr. Salih Kozan, Dr. Ali Öztuna İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Gülhane Çocuk Askeri Hematoloji Tıp Akademisi, Onkoloji Tıbbi Bilim Genetik Dalı, İstanbul, Anabilim Türkiye Dalı Başkanlığı, e-posta: zkarakas@istanbul.edu.tr Ankara, Türkiye e-posta: skozan@gata.edu.tr Anahtar Sözcükler Anahtar Sözcükler Alfa talasemi, Genetik, Klinik, Sessiz alfa talasemi taşıyıcı, Ağır alfa talasemi İndüklenmiş taşıyıcı, pluripotent Hb H kök hastalığı, hücre, Hb Pluripotensi, Barts, Hidrops Yeniden fetalis programlama, Rejeneratif tıp İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELERİN GENEL ÖZELLİKLERİ VE TEMEL KAVRAMLAR ÖZET İndüklenmiş pluripotent kök hücreler, spesifik faktörler yardımıyla uyarılmış somatik hücrelerin pluripotent evreye yeniden programlanması sonucu oluşmaktadırlar. Kullanımlarına ilişkin halihazırda etik sınırlamalar bulunan insan embriyo ve oositlerinden sağlanan embriyonel kök hücrelerin aksine; fibroblast, adiposit, keratinosit ve kan gibi farklı orijinli hücrelerden elde edilebilmektedirler. İndüklenmiş pluripotent kök hücre teknolojisi ile hasta spesifik, otolog ve pluripotent kök hücrelerin elde edilebilmesi, bu hücrelerin ilaç çalışmaları, hastalık modellemesi ve rejeneratif tıp alanında kullanımlarının önünü açmıştır. Son yıllarda bu konuda yapılan çok sayıda çalışma bulunmakla birlikte, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin elde edilme ve hedef hücreye farklılaştırma yöntemlerindeki problemler ve aynı zamanda tümör oluşturma potansiyeli, bu hücrelerin klinik uygulamalarına geçilmeden önce yakın gelecekte aşılması gereken engeller olarak önümüzde durmaktadır. Bu derlemede, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin tarihsel gelişimine, mevcut teknolojisine ve olası klinik uygulamalarına ilişkin kısa ve öz bilgiler verilmeye çalışılmıştır. İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELERİN DOĞUŞU İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (İPKH) hikayesi yaklaşık 60 yıl önce Philadelphia dan Briggs ve King ile Cambridge den Gurdon isimli 351

2 :4 2 araştırmacıların, kurbağa yavrusu barsak hücre çekirdeklerini, çekirdeği çıkarılmış kurbağa yumurtalarına transplante etmeleri ile başlamıştır (1). Transplante edilen yumurtalar donör nükleusları ile genetik olarak aynı kurbağa yavrularını oluşturmuştur. Bu çalışma, alıcı yumurta sitoplazmasının transplante edilen çekirdeği bir şekilde sağlıklı erişkin kurbağaya çevirebilecek potansiyeli sağladığı gerçeğini ortaya çıkarmıştır. Somatik hücre nükleer transferi (Somatic cell nuclear transfer) adı verilen bu deney 1990 lı yıllarda memeli türlerinde de denenmiş ve meşhur koyun Dolly nin klonlanmasını sağlamıştır (2) yılında ise, Takahashi ve Yamanaka embriyonel kök hücrelerin (EKH) pluripotensi ve kendini yenileme özelliğini sağlayan 24 faktör üzerinde çalışma yapmışlardır. Oct4 (Octamer 3/4), Sox2 (SRY box-containing gene 2), Klf4 (Kruppel-like factor 4) ve c-myc kombinasyonunun retrovirüs aracılığı ile eksprese edilmesinin fare fibroblast hücrelerini yeniden programlamak için yeterli olduğunu göstermişlerdir ve bu hücrelere İPKH adı verilmiştir (3). Akabinde, belirtilen kombinasyondaki faktörlerin aynı yöntemle insan fibroblast hücrelerini de yeniden programladığını rapor etmişlerdir (4). Aynı zamanda başka gruplar da, Oct4, Sox2, Nanog ve LIN28A dan oluşan farklı kombinasyonlarla İPKH ler elde etmişlerdir (5,6). Bu dönüm noktası çalışmaları nedeniyle Shinya Yamanaka ve Sir John Bertrand Gurdon a, 2012 yılında Fizyoloji ve Tıp alanında Nobel Ödülü verilmiştir. EMBRİYONEL KÖK HÜCRE ile İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRENİN KARŞILAŞTIRILMASI Embriyonel kök hücreler, fare ve insan blastosistlerinden sırasıyla 1981 ve 1998 yıllarında elde edilmelerinden bu yana rejeneratif tıp tedavileri için ümit vaat eden kaynak olmuşlardır. Bunun nedeni ise kültür ortamlarında farklılaşma potansiyellerini ve kendini yenileme özelliklerini korumalarıdır. EKH ler her üç germ yaprağına (endoderm, mezoderm ve ektoderm) farklılaşabilen pluripotent kök hücrelerdir (7,8). İPKH ler de morfolojileri ve pluripotensi belirteçlerinin ekspresyonu açısından Embriyonel kök hücrelere benzemektedirler ve ciddi kombine immün yetmezlikli (SCID) farelere enjekte edildiklerinde üç embriyonel germ yaprağını içerecek şekilde teratom oluşturmaktadırlar. Bu da onların pluripotensi özelliklerini doğrulamaktadır. Hücre ve dokulara farklılaşma özellikleri de EKH ler ile benzerdir (3-6,9) (Tablo 1). İPKH ler benzer pluripotent karaktere sahip olmalarına ve bunu kültür ortamında devam ettirebilmelerine karşın terapötik kullanım açısından EKH lere göre bazı üstün özelliklere sahiptirler. İlk olarak Embriyonel kök hücrelerin izolasyonu, gelişimini tamamladığında yeni bir canlıya dönüşebilecek blastosistin yok edilmesine sebep olduğundan, çeşitli etik ve ahlaki tartışmalara neden olmaktadır. Bu nedenle insan Embriyonel kök hücre araştırma ve kullanımlarına ilişkin düzenlemeler açısından ülkeler arasında farklılıklar bulunmaktadır. İPKH ler çok farklı orijindeki somatik hücrelerden elde edilebildiğinden ve embriyonik materyal manipülasyonunu gerektirmediğinden kullanımlarına ilişkin etik ve yasal sınırlamalar bulunmamaktadır. EKH lerin heterolog kaynaklardan elde edilmesi sebebiyle

3 İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELERİN GENEL ÖZELLİKLERİ VE TEMEL KAVRAMLAR 353 Tablo 1. Embriyonel kök hücre ile indüklenmiş pluripotent kök hücrenin karşılaştırılması Özellik Kültür ortamında çoğalma Embriyonik kök hücre Sınırsız İndüklenmiş pluripotent kök hücre Sınırsız Kaynak Epiblast Farklılaşmış somatik hücre Pluripotensi Pluripotent Pluripotent Kendini yenileme (Self-renewal) Sınırsız Sınırsız TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ Avantaj Dezavantaj Farklılaşmış hücreler için sınırsız kaynak Ahlaki ve etik kaygılar, Doku uyumsuzluğu, Teratom oluşma riski Otolog farklılaşmış hücreler için sınırsız kaynak, Etik sınırlamalar yok Yeniden programlama prosedürü kaynaklı artık DNA veya DNA integrasyonuna bağlı tümörojenite riski, Teratom oluşma riski mevcut olan immün rejeksiyon riski tedavi amaçlı kullanımlarındaki önemli sınırlamalarından biri olarak görülmektedir ve bu konu çeşitli araştırmalarda irdelenmiştir (10,11). İPKH teknolojisinin fonksiyonel otolog hücrelerin eldesini mümkün kılması sebebiyle, rejeneratif tıp uygulamalarını greft rejeksiyon riski minimalize edilmiş kişiselleştirilmiş tedavi boyutuna çevireceği ön görülmektedir (12). YENİDEN PROGRAMLAMA: TRANSKRİPSİYON FAKTÖRLERİ ve HÜCREYE AKTARIM YÖNTEMLERİ Yeniden programlama, farklılaşmanın geriye döndürülerek farklılaşmış hücrelerin tekrar pluripotent hücreler haline dönüştürülme sürecidir. Bu süreç, kromatin yapısının yeniden düzenlenmesiyle birlikte somatik olarak eksprese olan genlerin susturulmasına ve Embriyonel kök hücre genlerinin ifadesinde artışa yol açmaktadır. Yeniden programlamayı anlamak için Embriyonel kök hücrelerdeki Oct4, Sox2, Klf4 ve c-myc in rolü incelenmelidir. Bu transkripsiyon faktörlerinin tümü erken embriyonik gelişim sürecinde pluripotensinin kurulumunda ve/veya sürdürülmesinde önemlidir.

4 :4 1 Transkripsiyon Faktörleri Oct4, Sox2, Klf4; pluripotensi genleri olarak tanımlanan ve EKH lerde yüksek miktarda eksprese edilen genlerin promotor ve enhancer bölgelerini birlikte kullanarak EKH lerin pluripotensi ve kendini yenileme durumlarının devamını sağlamaktadır. Diğer bir EKH spesifik transkripsiyon faktörü olan Nanog da Oct4 ve Sox2 ile birlikte pluripotensi için gereklidir. Oct4, Sox2 ve Klf4, EKH spesifik transkriptomun upregülasyonunda gerekli fonksiyonel sürecin oluşması için yeniden programlama olayında işbirliği yapmaktadır. EKH lerde bu faktörlerin tek başlarına etkileri ise genellikle transkripsiyonel baskılanma şeklindedir. İyi bilinen proto-onkogen ve hücre döngüsü düzenleyicisi olan c-myc in ise EKH lerdeki hedef genleri Oct4, Sox2 ve Klf4 dan büyük ölçüde farklıdır ve ayrı bir transkripsiyonel ağ oluşturmaktadır. c-myc, İPKH lerin oluşumunda vazgeçilmez değildir ancak yeniden programlamanın kinetiklerini ve etkinliğini arttırıcı etkisi bulunmaktadır. Bu faktörlerin fonksiyonlarına ilişkin daha ayrıntılı bilgi Pei (13), Ralston-Rossant (14) ve Ng-Surani nin (15) derlemelerinde bulunabilir. Hücreye Aktarım Yöntemleri İPKH eldesine yönelik yeniden programlama faktörlerinin hücreye veriliş yöntemleri viral (retrovirüs, lentivirüs, adenovirüs, sendai virüs) ve viral olmayan (piggybac transpozon, plazmid vektör, epizomal vektör, minicircle vektör, mirna, mrna, protein ve küçük moleküller) olmak üzere iki başlık altında toplanabilir (Tablo 2). Tablo 2. Yeniden programlamada kullanılan hücreye aktarım yöntemleri Aktarım yöntemi Vektör Avantajları Dezavantajları Kaynakça Retroviral Yüksek verimlilik Genomik integrasyon, Tümör oluşumu 4,9 Yüksek verimlilik, Viral Lentiviral Adenoviral Transgen aktivasyon riskini azaltması Genomik integrasyon yok Genomik integrasyon riski Düşük etkinlik, İnsan sisteminde uygulanabilir değil 5 32 Düşük etkinlik, Sendai virüs Genomik integrasyon yok Viral genlerin olası reaktivasyonu 33

5 İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELERİN GENEL ÖZELLİKLERİ VE TEMEL KAVRAMLAR 355 Viral Olmayan piggybac transpozon Plazmid veya minicircle DNA Epizomal Düşük genomik integrasyon, Self-excision Düşük genomik integrasyon, Büyük DNA fragmentlerini taşıma olasılığı Düşük genomik integrasyon, Büyük DNA fragmentlerini taşıma olasılığı, Kendini replike eder bu sebeple ardışık transfeksiyon gerekmez Genom integrasyonu tamamıyla elimine edilmiş değil, Transpozisyon sonrası pbt geni hala aktif kalabilir Düşük etkinlik, Genom integrasyonu tamamıyla elimine edilmiş değil, Ardışık transfeksiyonlar emek yoğun ve hücreye zarar verici Düşük etkinlik, Genom integrasyonu tamamıyla elimine edilmiş değil 21 34,35 36 TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ Düşük etkinlik, Protein Genomik integrasyon yok Yüksek miktarda saf proteine gereksinim, Kısa yarılanma ömrü 37 mrna Genomik integrasyon yok, Yüksek etkinlik, Kontrol edilebilir hücresel aktarım İmmünojenik etkilere neden olan ardışık transfeksiyonlar gerekli, Pahalı 38 mirna Genomik yok, Oldukça etkin, Hızlı Belirsiz etki mekanizması 39,40 Genomik integrasyon yok, Küçük moleküller İmmünojenik değil, Doz bağımlı, Etkileri geri dönüşümlü, Sinyal yolakları ya da epigenetik mekanizmalarda spesifik hedeflere sahip Fonksiyonları/etkileri spesifik kültür koşullarına son derece bağımlı, Kromatin modifikasyonu yapanlar gen ekspresyon profilini değiştirebilir 31

6 :4 1 Viral Yöntemler Takahashi ve Yamanaka ilk İPKH yi elde ettikleri çalışmalarında transkripsiyon faktörlerinin aktarımını gama retroviral Mo-MLV (Moloney murine Leukemia Virus) temelli vektör kullanarak gerçekleştirmişlerdir. Bunlar, virüs replikasyonu ve paketlenmesi için gerekli proteinleri kodlayan bölgelerin viral genomdan silinmesi sebebiyle replikasyon-defektif vektörlerdir. Defektif gama retrovirüslerin genomları 6-8 kb klonlama kapasitesine sahip olup, kullanımdaki zarf psödotipine göre hedefindeki bölünen hücreleri transdükte edebilirler. Aktif olarak bölünen hücrelerde transgen aktarım verimlilikleri %90 a kadar ulaşabilmektedir, ancak kullanımlarını kısıtlayan önemli bir husus yavaş bölünen veya bölünmeyen hücrelerin gama retrovirüs aracılı transdüksiyona dirençli olmalarıdır. Gama retrovirüslerin en önemli dezavantajı özellikle klinik çalışmalarda insersiyonel mutageneze bağlı malignite gelişme riskidir (16). HIV-1, HIV-2 (insan), SIV (simian) ve EAIV den (at) derive edilen, retrovirüslerin ayrı bir grubu olan, lentivirüsler de İPKH eldesinde başarılı şekilde kullanılmışlardır ve gama retrovirüslerden farklı olarak bunlara bağlı malignite gelişimi şu ana kadar bildirilmemiştir. Lentivirüslerin en önemli özelliği hem bölünebilen hem de bölünmeyen hücreleri transdükte edebilmeleridir ve böylelikle birçok hücre tipinden İPKH eldesine imkan vermektedirler. Ayrıca, klonlama kapasiteleri gama retrovirüslere göre daha fazladır (18 kb ye kadar) ve özellikle insan hücrelerinde transdüksiyon verimlilikleri daha yüksektir (17). Adenovirüsler bölünen ve bölünmeyen birçok hücre tipini infekte edebilmeleri ve genoma entegre olmamaları sebebiyle İPKH eldesinde denenmişlerdir. Ancak adenovirüslerin de bazı dezavantajları görülmüştür ki bunlar; İPKH eldesinde verimliliklerinin düşük olması, bölünen hücrelerde hızla kaybolmaları ve gen ekspresyon düzeylerini tutarlı ve yeterli olarak uzun süre devam ettirememeleridir. Bu sebeple programlama sırasında birkaç kez kullanılmaları gerekmektedir (18). İPKH eldesinde kullanılan viral yöntemlerden bir diğeri de F proteininden yoksun olan (F-deficient) sendai virüsüdür (SeV). Bunlar infekte ettikleri hücrenin sitoplazmasında negatif sens tek zincirli RNA şeklinde replike olurlar ve genoma entegre olmazlar. Birçok dokuda yeterli transdüksiyon verimliliği sağlamaları, insan hücreleri için düşük sitotoksisiteye sahip olmaları ve gen ekspresyon düzeylerinin kontrol edilebilmesi olumlu özellikleridir. En önemli dezavantajları ise konak hücreden uzaklaştırılmaları için hücrelerin çok sayıda pasajlanması gerekliliğidir (19). Viral Olmayan Yöntemler Transpozonlar, genom içerisinde bir pozisyondan diğerine eksizyon/ insersiyon mekanizması ile gidebilen hareketli genetik ünitelerdir. piggybac (PB) transpozonlar sadece 13 bp ters terminal tekrarlarına (inverted terminal repeats) ve insersiyon/eksizyonu katalizleyecek aktif transpozas enzimine ihtiyaç duyarlar. Bunlar genomda başka bir pozisyona katılmalarına gerek olmaksızın, dolayısıyla genomda eksojen DNA kalmadan, DNA yı kesme özelliğine sahiptirler. Bu özellikleri PB transpozon/transpozas sistemini genetik olarak temiz İPKH elde etmek için

7 İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELERİN GENEL ÖZELLİKLERİ VE TEMEL KAVRAMLAR 357 somatik hücrelere yeniden programlama faktörlerinin aktarılmasında iyi bir alternatif haline getirmektedir. Bununla birlikte, transpozon ile yapılan yeniden programlamada DNA nın somatik hücrelere aktarımı için kullanılan yöntemlere (lipofeksiyon, elektroporasyon veya nükleofeksiyon) bağlı olarak sınırlamalar oluşabilmektedir çünkü bazı primer hücrelerde direnç ya da toksisite görülebilmektedir. Ayrıca, transpozisyon reaksiyonu her zaman kesin olmamakta, %5 oranında değişiklikler oluşabilmekte ve buna bağlı olarak da elde edilen İPKH genomunda izler bırakabilmektedir. Fare ve insan embriyonik fibroblastlarından PB transpozonlar ile İPKH eldesi gösterilmiştir ancak verimlilikleri orta düzeyde olmuştur ve erişkin cilt fibroblastları gibi zor yeniden programlanan hücreler için kullanılabilirlikleri gösterilememiştir (18,20,21). Virüs içermeyen yeniden programlamada kullanılan yöntemlerden biri de transkripsiyon faktörlerini içeren plazmidler ile somatik hücrelerin transfeksiyonudur. Uygulama kolaylığı ve viral partiküllerin üretimini gerektirmemesi bu yöntemin avantajlarıdır. Ancak bu yöntemle elde edilen yeniden programlama verimliliği virüs tabanlı sistemlere göre oldukça düşüktür. Ayrıca, aktarılan genleri geçici olarak eksprese etmeleri sebebiyle ardışık seri transfeksiyonların yapılmasını gerektirmektedir (18). Plazmid vektörler memeli hücrelerinde replike olamadıklarından, aktarılan genleri geçici olarak eksprese edebilirler. Ancak orip/epstein-barr nükleer antijen-1 (orip/ebna-1) gibi epizomal tabanlı vektörler bölünen ve bölünmeyen hücrelerde genoma entegre olmaksızın ilave kromozomal otonom parçalar olarak replike olmaktadırlar. Bu vektörler ilaç seçiciliği baskısı altında varlıklarını stabil epizomlar olarak devam ettirilebilmektedirler ve ilacın uzaklaştırılmasını müteakiben artan biçimde kaybolmaktadırlar. Uygulanmaları plazmid vektörlere göre daha kolay olmakla birlikte, yeniden programlama verimlilikleri plazmid vektörler gibi virüs tabanlı yöntemlerden düşüktür (18). Bakteriyel omurgası çıkarılmış, genoma entegre olmayan ve kendini replike etmeyen vektörler olan minicircle lar, plazmid vektörlere göre daha yüksek transfeksiyon verimlilikleri ve daha uzun süreli gen eksprese etme özellikleri sebebiyle İPKH eldesinde kullanılmışlardır. Minicircle DNA ların verimlilikleri virüs tabanlı yöntemlere göre düşük olsa da, kullanımları hali hazırda ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından onaylanmış olduğundan klinik uygulamalar için ümit vaat etmektedir (22). MikroRNA lar (mirna) nükleotid uzunluğunda kodlama yapmayan ve gen ekspresyonu üzerine etkileri bulunan küçük RNA molekülleridir. mirna lar, mrna daki parsiyel komplementer dizilerine bağlanarak ya yıkımlarını arttırırlar ya da translasyonel sessizleştirmeye neden olurlar. Hedef RNA lardaki bağlanma yerleri sadece 3 UTR si (translasyona uğramayan bölge) değildir, kodlayıcı bölgeleri de içeren herhangi bir yere bağlanabilirler. Ayrıca, promotor bölgeleri de hedef alırlar ve uzun kodlanmayan RNA lara (lncrna) bağlanırlar, böylelikle fonksiyon kapasitelerini çok fazla arttırırlar. İnsanlarda 2000 nin üzerinde farklı mirna bulunduğu düşünülmektedir ve birçoğu sekans benzerlikleri nedeniyle aileler olarak yazılmaktadır. Çünkü, birden çok mirna aynı hedefi regüle edebildiği gibi, tek bir mirna da transkripsiyon faktörleri ve kromatin düzenleyicilerini de içeren birçok TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ

8 :4 2 hedefi etkileyebilir. Belirli mirna lar pluripotensiyi düzenleyen genlerin kritik destekleyicisidirler ve EKH lerde yüksek miktarda eksprese olmaktadırlar. mirna lar İPKH eldesinde hem tek başlarına hem de transkripsiyon faktör kombinasyonlarına eklenerek kullanılmışlardır. mirna ların üstünlüğü geleneksel transkripsiyon faktörlerinin kombinasyonlarına göre yaklaşık 100 kat daha verimli ve hızlı olmalarıdır. mirna lar küçük olmaları, kolay sentezlenebilmeleri, kolay transfekte edilebilmeleri ve nispeten kararlı olmaları sebebiyle somatik hücrelerin yeniden programlanmasında ideal bir yöntem olarak görülmektedir. Ancak etki mekanizmaları halen tam olarak bilinmemektedir (23,24). İPKH eldesinde sentetik mrna lar ile somatik hücrelerin transfekte edilmesi de denenmiştir. mrna ların fonksiyon görmesi için hücre çekirdeğine ulaşmaları gerekmediğinden sadece sitoplazmaya transfeksiyonları yeterlidir ve yeniden programlama verimliliğinin yüksek olmasını sağlamaktadır. Ancak mrna ların ömrünün kısa olması tekrarlayan transfeksiyonları ve yüksek miktarda kullanımlarını gerektirmektedir, bu da iş yükünü ve maliyeti arttırmakta, bunun yanı sıra hücrelerde RNA ya karşı kazanılmış immün cevap oluşmasına neden olmaktadır (25,26). Yeniden programlama faktörleri yerine proteinlerin kullanılması özellikle biyoteknoloji firmaları tarafından insan uygulamaları kapsamında İPKH teknolojisinin ticarileştirilmesi yönünde ilgili çekici bulunmaktadır. Ancak, proteinlerin yarı ömürlerinin kısa olması, yüksek miktarda protein gerekmesi, programlamanın yavaş ve yeterince verimli olmaması sebebiyle bu yöntem üzerinde daha çalışılması gerekmektedir (27,28). Son olarak, yeniden programlamada ümit vaat eden bir diğer yaklaşım; epigenomik yeniden düzenlenme, proliferasyonun artırılması ve epitelyal fenotipin kazanılması gibi altta yatan moleküler mekanizmalar üzerinde etki gösterecek küçük moleküllerin (kimyasal bileşikler) kullanılmasıdır. Küçük moleküllerin, transkripsiyon faktörleri yerine kullanımını ya da programlama sürecinin kinetiğini ve etkinliğini arttırarak yeniden programlamayı kolaylaştırdığını bildiren çok sayıda çalışma bulunmaktadır. Kullanılan küçük moleküllere valproik asit (histon deasetilaz inhibitörü), BIX01294 (histon metil transferaz inhibitörü) ve PD [MEK (mitogen-activated protein kinase) inhibitörü] örnek olarak verilebilir. Burada unutulmaması gereken husus, bu moleküllerinin çoğunun güçlü DNA ve kromatin düzenleyicileri olduğu ve bu sebeple yeniden programlanmış hücrelerde istenmeyen epigenetik değişikliklere yol açabileceğidir (29-31). İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELERİN KARAKTERİZASYONU İPKH lerin programlanıp programlanmadığı ve pluripotensi düzeyleri fonksiyonel farklılaşma testleri [Teratom ve Embriyonumsu cisim (Embryoid body) oluşumu] ve pluripotensi belirteçlerinin analizi ile ortaya konmaktadır (Tablo 3). Pluripotensi belirteç analizleri, immünhistokimya, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), akım sitometri

9 İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELERİN GENEL ÖZELLİKLERİ VE TEMEL KAVRAMLAR 359 ve mikrodizin (microarray) analizi gibi yöntemlerle yapılabilmektedir. Pluripotensiyi göstermek için Oct4, Nanog, Sox2, Klf4, SSEA3/4, Tra-1-60/81 gibi belirteçler ve alkalen fosfataz boyama kullanılabilir. Fakat İPKH karakterizasyonundaki en önemli test teratom oluşumunun gösterilmesidir. Bu amaçla, elde edilen İPKH ler genellikle SCID farelere verilerek teratom oluşumu takip edilmekte ve yaklaşık 6-8 hafta sonunda kitle ekstirpe edilerek patolojik inceleme ile üç germ yaprağına ait dokular gösterilmektedir (41). Her ne kadar pluripotensinin gösterilmesinde teratom oluşumunun test edilmesi en sık kullanılan ve belirleyici yöntem olsa da bu bile insan somatik hücrelerinin tam programlandığını gösterememektedir. Ancak, amaç ilaç ve toksisite çalışmaları, rejeneratif tıp uygulamaları ve hastalık modellemesi alanlarında kullanılacak uygun kök ve progenitör hücrelerin eldesi ise bu durumda elde edilen hücrelerin teratoma oluşturmaları zorunlu değildir (42). TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ Tablo 3. İndüklenmiş pluripotent hücrelerin karakterizasyonu Deteksiyon yöntemi Belirteçler Yöntemin belirleyici gücü İmmünhistokimya Alkalen fosfataz boyama, Oct4, Nanog, Sox2, Tra-1-60/81, SSEA3/4 Orta Pluripotensi belirteç analizleri Akım sitometri Oct4, Nanog, Sox2, Tra-1-60/81, SSEA3/4 Orta-Yüksek RT-PCR Oct4, Nanog, Sox2, Lin28 Orta-Yüksek Mikrodizin İlgilenilen tüm pluripotensi belirteçleri Orta-Yüksek Fonksiyonel analizler Embriyonumsu cisim oluşumu Teratom oluşumu 3 germ yaprağından çeşitli hücre tiplerine farklılaşma Orta-Yüksek Yüksek İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELERİN UYGULAMA ALANLARI İPKH lerin farklılaşma potansiyelleri ve hasta kişilerden elde edilebilecek olmaları bunların hastalık modelleme, ilaç araştırmaları, rejeneratif tıp uygulamaları gibi çok çeşitli alanlarda kullanılabilmelerine imkan sağlamaktadır.

10 :4 2 İnsan primer hücrelerinin in vitro koşullarda uzun süreli kültür edilememeleri ve hayvan modellerindeki türler arası farklılıklardan dolayı güvenilir hastalık modelleri oluşturmak güçtür. Belirli bir hastalığı olan olgulardan elde edilecek İPKH lerin in vitro koşullarda tekrar farklılaştırılabilecek olması, çok farklı koşullar için daha iyi hastalık modellerinin geliştirilmesini ve hastalık mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. İlk İPKH hücresinin elde edilişinin üzerinden sadece 8 yıl geçmesine rağmen, Orak hücreli anemi, Fankoni anemisi, Jüvenil myelomonositik lösemi, Konjenital megakaryositik trombositopeni, Kronik granülamatöz hastalık gibi hematolojik hastalıklar için modeller oluşturulmuştur (43). Diğer İPKH hastalık modelleme çalışmalarına ilişkin ayrıntılı bilgi Inoue ve ark. nın derlemesinde bulunabilir (44). İPKH hastalık modellerinin geliştirilmesi aynı zamanda o hastalıklara yönelik yeni etkili tedaviler için de fayda sağlayacaktır. Bu kapsamda yeni ilaç geliştirme ve toksisite çalışmaları da yapılabilecektir. Egawa ve ark. tarafından yapılan, amiyotrofik lateral sklerozis (ALS) hastalarının İPKH lerinden elde edilen motor nöronların kullanıldığı bu hastalığın tedavisine yönelik kimyasal molekül çalışması örnek olarak verilebilir (45). Bir diğer uygulama alanı da İPKH lerin rejeneratif tıp çalışmaları kapsamında kişiselleştirilmiş hücre kaynağı olarak kullanımlarıdır. Buradaki nihai hedef tedavi edilecek hastalardan otolog İPKH elde ederek genetik defektin düzeltilmesi ve hücrelerin tekrar farklılaştırılarak tedavi amaçlı kullanılmasıdır. Başarılı ve güvenli şekilde İPKH lerin kullanılabilmesi şu an için mevcut olan bazı engellerin aşılmasıyla mümkün olacaktır (46). KARŞILAŞILAN GÜÇLÜKLER İPKH teknolojisinde hızlı ve umut vaat eden gelişmeler olmasına karşın bu hücrelerin klinik uygulamalara hazır olduğu konusunda temel sorular bulunmaktadır. İlk olarak üzerinde durulması gereken konu yeniden programlama sürecidir. Halihazırda tamamen DNA içermeyen, genomik integrasyon riski bulunmayan, xeno-free ve yeterli verimlilikte yeniden programlama yöntemi bulunmamaktadır (47). İkinci konu; İPKH elde edilmesinde, idamesinde ve farklılaştırılmasında epigenetik ve kromozomal aberasyonlara yol açmayacak, GMP (Good Manufacturing Practice) koşullarını yakalamış hücre kültürü protokollerinin kullanılması gerekliliğidir (47). Üçüncü husus ise, farklılaşmamış kök hücrelerin in vivo teratom oluşturduğu dikkate alındığında, transplantasyon öncesinde tüm İPKH lerin istenilen hücre tipine farklılaştığının gösterilmesi zorunluluğudur (48). Son husus ise zamansal ve ekonomik konulardır. Mevcut teknolojilerle hasta somatik hücrelerinden İPKH elde edilmesi, bunun farklılaştırılması, güvenlik ve kalite testlerinin yapılması yaklaşık 6 ay almaktadır ve her bir hücre hattı için onbinlerce dolar gerekmektedir. Bu sebeple çok sayıda insan İPKH sini üretmek şu an için pek mümkün gözükmemektedir.

11 İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELERİN GENEL ÖZELLİKLERİ VE TEMEL KAVRAMLAR 361 GELECEK İçİn BEKLENTİLER VE SONUÇ Pluripotent özelliğe sahip hücrelerden olan İPKH lerin tedavi temelli yaklaşımlarda gelecekte yer alabilmesi için öncelikle somatik yeniden programlamada kullanılacak teknikler, elde edilen İPKH lerin GMP koşullarında hedef doku ya da hücrelere farklılaştırılması ve kullanılacakları hedef doku veya organlarla in vivo entegrasyonun sağlanması konularındaki yukarıda bahsedilen problemlerin aşılması gerekmektedir. Ancak; bu konuya olan ilginin yoğunluğu, İPKH teknolojilerine yapılan hatırı sayılır büyüklükteki yatırımlar ve 8 yıl gibi kısa bir sürede gelinen şu anki durum göz önüne alındığında yakın gelecekte bu teknolojinin açık ara önde yer almasını bekleyebiliriz. Kaynaklar 1. Gurdon JB, Elsdale TR, Fischberg M. Sexually mature individuals of Xenopus laevis from the transplantation of single somatic nuclei. Nature 1958;182: Campbell KH, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 1996;380: Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006;126: Takahashi, K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007;131: Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007;318: Park IH, Zhao R, West JA, Yabuuchi A, Huo H, Ince TA, Lerou PH, Lensch MW, Daley GQ. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008;451: Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 1981;292: Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998;282: Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 2007;448: Wu DC, Boyd AS, Wood KJ. Embryonic stem cells and their differentiated derivatives have a fragile immune privilege but still represent novel targets of immune attack. Stem Cells 2008;26: English K, Wood KJ. Immunogenicity of embryonic stem cell-derived progenitors after transplantation. Curr Opin Organ Transplant 2011;16: Ebben D, Zorniak M, Clark PA, Kuo JS. Introduction to induced pluripotent stem cells: advancing the potential for personalized medicine. World Neurosurg 2011;76: Pei D. Regulation of pluripotency and reprogramming by transcription factors. J Biol Chem 2009;284: TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ

12 : Ralston A, Rossant J. The genetics of induced pluripotency. Reproduction 2010;139: Ng HH, Surani MA. The transcriptional and signalling networks of pluripotency. Nat Cell Biol 2011;13: Miller AD. Principles of Retroviral Vector Design. In: Coffin JM, Hughes SH, Varmus HE, (eds). Retroviruses. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; Available from: NBK19423/ 17. Kumar M, Keller B, Makalou N, Sutton RE. Systematic determination of the packaging limit of lentiviral vectors. Hum Gene Ther 2001;12: Shao L, Wu WS. Gene-delivery systems for ips cell generation. Expert Opin Biol Ther 2010;10: Macarthur CC, Fontes A, Ravinder N, Kuninger D, Kaur J, Bailey M, Taliana A, Vemuri MC, Lieu PT. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem Cells Int 2012;2012: Kaji K, Norrby K, Paca A, Mileikovsky M, Mohseni P, Woltjen K. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature 2009;458: Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, Desai R, Mileikovsky M, Hämäläinen R, Cowling R, Wang W, Liu P, Gertsenstein M, Kaji K, Sung HK, Nagy A. piggybac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature 2009;458: Jia F, Wilson KD, Sun N, Gupta DM, Huang M, Li Z, Panetta NJ, Chen ZY, Robbins RC, Kay MA, Longaker MT, Wu JC. A nonviral minicircle vector for deriving human ips cells. Nat Methods 2010;7: Bao X, Zhu X, Liao B, Benda C, Zhuang Q, Pei D, Qin B, Esteban MA. MicroRNAs in somatic cell reprogramming. Curr Opin Cell Biol 2013;25: Can A. Uyarılmış pluripotent kök hücreler ve yeniden programlama. In: Can A (eds). Kök hücre- biyolojisi, türleri ve tedavide kullanımları. Ankara, Akademisyen Tıp Kitabevi, Warren L, Wang J. Feeder-free reprogramming of human fibroblasts with messenger RNA. Curr Protoc Stem Cell Biol 2013;27:Unit 4A Steichen C, Luce E, Maluenda J, Tosca L, Moreno-Gimeno I, Desterke C, Dianat N, Goulinet-Mainot S, Awan-Toor S, Burks D, Marie J, Weber A, Tachdjian G, Melki J, Dubart-Kupperschmitt A. Messenger RNA- versus retrovirus-based induced pluripotent stem cell reprogramming strategies: Analysis of genomic integrity. Stem Cells Transl Med Baskıda. 27. Hu K. All roads lead to induced pluripotent stem cells: The technologies of ipsc generation. Stem Cells Dev Baskıda. 28. Hu K. Vectorology and factor delivery in induced pluripotent stem cell reprogramming. Stem Cells Dev Baskıda. 29. Li W, Ding S. Small molecules that modulate embryonic stem cell fate and somatic cell reprogramming. Trends Pharmacol Sci 2010;31: Plath K, Lowry WE. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet 2011;12:

13 İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELERİN GENEL ÖZELLİKLERİ VE TEMEL KAVRAMLAR Lin C, Yu C, Ding S. Toward directed reprogramming through exogenous factors. Curr Opin Genet Dev 2013;23: Zhou W, Freed CR. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells 2009;27: Nishimura K, Sano M, Ohtaka M, Furuta B, Umemura Y, Nakajima Y, Ikehara Y, Kobayashi T, Segawa H, Takayasu S, Sato H, Motomura K, Uchida E, Kanayasu- Toyoda T, Asashima M, Nakauchi H, Yamaguchi T, Nakanishi M. Development of defective and persistent Sendai virus vector: a unique gene delivery/expression system ideal for cell reprogramming. J Biol Chem 2011;286: Gonzalez F, Barragan Monasterio M, Tiscornia G, Montserrat Pulido N, Vassena R, Batlle Morera L, Rodriguez Piza I, Izpisua Belmonte JC. Generation of mouseinduced pluripotent stem cells by transient expression of a single nonviral polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A 2009;106: Jia F, Wilson KD, Sun N, Gupta DM, Huang M, Li Z, Panetta NJ, Chen ZY, Robbins RC, Kay MA, Longaker MT, Wu JC. A nonviral minicircle vector for deriving human ips cells. Nat Methods 2010;7: Okita K, Matsumura Y, Sato Y, Okada A, Morizane A, Okamoto S, Hong H, Nakagawa M, Tanabe K, Tezuka K, Shibata T, Kunisada T, Takahashi M, Takahashi J, Saji H, Yamanaka S. A more efficient method to generate integration-free human ips cells. Nat Methods 2011;8: Cho HJ, Lee CS, Kwon YW, Paek JS, Lee SH, Hur J, Lee EJ, Roh TY, Chu IS, Leem SH, Kim Y, Kang HJ, Park YB, Kim HS. Induction of pluripotent stem cells from adult somatic cells by protein-based reprogramming without genetic manipulation. Blood 2010;116: Warren L, Manos PD, Ahfeldt T, Loh YH, Li H, Lau F, Ebina W, Mandal PK, Smith ZD, Meissner A, Daley GQ, Brack AS, Collins JJ, Cowan C, Schlaeger TM, Rossi DJ. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mrna. Cell Stem Cell 2010;7: Anokye-Danso F, Trivedi CM, Juhr D, Gupta M, Cui Z, Tian Y, Zhang Y, Yang W, Gruber PJ, Epstein JA, Morrisey EE. Highly efficient mirna-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell 2011;8: Miyoshi N, Ishii H, Nagano H, Haraguchi N, Dewi DL, Kano Y, Nishikawa S, Tanemura M, Mimori K, Tanaka F, Saito T, Nishimura J, Takemasa I, Mizushima T, Ikeda M, Yamamoto H, Sekimoto M, Doki Y, Mori M. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature micrornas. Cell Stem Cell 2011;8: Zhang WY, de Almeida PE, Wu JC. Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research. StemBook [Internet]. Cambridge (MA): Harvard Stem Cell Institute; Yamanaka S. A fresh look at ips cells. Cell 2009;137: Kim C. Disease modeling and cell based therapy with ipsc: future herapeutic option with fast and safe application. Blood Res 2014;49: Inoue H, Nagata N, Kurokawa H, Yamanaka S. ips cells: a game changer for future medicine. EMBO J 2014;33: TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ

14 : Egawa N, Kitaoka S, Tsukita K, Naitoh M, Takahashi K, Yamamoto T, Adachi F, Kondo T, Okita K, Asaka I, Aoi T, Watanabe A, Yamada Y, Morizane A, Takahashi J, Ayaki T, Ito H, Yoshikawa K, Yamawaki S, Suzuki S, Watanabe D, Hioki H, Kaneko T, Makioka K, Okamoto K, Takuma H, Tamaoka A, Hasegawa K, Nonaka T, Hasegawa M, Kawata A, Yoshida M, Nakahata T, Takahashi R, Marchetto MC, Gage FH, Yamanaka S, Inoue H. Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells. Sci Transl Med 2012;4:145ra Sng J, Lufkin T. Emerging stem cell therapies: treatment, safety, and biology. Stem Cells Int 2012;2012: Tavernier G, Mlody B, Demeester J, Adjaye J, De Smedt SC. Current methods for inducing pluripotency in somatic cells. Adv Mater 2013;25: Lee AS, Tang C, Rao MS, Weissman IL, Wu JC. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med 2013;19: