Metabo Test INFAI Doğumsal metabolik hastalιklarda NMR tabanlι tarama

Transkript

1 Doğumsal metabolik hastalιklarda NMR tabanlι tarama Doğumsal metabolik hastalιklar: Çocuklarιn dünya çapιndaki bir problemi

2 Ana Merkez Cologne de (RTZ) Fabrika Bochum da INFAI, gelişmiş analitik teknolojiyi medikal tanısal ürünlerin ve yenilikçi farmasötik ürünlerin gelişimine aktarmada liderlik etmektedir. Şirket, kararlı izotopların ve NMR nin gastroenteroloji, metabolik hastalıklar ve onkolojide kullanımına öncülük etmektedir. INFAI nin Cologne, Almanya daki laboratuvarları, en gelişmiş NMR ve NMR görüntüleme araçları ile donatılmıştır. Bu tesisler kurum içi araştırma ve ürün geliştirme için kullanılmaktadır ve aynı zamanda ortak ve sözleşmeli araştırmalar için de kullanılabilmektedir. Son yıllarda bir grup non-invaziv ve oldukça etkili kararlı izotop nefes testleri geliştirdik. Bu testlerden biri ruhsat aldı ve Helicobacter pylori enfeksiyonunun rutin tanısında kullanım için uygundur. Gastrik boşalma oranını ve pankreas yetmezliğini belirlemek için de diğer testler yakında kullanılabilir olacak. NMR spektroskopi ve NMR görüntüleme, bir grup metabolik bozukluğun ve malign durumların araştırılmasında INFAI de kullanılmaktadır. Bu tekniklerin non-invaziv özellikleri, onları özellikle pediatrik kullanım için uygun hale getirmektedir. INFAI, Bruker ile ortaklaşa olarak Türkiye de 12 klinik merkezde yenidoğan taraması için klinik bir çalışma yürütmüştür. Metabo Testi doğumsal metabolizma hataları için geliştirilmiş ve doğrulanmıştır. INFAI nin Avrupa genelinde çeşitli bağlı şirketleri bulunmaktadır. 2 MTI-BOOKLET-TR

3 Yenidoğanlarda metabolik hastalıklara yönelik NMR tabanlı idrar taraması AB ülkelerinde 1500 yenidoğanın yaklaşık 1 inde ve Türkiye de 400 yenidoğanın 1 inde konjenital metabolik hastalıklar görülmektedir. Bu teşhis ve tedavi edilmemiş vakalar irreverzibl organ yetmezlikleri, sakatlık ya da ölüme varan sonuçlar doğurabilmektedir. Günümüzde yürütülmekte olan yenidoğan taraması çalışmaları (fenilketonüri, konjenital hipotiroidi ve biyotinidaz eksikliği), diğer bazı metabolik hastalıklar için yürütülen pilot taramalar ve klinik gözlemler; Türkiyde kalıtsal metabolizma hastalıklarının sıklığının yüksek olduğuna işaret etmektedir. Ancak, bilmekte olduğumuz metabolik hastalıkların sayısı çok daha fazladır. Şu an itibariyle, Tandem-MS (kütle spektrometrisi) ve GC-MS metabolik hastalıkların teşhisinde en çok başvurulan diyagnostik metotlardır. Örneklerin hazırlanması için harcanan süre de göz önüne alındığında bu metotlar tarama için uygun görülmemektedir; araştırma yalnızca şüpheli hastalığın bulunması durumunda uygulanabilirdir. GC-MS aynı zamanda, örnek değiştirme riskiyle türevlendirmeye (derivazitasyon) ihtiyaç durmaktadır. Vücut sıvılarının manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) NMR metodu, 1952 de bu çalışmalarıyla Nobel Ödülü almış Felix Bloch ve Edward Purcell tarafından bulunmuştur. Müteakiben metot geliştirilmiş ve çeşitli alanlarda sıklıkla kullanılmıştır. Temel uygulama alanları, organik kimyada bilinmeyen moleküllerin yapısal analizleri, karakterizasyonları ve miktarlarının belirlenmesidir. Özellikle görüntüleme yönünden tıbbi uygulamaları 1991 yılında Nobel Ödülü ne layık görülen Richard Ernst tarafından geliştirilmiştir. Geçtiğimiz on yılda, NMR spektroskopinin diğer medikal uygulamaları araştırılmış, vücut sıvıları (idrar, serum, serebrospinal sıvı) üzerine yapılan çalışmalarda potansiyel hastalıkların saptanabileceği görülmüştür. Vücut sıvılarının NMR spektroskopisi, noninvazif olması yönünden, bilinen ve bilinmeyen hastalıklarda metabolitlerin hedefe yönelik olan ya da olmayan analizleri için gelecek vadeden alternatif bir yaklaşımdır. 3

4 Kalıtsal metabolik hastalıkların teşhisinde, diğer tekniklerle karşılaştırıldığında bu büyük bir avantajdır. Vücut sıvılarının NMR spektroskopisi gerek bilinen gerekse henüz bilinmeyen doğumsal metabolizma bozukluklarının teşhisinde alternatif analitik bir yaklaşım olarak değerlendirilebilir. İdrar NMR spektrumu Vücut sıvısının 1H-NMR spektrumu, belirli bir metabolitteki hemen hemen tüm hidrojen atom çekirdeklerinin birer karakteristik parmak izini elde etmemizi sağlar. İdrarın NMR spektrumunda 1000 in üzerinde metabolit gözlenebilmektedir. Gözlenen rezonansın yoğunluğu örnekteki hidrojen atomunun sayısıyla orantılıdır. Bu şekilde, her metabolitin konsantrasyonu belirlenebilir. NMR spektroskopisi, hızlı ve uygun maliyetli tanı tarama yöntemi olarak, idrardaki tüm metabolitleri dakikalar içerisinde gerçekleştirilebilen tek bir ölçümle saptayabilir ve analiz edebilir. Tampon hazırlığının dışında, ölçüm için idrar örneklerinin ön işlemesine gerek bulunmamaktadır. Şekil 1: Pik belirlenmesi ile birlikte idrar spektrumu; yukarıda: genel görünüş; aşağıda: yakınlaştırılmış görünüş. 4

5 Türkiye de gerçekleştirilen klinik çalışma INFAI ve Bruker BioSpin Türkiye deki on klinik merkezle işbirliği içinde yürütülen geniş ve çok merkezli bir klinik çalışmada, sağlıklı yenidoğanlarda patolojik metabolitlerin gözlenip gözlenmediğinin anlaşılması ve bunların konsantrasyon aralıklarının belirlenmesi için 950 yenidoğan bebekten alınan idrar örnekleri toplanmış, Bruker ADVANCE III 500 MHz ve 600 MHz spektroskopi kullanılarak incelenmiştir. Burada, aynı zamanda standart model olarak adlandırılan yenidoğan taraması geliştirilmiştir. Şu anda, bu NMR metodu ile 600 ün üzerinde metabolit saptanabilmekte ve ölçülebilmektedir. Bir istatistik analiz yöntemi (PCA) normal ve anormal örneklerin otomatik ayrımının sağlanması için kullanılmaktadır. Göze çarpan örnekler, 2D NMR gibi daha kompleks NMR teknikleri ile ilave araştırmaya tabi tutulacaktır. Bu şekilde, sağlıklı ve hastalıklı yenidoğanların örnekleri ayrılacaktır. İstatistik analiz Metabolit konsantrasyonlarının istatistik analizi ve ölçümü bir 1D- ve hızlı 2D-Jçözümlü spektrum kombinasyonunu temel alacaktır. Burada, 2D spektrum, J-çözümlü 2D spektrumdan elde edilen dizi pozisyonu ve multiplet yapı gösteren metabolitlerin güvenli identifikasyonu ve dekonvolüsyon tabanlı ölçümünü destekler. İdrar örneklerinin spektrumlarının karşılaştırılması için, şüpheli idrar örneklerinin identifikasyonu, temel bileşen analizi (PCA) kullanılarak yapılmaktadır. Şekil 2: PCA kullanılarak gerçekleştirilmiş, hedefe yönelik olmayan analiz örneği Şüpheli örneklerin identifikasyonunda Türkiye de gerçekleştirilen klinik çalışmada toplanan 950 spektrumun istatistik analizleri kullanılmıştır. Şekil 2 de bu tür analizlere bir örnek verilmiştir. Temel bileşen analizi (PCA) her bir örneğin bireysel bir nokta olarak gösterildiği bir reprezantasyon üretmektedir. Şüpheli örnekler aykırı değerliklerdeki noktalar olarak belirgin hale gelmektedir. Şekilde, farklı renklerde gösterilen üç tip aykırı örnek görülmektedir. Spektral analiz farklı parmak izi metabolitlerin yüksek konsantrasyonlarını göstermektedir. Deneklerin ikisinin sarılık problemleri bulunduğu teyit edilmiştir; bunlardan biri yoğun bakım 5

6 ünitesinde tedavi edilmek durumunda kalmıştır. On denekte, alifatik bölgede makromoleküllerin yüksek konsantrasyonu gözlenmiştir. Harici bir laboratuvar, belirgin nefropati durumunu gösteren albümini tespit etmiştir. Çeşitli deneklerde 4-hidroksifenilasetik asit yüksek konsantrasyonlarda gözlenmiş ancak klinik veride hiçbir anormal bulgu rapor edilmemiştir. Ancak, veritabanındaki hastalık spesifik metabolitlerin tüm geçerli NMR belirteçleri metabolik hastalığı olan bireylerden elde edilmektedir. Bir tarama testi hizmeti için normal yenidoğanlarla gerçekleştirilecek karşılaştırma metodun doğru kalibrasyonu için oldukça önemlidir. Bu, özellikle metabolizmanın immatür yapı ve yaşlı hastalardakinden daha yüksek değişkenlik gösterdiği yenidoğanlarda uygulamayı etkiler. Bazı hastalık spesifik metabolitler yenidoğanlarda bir ölçüde halen fizyolojik olarak bulunabilirler. Şekil 3 te görüldüğü gibi, doğal olarak yüksek varyanslar içermektedir ,020,050,080,110,140,17 0,2 0,230,26 0,08 0,2 0,32 0,44 0,56 0,68 > 0,78 Şekil 3: 4-hidroksifenilasetik (solda) ve D-galaktozun (sağda) belirlenmiş konsantrasyon profilleri. Kapsamlı istatistik analiz ve klasifikasyon gerek sağlıklı kontrol gruplarından gerekse metabolik hastalıklı değişik hasta popülasyonlarından idrar örneklerinin toplanmasını gerektirir. İstatistik modellemenin hedefi, probleme ilişkin klinik bulgu göstermeyen yenidoğanların idrarlarında spesifik metabolitlerin varyasyon (konsantrasyon ve kimyasal değişim) aralığının araştırılmasıdır. Bu, sağlıklı yenidoğanlarla karşılaştırılarak, spesifik metabolitlerin patolojik eşik değerlerinin identifikasyonu ve Türk bebeklerine yönelik bir normal model oluşturmak için gereklidir. INFAI ve Bruker BioSpin Ltd. de geliştirilen ileri istatistik modüller, hedefe yönelik olmayan taramalar için normal bir model kullanmaktadırlar ve Türkiye deki bebeklerin bilinmeyen hastalıklarının tespitine olarak sağlamaktadırlar

7 Miktar tayini Uygun eksperimental koşullar kullanıldığında, 1H-NMR spektrumundaki bir rezonansın pik bölgesi ya da sinyal yoğunluğu, sinyale katkıda bulunan protonların sayısıyla doğru orantılıdır. Bu nedenle, dupletin pik alanı kuartetin pik alanından üç kat daha büyüktür. Pik alan, sinyale katkıda bulunan protonların sayısıyla doğru orantılı olduğu gibi ilgili molekülün konsantrasyonuyla da doğru orantılıdır. Bu nedenle, NMR spektroskopinin metabolit ölçümü için kullanımı mümkündür. Tekniğin duyarlılığı çoğu metabolit için düşük mikromolar aralıktadır. Metabolitlerin NMR spektrumundaki identifikasyonundan sonra, ilgilenilen metabolitlerden seçilen bazı sinyallerin basit entegrasyonu, konsantrasyonunun kantitatif bilgilerini tamamen açığa çıkarır. Aşağıda Şekil 4 te bir örnek verilmektedir. İki katının patolojik olarak tanımlandığı (631 mmol / mol), 4-hidroksifenilasetik asit (246 mmol / mol kreatinin) ve D-galaktozun (1274 mmol / mol) konsantrasyonları. Şekil 4: 4-OH-fenilasetik asit ve D-galaktozun her ikisinin patolojik konsantrasyonlarda bulunduğu bir denekte gösterilen ölçüm miktarları. 7

8 Hastalıklar ve idrar spektrumundaki metabolitler INFAI, vücut sıvılarının NMR tabanlı araştırılmasında 20 yıllık deneyime sahiptir. Yıllar boyunca, birçok hastalık ve izole edilmiş metabolitin bilgisini içeren kapsamlı bir kütüphane oluşmuştur. Aşağıda, teşhis edilmiş hastalıkları bulunan çocukların bazı idrar spektrum örnekleri sunulmaktadır. Daha fazla bilgi için, insan genleri ve genetik hastalıklarının online katalogu niteliğindeki Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) hastalık numaraları verilmektedir (omim. org). OMIM insan genleri, genetik bozukluklar ve özelliklerini içeren sürekli güncellenmekte olan bir katalogdur. Özel olarak genetik varyasyon ve fenotipik ekspresyon arasındaki moleküler ilişki üzerinde odaklanmaktadır. Bu özellikleriyle İnsan Genom Projesi ne eşlik eden fenotipik karşılığı olarak kabul edilmektedir. INFAI kendi web sitesinde ( hastalıklarla ilişkili metabolit aramaları için yardımcı bir araştırma aracı sunmaktadır. - Metabolik hastalıklardan örnek NMR spektrumlar Herediter üre döngüsü bozukluğu atıkların vücuttan idrar yoluyla atımında problemlerle kendini gösteren kalıtsal bir durumdur. Üre siklusu vücuttan atık maddelerin (amonyak) uzaklaştırıldığı bir prosestir. Protein aldığınızda, vücut bunları aminoasitlerine parçalayacaktır. Amonyak artık aminoasitlerden üretilmektedir ve vücuttan uzaklaştırılması gerekmektedir. Karaciğer, amonyağı idrarla vücuttan uzaklaştırılan üreye dönüştürecek çeşitli kimyasallar (enzimler) üretir. Eğer bu işlem bozulursa, amonyak düzeyleri artmaya başlar. Bazı kalıtsal durumlar bu atık boşaltım prosesinde görülen problemlere neden olabilir. Üre döngüsü bozukluğu olanların, vücutlarındaki amonyağın yıkımı için gereken enzimin sentezlenmesini sağlayan bir genleri eksiktir. Bu hastalıklar şunlardır: Arjininosüksinik asidüri Arjinaz eksikliği Karbamoil fosfat sentetaz (CPS) eksikliği Sitrülinemi N-Asetil glutamat sentetaz eksikliği (NAGS) Ornitin transkarbamilaz eksikliği (OTC) Bir grup olarak, bu bozukluklar yenidoğanlarda 30 binde bir meydana gelir. Ornitin transkarbamilaz eksikliği bu bozuklular arasında en yaygın olanıdır. 8

9 - Sitrülinemi OMIM # Sitrülinemi amonyak ve diğer toksik maddelerin kanda birikimine neden olan kalıtsal bir bozukluktur. Sitrülineminin iki formu tanımlanmıştır; bu formlar farklı belirtiler ve semptomlar göstermekle beraber farklı genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanmaktadırlar. Tip I sitrülinemi bu bozukluğun en yaygın formudur, genellikle yaşamın ilk birkaç günü içerisinde belli olur. Tip II sitrülinemi esas olarak sinir sistemini etkiler; bu etkilenim konfüzyon, huzursuzluk, hafıza kaybı, anormal davranışlar, nöbet ve komaya varabilen sonuçlar doğurur. Bazı durumlarda, hastalığın semptomları erişkinlikte görülebilir (yetişkin başlangıçlı). Yüksek düzeyde sitrülin ve N-asetil sitrülin idrar spektrumunda gözlenebilmektedir. 9

10 - Glutarik asidüri tip I OMIM # Glutarik asidüri tip I vücudun belli proteinleri düzgün olarak işleyemediği kalıtsal bir hastalıktır. Bu hastalığa sahip bireylerde, proteinlerin yapı taşları olan lizin, hidroksi lizin ve triptofan aminoasitlerinin yıkımına yardımcı enzim düzeylerinde yetersizlik mevcuttur. Tip I glutarik asideminin şiddeti büyük farklılıklar gösterir; bazı bireyler sadece hafif miktarda etkilenirken diğerleri şiddetli problemlerden muzdarip olabilmektedirler. Çoğu vakada, tip I glutarik asidüri belirtileri bebeklik ya da erken çocukluk döneminde ortaya çıkar. Tip I glutarik asidüri yaklaşık 30 bin ila 40 bin kişide bir görülmektedir. Yüksek konsantrasyonlarda glutarik asit tüm vücut sıvılarında gözlenmiştir. 10

11 - Metilmalonik asidüri OMIM # Metilmalonik asidemi vücudun belirli protein ve yağları (lipidler) doğru biçimde işleyemediği kalıtsal bir hastalıktır. Genellikle erken bebeklik döneminde görülen metilmalonik asideminin etkileri hafiften, yaşamı tehdit edecek düzeylere kadar değişir. Etkilenen bebeklerde kusma, dehidrasyon, zayıf kas tonusu (hipotoni), gelişimsel gecikme, aşırı yorgunluk (letarji), genişlemiş karaciğer (hepatomegali), kilo almada başarısızlık ve beklenen oranlarda büyümenin sağlanamaması (gelişim geriliği) ortaya çıkabilir. Uzun vadeli komplikasyonlar beslenme sorunları, entelektüel engellilik hali, kronik böbrek hastalığı ve pankreas enflamasyonunu (pankreatit) içerebilir. Bu hastalık için tahmini görülme sıklığı 50 bin ila 100 binde birdir. 11

12 2-OH-hidroksiglutarik asidürinin D ve L varyantı D ve L-2-hidroksiglutarik asidüriler, idrar (Şekil 5), plazma ve serebrospinal sıvıda 2-hidroksi glutarik asit seviyesindeki artışla karakterize 2-hidroksiglutarik asidürinin nadir, klinik değişkenlik gösteren nörolojik formlarıdır. 2-hidroksiglutarik asidin farklı enantiyomerik formları farklı hastalıklarla ilişkilidir. Daha az yaygın olan D-2-hidroksiglutarik asidüri (D-2-HGA) D-enantiyomeri ile bağlantılı iken, L-2-hidroksiglutarik asidüri (L-2-HGA), 2-hidroksiglutarik asidin L-enantiyomeri ile ilişkilidir. Bu bozukluğun prevalansı bilinmemektedir; dünya genelinde bugüne kadar yalnızca 80 vaka rapor edilmiştir. Şekil 5: 2-hidroksiglutarik asidürili idrar NMR spektrumu. L ve D varyantları arasındaki ayrımın, sıradan analitik yöntemler (Tandem-MS, GC-MS) kullanılarak yapılması mümkün değildir. Kesin tanı için, genellikle etkilenen genlerin birer genetik analizi gerekmektedir. Etkilenen genler L2HGDH (L-2-HGA da) ya da D2HGDH veya IDH2 genleridir (D-2-HGA da). Bir lantanit değişim reaktifi (Şekil 5) idrarın NMR spektrumunda L ve D-2-hidroglutarik asitin arasındaki ayrımın yapılmasına olanak sağlar. Kimyasal değişim reaktifi olarak bu samaryum kompleksinin eklenmesiyle, L ve D-2-hidroksiglutarik asidin NMR rezonansları farklı yönlere (Şekil 6 de gösterilen) kaydırılmış olur. 12

13 Şekil 6: Lantanit değişim reaktifi. Bu metoda, Hacettepe Üniversitesi, Ankara, Türkiye öğretim üyelerinden Prof. Dr. Turgay Coşkun ve Prof. Dr. Ali Dursun un 1, 5 ve 28 yaşlarındaki üç hastadan aldıkları idrar örnekleri üzerinde başvurulmuştur. Her üç vakada da, L-2-HGA teşhisini doğrulayan L-enantiyomer bulunmuştur. Şekil 7: L ve D-hidroksiglutarik asidin farklı kimyasal değişimlerde ayrımı. 13

14 Yenidoğan tarama sorunları Metabo Test INFAI Yanlış pozitifl ik ve yanlış negatifl ik sonuçları probleminden, aykırı gruplar sınıflaması yapılarak kaçınılmalıdır. Bilinmeyen metabolitler ek araştırmalar ve farklı teknikler gerektirmektedir. Tip II ve tip III tirozinemide, 3 metabolit: 4-hidroksifenilasetik asit, 4-hidroksifenilaktik asit ve 4 hidroksifenilpiruvik asit (Tomoeda ve ark 2000) idrarda bulunmuştur ve aminoasit tirozin plazmada saptanabilir olmalıdır. Şekil 8 muhtemel tip II yahut tip III tirozinemisi olan bir yenidoğanın sonuçlarını göstermektedir. Tip I tirozinemide, yukarıda bahsedilen ilk üç metabolit yine idrarda görünür ancak ek olarak 5-aminolevulinic asit da olmalıdır. Ancak bu durumda bu metabolitler bulunmadı. Bu nedenle, bu yenidoğanda tip II tirozinemi olabilir. Nihai bir tanı ancak plazma örneği ile konulabilirdi, bu örnek de mevcut değildi. Dahası, yenidoğanın sonraki klinik gidişatı hakkında bilgimiz bulunmamaktadır. Şekil 8: İdrardaki tanısal metabolitlerin veritabanı spektrumuyla eşleştirilmesi. İleri incelemeler Bazı metabolitlerin tanımlanmasında ardışık kütle spektrometrisi ve NMR gibi yöntemler yetersiz kalabilir. Tüm analizlere rağmen çocuğunuzun hastalığına özgül bir tanı konulamadı ise; enzim aktivitesi ölçümleri ve ileri gen dizi analiz teknikleri yardımcı olabilir. Şüphe edilen bir kalıtsal metabolizma hastalığı varsa; doğrudan bu hastalıkla ilişkili gende bir bozukluk olup olmadığı araşatırılabilir, bozukluk saptanırsa şüphe edilen hastalığın çocuğunuzda 14

15 bulunduğu ispatlanmış olur. Belirli bir kalıtsal metabolizma hastalığı üzerinde yoğunlaşılmamış ise; tüm gen analizi yapılması gerekir. Saptanan genetik bozukluk ile çocuğunuzdaki belirti ve bulgular arasında bir ilişki kurulabilir. Bazen bu; şimdiye kadar tanımlanmamış ilk defa çocuğunuzda tanı almış yeni bir hastalık da olabilir. Şüphe edilen kalıtsal metabolizma hastalığına ilişkin tanı koydurucu enzim aktivitesi ölçümleri yanı sıra çeşitli genetik analiz hizmetlerini de vermekte olduğumuzu bilgilerinize sunarız. Laboratuvarlar arası tekrarlanabilirlik Tüm örnekler Köln deki INFAI laboratuvarı ve Karlshure deki Bruker laboratuvarlarında iki kez ölçüme tabi tutulmuştur. Şekil 9 da, başvurulan PCA analizinin sonuçları birleştirilmiş veri kümesinde gösterilmiştir (her iki laboratuvar; Lab-1: Sarı, Lab-2: Mavi). Her iki örnek de mavi bir çizgi ile bağlanmış iki belirteç ile temsil edilmektedir. Eklenen küçük çerçeve, siyah dikdörtgen alanın içinin yakınlaşmış görüntüsünü vermektedir. Her iki laboratuvarda bağımsız olarak ölçülen her iki ilk örneğin alikotları sürekli birbirine çok yakın noktalarla temsil edilmektedir. Bu, mükemmel tekrarlanabilirliğin kanıtı niteliğindedir. Toplam NMR örneği sayısı Klinik metaverisi olan NMR örnekleri INFAI Bruker Her iki laborda Sadece INFAI Sadece Bruker Şekil 9: İki farklı laboratuvarda ölçülen ve incelenen NMR spektrumlarının PCA analizi. 15

16 Otomatik sayılan metabolitlerin güncel listesi Doğumsal Hataların Belirteci DMH hastalıklarının Belirteçleri Nr. İsim Nr. İsim 1 Orotic Acid 25 2-Hydroxyphenylacetic Aid 2 Methylmalonic Acid 26 2-Phenyllactic Acid 3 2-Hydroxyisovaleric Acid 27 3-Phenyllactic Acid 4 3-Hydroxyisovaleric Acid 28 4-Hydroxyphenyllactic Acid 5 Ethylmalonic Acid 29 3-Methyl-2-Oxovaleric Acid 6 N-Acetylaspartic Acid 30 2-Hydroxy-4-Methylvaleric Acid 7 Glutaric Acid 31 D-Galactonic Acid 8 Xanthine 32 3-Methylcrotonylglycine 9 Uridine 33 Uracil 10 Acetone 34 Galactitol 11 3-Hydroxybutyric Acid 35 Isovaleroylglycine 12 Acetoacetic Acid 36 5-Aminolevulinic Acid 13 Propionic Acid 37 2-Oxoisocaproic Acid 14 L-Isoleucine 38 Propionylglycine 15 Allo-Isoleucine 39 4-Hydroxyphenylacetic Acid 16 Leucine 40 3-Hydroxyvaleric Acid 17 Valine 41 D-Sorbitol 18 Citrulline 42 3-Hydroxyglutaric Acid 19 3-Hydroxypropionic Acid 43 E-Glutaconic Acid 20 Phenylalanine 44 2-Oxoisovaleric Acid 21 Phenylpyruvic Acid 45 L-Pyroglutamic Acid 22 N-Acetylphenylalanine 46 Tiglylglycine 23 Neopterin 47 Suberic Acid 24 Phenylacetic Acid 48 Sebacid Acid 16

17 Endojen Bileşenler, Safsızlıklar, Gıda ve İlaç ilişkili İdrarda her zaman görülen metabolitler Nr. İsim Nr. İsim 1 Creatinine 15 Fumaric Acid 2 Creatine 16 Formic Acid 3 D-Glucose-beta 17 1-Methylnicotinamide 4 D-Galactose-alpha 18 N,N-Dimethylglycine 5 D-Lactose 19 Myo-inositol 6 Alanine 20 Taurine 7 Lactic Acid 21 Trimethylamine-N-oxide (TMAO) 8 Acetic Acid 22 Hippuric Acid 9 Succinic Acid 23 4-Aminobutyric Acid GABA 10 Citric Acid 24 Trigonelline 11 Dimethylamine 25 Methanol 12 Trimethylamine 26 Ethanol 13 Betaine 27 Benzoic Acid 14 Glycine 17

18 Doğumsal Hata Referans Spectrumu Veritabanındaki Metabolit Listesi Nr. bileşik ana işlev/hastalık, vakaların çoğunda ileri hastalıklar 1 1,2-propanediol Artefacts-pharmaceutical products (additive) 2 1-methyl-1-cyclohexanecarboxylic 3-Methylcrotonylglycinuria acid 3 2,3-butanediol Artefacts-pharmaceutical products (from ethanol) 4 2,8-dihydroxyadenine Adenine phosphoribosyltransferase deficiency 5 2-aminoadipic acid 2-Aminoadipic aciduria 2-aminoadipic acid 2-Ketoadipic aciduria 6 2-aminoisobutyric acid ß-Aminoisobutyric aciduria 7 2-butanone ß-Ketothiolase deficiency 8 2-deoxyadenosine Adenosine deaminase deficiency 2-deoxyguanosine Purine nucleoside phosphorylase deficiency 9 2-hydroxy-3-methylvaleric acid Maple syrup urine disease 2-hydroxy-4-methylvaleric acid Maple syrup urine disease 10 2-hydroxyadipic acid 2-Ketoadipic aciduria 11 2-hydroxybutyric acid Lactic Acidosis 12 2-hydroxyglutaric acid Glutaric aciduria type II 13 2-hydroxyisocaproic acid Maple syrup urine disease 14 2-hydroxyisovaleric acid Maple syrup urine disease 15 2-hydroxyphenylacetic acid Phenylketonuria 16 2-hydroxysebacic acid Zellweger Syndrome 17 2-ketoadipic acid 2-Ketoadipic aciduria 18 2-methyl-3-hydroxybutyric acid ß-Ketothiolase deficiency 19 2-methylacetoacetic acid 3-Oxothiolase deficiency 20 2-methylbutyric acid Glutaric aciduria type II 21 2-methylbutyrylcarnitine Short/branched-chain/acyl-CoA dehydrogenase deficiency (SBCADD) 22 2-methylbutyrylglycine Glutaric aciduria type II 23 2-oxo-3-methylvaleric acid Maple syrup urine disease 24 2-oxoadipic acid 2-Oxoadipic aciduria 25 2-oxobutyric acid Methionine malabsorption 26 2-oxoglutaric acid Dihydrolipoyl dehydrogenase (E3) 27 2-oxoisocaproic acid Maple syrup urine disease 18

19 Nr. bileşik ana işlev/hastalık, vakaların çoğunda ileri hastalıklar 28 2-oxoisovaleric acid Maple syrup urine disease 29 3-aminoisobutyric acid Hyper-ß-alaninemia 30 3-hydroxy-3-methylglutaric acid 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase deficiency 31 3-hydroxyadipic acid Long-chain 3-hydroxyacylcoenzyme A dehydrogenase 32 3-hydroxybutyric acid Maple syrup urine disease 33 3-hydroxydodecanedioic acid Short-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase deficiency (SCHAD) 34 3-hydroxyglutaric acid Glutaric aciduria type I 35 3-hydroxyheptanoic acid Long-chain 3-hydroxyacylcoenzyme A dehydrogenase 36 3-hydroxyisovaleric acid Biotinidase deficiency 37 3-hydroxykynurenine Hydroxykynureninuria 38 3-hydroxypropionic acid Methylmalonic aciduria 39 3-hydroxysebacic acid Long-chain 3-hydroxyacylcoenzyme A dehydrogenase 40 3-hydroxyvaleric acid Propionic Acidemia 41 3-methoxytyramine Aromatic L-aminoacid decarboxylase deficiency 42 3-methoxytyrosine Aromatic L-aminoacid decarboxylase deficiency 43 3-methyl-2-oxovaleric acid Maple syrup urine disease 44 3-methylcrotonylglycine Biotinidase deficiency 45 3-methylglutaconic acid 3-Methylglutaconic aciduria type methylglutaric acid 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase deficiency 47 3-oxoglutaric acid Acidosis, gluconeogenesis 48 3-ureidoisobutyric acid Ureidopropionase deficiency 49 3-ureidopropionic acid Ureidopropionase deficiency 50 4-aminobutyric acid GABA-transaminase deficiency 51 4-hydroxy-3-methoxymandelic Asphyxia acid 52 4-hydroxybutyric acid 4-Hydroxybutyric aciduria 53 4-hydroxybutyric acid lactone 4-Hydroxybutyric aciduria 54 4-hydroxyphenylacetic acid Tyrosinemia I 4-hydroxyphenyllactic acid Lactic Acidosis 55 4-hydroxyphenylpyruvic acid Hawkinsinuria 56 5,6-dihydrothymine Dihydropyrimidinase deficiency 57 5,6-dihydrouracil Dihydropyrimidinase deficiency 19

20 Nr. 20 bileşik 58 5-aminolevulinic acid Tyrosinemia I ana işlev/hastalık, vakaların çoğunda ileri hastalıklar 59 5-hydroxyhexanoic acid Medium chain acyl-coa dehydrogenase deficiency 60 5-hydroxyindole-3-acetic acid Blue diaper syndrome 61 5-hydroxymethyluracil Dihydropyrimidine dehydrogenase deficiency (DHPD) 62 5-hydroxytryptophan Aromatic L-aminoacid decarboxylase deficiency 63 5-oxoproline 5-Oxoprolinuria (GLUTATHIONE SYNTHETASE DEFICIENCY) 64 5-phosphpmevalonic acid Mevalonic aciduria 65 6-methyluracil ß-Ketothiolase deficiency 66 acetoacetic acid Propionic aciduria 67 acetone Propionic aciduria 68 adipic acid Glutaric aciduria type II 69 adrenaline Dopamine beta-hydroxylase deficiency (DßH) 70 alanine Hartnup disorder 71 alanine-proline Prolidase deficiency 72 allo-isoleucine Pyrimidine Disorders 73 arabinose Polyol disease with arabinose and arabinitol 74 arabitol Polyol disease with arabinose and arabinitol 75 arginine Lysinuric protein intolerance 76 argininosuccinic acid Argininosuccinic aciduria 77 asparagine Hartnup disorder 78 aspartic acid Acidosis, gluconeogenesis 79 aspartylglucosamine Aspartylglucosaminura 80 azelaic acid Adrenoleukodystrophy, neonatal 81 biopterin Biopterin SYNTHESIS DEFICIENCY 82 ß-alanine Gaba Transaminase deficiency 83 betaine Tyrosinemia type I 84 biocytin Biotinidase deficiency 85 butanon ß-Ketothiolase deficiency 86 carnitine 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase deficiency 87 carnosine Carnosinemia 88 cis-4-hydroxyproline Renal dysfunction 89 citric acid Fumaric aciduria 90 citrulline Citrullinemia

21 Nr. bileşik ana işlev/hastalık, vakaların çoğunda ileri hastalıklar 91 creatine Guanidinoacetate methyltransferase (GAMT) deficiency 92 creatinine Cystinosis 93 cresol Artefacts-bacterial contamination 94 cystathionine Cystathionase Deficiency 95 cysteine g-glutamyltransferase deficiency 96 cystine Cystinuria 97 D-2-hydroxyglutaric acid D-2-Hydroxyglutaric aciduria 98 decanoyl-l-carnitine 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase deficiency 99 decenedioic acid Medium-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency 100 deoxyinosine Purine nucleoside phosphorylase deficiency 101 deoxyuridine Mitochondrial NeuroGastroIntestinal Encephalopathy 102 dermatane sulfate Mucopolysaccharidosis 103 D-galactonic acid Galactosemia 104 D-galactose Galactosemia 105 D-glucose Glucose transporter defect (SGTL2) 106 D-Lactose Malabsorption Syndromes 107 D-mannitol Dehydration 108 dopamine Aromatic L-aminoacid decarboxylase deficiency 109 D-sorbitol Galactosemia 110 D-xylose Pentosuria 111 D-xylulose Pentosuria 112 erythritol Transaldolase deficiency 113 ethanolamine Ethanolaminosis 114 ethylmalonic acid Ethylmalonic encephalopathy (EPEMA) 115 fructose Hereditary fructose intolerance 116 fumaric acid Fumaric aciduria 117 galactitol Galactosemia 118 glutaconic acid Glutaric aciduria type I 119 glutamic acid Acidosis, gluconeogenesis 120 glutamine Hartnup disorder 121 glutaric acid Glutaric aciduria type I 122 glutathione Glutathionuria 123 glyceric acid D-Glyceric aciduria 21

22 Nr. bileşik 124 glycerol Glycerol kinase deficiency 125 glycine Iminoglycinuria 126 glycine-proline Prolidase deficiency ana işlev/hastalık, vakaların çoğunda ileri hastalıklar 127 glycolic acid Primary hyperoxaluria I, PH1 128 glyoxilic acid Primary hyperoxaluria I, PH1 129 guanidinoacetic acid Guanidinoacetate methyltransferase (GAMT) deficiency 130 guanosine Purine nucleoside phosphorylase deficiency 131 hexanoic acid MCAD 132 hexanoyl-d,l-carnitine Multiple acyl-coenzyme A dehydrogenase deficiency 133 hexanoylglycine Dehydrogenase deficiency 134 hippuric acid Artefacts-bacterial contamination 135 histamine Histidinemia 136 histidine Histidinemia 137 homoarginine Hyperlysinemia 138 homocarnosine Homocarnosinosis 139 homocitrulline Citrullinemia 140 homocysteine Methylmalonic aciduria and homocystinuria, cblc type 141 homocystine Homocystinuria 142 homogentisic acid Alkaptonuria 143 homovanillic acid Neuroblastoma 144 hydroxyproline Glutaric aciduria type II 145 hypoxanthine Molybdenum cofactor deficiency 146 imidazoleacetic acid Histidinemia 147 imidazolepyruvic acid Histidinemia 148 indican Blue diaper syndrome 149 indole-3-aceticacid Blue diaper syndrome 150 inosine Purine nucleoside phosphorylase deficiency 151 isobutyric acid Glutaric aciduria type II 152 isobutyryglycine Glutaric aciduria type II 153 isovaleric acid Glutaric aciduria type II 154 isovalerylglycine Ethylmalonic encephalopathy (EPEMA) 155 kynurenine Hydroxykynureninuria 22

23 Nr. bileşik ana işlev/hastalık, vakaların çoğunda ileri hastalıklar 156 L-2-hydroxyglutaric acid L-2-Hydroxyglutaric aciduria 157 lactic acid Biotinidase deficiency 158 L-dopa Aromatic L-aminoacid decarboxylase deficiency 159 leucine Hartnup disorder 160 L-glyceric acid Hyperoxaluria type II 161 L-isoleucine Hartnup disorder 162 L-xylulose Pentosuria 163 lysine Glutaric aciduria type II 164 malic acid Acidosis, gluconeogenesis 165 malonic acid Malonic aciduria 166 methionine Cystathionine beta-synthase deficiency 167 methionine sulfoxyde Cystathionine beta-synthase deficiency 168 methylfumaric acid Isovaleric Acidemia 169 methylmalonic acid Methylmalonic aciduria 170 methylsuccinic acid Methylmalonic aciduria 171 mevalonic acid Mevalonic aciduria 172 mevalono lactone Mevalonic aciduria 173 myo-inositol Dehydration 174 N,N-dimethylglycine Dimethylglycine dehydrogenase deficiency 175 N-acetyl-2-aminoadipic acid Ketoadipic aciduria 176 N-acetylalanine Aminoacylase I deficiency 177 N-acetylaspartic acid Canavan disease 178 N-acetylcarnitine Isovaleric Acidemia 179 N-acetylglutamic acid Aminoacylase I deficiency 180 N-acetylglutamine Aminoacylase I deficiency 181 N-acetylglycine Aminoacylase I deficiency 182 N-acetylhistidine Histidinemia 183 N-acetylisoleucine Aminoacylase I deficiency 184 N-acetylmethionine Aminoacylase I deficiency 185 N-acetylneuraminic acid Salla disease 186 N-acetylphenylalanine Phenylketonuria 187 N-acetylthreonine Aminoacylase I deficiency 188 N-acetyltryptophane Isovaleric Acidemia 23

24 Nr. bileşik 189 N-acetyltyrosine Tyrosinemia I+II 190 N-acetylvaline Aminoacylase I deficiency 191 neopterin Phenylketonuria III 192 N-isovaleroylglycine Glutaric aciduria type II 193 N-methylhistamine Histidinemia ana işlev/hastalık, vakaların çoğunda ileri hastalıklar 194 noradrenaline Dopamine beta-hydroxylase deficiency (DßH) 195 N-trimethyllysine TMLHE deficiency 196 octanoic acid Medium chain acyl-coa dehydrogenase deficiency 197 octenedioic acid Medium chain acyl-coa dehydrogenase deficiency 198 octenylsuccinic acid Feeding: Amino Acid Formula 199 ornithine Cystinuria 200 orotic acid Orotic aciduria 201 orotidine Citrullinemia 202 oxalic acid Primary hyperoxaluria I, PH1 203 phenylacetic acid Phenylketonuria 204 phenylalanine Phenylketonuria 205 phenyllactic acid Phenylketonuria 206 phenylpropionylglycine Medium chain acyl-coa dehydrogenase deficiency 207 phenylpyruvic acid Phenylketonuria 208 phosphoethanolamine Hypophosphatasia 209 pimelic acid Adrenoleukodystrophy, neonatal 210 pipecolic acid Hyperprolinemia 211 proline Iminoglycinuria 212 propionylglycine Propionic Aciduria 213 propionylcarnitine Propionic Aciduria 214 pyruvic acid Lactic Acidosis 215 quinolinic acid Malabsorption Syndromes 216 ribitol Ribose 5-phosphate isomerase deficiency 217 saccharopine Saccharopinuria 218 S-adenosylhomocysteine S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase deficiency 219 salicylic acid Adenylosuccinate lyase deficiency 220 sarcosine Glutaric aciduria type II 221 sebacic acid Glutaric aciduria type II 24

25 Nr. bileşik 222 serine Renal dysfunction ana işlev/hastalık, vakaların çoğunda ileri hastalıklar 223 serotonine Monoamine oxidase-a deficiency (MAO-A) 224 sialic acid Sialic acid storage disease 225 S-sulfocysteine Molybdenum cofactor deficiency 226 suberic acid Glutaric aciduria type II 227 suberylglycine Medium chain acyl-coa dehydrogenase deficiency 228 succinic acid Fumaric aciduria 229 succinylacetone Tyrosinemia I hepatorenal form 230 sucrose Malabsorption Syndromes 231 taurine Hyper-ß-alaninemia 232 threonine Hartnup disorder 233 thymidine Mitochondrial NeuroGastroIntestinal Encephalopathy 234 thymine Dihydropyrimidinase deficiency 235 thyroxine Hypothyroidism 236 tiglylgylcine ß-Ketothiolase deficiency 237 trimethylamine Trimethylaminuria / fish odor syndrome 238 trimethylamine-n-oxide Trimethylaminuria / fish odor syndrome 239 tryptophane Hepatic failure 240 tyramine Artefacts-bacterial contamination 241 tyrosene Asphyxia 242 uracil Tyrosinemia type I 243 uric acid Citrullinemia 244 uridine Ornithine carbamoyltransferase deficiency 245 urocanic acid Urocanic aciduria 246 valine Hartnup disorder 247 valine-proline Prolidase deficiency 248 vanilmandelic acid Neuroblastoma 249 xanthine Molybdenum cofactor deficiency 250 xanthurenic acid Hydroxykynureninuria şu anda 250 metabolit 25

26 Vücut sıvılarının NMR Analizi (akış şeması) Numune hazırlama Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) Ölçümü 65 Metabolitlerin Otomatik Kuantifikasyonu PCA Analysis İstatistiksel Ayırma Istatistik outliers Ekstra NMR Araştırmaları Metabolit Profili Normal Normal Patolojik NMR raporu Tıbbi rapor Klinisyen İlave Tetkikler INFAI Tanı Tıbbi Partner Laboratuarlar (enzim analizi; gen dizi analizi - tüm ekzon, yeni nesil dizi analizi; vb.) Tıbbi rapor 26

27 Kaynaklar 1. Aksu F, Aygen S, Vigabatrintherapie bei einem 7jährigen Jungen mit Succinat- Semialdehyd-Dehydrogenase-Mangel, Monatsschrift Kinderheilkunde 144 (1996) Assfalg M, Bertini I, Colangiuli D, Luchinat C, Schäfer H, Schütz B and Spraul M, Evidence of different metabolic phenotypes in humans, PNAS 105 (2008) Aygen S et al., Hochauflösende 1H NMR Spektroskopie von Körperflüssigkeiten (Serum, Urin, Liquor) zur Diagnose und Therapiekontrolle bestimmter angeborener Stoffwechselerkrankungen im Kindesalter, Aktuelle Neuropäd. (1994) Aygen S et al., Urine based newborn screening study applying highresolution NMR spectroscopy in Turkey, JIMD 34 (Suppl. 3) (2011) S Aygen S, Dürr U, Coskun T, Dursun A, Different diagnosis: distinction between L-2- and D-2-hydroxyglutaric acid, JIMD 36 (Suppl. 2) (2013) S Blau N, Duran M, Blaskovics ME, Gibson KM, Laboratory diagnosis of metabolic diseases, Springer (2005) Engelke UF, Sass JO, Van Coster RN, Gerlo E, Olbrich H, Krywawych S, Calvin J, Hart C, Omran H, Wevers RA, NMR spectroscopy of aminoacylase 1 deficiency, a novel inborn error of metabolism, NMR Biomed. 21 (2008) Gryff-Keller A, Kraska-Dziadecka A, Kubica D, Detection of acylglycines in urine by 1H and 13C NMR for the diagnosis of inborn metabolic diseases, Acta Biochim. Pol. 59 (2012) Holmes E, Foxall PJD, Spraul M, Farrant RD, Nicholson JK, Lindon JC, 750 MHz 1H NMR spectroscopy characterisation of the complex metabolic pattern of urine..., J. Pharm. Biomed. Anal. 15 (1997) Lindon JC, Nicholson JK, Everett JR, NMR spectroscopy of biofluids, Ann. Rep. NMR Spectr. 38 (1999) Linn T, Santosa B, Grönemeyer D, Aygen S, Scholz N, Busch M, Bretzel RG, Effects of long-term dietary protein intake on glucose metabolism in humans, Diabetologica 43 (2000) Moolenaar SH, Engelke UF, Hoenderop SM, Sewell AC, Wagner L, Wevers RA, Handbook of 1H-NMR spectroscopy in inborn errors of metabolism, SPS Topcu M, Coskun T et al., L-2-Hydroxyglutaric aciduria: a report of 29 patients, Turkish J. Pediatr. 47 (2005) Yamaguchi S, Koda N, Eto Y, Aoki K, Quick screening and diagnosis of organic acidemia by NMR urinalysis, J. Pediatr. 106 (1985)

28 Sizlere sunduklarımız: Metabo Test INFAI Doğuştan metabolizma hastalıklarına yönelik genel ve seçici tarama. Hastalık belirteci olarak kullanılabilecek patolojik metabolitlerin tayini. Hastalık göstergesi olarak kullanılan ve şuanda 190 dan fazla doğuştan metabolizma hastalığına işaret eden 250 kadar metabolitin saptanması. Hastalıklarla ilgili metabolit araması için ana sayfamızdaki araştırma motoru kullanılabilir ( Tek seferde hedefe yönelik ve hedefe yönelik olmayan tarama Farklı ph değerlerinde, bir ve iki boyutlu NMR spektrumlarında karakterize 600 ün üzerinde metabolitten oluşan ve giderek büyüyen bir veritabanı idamesi. Gen dizi analizi (tüm ekzon, yeni nesil dizi analizi), enzim aktivitesi ölçümleri veya ardışık kütle spektroskopisi (tandem-ms) gibi yöntemlerle ek analizler. Kalite yönetimi INFAI, ulusal ve uluslararası regülasyonlara uygun olarak, ISO 9001:2008 temelli bir entegre kalite yönetim sistemi oluşturmuştur. Bu çerçevede tanımlanan yüksek kalite standartları, güvenilir ve yüksek kalitede farmasötik ürünlerin üretimini garanti altına almaktadır. Müşteri memnuniyeti tüm faaliyetlerimizin merkezindedir. Kalite yönetim sistemimizin sürekli iyileştirilmesi bizlere değişen pazar koşullarına hızla uyum sağlama şansı kazandırmaktadır. Metabo Test INFAI Türkiye de Bruker Biospin ile işbirliği içerisinde yürütülecektir. INFAI INFAI Institute for biomedical analysis and NMR imaging GmbH Gottfried-Hagen-Str , Köln, Germany Phone: Fax: -55 Website: Bruker BioSpin GmbH Silberstreifen 4, Rheinstetten, Germany Phone: Fax: -297 Website: 28