Pnömonilerde Mikrobiyolojik Tan

Transkript

1

2 Pnömonilerde Mikrobiyolojik Tan Ayfle YÜCE Geçmiflte oldu u gibi bugün de yüksek morbidite ve mortalite nedeni olan pnömoni, gerek toplumda gerekse hastane ortam nda infeksiyon hastal klar - na ba l ölüm nedenleri aras nda ilk s rada yer almaktad r (1,2). Akut pnömoniler baflta bakteriler olmak üzere virüs, mantar, parazit gibi çok de iflik etkenlerle oluflur ve hafif bir hastal ktan, a r ve ölümcül bir tabloya uzanan genifl bir klinik seyir gösterir. Hastalar n öyküsü, fizik bak s, hematolojik ve radyolojik bulgular spesifik etken konusunda baz ipuçlar verse bile özellikle a r seyirli olgularda etiyolojik ajan n tan nmas ampirik sa alt m aç s ndan son derecede önemlidir. Bu aflamada solunum yolu örneklerinin mikrobiyolojik incelemesi büyük önem tafl maktad r. En k sa sürede do ru tan ya ulafl labilmesi ise klinisyen - mikrobiyolog aras ndaki yak n ve bilinçli iflbirli i ile sa lanabilir (3,4). Tüm infeksiyon hastal klar n n tan s nda oldu u gibi pnömonilerin tan s nda da iki yol izlenebilir. Do rudan tan da amaç, etkeni veya evrim dönemlerinden herhangi birini görmek, varl n göstermek veya üretmektir. Dolayl tan - da ise, etkene karfl oluflan yan t veya yan t ürünlerini göstermek esast r. Pnömoni olgular n n bakteriyolojik tan s nda incelenecek bafll ca örnekler balgam, transtrakeal aspirasyon (TTA), bronkoskopi sekresyonlar, transtorasik ince i ne aspirat, akci er biyopsisi ve kand r. Kullan lan bafll ca yöntemler ise direkt bak, boyama ve kültür ifllemleri, serolojik ve moleküler tekniklerdir (5). Örneklerin al nmas ve ifllemlenmesi Balgam Pnömoni kuflkusunda en çok incelenen ve en de erli örneklerin bafl nda bal-

3 Pnömonilerde Mikrobiyolojik Tan 111 gam gelmektedir. Al m nda invazif yöntemler gerekmedi i için tercih edilmekle birlikte önemli ölçüde üst solunum yolu flora bakterileri ile kontaminedir. Balgam al m nda uyulmas gereken baz kurallar vard r. Difller f rçaland ktan ve a z antibakteriyel etkisi bulunmayan bir s v ile çalkaland ktan sonra derin bir öksürük ile sa lanan sabah balgam tercih edilmelidir. Genifl a zl, steril bir kaba al nan örnek hemen laboratuvara gönderilmeli ve en geç iki saat içinde ifllemlenmelidir. fllenene de in 2-8 C de tutulabilir ancak bu ortamda 20 saat kalan örneklerde önemli oranda bakteri azalmas saptan r. Bir gün boyunca birikmifl balgam örnekleri kültür için kullan lmamal d r. yi bir balgam eldesi hastan n bu konuda e itilmesine ba l d r. Balgam ç karamayan hastalardan postural drenaj ve torasik perküsyon ile örnek al nmaya çal fl lmal d r. Ayr ca %3 NaCl solüsyonu ile 10 dakika nebulizasyon yap larak balgam ç k fl uyar - labilir (enjeksiyon için kullan lan NaCl, antibakteriyel ajanlar içerebilece inden kullan lmamal d r) (9). Bronkoskopi Örnekleri Bronkoalveoler lavaj (BAL), bronfliyal y kama, korunmal bronfliyal f rçalama (PSB) ve transbronfliyal biyopsi (TBB) örnekleri bronskopi örnekleri olarak bilinir ve invazif ifllemlerdir. Tüm bronkoskopik ifllemler yak n monitorizasyonla yap lmal, balgam ç karamayan seçilmifl hasta gruplar na uygulanmal d r. BAL örne i, fiberoptik bronkoskop arac l ile ml steril serum fizyolojik verilmesi ve aspire edilmesi ile sa lan r. Diffüz lezyonlarda orta lobdan, lokalize olanlarda ise en yo un tutulum bölgesinden yap lmal d r. P. carinii, M. tuberculosis, CMV pnömonilerinin tan s için özellikle uygun örneklerdir. Korumal BAL (pro- BAL) ve PSB teknikleri ile sa lanan örnekler oral flora bakterileri ile en az kontamine olan örnekler olup, özellikle ba fl kl k sistemi bask lanm fl hastalardaki pulmoner infeksiyonlar n tan s nda kantitatif kültürlerin son derece de erli oldu u bildirilmektedir (11-16). Pro-BAL al m nda bronkoskopun daha proksimalde tutulmas hem hastan n daha rahat etmesini sa lamakta, hem de kanama ve kontaminasyon riskini azaltmaktad r. PSB öncelikle bakteriyel ve etkenin düflünüldü ü ve trombosit say s n n /mm 3 ün üstünde olan hastalara uygulanmal d r. Ayn flekilde bronkoskop örnek al nacak segmentler daha proksimalde tutularak kontaminasyon önlenmeli, f rça steril koflullarda, steril bir lama yay lmal ve hemen steril bir makasla 1 cc Ringer laktat içeren tüpün içine kesilerek laboratuvara gönderilmelidir. Her iki yöntem de tek kullan ml k kateter gerekti i için pahal yöntemlerdir (5,9). TBB, bronkoskopik yöntemler aras nda en invazif ve en yüksek morbiditeye sahip olan yöntemdir. P. carinii, CMV, HSV, Aspergillus, Candida gibi mik-

4 112 Solunum Sistemi nfeksiyonlar roorganizmalar ve infeksiyon d fl nedenler düflünülüyorsa tercih edilmelidir. Diffüz lezyonlarda alt lobdan, lokalize infiltrasyonlarda ilgili bölgeden 4-6 biyopsi örne i al nmal, yüksek komplikasyon oran nedeni ile orta lobdan kaç n lmal d r. BAL örneklerinin ifllemlenmesi fiekil 1 de görülmektedir. Ek çal flmalar için bir miktar ayr l r (Ör: sitoloji) Mikrobiyoloji Vorteks Kantitatif kültür Mukolizis Santrifüj ( g x dk) Eritrosit lizisi Süpernatan, kimyasal analize al n r. Sediment, dengeli tuz solüsyonuna al n r. Sitosantrifüj Di er mikrobiyolojik kültürler ( rpm x dak) Chlamydia, Legionella, Mikobakteri, Fungus, Virüs Boyal preparatlar Gram, Wright, Giemsa, Aside dirençli, Modifiye aside dirençli, Fungal (PAS, Calcofluor beyaz, Gomori metanamin gümüflleme) DFAT, mmunperoksidaz, Elastin, in situ hibridizasyon fiekil 1. BAL Örneklerinin fllemlenmesi Transtrakeal Aspirasyon Trakea içine küçük plastik bir kateter konmas ile bizzat trakeadan sa lanan örnektir. nvazif bir teknik olup kooperasyonu mümkün olmayan hastalara, kanamaya e ilimlilere ve solunum yetmezli i olanlara uygulanmaz. Üst solunum yollar floras ile kontamine olmayan, steril ve eklenen s v larla sulanmam fl en kaliteli örnektir. Komplikasyonlar nedeniyle son y llarda giderek daha az kullan lmaktad r. Aktinomikoz ve di er anaerobik infeksiyonlar kuflkusunda ve aspirasyon pnömonilerinde tercih edilir (5,9). Transtorasik nce ne Aspirasyonu ve Torasentez S v s Bu yöntemle etiyolojik ajan en iyi yans tan bir örnek elde edilir. Pnömoni ve ampiyem olgular nda plevra ponksiyonu yap labilece i gibi pnömonik konsolidasyonlarda gö üs duvar ndan ince i ne (25 numaral Chiba) ile lezyonlu bölgeye serum fizyolojik verilerek aspire edilir. 1-5 ml örnek yeterlidir. E er lezyon büyük veya birden çoksa birçok bölgeden örnek al nmal d r. Bu ifllem am-

5 Pnömonilerde Mikrobiyolojik Tan 113 fizemli, üremili, trombositopenili veya pulmoner hipertansiyonlu hastalarda pnömotoraks veya kanamaya yol açabilir. Aç k Akci er Biyopsisi ve VATS Baz alt solunum yolu infeksiyonlar n n tan s nda doku parças gerekebilir. Her iki yöntem de tan amac ile kullan lacak son basamakt r. Tan sal de eri %90 n üzerinde, komplikasyon riski %2-20 (trombositopenik hastalarda pnömotoraks ve kanama insidans %10) ve mortalite %1 in alt ndad r. Aseptik koflullarda i ne biyopsisi, minitorakotomi veya VATS yap l r ve steril kaplarda formalinsiz olarak laboratuvara gönderilir. Bu örneklerin sa lanmas zor oldu- undan dokunun bir k sm steril buyyonda buzdolab nda veya -20 C, - 70 C de en az 4 hafta süre ile ileri çal flmalar için saklanmal d r. Dokular laminar flow biyolojik emniyet kabininde özel giysi ve eldivenler giyilerek ifllemlenmelidir. Dokunun bir k sm bakteri, bir k sm mantar ekimleri için kullan - l r. Tüm doku örnekleri mutlaka her iki ajan içinde kültüre al nmal d r. Özellikle Herpes ve P. carinii pnömonilerinde yararl d r. Kan Kültürü Pnömonilerin tan s nda önemli yöntemlerden birisi de hemokültürdür. Bakteriyemi oran n n %20-30 oldu u bakteriyel pnömonilerde komplikasyon olas - l yüksektir. Pnömokoksik pnömoni kuflkusu olan tüm hastalara özellikle akut dönemde yap lmal d r. Hemokültür al m nda uyulmas gereken ölçütler vard r. Hastan n atefli yükselmeden ve sa alt m bafllamadan önce aseptik koflullarda ve bir günde belli aral klarla de iflik venlerden 3 kez al nmal d r. Antikoagülanl kan al nmamal ve al nan kan/besiyeri oran 1/10 olmal d r (6). Örneklerin ncelenmesi Makroskopik Bak Laboratuvara gelen balgam n makroskopik bak s de er tafl r. Örne in üzerinde çizgi fleklinde kan bulunmas akci er tüberkülozunu, kahverengimsi-kanl görünümü akci er gangrenini, pasl görünüm pnömokoksik pnömoniyi, koyu k rm - z mukoid balgam Klebsiella pnömonisini, pürülan yeflilimsi balgam Pseudomonas infeksiyonunu, baz akci er tümörleri, bronflektazi ve apseleri düflündürmelidir. Akci er gangreni ve bronflektazilerde balgam kötü kokulu, M. pneumoniae ve Adenovirus infeksiyonlar nda normal görünümlü olabilir (1). Mikroskopik Bak 1. Direkt Boyas z Preparat Temiz bir lam üzerine, balgam n pürülan k s mlar ndan al nan bir öze dolusu örnek konulur ve lamel kapat larak fl k mikroskobunda büyütme ile incelenir. Burada baz parazitler (Ascaris, Strongyloides), mantar elemanlar, bakteriler, epitel hücresi ve nötrofiller görülebilir. P. carinii için özel yöntemler uygulanmal d r. Mantar elemanlar %10 KOH ile faz mikroskobunda veya cal-

6 114 Solunum Sistemi nfeksiyonlar cofluor beyaz ile floresan mikroskobunda görülebilir. Aspergillus türleri ve di- er mantarlarla oluflan allerjik bronkopulmoner infeksiyonlarda eozinofil içeren yap flkan mukus t kaçlar, Charcot-Leyden kristalleri ve hifal elementler gözlenir. Pnömokok veya H. influenzae tip b düflünülüyor ise pürülan materyalin bir k sm, eflit miktar antikapsül ba fl k serumla kar flt r larak kapsül fliflme reaksiyonu (Quellung test) ile tan koymaya çal fl l r. Nadiren α-hemolitik streptokok ile yalanc reaksiyon görülebilir. Kültür ile bu test aras ndaki paralellik %85 tir (1,5). 2. Boyal Preparat Balgam n Gram boyal preparatlar n n incelenmesi pnömoni tan s nda en yararl ve güvenilir yöntemdir. Temiz bir lam üzerine bir öze dolusu pürülan balgam konularak yavafl dairesel hareketlerle ince bir tabaka halinde yay l r. Etrafa damlac k s çramamas na dikkat edilmelidir. Havada kurutulan ve Gram boyas ile boyanan preparat x10 (küçük büyütme) ile incelenir. Her sahada 10 veya daha az epitel hücresi, 25 veya daha fazla polimorf nüveli lökosit (PNL) görülmesi balgam n kaliteli bir örnek oldu unu, gerçek infeksiyon bölgesinden geldi ini düflündürür. Kural olarak bu örneklerin minimal orofaringeal flora içerdi i kabul edilir (1,17). Ayn flekilde 10 veya daha fazla epitel hücresinin varl, balgam n tükürükle kar flm fl oldu unu gösterir. Belirgin olarak tükürükle kar flm fl olan örnekler reddedilir. Balgam örneklerinin mikrobiyolojik incelemeler için uygunlu- u ve kalitesi konusunda de iflik derecelendirme sistemleri gelifltirilmifltir (Tablo I, II ve III). Lökosit say s n n azl, balgam n inceleme yönünden de erini düflürmez, çünkü hastalar ciddi flekilde nötropenik olabilir veya Legionella pnömonisinde oldu u gibi balgam sulu, az hücreli veya hücresiz olabilir. Kabul edilebilir örneklerin Gram boyamas nda predominant bir bakterinin ve/veya her immersiyon alan nda 10 veya daha fazla say da Gram pozitif, lanset fleklinde diplokoklar n varl %85 do rulukla pnömokoksik pnömoni tan s koydurur (1). Ayn flekilde santrifüjlenmifl BAL dan yap lan boyal preparatlar n incelenmesinde (x100) büyütmede (büyük büyütme) birden fazla mikroorganizman n varl veya inflamatuar hücrelerin %25 inden ço unda hücre içi bakteri bulunmas bakteriyel pnömoni tan s nda önemli olan koloni say s ile paralellik gösterir Tablo I. Bartlett de erlendirmesi* Nötrofil say s (x10) Derece Epitel hücre say s (x10) Derece < >25-2 >25 +2 mukus varl +1 *20-30 farkl alandaki epitel ve nötrofil say s n n ortalamas al n r. Sonuç 0 veya daha az ise tükürük kontaminasyonu olarak düflünülür ve yeni bir örnek istenir. Kaynak: (4,6-8)

7 Pnömonilerde Mikrobiyolojik Tan 115 Tablo II. Murray ve Washington de erlendirmesi Nötrofil say s (x10) Epitel hücre say s (x10) Grup 1* Grup Grup Grup Grup 5 25 <10 *Grup 1-4 orofaringeal kontaminasyon nedeniyle uygunsuz örneklerdir. Grup 5 uygun balgam örne idir Kaynak: (4,7) Tablo III. Gram de erlendirmesi Grup Nötrofil Hücre say s /Alan (x100) Yass epitel 6 (TTA)* <25 <25 5 >25 <10 4 > >25 > >25 1 <10 >25 *E er mikroorganizma yok ve epitel say s >10 ise reddedilmelidir Grup 4-6 kültür için uygundur. Grup 1-3 kültür için uygun de ildir yeni örnek istenmelidir. Grup 4 ve 5 gibi kültür için uygun bir örnekte mikroorganizma görülmüyor ise Legionella türleri, Mycoplasma türleri veya Mikobakteriler düflünülmelidir. Nötrofil say s >25 oldu u halde kültürde üreme olmayan bir örnek için anaerop bakteriler, zor üreyen bakteriler ve antibiyotik kullan m na ba l üreyemeyen bakteriler düflünülmelidir. Kaynak: (17). (1,9). Gram boyamada ayr ca alveoler hücreler de de erlendirilmelidir. Alveoler hücrelerin %5 i ve fazlas nda hücre içi bakteri (H B) görülmesi özellikle ventilatöre ba l pnömoni tan s nda anlaml d r. Buna göre BAL veya PSB örneklerinin Gram boyal preparatlar nda %5 ten az H B varsa antibiyotik önerilmez, kültür yap lmas önerilir. Yüzde 5 ten fazla H B görülmesi halinde ampirik antibiyotik bafllanmas ve kültür yap lmas önerilmektedir (18,19). Balgam Örneklerinde Kalite De erlendirme Sistemleri Balgam n yan s ra bronkoskopi sekresyonlar n n direkt ve boyal incelemeleri yap lmal d r. Bronkoskopi veya BAL ile al nan ve santrifüjlenen örneklerde silyal kolumnar bronfliyal epitel hücrelerinin, goblet hücreleri veya pulmoner makrofajlar n varl örneklerin alt solunum yollar ndan geldi ini gösterir (5,8,10).

8 116 Solunum Sistemi nfeksiyonlar Bu derecelendirme sistemleri mikobakteri, mantar ve virüs infeksiyonlar kuflkusunda kullan lmamal d r (4,5). Balgam örneklerinin kalitesi Gram boyas z olarak da küçük büyütmede incelenebilir. Bu flekilde zamandan kazan m sa lanabilir (5). Solunum yolu örnekleri Gram boyas d fl nda klasik Ehrlich-Ziehl-Nielsen veya Kinyoun yöntemi ile ya da Auramine veya Auramine rhodamine gibi floresan boyalarla boyanarak aside dirençli bakteriler yönünden de incelenmelidir. Aside dirençli bakteri görülmesi tüberküloz için önemlidir. Ayr ca özellikle ba - fl kl k sistemi bask lanm fl kiflilerde bu yöntemlerle Nocardia ve Cryptosporidium türleri gibi aside dirençli boyanan mikroorganizmalar saptanabilir. Bu hastalar P. carinii infeksiyonlar için de risk alt ndad r. O nedenle modifiye Gomori metanamin gümüfl boyamas ve Toluidine mavisi boyamalar yap lmal d r. Gomori metanamin gümüfl boyamas ile Nocardia, Actinomycesler, mantar ve parazitlerin identifikasyonu ve yorumu kolay ise de yaklafl k 60 dakikal k bir süreç gerektirdi inden acil durumlarda daha h zl bir teknik olan Toluidine mavisi 0 boyas tercih edilmekte ve baflar ile kullan lmaktad r. Bu teknikle yaln zca P. carinii de il Nocardia ve baz mantarlar da saptanabilir. Ayr ca P. carinii için yeni bir monoklonal antikor boyas gelifltirilmifl olup özgül ve duyarl bir boyama olarak umut vermektedir (4,5). Alt solunum yolu infeksiyonlar nda balgam, plevral s v, aspire edilmifl örnekler ve dokularda Legionella türlerinin HSV, CMV, Adenovirus, RSV gibi virüsleri saptamak için direkt floresan antikor boyama (DFA) tekni i de kullan l r. Özellikle yenido an pnömonilerinde solunum sekresyonlar n n DFA ile C. trachomatis aç s ndan incelenmesi baflar l sonuçlar verir (4,5,17). Kültür Yöntemleri Alt solunum yolu infeksiyonlar nda al nan örneklerin kültür yöntemlerinde uygulanacak esaslar flunlard r. 1. Balgam ve bronfliyal y kama s v lar bol miktarda oral flora bakterileri ile kontamine olduklar için anaerop kültür yap lmaz. Sadece transtrakeal aspiratlar ve torasentez s v lar anaerop kültür için uygundur. 2. Bronkoskopi örnekleri kantitatif olarak incelenmelidir. 3. L. pneumophila için Fooley Gorman n sisteinli ve ferrik pirofosfatl (FG) agar, buffered charcoal yeast extract (BCYE) agar ve selektif BCYE agar kullan lmal d r. Zor üreyen bakterilerdir. Solunum yolundan bulaflt için çal flanlar maske ve eldiven kullanmal d r. 4. Mikobakterium için al nan kontamine örnekler dekontaminasyon ve konsantrasyon ifllemlerinden sonra ekilmelidir.

9 Pnömonilerde Mikrobiyolojik Tan Mikoplazmalar için özel besiyerleri kullan lmal d r. 6. Dimorfik mantarlar için, beyin kalp infüzyon (BK ) agar, kanl sabouraud kalp infüzyon agar, mikobiyotik veya mikosel agar kullan lmal d r. 7. Kistik fibrozislilerde bol miktarda P. aeruginosa, S. aureus, H. influenzae, P. cepacia vs. bulunur. Etkenlere yönelik uygun besiyerleri kullan lmal d r. 8. Virüs ve Chlamydia lar için doku kültürleri yap lmal d r. Bu özel durumlar d fl nda balgam örnekleri rutin olarak %5 koyun kanl agar, MacConkey agar ve çikolata agar besiyerlerine tek koloni düflecek fleklinde ekilir. MacConkey agar aerop, di er iki plak %5-10 CO 2 li ortamda C de saat enkübe edilir. Balgam ve di er alt solunum yollar örneklerinin kültürleri, orofaringeal kontaminasyonu da yans tt için tan da çok güvenilir de ildir. Bu denli çok üreyen bakteriler aras nda egemen karakter gösterenlerin saptanmas ve bunlar n etken olarak de erlendirilmesi oldukça zor bir karard r. Bunu baflarabilmek için plak ekimlerinin standart yöntemlerle yap lmas uygun olur. Her çiziflte çaprazlama yöntemi ile yap lan ekimlerde; enkübasyondan sonra plaklar incelenir. lk çaprazlama ekim çizgileri bölgesinde 10 ve daha çok, ikinci çaprazlama ekim çizgileri bölgesinde 5 ve daha çok, üçüncü çaprazlama ekim çizgileri bölgesinde toplam 5 ten az koloni oluflturan bakteriler egemen bakteri olarak kabul edilir ve etken olarak de erlendirilir (4,6,7,20). Enkübasyon süresi sonunda kanl plaklar incelendi inde S. pneumoniae küçük, parlak yeflil hemolizli koloni, S. aureus 1-2 mm çap nda ço u kez beta hemolizli, sar -beyaz kabar k, mat ve düzgün koloni, H. influenzae, Staphylococcus veya di er bakterilerin çevresinde çok küçük, saydam koloniler oluflturarak ürerler. Gram negatif bakteriler MacConkey agarda kendine özgü koloniler yaparlar. Egemen özellik gösteren koloniler morfolojik ve biyokimyasal özelliklerine göre identifiye edilirler. Saf kültürler ile antibiyotik duyarl l k testleri yap l r. Balgam kültürlerinde her zaman kesin sonuçlar al namayaca bilinmelidir. Pnömoni oldu undan emin oldu umuz olgularda bile kültürlerinden %100 olumlu sonuç almak olas de ildir. Sa l kl eriflkinlerin %50 sinden fazlas nda pnömokoklar flora üyesi olarak bo azda bulunurlar. Bu mikroorganizman n identifikasyonu her zaman hastal göstermez. Mikrobiyolojik olarak infeksiyon ile kolonizasyonu ay rt etmek zordur. Burada solunum bölgesinin klinik durumuna göre karar verilir. Yap lan çal flmalar bakteriyemik pnömokokal pnömonili hastalar n Gram boyal preparatlar nda çok miktarda mikroorganizma saptand halde olgular n %45-50 sinde kültürlerin negatif bulundu unu göstermektedir. Ayr ca laboratuvara gelen balgam örneklerinin %48 inin kaliteli olmad, klinik ve radyolojik olarak pnömoni bulgular tafl mayan hastalar n %26.5 inde pürülan balgam örne i olabilece i, pnömonili hastalardan

10 118 Solunum Sistemi nfeksiyonlar al nan balgam örneklerinin %40 n n derin ekspektorasyonla al nmad ve oral sekresyonlar yans tt, pnömoni olan hastalar n %10.8 inin pürülan balgam ç karmad, %56.8 inin ise pürülan balgam ç kard hat rda tutulmal d r (9). Ancak balgam kültürlerinden en iyi sonuçlar elde edebilmek için baz ifllemlerin yap lmas yararl olabilir. Balgam örnekleri tedavi öncesi al nmal, hemen ifllemlenmelidir. Ayr ca balgam n kantitatif kültürlerinin yap lmas, (10 6 cfu/ml - koloni oluflturan bakteri say s - anlaml ) a z floras n ortadan kald rmak için örneklerin y kanmas ve mukolitik ajanlar n kullan m balgam kültürlerinin tan sal de erini art r r (1,7-9). Solunum sekresyonlar n n kantitatif kültürlerinin yap lmas n n akut bakteriyel pnömoni tan s nda duyarl ve özgül bir test oldu u bildirilmektedir (14). Kantitatif kültürler ile ilgili gerçek infeksiyonu kolonizasyondan ay rmak olanakl d r. Pnömoni bölgesinde cfu/ml mikroorganizma bulunmaktad r. BAL, endotrakeal aspirat, PSB, TBB gibi örneklerde %1 den az skuamöz epitel bulunmas ve kantitatif kültürlerde 10 4 cfu/ml ve daha fazla bakteri bulunmas infeksiyonu yans t r. Koloni say m ya bu s v lardan 1/10, 1/100, 1/1000 suland - r mlar ile veya 0.01 ml örnek alabilen özel inokülasyon özeleri kullan larak yap labilir. PSB; 1 ml buyyonda kuvvetli vorteksleme ile süspanse edildikten sonra 0.01 ml ölçülü inokülasyon özesi ile ekilir. Kantitatif kültürde >10 3 cfu/ml bakteri bulunmas infeksiyon lehine düflünülür (5,6,9). Bu ifllemlerin geçerlili i konusunda baz problemler oldu u, örne in önceden antibiyotik alan hastalar, ml/10 3 ün üzerinde bakteri bulunan pürülan bronflitliler ve pnömoni olmad halde bronkoskopi örneklerinde önemli say da mikroorganizma bulunduran hastalar için bu tekni in uygun olmad bildirilmektedir. nfekte ve infekte olmayan örneklerde yalanc pozitifliklerin %31 lere ç kmas özellikle mekanik ventilasyonlu hastalarda geliflen pnömonilerin tan s nda BAL örneklerinin kantitatif kültürlerinin de erini azaltm flt r. Birçok çal flmada, antibiyotik tedavisi ve uzam fl ventilasyon süresine göre testin özgüllük ve duyarl l n n azald, o nedenle kullan lacak örneklerin tipi ile teknik yöntemlerin standardize edilmesinin çok önemli oldu u vurgulanm flt r (21,22). BAL örne i atipik pnömoni etkenleri ve M. tuberculosis ile oluflan pnömoni tan s nda da de erlidir. Balgam ve mide aspirat kültürleri negatif oldu unda bile %85 duyarl l kta olumlu sonuç al - n r. Miliyer tüberkülozlu hastalarda balgam kültürlerinin %25, BAL kültürlerinin ise %100 olumlu sonuç verdi i bildirilmektedir (1). Solunum sisteminde s k bulunan patojen bakteriler ve kültür ortamlar Tablo IV te görülmektedir. Anaerop Kültür Yöntemleri Özellikle akci er apsesi, bronflektazi, ampiyem olgular nda al nan TTA örnekleri ile uygun al nm fl akci er aspirasyon s v lar, anaerobik kültüre al n r. Örnekler en az 1-5 ml olmal d r. Eksüda oldu undan kuflkulan lan tüm s v lar bakteriyolojik yönden incelenmelidir. Berrak s v lar 3000 rpm de 10 dakika santrifüje edildikten sonra çöküntüden mikroskopik bak ve kültür yap l r. Pü-

11 Pnömonilerde Mikrobiyolojik Tan 119 Tablo IV. Solunum sisteminde s k bulunan patojen bakteriler ve kültür ortamlar Patojen Bakteriler Önerilen Kültür Ortamlar A grubu beta hemolitik Streptococcus S. pneumoniae, S. aureus %5 koyun kanl agar Enterobacteriaceae üyeleri Pseudomonas aeruginosa MacConkey agar Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Modifiye Thayer-Martin (MTM) Haemophilus influenzae tip b Kolistin/nalidiksik asit at kanl agar (CNA) Corynebacterium diphtheriae Loeffler veya serum tellurit agar Moraxella catarrhalis %5 koyun kanl veya çikolata agar Bordatella pertussis Bordet-Gengou patates agar Mycobacterium tuberculosis Löwenstein-Jensen/Middlebrook 7H11 Legionella pneumophila Charcoal yeast extract (CYE) agar rülan s v lardan ise direkt olarak mikroskopik bak ve kültür yap l r. Anaerop kültür için örnekler, bir kanl agar yüzeyine aerop, bir kanl agar yüzeyine anaerop olarak ekilir. Ayr ca kanl jeloz içine ve thioglikolatl buyyon besiyerine ekilir. Aerop ve anaerop koflullarda enkübe edilir. Üreyen bakteriler Gram boyama, morfolojik, fizyolojik ve biyokimyasal özelliklerine göre identifiye edilir. Doku Biyopsi Kültürleri Actinomyces, Brucella, Legionella, Listeria, M. tuberculosis, Mycoplasma, sistemik mantarlar ve baz virüsler için yap l r. Akut pnömonililerde pek s k yap lan bir yöntem de ildir. Kanama ve pnömotoraks tehlikesi vard r. Doku örne inin gram ndaki mikroorganizman n say s tan aç s ndan de erlidir (3). Doku örnekleri HSV, CMV, Legionella, P. carinii aç s ndan DFA ile de incelenebilir. Kan Kültürleri Kan kültürleri C de enkübe edilir saatte üreme saptanabilir. Makroskopik olarak üreme belirtisi olan veya olmayan kanlardan Gram boyal incelemeler yap lmal d r. Üreme saptanmas büyük olas l kla pnömoni etkenini gösterir. Pnömokoksik pnömonili hastalar n %20-30 u bakteriyemik olup, balgam kültürü negatif bulunan hastalar n %25-30 unun kan kültürü pozitif bulunabilir (1,9). Septisemi ve özellikle fungemi kuflkusunda lizis-santrifugasyon kan kültürü yap labilir. Kan saponin içeren özel tüplere ml al n r. Saponin hem erit-

12 120 Solunum Sistemi nfeksiyonlar rositleri, hem de lökositleri eriten bir kimyasal maddedir. Tüp ara s ra çevrilip kar flt r larak lizis ifllemi gerçeklefltirilir. Daha sonra santrifüjde 3000 rpm de 15 dakika çevrilerek bulunan mikroorganizmalar çöktürülür. Sediment steril koflullarda aspire edilerek uygun ortamlara ekilir. Alt Solunum Yolu nfeksiyonlar n n Tan s nda Kullan lan Kültür D fl Yöntemler Mikroorganizmaya ait antijen veya nükleik asitlerin moleküler yöntemlerle saptanmas esas na dayan r (3-9). 1. Mikroorganizmaya özgül antijenlerin saptanmas Bo az sürüntüsü, nazofarinks y kama s v s, balgam, plevra s v s, serum ve idrarda DFA, lateks aglütinasyon, koaglütinasyon, CIE (karfl t ak m elektroforezi), RIA, ELISA, Western blotting gibi yöntemlerle antijenler saptanabilir. DFA: Fluorescein istohiocyanate veya di er floresanl boyalar, özel yöntemlerle antikorlara ba lanabilirler. Bu ba lanma, antikorun özgül antijeni ile ba lanmas n pek etkilemez. Lamlar n üzerine konulmufl antijenler üzerine, floresanl antikor konuldu unda; antijen uygun ise floresanl antikoru ile birleflir ve floresan mikroskobunda incelenirse floresans verir. çlerinde bakteri, mantar, parazit, virüsler ya da bunlar n antijenlerinin bulundu u kültürler, çeflitli hastal k materyalleri veya doku kesitleri bu yöntemle incelenerek do rudan antijen saptanabilir. Bir iki saatte sonuç veren, ancak deneyimli personel gerektirmesi, dikkat edilmezse özgül olmayan sonuçlar n yanl fl de erlendirilmesi gibi dezavantajlar olan bir yöntemdir. Nazofarinks salg s nda ve di er çeflitli klinik örneklerde C. diphtheriae, B. pertussis, L. pneumophila, C. trachomatis, H. influenzae, N. meningitidis, S. pneumoniae gibi bakteriyel ve RSV, CMV gibi virüs infeksiyonlar n n tan s nda kullan labilir. Özellikle P. carinii tan s nda çok duyarl d r. Lateks Aglütinasyon ve Koaglütinasyon Eritrositler veya lateks partikülleri çeflitli antikorlarla kaplanabilir. Böylece antikorlarla kapl bu eritrosit veya sentetik parçac k süspansiyonlar kendi antijenleri ile karfl lafl rlarsa birleflerek aglütine olurlar. Bu flekilde do rudan hastal k örne inde bulunabilecek belirli baz mikroorganizma antijenlerinin saptanmas mümkündür. Lateks aglütinasyonu ile L. pneumophila, H. influenzae tip b, N. meningitidis, S. pneumoniae (83 serotip), S. pyogenes ve di er streptokoklar, C. neoformans araflt r labilmektedir. Koaglütinasyonda ise S. aureus A proteinine ba lanm fl özgül antikorlar kullan - l r. Lateks aglütinasyon ile araflt r lan tüm antijenler bu yöntemle de araflt r labilir. CIE: Alkali ph daki jel içerisinden do ru ak m geçerken negatif yüklü antijen

13 Pnömonilerde Mikrobiyolojik Tan 121 molekülleri anoda, antikor molekülleri de katoda göç ederler. Pnömokok antijenleri idrar, serum, balgam ve plöral s v da saptanabilir. Ancak sonuçlar çok tutarl de ildir. Çünkü pozitif yüklü kapsül polisakkaritlerini kaç rabilir. RIA: Kolayca radyoaktif hale getirilen antijenlerin araflt r lmas ve miktarlar - n n ölçülmesinde kullan lan çok duyarl bir yöntemdir. Bu yöntemle Legionellozisli hasta idrarlar nda L. pneumophila antijenleri saptanabilir. ELISA: Çok duyarl bir serolojik yöntem olup pek çok mikrobik antijeni tan mlamak üzere uygun antikorlar ile kaplanm fl ELISA kitleri gelifltirilmifltir. C. trachomatis, adenovirüsler, RSV gibi infeksiyonlar n tan s nda kullan l r. Özel cihaz ve deneyimli personel gereksinimine ra men giderek daha yayg n olarak kullan lan bir yöntemdir. Western Blotting çerisinde özellikle virüslerin bulunup bulunmad araflt r lacak olan inceleme örneklerinden özel yöntemlerle bu mikroorganizmaya ait antijenik proteinlerin ekstrakt haz rlan r. Poliakrilamid jel eklektroforezi yap larak bu proteinler molekül büyüklüklerine göre ayr l r. Bunlar özel teknik ile nitroselüloz membrana aktar l r. Kurutulup, fleritler halinde kesilir. Araflt r lan antijene karfl elde edilmifl özgül monoklonal veya poliklonal antikorlarla karfl laflt r l r. Nitroselülöz membran fleritte araflt r lan mikroorganizmaya ait antijenler varsa antikorlar yap fl r P 32 veya biyotin iflaretlenmifl anti-antikorlar kullan larak antijenin varl saptan r. 2. Mikroorganizmaya ait bir ürünün saptanmas Gaz-likid kromatografisi ve di er kromatografik yöntemler mikroorganizmalar n metabolizmas na ait ürünlerinin saptanmas amac na yönelik olarak kullan lan yöntemlerdir. Çeflitli örneklerde S.pneumoniae, M. tuberculosis ve di- er patojenlerin metabolitlerinin varl n analiz etmede kullan l r. 3. Mikroorganizmaya ait nükleik asitin saptanmas DNA Hibridizasyon Yöntemleri flaretli bir araflt rma DNA s (DNA probe) kullan larak hastal k örne inde bulunan hibrid yapabilecek uygun mikroorganizma DNA s n n varl n araflt rma esas na dayan r. HSV, CMV, EBV, Adenovirus ve Chlamydia, M. pneumoniae, L. pneumophila DNA lar n saptamak amac ile kitler gelifltirilmifltir. Az say da mikroorganizmay saptayamamas bu yöntemin dezavantaj d r. n situ hibridizasyon ile de; akci er ile enfekte hücreler biyotinlenmifl veya di- er DNA proplar kullan larak HSV, Adenovirus, CMV, VZV saptanabilir (5,23).

14 122 Solunum Sistemi nfeksiyonlar Tablo V. Solunum sisteminde az s kl kta rastlanan patojenlerin tan s Direkt preparat Kültür Seroloji Antijen ve nükleik asitin saptanmas M. pneumoniae - Selektif by SA,KB,EIA PZR (Bo az ve nazofarinks y kant suyu) C. pneumoniae - Hücre kültürü M F, KB,EIA C. psittaci - - KB PZR C. burnetti - - FA, KBR, EIA PZR L. pneumophila DFA BCYE FA, EIA drarda antijen, PZR Gram, Nocardia türleri Modifiye EZN Kanl Agar, Sabouraud - - DFA, P. carinii Giemsa, Toluidine mavisi O, - - PZR Gomori methanamine gümüfl boyas Aspergillus türleri %10 KOH BK agar, Allerjik Aspergillus ta - Calcouflor beyaz Sabouraud de erli Candida türleri Gram Sabouraud - Histolojik tan Hücre kültürü Virüsler DFA (Bo az, nazofarinks EIA,KB PZR sürüntüsü/çalkant suyu, BAL) DFA: Direkt floresan antikor PZR: Polimeraz zincir reaksiyonu E A: Enzim immunoassay BCYE: Buffered charconal yeast extract BKI: Beyin kalp infüzyon KB: Kompleman birleflmesi, M F: Mikroimmünofloresan.SA:So uk aglütinasyon

15 Pnömonilerde Mikrobiyolojik Tan 123 Nükleik asit amplifikasyon teknikleri Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) Ligaz zincir reaksiyonu (LZR) Burada esas, mikroorganizmaya ait nükleik asitin polimeraz enzimi yard m ile say ca art r lmas ve kolay saptanmas d r. Bu yöntem çeflitli virüsler, (CMV, HSV, EBV, vs.) bakteriler (S. pneumoniae, Mycobacterium, Chlamydia, Mycoplasma, Coxiella), parazitler (P. carinii, T. gondii) için denenmifltir. Kullan m n n daha ekonomik ve daha pratik hale gelmesi ile daha yayg n kullan labilecek ve çabuk tan da önemli yeri olabilecek tan yöntemleridir. 4. Serolojik yöntemler Özellikle üretilmesi güç ya da çok özel laboratuvarlara gerek gösteren mikroorganizmalarla olan baz pnömoni olgular nda kanda oluflan özgül antikorlar n aranmas da tan koydurucu olabilmektedir. Günümüzde duyarl l k ve özgüllükleri de iflken, standardizasyonlar tart flmal olmakla birlikte L. pneumophila, M. pneumoniae, C. burnetii, C. trachomatis, C. pneumoniae gibi atipik pnömoni etkenlerinin tan s nda bu yöntemlerden yararlan l r. Bu yöntemler KB, ELISA, FA ve So uk Aglütinasyon gibi testlerdir. En s k kullan lan serolojik test M. pneumoniae pnömonisini desteklemek için so uk aglütinasyondur. Ancak so uk aglütinasyon nonspesifik bir test olup olgular n %50 sinde 7-14 gün sonra pozitif sonuç verir. Ayr ca kollajen doku hastal klar, miyelom, çeflitli tropikal hastal klar n seyri s ras nda da düflük titrelerde pozitif olabilir. M. pneumoniae özgül IgM antikorlar n n saptanmas daha anlaml d r. Solunum sisteminde daha az s kl kla karfl lafl lan mikroorganizmalara iliflkin çeflitli tan yöntemleri Tablo V te görülmektedir. Kaynaklar 1. Donowitz GR, Mandell GL: Acute pneumoniae. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, (eds), Principles and Practice of Infectious Diseases. 4th ed. New York: Churchill Livingstone 1995: Bartlett JG, Breiman RF, Mandell LA, File, Jr TM. Community-acquired pneumonia: guidelines for management. Clin Infect Dis 1998; 26: Woods GL, Washington JA. The clinical and the microbiology laboratory. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, eds. Principles and Practice of Infectious Diseases. 4 th ed. New York: Churchill Livingrtone, 1995: Koneman EW. Allen SD. Jonda WM. Schreckenberger PC, Win WC Jr. The role of the Microbiology Laboratory in the diagnosis of infectious diseases. Guidelines to practice and management. In Color atlas and text book of Diagnostic Microbiyology, Fifthy ed. JB. Lippincott Company: Philadelphia. 1997; Baron EJ, Finegold SM: Microorganisms encountered in the respiratory tract. In: Bailey and Scott s Diagnostic Microbiology, The C.V. Mosby Company: St. Louis. 1990:

16 124 Solunum Sistemi nfeksiyonlar 6. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC Jr: Laboratory and Clinical Diagnosis of Infectious Diseases. In: Introduction to diagnostic Microbiology. JB Lippincott Company, Philadelphia. 1994: Forbes BA, Granato PA. Processing specimens for bacteria. In: Murray PR, ed. Manual of Clinical Microbiology. 6th ed. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1995: Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Vol 1. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1992: , 1-12, Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC Jr. Guidelines for the collection, transport, processing, analysis and reporting of cultures from specific specimen sources. In: Color atlas and textbook of Diagnostic Microbiology, 5 th ed. J. B. Lippincott Company, Philadelphia. 1997: Reimer LG, Carroll KC. Role of the microbiology laboratory in the diagnosis of lower respiratory tract infections. Clin Infect Dis 1998; 26: Meduri GU. Beals DH, Maijub AG, et all. Protected bronchoalveolar Lavage. Am Rev Respir Dis 1991; 143: Ekdahi K, Eriksson L, Rollaf J et all. Bronchoscopic diagnosis of pulmonary infections in a heterogeneous nonselected group of patients. Chest 1993; 103: Stover DE, Zaman MB, Hadju SI et all. Bronchoalveolar lavage in the diagnosis of diffuse pulmonary infiltrates in the immunosupressed host. Annals of Internal Med. 1984; 101: Bjermer L, Rust M, Heurlin N, Rennards S, Klech H. The clinical use of BAL in patients with pulmonary infections. Eur Respir Rev 1992; 2: Broughton WA, Middleton RM, Kirkpatrick MB, Bass JB. Bronchoscopic protected specimen brush and bronchoalveolar lavage in the diagnosis of bacterial pneumonia. Inf Dis Clin North Am 1991; 5: Cantral DE, Tape TG, Reed EC et all. Quantitative culture of bronchoalveolar lavage fluid for the diagnosis of bacterial pneumonia. The Am J Med 1993, 95: Chapin K. Clinical Microscopy. In: Murray PR, ed. Manual of Clinical Microbiology. 6th ed. Washington, DC: American Society for Microbiology 1995: Nieto S, Alcaraz AC: The role of bronchoalveolar lavage in the diagnosis of bacterial pneumonia. Eur J Clin Microbial Infect Dis. 1995; 14: American thoracic Society: Hospital acquired pneumoniae in adults. Am J Respir Crit Care Med 1995; 153: Bilgehan H: Alt solunum yollar infeksiyonlar n n mikrobiyolojik tan s, Klinik Mikrobiyolojik tan. fiafak Matbaas : zmir. 1992: Torres A, Martos A, Bellacasa JP et all. Specificity of endotracheal aspiration, protected specimen brush and bronchoalveolar lavage. In Mechanically ventilated patients. Am Rev Respir Dis 1993, 147: Dreyfuss D, Mier L, Bourdelles G et all. Clinical significance of borderline quantitative protected brush specimen culture results. Am Rev Respir Dis. 1993; 147: Delvenne P, arresi JE, Thiry A et all: Detections of Cytomegalovirus, Pneumocystis carinii and Aspergillus species in Bronchoalveolar lavage fluid. Immunohistochemistry Am J Clin Pathol 1993; 100: