2.KAYNAK ÖZETLERİ. 2.1 Sığır Lökosit Adhezyon Yetersizliği (BLAD)

Transkript

1 1. GİRİŞ Siyah Alaca sığır ırkı dünyada yayılma alanı en geniş olan ve en fazla kullanılan ırktır. Anavatanı Hollanda nın Frizya bölgesi olan bu ırkın yeryüzündeki mevcudu 100 milyondan fazladır. Sütçü ırkların en iri yapılısı olan Siyah Alaca nın bazı Avrupa ülkelerindeki örnekleri iki verim yönlüdür. Bir başka ifade ile bu hayvanların hem süt hem de et verimleri ön plandadır. Bu nedenle sadece süt değil, et üretim amacıyla da kullanılagelen bir ırktır (Akman 1998). FAO (Food and Agriculture Organization) dan elde edilen verilere göre şuan dünyada 622 milyon ton olan toplam süt üretiminin 523 milyon tonu Siyah Alaca sığırlarından sağlanmaktadır. 260 milyon ton olan Dünya toplam et üretiminin de 59 milyon tonu Siyah Alaca sığırlarından elde edilmektedir ( 2006). Türkiye de Siyah Alaca ırkından bir verim döneminde ortalama kg süt elde edilebilen işletmeler vardır. Dünya süt üretme rekorunu da (25 ton) elinde tutan bu ırk içerisinde 10 tonun üzerinde süt veren bireylerin oranı bir hayli yüksektir. Sütte yağ oranı %3,0-3,5 olan Siyah Alaca ırkı hızlı gelişir ve erken damızlıkta kullanılabilir. Hızlı gelişme özelliği sayesinde et üretimine de uygundur. Birçok Avrupa ülkesinde ve Amerika da erkek buzağıları haftalık yaşa kadar özel olarak beslenip kesilirler. Bu yaşta yaklaşık kg canlı ağırlığa ulaşan bu hayvanların eti (buzağı eti olarak) iyi fiyat bulur (Akman 1998). Türkiye sığır populasyonunun ıslah edilmesine yönelik olarak yurt dışından hem Siyah Alaca sığırı (son yıllarda canlı materyal ithalatı azalmakla birlikte) hem de spermi ithalatı yaygın bir şekilde yapılmaktadır. Türkiye Damızlık Sığır Yetiştircileri Merkez Birliği ile kimi kurum ve şahıslar tarafından ithal edilen canlı hayvan ya da spermlerin genetik kusur taşımamaları önemlidir. İthal edilen canlı hayvan ve spermlerin genetik kusurları taşıyıp taşımadıklarının kontrolleri genellikle ilgili ülke tarafından yapılarak hayvanların pedigrisinde belirtilmektedir. II. Tarım Şurası (IV. Komisyon) nda Ülkemizde üretilen veya ithal edilen spermaların bulaşıcı ve genetik hastalıklar (BLAD) yönünden kontrollerinin daha dikkatli yapılması gerekir şeklindeki kararı 1

2 doğrultusunda ithal edilecek spermaların genetik kusur taşıyıp taşımadıklarının Türkiye de kurulu bulunan bir laboratuvar tarafından da kontrol edilmesi zorunluluk arzetmektedir (Anonim 2004). Uluslararası Hayvancılık Kayıt Komitesi (ICAR, International Committe of Animal Recording) ve 1988 yılından bu yana işlevini ICAR ın alt birimi olarak sürdüren Uluslararası Boğa Kullanımı Organizasyonu (INTERBULL, International Bull Evaluation Board) nun birlikte yürüttükleri bir dizi çalışma sonunda, üye ülke ve örgütler tarafından gerçekleştirilen genetik değerlendirmelerde önemli farklılıklar saptanmıştır. Bunun üzerine; bir örnekliği sağlamak, değerlendirmenin niteliği ve isabetini yükseltmek amacıyla bir seri çalışma yürütülmüş ve 30 Mayıs 2002 tarihinde gerçekleştirilen genel kurulda Kayıt Tutmada Uluslararası Mutabakat adı altında bir dizi kural kabul edilmiştir. Bu dokümanın bir bölümü Süt Sığırlarında Genetik Değerlendirme Sistemleri (Genetic Evaluation Systems in Dairy Cattle) isimli bir kılavuza ayrılmıştır. Bu kılavuzun 10. maddesinde yetiştirilen ırkla ilgili uluslararası örgütlerce belirlenmiş genetik kusurların taşıyıcısı olduğu belirlenen hayvanların en kısa sürede duyurulması önerilmektedir (Kumlu ve Akman 2004). Üzerinde durulan bir çok kalıtsal kusur o özelliğin meydana gelmesini sağlayan resesif gen bakımından homozigot genotiplerde ortaya çıkmakta ve populasyonda bu şekilde fark edilebilmektedir. Söz konusu gen bakımından homozigot genotipte olan hayvanlar genellikle erken dönemlerde (damızlıkta kullanılmadan) ölmektedir. Bu homozigot genotipteki hayvanların ölmesi sonucunda genetik kusurun gelecek generasyonlara aktarılması ve söz konusu olan genin populasyonda yayılması önlenmiş olmaktadır. Resesif etkili bir gen tarafından belirlenen genetik bir kusur bakımından heterozigot genotipte olan bireylerin tespit edilmesi ve bu gene sahip olan hayvanların populasyondan uzaklaştırılması çok daha önemlidir. Heterozigot genotipte olan bireylerin fenotiplerinde çoğunlukla herhangi bir değişiklik meydana gelmemektedir. Bunun sonucunda genetik kusurun meydana gelmesine neden olan resesif etkili gen belirli oranlarda gelecek generasyonlara aktarılmaktadır. Böylece genetik kusurun oluşmasından sorumlu olan genin populasyondaki varlığı ve buna bağlı olarak ta frekansı generasyonlar boyunca artabilmektedir. Genetik kusurlu hayvanların 2

3 populasyondaki frekanslarının artması sonucunda ekonomik verimler bakımından da önemli kayıplar meydana gelebilmektedir. Ekonomik kayıpların en aza indirilmesi amacıyla damızlıkta kullanılacak ebeveynlerin söz konusu genetik kusurlar bakımından taşıyıcı olup olmadıklarının belirlenerek ayıklanması populasyonun devamı ve ekonomik verim seviyesinin korunması açılarından son derece önemlidir. Sığırlarda 100 ün üzerinde genetik kusur tespit edilmiş olup bu kalıtsal kusurlardan birisi de BLAD (Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency, Sığır Lökosit Adhezyon Yetersizliği) dır. BLAD, 1 numaralı otozomal kromozom üzerinde bulunan, öldürücü (letal) etkiye sahip resesif etkili bir gen tarafından belirlenmektedir. Bu genetik kusur sadece Siyah Alaca sığır ırkında ortaya çıkmaktadır. BLAD genetik kusuru bakımından resesif homozigot genotipte olan buzağılarda, genellikle sindirim ve solunum sistemlerinde sık sık bakteriyal enfeksiyonlar meydana gelmekte ve bağışıklık sisteminde meydana gelen zayıflamaya bağlı olarak hastalıklara karşı duyarlılıkları artmaktadır. Resesif homozigot genotipteki buzağılar zatüre, ishal, diş dökülmesi ve kilo kaybı gibi belirtiler göstererek 2 ila 12. aylarda ölmektedirler (Shuster et al. 1992, Nagahata et al. 1996, Tammen et al. 1996, Cox et al. 1997, Fesus et al. 1999, Riberio et al. 2000, Citek et al. 2004). Bu çalışma ile, Siyah Alaca sığırlarında BLAD genetik kusurunun moleküler genetik teknikler temelinde laboratuvar ortamında PCR-RFLP yöntemi kullanılarak belirlenmesi amaçlanmıştır. 3

4 2.KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Sığır Lökosit Adhezyon Yetersizliği (BLAD) Takashi et al. (1980) ve Hagemoser et al. (1983) tarafından ABD de tanımlanan ve Bovine Granulocytopathy olarak isimlendirilen Sığır Lökosit Adhezyon Yetersizliği (BLAD, Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency), sığır genomunun 1 numaralı otozomal kromozomu üzerinde bulunan, CD18 glikoproteinini kodlayan gende meydana gelen bir nokta mutasyonu (D128G) sonucunda oluşan öldürücü (letal) etkiye sahip resesif etkili bir gen (q b ) tarafından belirlenmektedir. BLAD genetik kusuru β 2 integrin yokluğu, CD18 yokluğu, CD11/CD18 yokluğu, Mac-1 yokluğu ve Granulocytopathy sendromu olarak da adlandırılmaktadır. Bu genetik kusur sadece Siyah Alaca sığır ırkında görülmektedir (Shuster et al. 1992, Nagahata et al. 1996, Tammen et al. 1996, Cox et al. 1997, Fesus et al. 1999, Riberio et al. 2000, Citek et al. 2004). BLAD, lökosit integrinlerinin azlığı veya yokluğu sonucunda görülen ve resesif kalıtım modeline sahip olan genetik bir kusurdur. β 2 integrin taşımayan nötrofiller dokulara girerek patojenleri yok etme gücünden yoksun kalırlar. β 2 integrinler Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından tarafından CD11/CD18 olarak adlandırılmakta olup β (CD18) ve α (CD11) alt ünitelerinden oluşmaktadır. β alt ünitesi tek bir üniteden oluşurken, α alt ünitesi lökosit fonksiyon antijen-1 (LFA-1, CD11a) ile membran yapışma parçası-1 (Mac-1, CD11b) ve p150,95 (CD11c) olarak adlandırılan birimlerden meydana gelmektedir (Cox et al. 1997, Özbeyaz 1997, Kehrli 2000, Akyüz 2005, Citek et al. 2006). Bir glikoprotein olan CD18 (veya ITGB2= Integrin Beta 2, GENBANK erişim numarası: M81233, BOVCD18A lokusu) geni toplam 2172 nükleotid ve 723 amino asitten meydana gelmektedir (Anonymous 2006). CD18 geninin 383. nükleotidi olarak bulunan adenin (A) nükleotidinin guanin (G) nükleotidi ile yer değiştirmesi sonucunda meydana gelen D128G nokta mutasyonu BLAD ın oluşmasına sebep olmaktadır. Bu mutasyon sonucunda normal fenotipte 128. amino asit olarak bulunan aspartik asit 4

5 amino asidi yerine mutant fenotipte glisin amino asidi yer almaktadır. D128G mutasyonu sonucunda Siyah Alaca sığır ırkında lökosit yetersizliği meydana gelmektedir (Shuster et al. 1992, Nagahata 2002). Meydana gelen D128G mutasyonu DNA düzeyinde (A G) bir transition (purin nükleotidinin yine bir purin nükleotidi ile yer değiştirmesi) mutasyonudur. D128G mutasyonuna protein düzeyinde bakıldığı zaman (aspartik asit glisin amino asidi) bir missense (meydana gelen tek nokta mutasyonu sonucunda sentezlenecek olan amino asidin yerine başka bir amino asidin sentezlenmesi) mutasyonudur. CD18 glikoproteinini kodlayan gende meydana gelen D128G mutasyonu, sığır lökositlerinin hücre zarında bulunan löko-integrinlerin CD18 ve CD11 alt üniteleri arasındaki kompleksin oluşumunu engeller. Lökositlerin damar dışına çıkmaları için gerekli olan CD11/CD18 adezyon glikoprotein kompleksinin oluşamaması nedeniyle de lökositlerin damar dışına çıkması büyük ölçüde engellenmiş olur (Cox et al. 1997). Bu mutasyon yönünden heterozigot sığırların nötrofillerindeki CD18 glikoprotein miktarında bir azalma olabilir. Ancak heterozigot hayvanlarda bu azalma kesin olarak saptanamamıştır. BLAD mutant alleli homozigot olarak bulunduran hayvanlarda CD18 glikoprotein miktarı ve dolayısıyla da β 2 integrin miktarı ya çok azalmış ya da hiç tespit edilememiştir (Shuster et al. 1992, Cox et al. 1997, Akyüz 2005). CD18 geninde meydana gelen D128G mutasyonuna ilave olarak ikinci bir mutasyon daha meydana gelmektedir. Bu nokta mutasyonunda da CD18 geninin 775. nükleotidi olarak bulunan Sitozin (C) nükleotidi Timin (T) nükleotidi ile yer değiştirmektedir. Meydana gelen bu ikinci mutasyon silent (mutasyonun meydana geldiği kodonun amino asit anlamı değişmez) tipte bir mutasyon olup protein düzeyinde herhangi bir değişime neden olmamaktadır. Diğer bir ifade ile DNA düzeyinde meydana gelen silent mutasyon sonucunda protein seviyesinde herhangi bir değişim meydana gelmemektedir (Shuster et al. 1992, Riberio et al. 2000, Czarnik et al. 2004, Nagahata 2004). 5

6 Yapılan pedigri analizlerine dayanılarak BLAD ın ortaya çıkmasına neden olan mutasyonun ilk defa 1952 yılında Amerika Birleşik Devletleri nde doğan Osborndale Ivanhoe isimli bir boğada meydana geldiği belirlenmiştir (Shuster et al. 1992). Osborndale Ivanhoe döl verimi, süt verim kapasitesi ve bu özelliklerini döllerine aktarabilme kabiliyeti yüksek olan bir boğa olarak tanımlanmıştır. Osborndale Ivanhoe belirtilen bu üstün özelliklerinden dolayı çeşitli ülkelerde (özellikle ABD ve Japonya başta olmak üzere Danimarka, Hollanda, Almanya, Belçika, Avusturya, Arjantin, Brezilya, Kore ve Güney Afrika) yürütülen ıslah faaliyetlerinde damızlık olarak yaygın bir şekilde kullanılmıştır. Osborndale Ivanhoe boğasının artan kullanım oranına bağlı olarak ta BLAD ın ortaya çıkmasına neden olan gen, farklı populasyonlara aktarılmış bulunmaktadır (Shuster et al. 1992, Powell et al. 1996, Ekin 2003). Şu anda dünyanın her yerinde BLAD vakalarına rastlamak mümkündür. Pedigri analizleri sonucunda tespit edilen BLAD vakalarının tamamının Osborndale Ivanhoe, Penstate Ivanhoe Star ve Carlin M Ivanhoe Bell gibi, Siyah Alaca Sığır ırkının en seçkin boğaları ile akraba oldukları belirlenmiştir. ABD de damızlık olarak yaygın bir şekilde kullanılmış olan bu üç boğanın donmuş spermaları moleküler tekniklerle incelendiğinde, mutant D128G alelini taşıdıkları tespit edilmiştir. BLAD ilk olarak ABD de ortaya çıkmasına rağmen bu ülkeden diğer ülkelere damızlık Siyah Alaca sığır ve donmuş sperma ihracatı ile yayılmış bulunmaktadır (Shuster et al. 1992, Powell et al. 1996, Fesüs et al. 1999). BLAD Takaşhi et al. (1980) ve Hagemoser et al. (1983) ABD de bazı Siyah Alaca ırkı buzağılarda insanlarda görülen LAD (Lökosit Adhezyon Yetersizliği) ve İrlanda Seter ırkı köpeklerde görülen CLAD (Canine Lökosit Adhezyon Yetersizliği) kalıtsal kusuruna benzer semptomlar gözlemlemişler ve bunu Bovine Granulocytopathy olarak tanımlamışlarıdr. Kerhli et al. (1990) söz konusu kusurun Mac-1 (CD11/CD18) glikoproteinin eksikliği sonucu nötrofil fonksiyonlarının bozulmasına dayandığını ve Siyah Alaca sığır ırkından bir boğa familyasının bu BLAD ın taşıyıcısı olduğunu saptamışlardır. Bu araştırıcılar hastalığın nedeninin sığır lökosit hücre zarında bulunan ve lökosit bağlanma glikoproteinlerini kodlayan gende meydana gelen bir nokta 6

7 mutasyonu olduğunu belirlemişlerdir. Bu mutasyonun neden olduğu kalıtsal bozukluğu da BLAD olarak adlandırmışlardır (Tammen et al. 1996, Ekin 2003). Sadece Siyah Alaca sığırlarında tespit edilen BLAD kalıtsal kusuruna benzer bir mutasyon ilk önce insanlarda (LAD, Lökosit Adhezyon Yetersizliği) tespit edilmiştir. Tespit edilen bu genetik kusur İrlanda Seter köpeklerinde de görülmekte ve CLAD (Canine Lökosit Adhezyon Yetersizliği) olarak adlandırılmaktadır. LAD insan genomunun 21 numaralı otozomal kromozomu üzerinde resesif etkili bir gen tarafından belirlenen kalıtsal bir kusur olup ilk defa 1974 yılında A.B.D. de tanımlanmıştır. LAD lökosit hücre zarında bulunan ve lökositlerin damar endotel hücrelerine bağlanmalarını sağlayan CD18 glikoproteinini kodlayan gende meydana gelen nokta mutasyonunun sonucunda oluşmaktadır. Meydana gelen bu mutasyon lökositlerin özellikle de nötrofil lökositlerin, damar duvarına yapışarak enfeksiyon bölgelerine ulaşmalarına engel olur. LAD yeni doğan bebeklerde bağışıklık sisteminin baskılanmasına neden olmaktadır. Bu da homozigot bebeklerde tekrarlayan bakteriyel ve fungal enfeksiyonların görülmesine neden olmaktadır. Homozigot bebeklerde tekrarlayan yumuşak doku enfeksiyonları, yara iyileşmesinde gecikme, göbek kordonunun geç düşmesi ve özellikle de nötrofil lökosit artışı ile tanımlanan devamlı ilerleyici lökosit artışı görülmektedir. Bir çok LAD hastasının yoğun antibiyotik tedavisine rağmen erken yaşta öldüğü ve kemik iliği naklinin LAD ın tek tedavi şekli olduğu ifade edilmektedir (Kehrli et al. 1992, Akyüz 2005). CLAD köpek genomunun 31 numaralı otozomal kromozomu üzerinde taşınan resesif etkili bir gen tarafından belirlenen kalıtsal bir kusur olup ilk defa ABD de 1975 yılında Renshaw et al. (1975) tarafından İrlanda Seter köpek ırkında tanımlanmıştır. Bu kalıtsal bozukluğun insanlarda görülen LAD hastalığında görülen semptomlarla benzer olduğu bildirilmiştir (Gerardi 1996). CLAD CD18 geninde meydana gelen bir nokta mutasyonu sonucunda oluşmaktadır. CD18 geninin 107. nükleotidi olarak bulunan guanin (G) nükleotidinin sitozin (C) nükleotidi ile yer değiştirmesi sonucunda meydana gelen mutasyon CLAD ın oluşmasına sebep olmaktadır. Bu mutasyon sonucunda normal fenotipte 36. amino asit olarak bulunan sistein amino asidi yerine mutant fenotipte serin 7

8 amino asidi yer almaktadır. Bu mutasyon sonucunda İrlanda Seter köpek ırkında lökosit yetersizliği meydana gelmektedir. Süt sığırı yetiştiriciliğinde buzağı ölümü önemli bir ekonomik kayıptır. Süt sığırcılığında doğan buzağıların yaklaşık % 7,7 si çeşitli nedenlerden dolayı ölmektedir. İlk olarak ABD de belirlenen BLAD süt endüstrisini tehdit eden en önemli kalıtsal hastalıklardan birisidir (Shuster et al. 1992). İshal nedeniyle ölen sütçü ırklara ait buzağıların % 36 sında ölümün belirli bir mikrobik faktörlerden kaynaklanmadığı ifade edilirken genç Siyah Alaca buzağılarında ölüm sebebi nadiren granülositopati sendromu (BLAD) olarak bildirilmektedir (Kehrli et al. 1990). A.B.D. de Siyah Alaca Yetiştiricileri Birliği, Siyah Alaca boğaların moleküler DNA seviyesinde kontrol edilerek BLAD allelini taşıyan boğaların pedigrisine BL, taşımayanların pedigrisine ise TL kodunun eklenmesini kararlaştırmıştır. Buna göre, Kuzey Amerika da suni tohumlama şirketleri tarafından aktif olarak kullanılan damızlık boğalar DNA testi ile kontrol edildikten sonra, eğer boğa BLAD genini taşımıyorsa, boğa kataloğuna isminden sonra TL kısaltması eklenir. Eğer test edilen boğa taşıyıcı ise boğa isminden sonra BL kısaltması eklenir. Bu sayede damızlık boğaların BLAD durumu hakkında yetiştiriciler bilgilendirilmiş olmaktadır (Tammen et al. 1996, Citek et al. 2004, Nagahata 2004). BLAD genetik kusuru bakımından buzağılarda görülen belirtiler oldukça farklılık göstermektedir. Genellikle bu belirtiler homozigot resesif genotipe sahip olan buzağılarda doğumdan hemen sonra görülür. BLAD bakımından homozigot resesif genotipe sahip olan buzağılarda lökosit hücre zarlarında bulunan bağlanma proteinlerinin tamamen yokluğu veya önemli ölçüde azalması lökositlerin damar duvarını geçmelerini dolayısıyla da enfeksiyon etkenleriyle savaşmalarını engeller. Bunun sonucu olarak ta BLAD bakımından homozigot resesif genotipe sahip olan buzağıların sindirim ve solunum sistemlerinde sık ve tekrarlayan bakteriyel enfeksiyonlar görülmektedir. Ayrıca, buzağıların bağışıklık sisteminde meydana gelen zayıflamaya bağlı olarak hastalıklara karşı duyarlılıkları da artmaktadır. BLAD bakımından homozigot resesif genotipe sahip olan buzağılar 12 aylık yaşa kadar 8

9 ölmektedirler. Buzağılarda 2 ila 12. aylarda görülen ve bir yaşına kadar olan bireylerin ölmesine sebep olan bu genetik kusur; zatüre (pneumonie), dişlerin dökülmesi, mide ülseri, şiddetli bakteriyel enfeksiyonların sık sık tekrar etmesi, ishal, hastalıklara karşı duyarlılığın artması, yaraların geç iyileşmesi, kıl örtüsünün mat ve dağınık görünmesi, iştah azalması, kilo kaybının meydana gelmesi, büyümenin yavaşlaması, iri kafalı ve iri ayak yapılı oluş şeklinde tanımlanmaktadır (Shuster et al. 1992, Nagahata et al. 1996, Özbeyaz 1997, Riberio et al. 2000, Akyüz 2005). Kalıtsal bozukluğa homozigot olarak sahip buzağıların canlı ağırlıkları beklenen vücut ağırlığın ancak %50-60 ı kadardır. BLAD lı buzağıların günlük canlı ağırlık artışları 0,3 kg/gün iken sağlıklı buzağılarda 0,6 kg/gün olarak belirlenmiştir. Agerholm et al. (1993) BLAD olduğunu belirledikleri iki Siyah Alaca buzağı ile aynı çiftlikteki normal yaşıtlarını 42., 70. ve 210. günlerde canlı ağırlıkları bakımından karşılaştırmışlardır. Yapılan karşılaştırma sonunda 210. günde normal buzağıların BLAD lı buzağılardan 93 kilo daha fazla canlı ağırlığa sahip olduklarını belirlemişlerdir (Akyüz 2005). BLAD bakımından homozigot resesif genotipe sahip olan buzağılar genellikle doğumu takip eden ilk birkaç hafta içinde yaygın ve tekrarlayan bakteriyel enfeksiyonlar sonucu ölürler. Fakat enfeksiyonların yaygınlığı ve etkilenen organların etkilenme derecesine bağlı olarak ölüm bir yaşına kadar ertelenebilir. BLAD bakımından homozigot resesif genotipe sahip olan buzağılar ancak steril bir ortamda, yoğun bir tıbbi müdahele ve özel bakımla 2-3 yaşına kadar yaşayabilir. Ancak bu hayvanlar kesinlikle kızgınlık göstermezler (Powell et al. 1996). Tayvan da yapılan bir araştırma sonucunda BLAD taşıyıcısı olan sığırların süt verimlerinin, normal sığırların süt verimlerinden yüksek, buna karşılık süt kalitesinin ise düşük olduğu bildirilmektedir (Ekin 2003). Powell et al. (1996) BLAD allelini taşıyan ve taşımayan boğaların kızlarının süt verimlerini, sütteki yağ ve protein oranlarını karşılaştırmışlardır. Söz konusu araştırmada BLAD bakımından taşıyıcı hayvanların BLAD alleline sahip olmayanlara oranla, bir laktasyon döneminde süt veriminin 18 kg, sütteki yağ miktarının 0,4 kg, 9

10 sütteki protein miktarında 0,9 kg daha düşük seviyede olduğu bildirilmektedir. Ayrıca BLAD taşıyıcısı hayvanlarda süt yağı miktarının normal hayvanlara oranla daha az olduğu (Janosa et al. 1999), 305 günlük süt verimleri temelinde süt verim ortalamaları arasında istatistik olarak önemli farklılıkların olmadığını (Wanner et al. 1998) bildiren araştırmalara da rastlanmaktadır. 2.2 BLAD genotipli Sığırları Belirleme Yöntemleri Sığır yetiştiriciliğinde ekonomik kayıplara neden olan kalıtsal kusurların belirlenmesi ve genetik temellerinin açıklanması, ekonomik verim seviyesinin korunması ve populasyonun devamı bakımlarından oldukça önemlidir. Sığırlarda görülen kalıtsal bozukluklar çoğunlukla resesif etkili bir gen tarafından belirlenmekte olup otozomal kalıtım modeliyle generasyonlar boyunca aktarılmaktadır. BLAD gibi otozomal kromozomlar üzerinde bulunan resesif etkili bir gen tarafından belirlenen kalıtsal kusurlar bakımından sığırlar, normal (BB), genetik kusur veya BLAD taşıyıcısı (Bb) ve genetik kusurlu veya BLAD genotipli hasta (bb) olmak üzere üç farklı genotipte sınıflandırılmaktadırlar. Üzerinde durulan bir çok kalıtsal kusur o özelliğin meydana gelmesini sağlayan resesif gen bakımından homozigot genotiplerde ortaya çıkmakta ve populasyonda bu şekilde fark edilebilmektedir. Söz konusu gen bakımından homozigot genotipte olan hayvanlar genellikle erken dönemlerde (damızlıkta kullanılmadan) ölmektedir. Bu homozigot genotipteki taşıyıcı hayvanların ölmesi sonucunda genetik kusurun gelecek generasyonlara aktarılması ve söz konusu olan genin populasyonda yayılması önlenmiş olmaktadır. Resesif etkili bir gen tarafından belirlenen genetik bir kusur bakımından heterozigot genotipte olan bireylerin tespit edilmesi ve bu gene sahip olan hayvanların populasyondan uzaklaştırılması çok daha önemlidir. Heterozigot genotipte olan bireylerin fenotiplerinde çoğunlukla herhangi bir değişiklik meydana gelmemektedir. Bunun sonucunda da öldürücü etkiye sahip olan resesif etkili gen belirli oranlarda gelecek generasyonlara aktarılmaktadır. Böylece genetik kusurun oluşmasından sorumlu olan genin populasyondaki varlığı ve buna bağlı olarak ta frekansı 10

11 generasyonlar boyunca artabilmektedir. Genetik kusurlu hayvanların populasyondaki frekanslarının artması sonucunda ekonomik verimler bakımından da önemli kayıplar meydana gelebilmektedir. Ekonomik kayıpların en az seviyeye indirilmesi amacıyla damızlıkta kullanılacak ebeveynlerin söz konusu genetik kusurlar bakımından taşıyıcı olup olmadıklarının belirlenmesi son derece önemlilik arzetmektedir. BLAD taşıyıcısı olan heterozigot genotipteki Siyah Alaca buzağılarında tipik klinik belirtiler tespit edilememektedir. Bu nedenle BLAD genetik kusuru Siyah Alaca populasyonunun devamı için potansiyel bir tehlike oluşturmakta ve BLAD taşıyıcısı genotiplerin belirlenmesi homozigot genotiplerin belirlenmesinden çok daha önemli olmaktadır (Cox et al. 1997). BLAD genetik kusurunun tanısı biyokimyasal, sitolojik ve moleküler genetik yöntemleri kullanılarak yaygın bir şekilde yapılmaktadır. Üzerinde durulan herhangi bir protein yada enzim bakımından çeşitli doku ve organlarda fazlalık veya eksiklik meydana gelebilir ve bu laboratuvar koşullarında çeşitli yöntem ve testler yardımıyla biyokimyasal olarak belirlenebilmektedir. Protein seviyesinde tespit edilen farklılıklar temelinde sığırlar normal ve hasta olarak sınıflandırılabilmektedir. Yapılan bu sınıflandırmada taşıyıcı bireylerin diğer genotiplerden ayrılması çoğunlukla mümkün olmamaktadır. Normal ve mutant lökositlerin sayılması ile mutant lökosit yoğunluğu ve miktarının belirlenmesi esaslarına dayandırılan sitolojik yöntemler kullanılarak ta BLAD genetik kusurunun tanısı konabilmekte ve çok gelişmiş laboratuvarlarda pahalı ekipmanlar kullanılarak, sığırlar normal ve hasta olarak gruplandırılabilmektedir. Heterozigot bireyler kesin olarak belirlenememektedir. BLAD genotiplerinin tanısının yapılmasında biyokimyasal ve sitolojik yöntemlerin belirtilen eksikliklerinin giderilmesi amacıyla son zamanlarda moleküler genetik yöntemlerden yararlanılmaya başlanmıştır. PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) temelli olarak geliştirilen DNA Dizi Analizi ve RFLP gibi moleküler teknikler kullanılarak sığır genotipleri belirlenmekte ve BLAD bakımından üç farklı genotip tespit 11

12 edilebilmektedir. Moleküler genetik teknikler kullanılarak BLAD genetik kusuru bakımından sığır genotiplerinin belirlenmesi kısa sürede çok daha duyarlı bir şekilde ve diğer yöntemlere göre de daha ucuz maliyetle yapılabilmektedir. Moleküler genetik teknikler kullanılarak BLAD ın tanısı ilk olarak 1992 de yapılmıştır (Shuster et al. 1992). Belirtilen araştırmada genel olarak, CD18 geni PCR ortamında çoğaltılmakta ve daha sonra PCR ürünleri restriksiyon endonükleaz enzimleri ile muamele edilerek kesim noktalarının varlığı ve yokluğu temelinde sığırların genotipleri normal (BB), BLAD taşıyıcı (Bb) ve BLAD genetik kusurlu (bb) olarak belirlenmektedir. Çalışmada CD18 geni primerleri (İleri primer olarak 5 TCC GGA GGG CCA AGG GCT A 3 ve ters primer olarak 5 GAG TAG GAG AGG TCC ATC AGG TAG TAC AGG 3 ) kullanılarak PCR ortamında 58 bç uzunluğunda DNA parçası verecek şekilde çoğaltılmaktadır. Elde edilen PCR ürünü TaqI ve HaeIII restriksiyon endonükleaz enzimleri ile muamele edilmekte ve %4 lük agaroz jellerinden elektroforez işlemine tabi tutulmaktadır. Elektroforez işleminden sonra jeller boyanarak genotipler belirlenmektedir. PCR ürünlerinin kesiminde TaqI restriksiyon enzimi kullanıldığında normal genotipteki bireyler 26 bç ve 32 bç uzunluğunda iki bant veren bir modele sahip olurken, taşıyıcı genotipte olan bireyler 26 bç, 32 bç ve 58 bç uzunluklarında üç bant veren bir modele sahip olmaktadırlar. PCR ürünlerinin kesiminde HaeIII restriksiyon enzimi kullanıldığında ise normal genotipteki bireyler 9 bç ve 59 bç uzunluğunda iki bant veren bir modele sahip olurken, taşıyıcı genotipte olan bireyler 9 bç, 19 bç, 30 bç ve 49 bç uzunluklarında dört bant veren bir modele sahip olmaktadırlar 1992 yılında Shuster et al. (1992) geliştirdikleri bu yöntem sonucunda elde edilen PCR ürünün çok küçük (PCR ürünü küçük olduğu için kesim ürünleri de çok küçük olmakta ve bunların agaroz jellerinde belirlenmesi çoğu zaman mümkün olamamaktadır) olmasından dolayı, Kriegesmann et al. (1997) yeni bir primer çifti geliştirmişlerdir. Bu primerler kullanılarak yapılan PCR sonrasında elde edilen 343 bç lik PCR ürünlerinin TaqI restriksiyon enzimi ile kesiminden sonra, homozigot normal bireylerde 2 bant (191 bç, 152 bç), heterozigot (taşıyıcı) bireylerde 3 bant (343 bç, 191 bç, 152 bç) ve homozigot hasta bireylerde ise tek bant (343 bç) görülmüştür. 12

13 Siyah Alaca sığırlarında BLAD genetik kusurunun moleküler genetik teknikler kullanılarak belirlenmesi ve kimi özellikler üzerine olan etkilerinin tespit edilmesi amacıyla yürütülen birçok araştırmaya rastlanılmıştır (Çizelge 2.1). Çizelge 2.1 de verilen araştırmalarda; esas olarak farklı primerler tasarlanarak çoğaltılmış CD18 geninin TaqI ve HaeIII restriksiyon enzimleriyle muamele edilmesiyle elde edilen farklı PCR-RFLP bant modellerinden yararlanılarak BLAD genotiplerinin belirlenmesi (Shuster et al. 1992, Tammen et al. 1996, Riberio et al. 2000, Ilie et al. 2004) ne yönelik araştırmalara ilave olarak çeşitli ülkelerdeki BLAD taşıyıcısı hayvanların genotip frekanslarının tahmin edilmesine dayalı çalışmalara da rastlanılmaktadır. Söz konusu araştırmalarda ABD de boğalarda %14,1, ineklerde ise %5,8 (Shuster et al. 1992), yine ABD de %8,2 (Powell et al. 1996), Japonya da %8,1 (Nagahata et al. 1999) ve Brezilya da %5,7 (Riberio et al. 2000) oranında taşıyıcı hayvanların bulunduğu bildirilmektedir. Genel olarak BLAD geninin (q b ) frekansının çok düşük değerler arasında olduğu bildirilmekle beraber Brezilya da 0,028 (Riberio et al. 2000), Rusya da 0,029 (Hofer et al. 2000) ve Şili de 0,0179 (Ricardo et al. 2001) olarak ifade edilmiştir. Ayrıca Çek Cumhuriyeti nde 406 inek üzerinde yapılan araştırmada BLAD genine rastlanmamıştır (Citek et al. 2006). Ayrıca Polonya da CD18 geninin 775. nükleotidinde meydana gelen silent mutasyon temelinde 15 boğa ve 195 ineğin genotipinin belirlenmesine yönelik yürütülen bir araştırmada da çoğaltılan 108 bç lik PCR ürününü Fnu4HI restriksiyon enzimi ile kesilmiş ve BLAD bakımından homozigot genotipe sahip hayvanların genotip frekansı 0,03 olarak hesaplanmıştır (Czarnik et al. 2004). Türkiye de BLAD genetik kusurunun tanısına yönelik olarak yalnızca bir araştırmaya rastlanmıştır. Bu araştırmada 120 Siyah Alaca, 20 İsviçre Esmeri, 20 Yerli Kara, 20 Boz Irk, 20 Güney Doğu Anadolu Kırmızısı ve 20 Doğu Anadolu Kırmızısı sığırı materyal olarak kullanılmıştır (Akyüz 2005, Akyüz and Ertuğrul 2006). Araştırmada Kriegesmann et al. (1997) un tarafından tasarlanan primerler kullanılarak 343 bç uzunluğunda PCR ürünü elde edilmiştir. Elde edilen PCR ürünleri TaqI restriksiyon 13

14 enzimi ile muamele edilerek hayvanların genotipleri %2 lik agaroz jellerinde belirlenmiştir. Araştırmaya konu olan Siyah Alaca ırkı sığırlarında bir boğa ve bir inek olmak üzere ikisinin BLAD yönünden taşıyıcı oldukları belirlenmiştir. Çalışılan Siyah Alaca sığır ırkı içinde homozigot BLAD lı bireye rastlanılmamıştır. Materyal olarak kullanılan diğer sığır ırklarında mutant BLAD alleline rastlamamış olup, toplam 120 Siyah Alaca ırkı sığırda, mutant BLAD allelinin frekansı 0,0084 olarak hesaplanmıştır. Çizelge 2.1 BLAD genetik kusurunun moleküler genetik teknikler kullanılarak belirlenmesine yönelik yürütülen araştırmalar ve sonuçları. Ülke Örnek Genişliği BLAD Genotipleri BB* Bb* Bb* q b Gen Frekansı** Kaynak ABD (0,141) (0,058) [0,07] [0,03] Shuster et al Danimarka [0,11] Jorgensen et al Almanya [0,08] Tammen et al ABD 6400 (0,082) [0,04] Powell et al Japonya 796 (0,081) [0,04] Nagahata et al Japonya 792 (0,134) [0,06] Nagahata et al ABD [0,04] Wanner et al Brezilya Riberio et al Rusya Hofer et al Şili Ricardo et al Polonya Türkiye (0.47) (0.50) (0.03) [0.28] Czarnik et al Akyüz Çek Cumh [0,00] Citek et al *Parantez içinde bildirilen değerler genotip frekanslarını ifade etmektedir. **Köşeli parantez içinde bildirilen gen frekansları tarafımızdan hesaplanmıştır. 14

15 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Canlı materyal Araştırmada Çizelge 3.1 de verilen Siyah Alaca ve Simental ırklarına ait toplam 122 sığır materyal olarak kullanılmıştır. Tarım İşletmeleri Genel Müdürlüğü (TİGEM) ne ait çiftliklerden temin edilen ve bu çalışmanın materyali olarak kullanılan erkek hayvanlar, boğa adayı olarak seçilen ve damızlıkta kullanılması düşünülen Siyah Alaca buzağıları ve danalarından oluşmaktadır. TİGEM e ait Bala ve Polatlı çiftliklerinden temin edilen 19 inek sağılan ergin Siyah Alaca sığırlarıdır. Damızlık Sığır Yetiştiriciler Merkez Birliği nden sağlanan 7 boğa birlik tarafından damızlık olarak kullanılan boğalardır. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Zootekni Bölümü Hayvancılık İşletmesinden temin edilen Siyah Alaca (5) ve Simental (6) inekleri ise günlük olarak sağılan sığırlardır. Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan ırklar, örnek sayısı ve örneklerin alındığı işletmeler Irk Örnek Sayısı Örneğin Alındığı İşletmeler Siyah Alaca TİGEM Bala Tarım İşletmesi Müdürlüğü Bala / Ankara Siyah Alaca 20 TİGEM Polatlı Tarım İşletmesi Müdürlüğü Polatlı / Ankara Siyah Alaca 7 Damızlık Sığır Yetiştiriciler Merkez Birliği Ankara Siyah Alaca 5 Anakara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Zootekni Bölümü Hayvancılık İşletmesi Ankara Simental TOPLAM Anakara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Zootekni Bölümü Hayvancılık İşletmesi Ankara 15

16 3.1.2 Araç ve gereçler Bu araştırmanın yürütülmesinde Zootekni Bölümü Biyometri ve Genetik Anabilim Dalı Genetik Laboratuvarı nda mevcut bulunan ve Çizelge 3.2 de detayları açıklanan araç ve gereçler kullanılmıştır. Çizelge 3.2 Araç ve gereç listesi Adı/Modeli Çalışmada Kullanım Amacı Bidestile Saf Su Cihazı / Büchi Fontavapor 285, Ultra Saf Su Cihazı / Sg Ultra Clear Basic DNA izolasyonu ve PCR reaksiyonları için kullanılan tampon çözeltilerin hazırlanması ph metre / Orion 420 Tampon çözeltilerin hazırlanması için gerekli ph nın belirlenmesi Otoklav / Hyrama Kullanılan malzemlerin sterilizasyonu Nano Drop Spectrofotometre/ ND 1000 İzole edilen DNA örneklerinin konsantrasyonları ve saflık derecelerinin belirlenmesi Çalkalayıcılı Sıcak Su Banyosu / Kotterman DNA izolasyonu Isıtıcılı Manyetik Karıştırıcı / Janke & Kunkel KG Tampon çözeltilerin hazırlanması Çalkalayıcı (Vortex) / Julabo Paramix3 Tampon çözeltilerin hazırlanması ve DNA izolasyonu Santrifüj / NÜVE NF rpm, Mikro Santrifüj / SIGMA 1-15, rpm Mikro Santrifüj / HERMLE Z 231M, rpm DNA izolasyonu ve PCR aşamalarında örneklerin kısa süreli santrifüj edilerek çöktürülmesi Soğutmalı Santrifüj / Thermo Iec Multi Rf , DNA izolasyonu sırasında örneklerin Rpm, g bozulmadan santrifüj edilmesi Manuel Hassas Terazi / Sartorius, 200 G Dijital Hassas Terazi / Sartorius, R 200 D, 1000 G Tampon çözeltilerin hazırlanmasında sarf malzemlerin tartılması Gradient Thermal Cycler 96 Örneklik / Biorad Mikrosatelit lokusların çoğaltılması Thermal Cycler 25 Örneklik / Techne TC 312 Agaroz Jel Elektroforez Takımları / Thermo DNA izolasyonu ve PCR ürünlerinin tespiti Güç Kaynakları / HSI 2500 DC, Bimetra P25, BioRad Elektroforez sistemlerinin elektrik Model 200/2.0 Jel Görüntüleme ve Analiz Sistemi / Kodak Gel Logıc 200 ortamlarının sağlanması DNA izolasyonu, PCR ürünleri ile mikrosatelit lokusların ön denemelerinin jelde görüntülenmesi ve bilgisayar ortamına aktarılması Termal Yazıcı / Sony Digital Graphic Printer Up-D895 DNA izolasyonu, PCR ürünleri ile mikrosatelit lokusların arşivlenmesi için baskı yapılması Mikro Dalga Fırını (ARÇELİK MD 500) UV Transilluminatör / Vilber Lourmat UV Lambası ve Gözlükleri / Mineralight Lamp UV- 254/366 Nm Derin Dondurucu / Rua Instruments, -80 C 0 Derin Donduruculu Buzdolabı / Arçelik, -25, +4 Steril DNA İzolasyon Kabini / Metisafe Class II Çeker Ocak / Metisafe Class II Agaroz jellerin hazırlanması DNA izolasyonu ve PCR ürünleri ile mikrosatelit lokusların ön denemelerinin agaroz veya PAGE jel elektroforez yapılırken aynı anda fragment ayrımlarının kontrollerinin de yapılması Örnek ve çeşitli sarf malzemelerin saklanması DNA izolasyonu ve PCR işlemlerinin steril ortamda yapılması Çeşitli tampon çözeltilerin hazırlanması 16

17 3.1.3 Tampon çözeltiler DNA moleküllerinin izolasyonu, PCR optimizasyonlarının yapılması, restriksiyon enzimi ile muamele edilmesi, agaroz jellerin hazırlanması ve elektroforez işlemlerinin yapılmasında kullanılan çözeltiler Çizelge 3.3 de verilmiştir. Çizelge 3.3 Çalışmada kullanılan tampon çözeltilerin molaritesi/miktarı ve içerikleri Tampon Çözelti Molarite/Miktar İçerik Eritrosit Lisis Tampon Çözeltisi Fizyolojik Tampon Çözeltisi Lisis TE Tampon Çözeltisi TE Tampon Çözeltisi 6M NaCl Çözeltisi DNA Yükleme Tampon Çözeltisi 10 X TBE Elekrtroforez/Jel Stok Tampon Çözeltisi 1 X TBE Elekrtroforez/Jel Tampon Çözeltisi TaqI Kesim Çözeltisi PCR Stok Tampon Çözeltisi 0,32 M 10 mm 5 mm 75 mm 25 mm 500 mm 20 mm 10 mm 10 mm 1mM 5.64 g 10 ml ye tamamlanır 5.0 ml 2.0 ml 1.5 ml 1.5 ml g 55.0 g 40.0 ml 1 litreye tamamlanır 200 ml 2 litreye tamamlanır 0,5 μl 1,5 μl 8,5 μl 1,3 μl 2,0 μl 2,0 μl 2,0 μl 0,5 μl 0,5 μl 0,2 μl 11,5 μl Sukroz EDTA MgCl 2 NaCl EDTA Tris-HCl EDTA NaCl Tris EDTA NaCl Deiyonize bdh 2 O Gliserol Bromfenol EDTA Deiyonize bdh 2 O Tris Borik Asit 0.5 M EDTA (ph 8,0) Deiyonize bdh 2 O 10 X TBE Deiyonize bdh 2 O TaqI Buffer (Tampon) TaqI Deiyonize bdh 2 O Genomik DNA 10 X PCR tamponu 10 x dntp (0,2 mm) MgCl 2 (1,5 mm) İleri Primer Ters Primer Taq DNA polimeraz (0.5 U) Deiyonize bdh 2 O 17

18 3.2 Yöntem Kan örneklerinin alınması Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Zootekni Bölümü Biyometri ve Genetik Anabilim Dalı Genetik Laboratuvarı nda yürütülen bu çalışmada kullanılan kan örnekleri, 10 ml lik EDTA lı tüplere, steril ve tek kullanımlık iğneler ile vena jugularisten alınmıştır. Hayvanlardan alınan kanlar soğuk zincirde laboratuvara getirilmiştir ve genomik DNA izolasyon işlemine kadar -20 ºC de saklanmıştır. Ayrıca Damızlık Sığır Yetiştiricileri Merkez Birliği nden temin edilen ve araştırmada kullanılan donmuş spermler sıvı azot içerisinde laboratuvara getirilerek -80 ºC de muhafaza edilmiştir Genomik DNA izolasyonu Genomik DNA molekülünün izolasyonunda Miller et al. (1988) tarafından bildirilen DNA izolasyon protokolü laboratuvar ortamında optimize edilmiş ve aşağıdaki şekilde uygulanmıştır ºC de muhafaza edilen kan örnekleri çözülene kadar oda sıcaklığında (24 25 ºC) bekletilmiştir. 2. Her bir kan örneğinden 500 μl alınarak 1,5 ml lik ependorf tüp içine konulmuştur. 3. Örneklerin üzerine μl Eritrosit Lisis Tampon Çözeltisi (Çizelge 3.3) ilave edilmiş ve kısa bir süre vorteksle iyice karıştırılarak 10 dakika oda sıcaklığında bekletilmiştir. 4. Bekletme süresinin sonunda örnekler rpm de 10 dk santrifüj edilmiştir. 5. Ependorf tüplerin üst kısmında toplanan sıvı kısım (süpernatant) dikkatli bir şekilde uzaklaştırılmıştır. Dipte kalan peletlerin (hücre kısmı) rengi gözlenerek peletlerin rengi beyaz olana kadar Eritrosit Lisis Tampon Çözeltisi ile tekrar (en fazla 3 defa) muamele edilmiştir. 6. Peletlerin üzerine μl Fizyolojik Tampon Çözeltisi (Çizelge 3.3) eklenmiş ve kısa bir süre karıştırılmıştır. 18

19 7. Örnekler rpm de 10 dk santrifüj edilmiş ve santrifüj sonunda sıvı kısım dikkatli bir şekilde tekrar uzaklaştırılmıştır. 8. Peletlerin üzerine 600 μl Lisis TE Tampon Çözeltisi (Çizelge 3.3) eklenmiş ve peletlerin iyice çözünmesi sağlanmıştır. 9. Çözülen peletlerin üzerine 100 μl SDS solusyonu ve 5 μl proteinaz K (10 mg/ml) eklenerek hafifçe karıştırılmış ve 65 ºC de 1,5 saat su banyosunda tutulmuştur. İnkübasyon süresince her 15 dakikada bir hafifçe karıştırılmıştır. 10. İnkübasyondan çıkarılan örneklerin üzerine 200 µl 6M NaCl Çözeltisi (Çizelge 3.3) eklenmiş ve 15 dk vorteksle iyice karıştırılmıştır. 11. Örnekler rpm de 10 dk santrifüj edilmiştir. 12. Santrifüj sonunda üstte kalan ve DNA moleküllerini içeren sıvı kısım yeni bir ependorf tüp içine koyulmuştur. 13. Örnekler rpm de 5 dk tekrar santrifüj edilmiş ve yine üstte kalan sıvı kısım yeni bir ependorf tüp içine alınmıştır. 14. Örnekler üzerine örnek hacminin iki katı hacimde ( yaklaşık µl) %99,9 luk saf etil alkolden ( 20 ºC de saklanan) ilave edilmiştir. 15. Etil alkol ilave edildikten sonra ependorf tüpü DNA iplikçikleri kümeleşinceye kadar 4-5 kez hafifçe karıştırılmıştır. 16. Kümeleşen DNA iplikçiklerinin tüpün dibine çökmesi için tüp rpm de 5 dk santrifüj edilmiştir. 17. Santrifüj sonunda etil alkol uzaklaştırılarak tüpün dibine çökmüş olan DNA peletinin üzerine μl %70 lik etil alkol ilave edilerek rpm de 5 dk santrifüj edilmiştir. 18. Santrifüj işleminden sonra tüpün üstünde yer alan alkol uzaklaştırılmıştır. 19. Tüp içindeki alkolün tamamen uzaklaşmasını sağlamak amacıyla örnekler çeker ocak içinde kurumaya bırakılmıştır. 20. Tamamen kuruyan örnekler üzerine 100 μl TE Tampon Çözeltesi (Çizelge 3.3) ilave edilmiş olup, DNA peletinin çözülmesi için bir gece buzdolabında +4 ºC de bekletilmiştir. 21. Genomik DNA izolasyonunun miktar ve saflık kontrollerinin yapılmasında NanoDrop Spektrofotometre (ND 1000) den yararlanılmış ve elde edilen veriler bilgisayar ortamına aktarılmıştır. 19

20 22. Örneklerden izole edilen genomik DNA moleküllerinin tek parça olup olmadıklarının (kırılıp kırılmadığı) kontrolleri %2 lik agaroz jellerinde yapılmıştır. 23. Spektrofotometre ölçümleri sonucunda 260/280 dalga boylarında 1,8-2,0 saflık ile miktar olarak 50 ng / μl değerinin üzerinde bulunan ve ayrıca %2 lik agaroz jellerinde tek parça olduğu tespit edilen herbir örneğe ait DNA molekülleri PCR işlemi yapılıncaya kadar +4 ºC de muhafaza edilmiştir. 24. Ayrıca Damızlık Sığır Yetiştiriciler Merkez Birliği nden temin edilen donmuş sperm örneklerinden DNA izolasyonu amacıyla QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) standart izolasyon kitinden yararlanılmıştır Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) BLAD geninin PCR ortamında çoğaltılması amacıyla hem Shuster et al. (1992) hem de Kriegesmann et al. (1997) tarafından bildirilen metotlar kullanılmıştır. BLAD geninin PCR ile çoğaltımı için Shuster et al. (1992) tarafından bildirilen reaksiyon koşulları araştırmanın yürütüldüğü laboratuvar koşullarına adapte edilmiş ve ileri primer olarak 5 TCC GGA GGG CCA AGG GCT A 3, ters primer olarak da 5 GAG TAG GAG AGG TCC ATC AGG TAG TAC AGG 3 primeri kullanılmıştır. Genomik DNA dışındaki tüm bileşenlerin içinde bulunduğu PCR Stok Tampon Çözeltesi (Çizelge 3.3), her seferde incelenecek örnek sayısı ile orantılı olacak şekilde steril 1,5 ml lik ependorf tüpü içinde hazırlanmıştır. Bu PCR Stok Tampon Çözeltesinde her bir örnek için 18,7 μl alınarak 0,2 ml lik ependorf tüplere dağıtılmıştır. Hazırlanan PCR Stok Tampon Çözeltesi 0,2 ml lik ependorf tüplerine dağıtıldıktan sonra örneklere ait genomik DNA dan 1,3 μl alınarak bu çözeltinin üzerine eklenmiştir. Daha sonra ependorf tüplerinin kenarlarına yapışmış olan kısmı dibe çöktürmek için bu karışım 3-5 sn. mikrosantrifüjde rpm de santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonucunda içinde örneklerin bulunduğu 0,2 ml lik ependorf tüpler PCR çoğaltımlarının yapıldığı termal cycler cihazına yerleştirilmiştir. BLAD geninin çoğaltılmasında Çizelge 3.4 de verilen PCR programı uygulanmıştır (Shuster et al. 1992). 20

21 Çizelge 3.4 PCR programı (Shuster et al. 1992) 94 o C 3 dak Ön denaturasyon (DNA eksenlerinin birbirlerinden ayrılması) 94 o C 30 san. Denaturasyon (DNA eksenlerinin birbirlerinden ayrılması) 65 o C 40 san. 35 döngü Annealing (Primerin komplimenter kalıp DNA ekseni bölgesine bağlanması) 72 o C 40 san. Extension (Üzerinde durulan DNA bölgesinin sentezinin yapılması) 72 o C 5 dak Son Extension (Üzerinde durulan DNA bölgesinin sentezinin son kez yapılması) BLAD geninin PCR işlemi sonucunda çoğaltılıp çoğaltılmadığı %2 lik agaroz jellerinde kontrol edilmiştir (Şekil 4.1). Elde edilen PCR ürünlerine, içeriği Çizelge 3.3 de verilen DNA Yükleme Tampon Çözeltisi nden 3 4 µl ilave edilmiştir. PCR ürünleri restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesim işleminde kullanılmak üzere + 4 ºC de saklanmıştır Elektroforez Örneklerin elektroforez işlemi için elektroforez çözeltisi olarak Çizelge 3.3 te içeriği verilen 1 X Elektroforez/Jel Tampon Çözeltisi kullanılmıştır. Elektroforez çözeltisi önce 10 X Elektroforez/Jel Stok Tampon Çözeltisi olarak hazırlanmıştır (Çizelge 3.3). Hazırlanan bu stok solüsyonu deiyonize su ile 10 katı sulandırılarak (1 X TBE Elektroforez/Jel Tampon Çözeltisi) hem jelin hazırlanmasında hem de elektroforez tampon çözeltisi olarak kullanılmıştır. Jelin hazırlanması için 100 ml, Elektrolit Çözeltisi olarak da 1000 ml 1 X TBE Elektroforez/Jel Tampon Çözeltisi kullanılmıştır Metaphor agaroz jellerin hazırlanması BLAD genotipleri %4 lük methapor agaroz jellerinden yararlanılarak tespit edilmiştir. Methapor agaroz jelleri 4 gr methapor agaroz tartılıp 250 ml lik erlen mayerin içine konmuş ve üzerine 100 ml 1 X TBE Elektroforez/Jel Tampon Çözeltisi eklenerek 21

22 hazırlanmıştır. Belirtilen çözelti içinde agaroz iyice homojenize edildikten sonra jel tampon çözeltisi 2-5 dk mikro dalga fırında kaynatılmıştır. Jel kaynatıldıktan sonra üzerine 5 l etidyum bromid çözeltisi (10 mg etidyum bromid/ml deiyonize su) ilave edilmiştir. Hazırlanmış olan jel 8 X 20 X 0,8 cm ebatlarında olan ve üzerinde 22 kuyucuklu tarak bulunan jel tablasına dökülerek oda sıcaklığında soğuması sağlanmıştır. Yaklaşık 30 dk sonra tarak kuyulara zarar vermeden ve jeli yırtmadan dikkatli bir şekilde çıkartılmıştır. Hazırlanan jel 1 x TBE Elektroforez/Jel Tampon Çözeltisi ile dolu olan yatay elektroforez tankına yerleştirilmiştir. Jel tanka yerleştirildikten sonra üzerini tamamen kaplayacak şekilde kadar 1 X TBE Elektroforez/Jel Tampon Çözeltisi ilave edilmiştir PCR ürünlerinin jele yüklenmesi ve fotoğraflarının çekilmesi PCR ürünlerinden 7 µl alınarak 0,2 µl lik PCR tüplerine konulmuş ve üzerine 3µl DNA Yükleme Tampon Çözeltisi eklenmiştir. Örnekerin jele yüklenmesinden önce PCR ürünlerinin tüplerin kenarlarına yapışmış olma ihtimalini azaltmak için bu karışım 3-5 sn mikrosantrifüjde rpm de santrifüj edilmiştir. Daha sonra bu karışım kuyulara dikkatli bir şekilde yüklenmiştir. PCR ürünlerinin büyüklüklerinin tahmin edilebilmesi için 50 bç lik (Fermentas GeneRuler SMO241) standart DNA markeri (DNA Ladder) yüklenmiştir. Elektroforez işlemi 85 V/cm de yaklaşık olarak 1 saat sonra tamamlanmıştır. Elektroforez işleminden sonra jellerin Jel Görüntüleme Analiz Sisteminde (Kodak Gel Logic 200) fotoğrafları çekilerek elde edilen görüntüler bilgisayar ortamına aktarılmıştır PCR ürünlerinin TaqI restriksiyon enzimi ile kesilmesi Elektroforez sonunda 58 bç lik bantların elde edildiği örneklere ait PCR ürünleri TaqI (Fermentas ER0671) restriksiyon enzimi ile kesilmiştir. Çalışmada 10 ünite/μl konsantrasyonundaki 3000 U TaqI restriksiyon enzimi kullanılmıştır. TaqI restriksiyon enzimi aşağıda verilen nükleotid sıralarını tanıyarak bu bölgelerden yapışkan uçlu (sticky, cohesive) kesim yapmaktadır. 22

23 5'...CCAT CGACCT...3' 3'...GGTAGC TGGA...5' TaqI 5'...CCAT 3'...GGTAGC + CGACCT...3' TGGA...5' Restriksiyon enzim ile kesim işlemi bir örnek için toplam hacmi 10 μl olacak şekilde hazırlanmıştır. İçeriği Çizelge 3.3 de verilen bu 10 µl TaqI kesim çözeltisi 13 µl PCR ürünlerinin üzerine eklenmiştir. TaqI kesim çözeltisi bir seferde kesilecek olan örnek sayısı ile orantılı olacak şekilde steril bir 0,2 ml lik ependorf tüpü içinde hazırlanmış ve her bir PCR ürününün bulunduğu tüplere 10 ar µl olacak şekilde dağıtılmıştır. Üzerine TaqI kesim çözeltisi eklenmiş olan PCR ürünleri 65 o C de 3 saat inkübasyona tabi tutulmuştur. İnkübasyon sonrasında, de anlatıldığı şekilde %4 lük Metaphor agaroz jelleri hazırlanarak elektroforez işlemi gerçekleştirilmiştir. Bu tez çalışmasında Shuster et al. (1992) nın kullandığı primerlerin yanısıra primer olarak, Kriegesmann et al. (1997) tarafından bildirilen primerler de kullanılmıştır. Hedef bölgelerin PCR ile çoğaltımı için Kriegesmann et al. (1997) tarafından bildirilen reaksiyon koşulları araştırmanın yürütüldüğü laboratuvar koşullarına adapte edilmiştir. Bu amaçla ileri primer olarak 5' CCT GCA TCA TAT CCA CCA G 3' ve ters primer olarak da 5' GTT TCA GGG GAA GAT GGA G 3 kullanılmıştır. Bu primerlerin ikisi de 19 nükleotitden oluşmaktadır. Bu primerler kullanılarak yapılan PCR sonunda 343 bç uzunluğunda tek bir PCR ürünü elde edilmiştir. Yapılan birçok denemeden sonra PCR optimizasyonu olarak Çizelge 3.5 de verilen PCR programı kullanılmıştır. 23

24 Çizelge 3.5 PCR programı (Kriegesmann et al. 1997) 94 o C 3 dak Ön denaturasyon (DNA eksenlerinin birbirlerinden ayrılması) 94 o C 1 dak Denaturasyon (DNA eksenlerinin birbirlerinden ayrılması) 65 o C 1 dak 35 döngü Annealing (Primerin komplimenter kalıp DNA ekseni bölgesine bağlanması) 72 o C 1 dak Extension (Üzerinde durulan DNA bölgesinin sentezinin yapılması) 72 o C 5 dak Son Extension (Üzerinde durulan DNA bölgesinin sentezinin son kez yapılması) PCR işleminin ardından örnekler %2 lik agaroz jellerinde (2 g agaroz 100 ml 1X TBE Elektroforez/Jel Tampon Çözeltisinde çözdürülmüştür) yüklenmiş ve elektroforez işlemine tabi tutulmuştur. Elektroforez işleminden sonra Jel Görüntüleme Analizi Sisteminde jellerin fotoğrafı çekilmiştir ve bilgisayar ortamında kayıt altına alınmıştır. Elektroforez işlemi sonunda 343 bç lik bantların elde edildiği örneklere ait PCR ürünleri TaqI restriksiyon enzimi ile kesilmiştir. Restriksiyon enzim ile kesim işlemi, bir örnek için toplam hacmi 10 μl olacak şekilde hazırlanmıştır. İçeriği Çizelge 3.3 te verilen bu 10 µl TaqI Kesim Çözeltisi 13 µl PCR ürünlerinin üzerine eklenmiştir. Kesim reaksiyon karışımı bir seferde kesilecek olan örnek sayısı ile orantılı olacak şekilde steril bir 0,2 ml lik ependorf tüpü içinde hazırlanmış ve her bir PCR ürününün bulunduğu tüplere 10 ar µl olacak şekilde dağıtılmıştır. Üzerine TaqI Kesim Çözeltisi eklenmiş olan PCR ürünleri 65 o C de 3 saat inkübasyona tabi tutulmuştur. İnkübasyon sonrasında %2 lik agaroz jelleri hazırlanarak elektroforez işlemi gerçekleştirilmiştir Genotiplerin belirlenmesi BLAD geni bakımından genotiplerin belirlenmesi amacıyla başlangıç denemelerinde Damızlık Sığır Yetiştiricileri Merkez Birliğinden sağlanan ve heterozigot (taşıyıcı) genotipte olduğu bilinen Vedat isimli boğanın donmuş spermasından izole edilen DNA 24

25 moleküllerinden yararlanılmıştır. Daha sonra Dr. Anne WOHLKE (From Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung Tierärztliche Hochschule Hannover / GERMANY) tarafından gönderilen ve taşıyıcı genotipte olduğu bildirilen DNA örnekleri standart olarak kullanılarak 116 baş Siyah Alaca ve 6 baş Simental sığırının BLAD bakımından genotipleri belirlenmiştir (Çizelge 3.6 ve Çizelge 3.7). Çizelge 3.6 İleri primer olarak 5 TCC GGA GGG CCA AGG GCT A 3 ve ters primer olarak ta 5 GAG TAG GAG AGG TCC ATC AGG TAG TAC AGG 3 kullanılarak elde edilen PCR ürünü ile TaqI ve HaeIII kesim enzimleriyle oluşturulan BLAD fenotiplerinde beklenen DNA parçacıklarının büyüklükleri (Shuster et al. 1992) PCR TaqI HaeIII ürünü Normal Taşıyıcı BLAD Normal Taşıyıcı BLAD 58 bç 58 bç 58 bç 49 bç 49 bç 32 bç 32 bç 30 bç 30 bç 26 bç 26 bç 19 bç 19 bç 9 bç 9 bç 9 bç Çizelge 3.7 İleri primer olarak 5' CCT GCA TCA TAT CCA CCA G 3've ters primer olarak ta 5' GTT TCA GGG GAA GAT GGA G 3 kullanılarak elde edilen PCR ürünü ile TaqI kesim enzimiyle oluşturulan BLAD fenotiplerinde beklenen DNA parçacıklarının büyüklükleri (Kriegesmann et al. 1997) PCR TaqI ürünü Normal Taşıyıcı BLAD 343 bç 343 bç 343 bç 191 bç 191 bç 152 bç 152 bç 25

26 3.2.7 BLAD gen frekansının hesaplanması Mutant BLAD geninin frekansı ve standart hatasının hesaplanmasında lokus sayma (counting the number of genes) yöntemi kullanılmıştır (Nei 1987). Çünkü muhtemel olan tüm genotipler (BB, Bb ve bb) belirlenmiş olup, gen frekanslarının hesaplanmasında bu genotiplerden yararlanılmıştır. P S i Pi ( 2 2 f1 f 2N ) Pi (1 Pi ) 2N P İ f 1 f 2 N S p i : i inci allelin frekansı : i inci allel bakımından homozigot genotipli bireylerin sayısı : i inci allel bakımından heterozigot genotipli bireylerin sayısı : i inci lokus bakımından toplam birey sayısı : i inci allel frekansının standart hatası TİGEM Bala Tarım İşletmesi nde yetiştirilen Siyah Alaca sığır populasyonunun BLAD lokusu bakımından, Hardy Weinberg kanununa uygunluğu (genetik dengenin kontrolü ) χ 2 (Khi Kare ) testi ile kontrol edilmiştir. 2 2 ( f f ') f ' χ 2 = Khi kare değeri f = Gözlenen genotip frekansları f 1 = Beklenen genotip frekansları 26

27 4. SONUÇ 4.1 Genomik DNA izolasyonu 116 baş Siyah Alaca ve 6 baş Simental sığır ırkından alınan kanlardan çöktürme (Salting Out) yöntemi kullanılarak genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. DNA izolasyonu sonucunda elde edilen jel görüntüsü Şekil 4.1 de verilmiştir. İzole edilen DNA moleküllerinin olarak ortalama ve standart hatası 154,03 6,70 ng / µl dir. Örneklerden elde edilen genomik DNA ların NanoDrop Spektrofotometre ile ölçümü yapıldıktan sonra, yeterli derecede saf olmadığına karar verilen örneklerde genomik DNA izolasyonu işlemi tekrarlanmıştır. Elde edilen genomik DNA ların yeterli derecede saf olduğuna karar verildikten sonra PCR işlemine geçilmiştir. Şekil 4.1 İzole edilen genomik DNA ların % 2 lik agaroz jellerindeki görünümü 4.2 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) PCR işlemi sonucunda Shuster et al. (1992) ve Kriegesmann et al. (1997) tarafından bildirilen yöntemler kullanılarak sırasıyla 58 bç (Şekil 4.2) ve 343 bç (Şekil 4.3) uzunluğunda PCR ürünleri elde edilmiştir. 27

28 M bç Şekil 4.2 Shuster et al. (1992) yöntemi kullanılarak yapılan PCR işlemi sonrasında elde edilen 58 bç lik PCR ürünlerinin % 4 lük metaphor agaroz jellerindeki görünümü (M, 50 bç Fermentas GeneRuler DNA marker) M bç Şekil 4.3 Kriegesmann et al. (1997) yöntemi kullanılarak yapılan PCR işlemi sonrasında elde edilen 343 bç lik PCR ürünlerinin % 2 lik agaroz jellerindeki görünümü (M, 50 bç Fermentas GeneRuler DNA marker) 28

29 4.3 PCR Ürünlerinin TaqI Restriksiyon Enzimi ile Kesilmesi ve Genotiplerin Belirlenmesi Shuster et al. (1992) yöntemi kullanılarak elde edilen 58 bç lik PCR ürünleri TaqI restriksiyon enzimi ile muamele edildikten sonra meydana gelen genotiplerin %4 lük metaphor agaroz jeller üzerindeki görüntüsü Şekil 4.4 te verilmiştir. Şekil 4.4 te de görülebileceği gibi 3 ve 4 numaralı BLAD geni taşımayan normal genotipteki sığırlar 26 bç ve 32 bç lik bir bant modeline sahipken, BLAD geni bakımından heterozigot genotipe sahip olan 1 ve 2 numaralı taşıyıcı sığırlar 26 bç, 32 bç ve 58 bç lik bant modeline sahiptirler. Bant modellerinde tespit edilen bu farklılıkların temelinde normal ve BLAD taşıyıcı sığırların genotipleri belirlenmiştir. M bç 32 bç 26 bç Şekil 4.4 Shuster et al. (1992) yöntemi kullanılarak elde edilen 58 bç lik PCR ürünleri TaqI restriksiyon enzimi ile muamele edildikten sonra PCR kesim ürünlerinin % 4 lük metaphor agaroz jel elektroforezi sonucu oluşan genotipler (M, 34 bç PucMix DNA marker; 1. ve 2. örnek BLAD taşıyıcısı; 3. ve 4. örnek normal) 29

30 Kriegesmann et al. (1997) yöntemi kullanılarak elde edilen 343 bç lik PCR ürünleri TaqI restriksiyon enzimi ile muamele edildikten sonra meydana gelen genotiplerin %2 lik agaroz jeller üzerindeki görüntüsü Şekil 4.5 te verilmiştir. Şekil 4.5 de de görülebileceği gibi 1, 3, 4, 5, 6 ve 7 numaralı BLAD geni taşımayan normal genotipteki sığırlar 152 bç ve 191 bç lik bir bant modeline sahipken, 2 numaralı BLAD geni bakımından heterozigot genotipe sahip olan taşıyıcı sığırlar 152 bç, 191 bç ve 343 bç lik bant modeline sahiptirler. Bant modellerinde tespit edilen bu farklılıkların temelinde normal ve BLAD taşıyıcı sığırların genotipleri belirlenmiştir. Şekil 4.5 Kriegesmann et al. (1997) yöntemi kullanılarak elde edilen 343 bç lik PCR ürünlerinin TaqI restriksiyon enzimi ile muamele edildikten sonra PCR kesim ürünlerinin % 2 lik agaroz jel elektroforezi sonucu oluşan genotipler (M, 50 bç DNA marker; 1,3,4,5,6,7 numaralı örnekler normal; 2. örnek BLAD taşıyıcısı). Bu çalışma sonucunda, daha önceden taşıyıcı genotipte olduğu belirlenen ve Damızlık Sığır Yetiştiricileri Merkez Birliğinin Menemen deki suni tohumlama istasyonunda sperması sağılan ve TR kulak numaralı, babası Almanya doğumlu, annesi Türkiye de yetiştirilen Vedat isimli damızlık boğa ile Dr. Anne WOHLKE tarafından gönderilen ve BLAD taşıyıcısı olduğu bildirilen örnekler standart olarak kullanılarak toplam 116 Siyah Alaca sığırından 8 tanesinin BLAD taşıyıcısı olduğu tespit edilmiştir. Taşıyıcı olduğu tespit edilen 8 hayvandan 7 tanesi TİGEM Bala Tarım İşletmesi Müdürlüğü tarafından yetiştirilen boğa adayı erkek buzağı ve danalar olup geriye kalan 30