ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ ORNİZADOL ÜN ELEKTROKİMYASAL DAVRANIŞI VE ADSORPTİF SIYIRMA YÖNTEMLERİYLE TAYİNİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ ORNİZADOL ÜN ELEKTROKİMYASAL DAVRANIŞI VE ADSORPTİF SIYIRMA YÖNTEMLERİYLE TAYİNİ ŞENOL TURAN KİMYA ANABİLİM DALI ANKARA 2008 Her hakkı saklıdır

2 TEZ ONAYI ŞENOL TURAN tarafından hazırlanan Ornizadol ün Elektrokimyasal Davranışı ve Adsorptif Sıyırma Yöntemleriyle Tayini adlı tez çalışması 04/06/2008 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman: Doç. Dr. Zehra DURMUŞ Jüri Üyeleri: Başkan: Doç. Dr. Kamran POLAT Ankara Üniversitesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. Raif KURTARAN Balıkesir Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü Üye : Doç. Dr. Zehra DURMUŞ Ankara Üniversitesi, Kimya Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım. Prof. Dr. Orhan ATAKOL Enstitü Müdürü

3 ÖZET Yüksek Lisans Tezi ŞENOL TURAN ORNİZADOL ÜN ELEKTROKİMYASAL DAVRANIŞI VE ADSORPTİF SIYIRMA YÖNTEMLERİYLE TAYİNİ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Zehra DURMUŞ Bu çalışmada antibakteriyel, antiprotozoan ve antikanser etkiye sahip ornidazol ün elektrokimyasal davranışı, asılı cıva damla elektrotta (HMDE), Britton-Robinson tampon (ph 5) ortamında dönüşümlü voltametri (CV) ve sabit potansiyelli kulometri (BE) yöntemleri ile incelendi. Ornidazol ün indirgenme reaksiyonunda aktarılan elektron sayısı, difüzyon katsayısı, adsorpsiyon özellikleri belirlendi. Ornidazol ün elektrokimyasal davranışına bağlı olarak, diferansiyel puls adsorptif sıyırma voltametrisi (AdsDPV) ve kare dalga adsorptif sıyırma voltametrisi (AdsSWV) ile yöntem geliştirildi. AdsDPV ve AdsSWV teknikleri ile elde edilen pik akımı-derişim grafiklerinden doğrusallık aralığı AdsDPV için mol l -1 ve AdsSWV için mol l -1 belirlendi. Bu grafiklerden yararlanılarak belirlenen sınırı ve kantitatif alt tayin sınırı hesaplandı. Uygulanan voltametrik yöntemin doğruluk ve kesinliğini kontrol etmek amacı ile ilaç tabletlerinden ornidazol ün geri kazanım çalışmaları yapıldı. Geliştirilen yöntem ile elde edilen sonuçlar kaynaklardaki spektrofotometrik yöntem sonuçları ile karşılaştırılmıştır. Haziran 2008, 73 sayfa Anahtar Kelimeler: Ornidazol, dönüşümlü voltametri, adsorptif sıyırma diferansiyel puls voltametrisi, adsorptif sıyırma kare dalga voltametrisi i

4 ABSTRACT Master Thesis ELECTRCHEMICAL BEHAVIORS OF ORNIDAZOLE AND ITS ADSORPTIVE STRIPPING DETERMINATION ŞENOL TURAN Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Zehra DURMUŞ In this study, electrochemical behaviors of ornidazole, which posses antibacterial, antiprotozoan and anticancer activity, was investigated on hanging mercury drop electrode (HMDE) in Britton-Robinson buffer (ph 5) by cyclic voltammetry (CV) and controlled-potential coulometry (BE). The number of electron transferred in the reduction of ornidazole and diffusion coefficient and adsorption properties were determined as the related to electrochemical behavior of ornidazole, the method was developed by differential pulse adsorptive stripping voltammetry and squarewave voltammetry techniques. Linearity range (for AdsDPV mol l -1 ; for AdsSWV mol l -1 ) was determined from peak current-concentration curves which obtained AdsDPV and AdsSWV technigues limit of detection and limit of quantitation were calculated using these curves. In order to check accuare and precision of applied voltametric method, recovery experiments of ornidazole was carried out from the drug tablets. The results obtained by the developed method were compared with a spectrophotometric method in the literature. June 2008, 73 pages Key Words: Ornidazole, cyclic voltammetry, adsorptive stripping differential pulse voltammetry, adsorptive stripping square wave voltammetry ii

5 TEŞEKKÜR Tez çalışmam sırasında ve tezimin hazırlanmasında bana her konuda yardımcı olan, bilgisini, tecrübesini, hoşgörüsünü esirgemeyen danışmanım Sayın Doç. Dr. Zehra DURMUŞ a, Çalışmalarım sırasında bana destek olan ve yardımlarını esirgemeyen Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü elemanlarına ve özellikle Sayın Prof. Dr. Esma KILIÇ a, Son dört yıldır yanımda olan ve her zaman beni çalışmalarımda destekleyen Sibel KARAKAŞ a, Bugüne kadar, maddi ve manevi desteklerini hiç esirgemeyen her zaman yanımda olan sevgili Ailem e, sonsuz teşekkürlerimi sunarım ŞENOL TURAN Ankara, Haziran 2008 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT.ii TEŞEKKÜR...iii SİMGELER DİZİNİ.vii ŞEKİLLER DİZİNİ...x ÇİZELGELER DİZİNİ....xii 1. GİRİŞ 1 2. KURAMSAL TEMELLER Voltametri ve Voltametrik Metotların Sınıflandırılması Voltametri Dönüşümlü voltametri (CV) Tersinir sistemler Tersinmez ve yarı-tersinir sistemler Adsorpsiyonun dönüşümlü voltametri ile incelenmesi Diferansiyel puls voltametri (DPV) Kare dalga voltametri (SWV) Sabit potansiyelli elektroliz (Bulk elektroliz, BE) Sıyırma voltametrisi Anodik sıyırma voltametrisi Katodik sıyırma voltametrisi (KSV) Adsorptif sıyırma voltametrisi (AdSV) Elektrotlar Elektrot seçimi Çözeltinin-karıştırılması ve biriktirme süresi Biriktirme potansiyelinin seçimi Sıyırma basamağı Kaynak Araştırması MATERYAL VE YÖNTEM Ornidazol Kullanılan Kimyasal Maddeler iv

7 3.3 Kullanılan Diğer Cihaz ve Malzemeler Elektrokimyasal Ölçme Sistemi Kullanılan Elektrotlar Kullanılan Çözeltiler Destek elektrolit stok çözeltilerinin hazırlanması İncelenen ornidazol çözeltilerinin hazırlanması Sabit potansiyelli kulometri (BE) çalışmalarında kullanılan çözeltilerin hazırlanması Dönüşümlü Voltametri Deneylerinin Yapılışı Diferansiyel Puls Voltametri Deneylerinin Yapılışı Kare Dalga Voltametri Deneylerinin Yapılışı Bulk Elektroliz Deneylerinin Yapılışı ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Dönüşümlü voltametri çalışmaları Tekrarlanabilirliğinin incelenmesi Ornidazol ün adsorpsiyon özelliği Elektrot reaksiyonunda aktarılan elektron sayısı (n), difüzyon katsayısı (D) Aktarılan elektron sayısının (n) sabit potansiyelli kulometriyle (BE) bulunması Garrido yöntemi ile difüzyon katsayısının (D) bulunması Önerilen Reaksiyon Mekanizması Ornidazol ün Sıyırma Voltametrisi ile Tayini Deneysel şartların belirlenmesi Pik akımına ph ın etkisi Pik akımına biriktirme potansiyelinin etkisi Pik akımına biriktirme süresinin etkisi Pik akımına karıştırma hızının etkisi Kalibrasyon Eğrisinin Hazırlanması Kalibrasyon grafikleri kullanılarak etken madde miktarının tayini Standart Katma Yöntemi Ornidazol içeren tabletlerin analize hazırlanması Standart katma eğrisinin hazırlanması..56 v

8 4.6.3 Standart katma grafikleri kullanılarak numune madde miktarının tayini Gözlenebilme sınırı ve alt tayin sınırı Ultraviyole (UV) Spektroskopisi Çalışmaları Kalibrasyon eğrisinin hazırlanması Farmasötik preparatların analizi SONUÇLAR Yöntemin Validasyonu Doğrusallık aralığı Yöntemin duyarlılığı Yöntemin doğruluğu Yöntemin kesinliği Yöntemin tutarlılığı Yöntemin farmasotik preparatlara uygulanabilirliği..67 KAYNAKLAR..69 ÖZGEÇMİŞ..73 vi

9 SİMGELER DİZİNİ A Elektrodun yüzey alanı, cm 2 ACE Asılı cıva elektrot AdSDPV Adsorptif sıyırma diferansiyel puls voltametrisi AdSSWV Adsorptif sıyırma kare dalga voltametrisi AdSV Adsorptif sıyırma voltametrisi ASV Anodik sıyırma voltametrisi BE Bulk elektroliz, sabit potansiyelli kulometri BH Biriktirme hızı BP Biriktirme potansiyeli BS Biriktirme süresi BR Britton-Robinson tamponu C Ana çözeltideki elektroaktif madde derişimi, (mol/cm 3 ), (mol/l) CE Yavaş bir kimyasal reaksiyonun ardından bir elektron aktarımının gerçekleştiği reaksiyon mekanizması CFE Cıva film elektrot CGME Damla büyüklüğü kontrol edilebilen cıva elektrot (Controlled growth mercury electrode) CV Dönüşümlü voltametri D Difüzyon katsayısı, cm 2 /s DMSO Dimetil sülfoksit DPV Diferansiyel puls voltametrisi E Uygulanan potansiyel, (V) E 0 Standart potansiyel veya formal potansiyel, (V) E p Pik potansiyeli, (V) a E p Anodik pik potansiyeli, (V) k E p Katodik pik potansiyeli, (V) f Kare dalganın frekansı, (s -1 ) F Hg HOAc HPLC Faraday sabiti, C Cıva Asetik asit Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi vii

10 i d Difüzyon akımı, (A) İnd İndirgenmiş tür i p Pik akımı, (A) a i p Anodik pik akımı, (A) k i p Katodik pik akımı, (A) i g i p / i p Geri tarama akımının ileri tarama akımına oranı KSV Katodik sıyırma voltametrisi KH Karıştırma hızı k s (k 0 ) Elektrot reaksiyonunun standart hız sabiti, (cm/s) n Aktarılan elektron sayısı, (eg/mol) Pt Platin ppb µg çözünen / kg veya litre çözelti R Regresyon katsayısı rpm Dakikadaki devir sayısı s Standart sapma S Maddenin Cottrell eğimi S s Standart referans maddenin Cottrell eğimi SW Kare dalga SWV Kare dalga voltametri T Sıcaklık, (K) t Zaman, (s) UV Ultra viyole v Tarama hızı (V/s), (mv/s) Yük Yükseltgenmiş tür α Elektrot reaksiyonunun transfer katsayısı β Elektrot reaksiyonunun transfer katsayısı Γ Elektrot yüzeyine adsorbe olan madde miktarı (mol/cm 2 ) E Puls genişliği, (V) E p Pik potansiyelleri arasındaki fark, (V) E s Kare dalganın basamak yüksekliği, (V) I Net akım, (A) I puls Pulsun başladığı anda potansiyelde bir artış olmadan ölçülen akımla, pulsun bitmesine yakın bir bölgede ölçülen akım arasındaki fark, (A) viii

11 ε 0 ε r Vakumun geçirgenliği Elektriksel geçirgenlik π Pi sayısı (3,14) ix

12 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Dönüşümlü voltametri için uyarma sinyalinin dalga şekli...5 Şekil 2.2 Yük İnd reaksiyonuna ait tersinir (Eğri 1), tersinmez (α = 0,5 ) (Eğri 2) ve tersinir fakat İnd türünün elektroinaktif bir türe dönüştüğü bir sistem (Eğri 3) için dönüşümlü voltamogramlar...6 Şekil 2.3 Diferansiyel puls voltametride puls tipi uyarma sinyalinin dalga şekli..11 Şekil 2.4 Kare dalga voltametride puls tipi uyarma sinyalinin dalga şekli...11 Şekil 2.5 Sıyırma tekniklerinde potansiyel-zaman profili ve akım potansiyel eğrileri...15 Şekil 3.1 Çalışmanın yapıldığı elektrokimyasal sistem: CH Instruments Electrochemical Workstation CHI760B ve BAS CGME hücre standı...32 Şekil 3.2 BAS CGME (Controlled Growth Mercury Electrode) hücre standı...34 Şekil 4.1 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında, asılı cıva elektrotta ph 5 de elde edilen dönüşümlü voltamogramları (v: 0,1 V/s, a: destek elektrolit, b: ornidazole ait katodik pik)..38 Şekil 4.2 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında, asılı cıva elektrotta 0,01; 0,025; 0,050; 0,100; 0,500; 1 V/s lik tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogramları (ph 5) 39 Şekil 4.3 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta, farklı tarama hızlarındaki alınan dönüşümlü voltamogamlarından elde edilen i k p /v 1/2 akım fonksiyonunun tarama hızıyla (v) değişimi grafiği...40 Şekil 4.4 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta ard arda alınan dönüşümlü voltamogramları (ph 5, v: 0,1 V/s)..41 Şekil 4.5 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogamlarından elde edilen log i k p - log v grafiği (ph5)..42 Şekil 4.6 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta, alınan 5 dönüşümlü voltamogamı (v: 0,1 V/s, ph 5)...42 Şekil 4.7 Ornidazol ün olası elektrot reaksiyon mekanizması...45 Şekil 4.8 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta alınan AdSDPV yöntemi ile pik akımlarının ph ile değişimi...47 Şekil 4.9 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta alınan AdSSWV yöntemi ile pik akımlarının ph ile değişimi Şekil , M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSDPV yöntemi ile biriktirme potansiyelinin pik akımı ile değişimi (ph 5)..48 Şekil , M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSSWV yöntemi ile biriktirme potansiyelinin pik akımı ile değişimi (ph 5)..49 x

13 Şekil 4.12 Şekil 4.13 Şekil 4.14 Şekil 4.15 Şekil 4.16 Şekil 4.17 Şekil 4.18 Şekil 4.19 Şekil 4.20 Şekil 4.21 Şekil 4.22 Şekil , M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSDPV yöntemi ile biriktirme süresinin pik akımı ile değişimi (ph 5, B.P: 0 V) , M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSSWV yöntemi ile biriktirme süresinin pik akımı ile değişimi (ph 5, B.P: 0 V) , M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSDPV yöntemi ile karıştırma hızının pik akımı ile değişimi (ph 5, B.P: 0 V, B.S: 15 s).51 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSSWV yöntemi ile karıştırma hızının pik akımı ile değişimi (ph 5, B.P: 0 V, B.S: 15 s).51 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSDPV yöntemi ile pik akımlarının derişim artışı (ph 5, B.P: 0 V, BS: 15 s, K.H 550 rpm) Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSSWV yöntemi ile pik akımlarının derişim artışı (ph 5, B.P: 0 V, BS: 15 s, K.H 550 rpm)..53 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSDPV yöntemi ile pik akımlarının derişim artışı ile oluşturulan kalibrasyon eğrisi (ph 5, B.P: 0 V, BS: 15 s, K.H 550 rpm).53 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSSWV yöntemi ile pik akımlarının derişim artışı ile oluşturulan kalibrasyon eğrisi (ph 5, B.P: 0 V, BS: 15 s, K.H 550 rpm)..54 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSDPV yöntemi ile pik akımlarının derişim artışı ile oluşturulan eğri (ph 5, D.E: 0 V, D.T: 15 s, 550 rpm). 57 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSSWV yöntemi ile pik akımlarının derişim artışı ile oluşturulan eğri (ph 5, D.E: 0 V, D.T: 15 s, 550rpm) Ornidazol ün BR tamponu ortamında UV Spektroskopi yöntemi ile Abs değerlerinin derişim artışı ile oluşturulan şema nın 3B görüntüsü (ph5) Ornidazol ün BR tamponu ortamında UV Spektroskopi yöntemi ile Abs değerlerinin derişim artışı ile oluşturulan kalibrasyon eğrisi (ph 5)...62 xi

14 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Çizelge 3.1 Çizelge 4.1 Çizelge 4.2 Çizelge 4.3 Çizelge 4.4 Çizelge 4.5 Çizelge 4.6 Çizelge 4.7 Çizelge 4.8 Çizelge 4.9 Diferansiyel puls voltametrisi kullanılarak ADCE ile hızlı doğru akım taramalı CFE nin karşılaştırılması...19 Kullanılan kimyasal maddeler, temin edildikleri firma ve saflık dereceleri , M ornidazol ün BR tamponu ortamında, asılı cıva elektrotta, dönüşümlü voltamogramlarından elde edilen pik potansiyellerinin tarama hızına göre değişimi (ph 5)..39 Ornidazol ün sabit potansiyelli kulometriyle bulunan elektron sayısı , M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogamlarından elde edilen difüzyon katsayıları (ph 5)...44 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSDPV yöntemi ile analizlerine ait bulgular (ph 5)...55 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSSWV yöntemi ile analizlerine ait bulgular (ph 5)...55 Ornidazol ün BR tamponu ortamında, asılı cıva elektrotta, adsorptif diferansiyel puls yöntemi ile analizlerine ait bulgular (ph 5)..58 Ornidazol ün BR tamponu ortamında, asılı cıva elektrotta, adsorptif kare dalga yöntemi ile analizlerine ait bulgular (ph 5) 59 Ornidazol ün AdsDPV ve AdsSWV yöntemleri elde edilen alt tayin ve gözlenebilme sınırları.. 61 Ornidazol ün BR tamponu ortamında, UV Spektroskopi yöntemi ile analizlerine ait bulgular 63 xii

15 1. GİRİŞ Son yıllarda enstrümental yöntemler yanında, elektrokimyasal ve biyolojik reaksiyonların arasındaki benzerlikler, elektrot ve metabolizma mekanizmaların benzer ilkelere sahip olmasından dolayı elektro analitik yöntemler de, ilaç etken maddelerinin hem nicel tayini hem de etki mekanizmalarının nasıl yürüdüğü hakkında bilgiler edinmek amacıyla yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Kaynaklarda ilaç etken maddelerinin, tabletlerden, preparatlardan ve biyolojik materyalden analizi ile ilgili olarak yüksek basınçlı sıvı kromotografisi (HPLC), UV spektrofotometrisi gibi yöntemler yer almaktadır. Ancak diferansiyel puls voltametrisi, adsorptif sıyırma voltametrisi gibi elektro analitik yöntemlerle tayinlere sık rastlanmadığından dolayı ilaç etken maddelerinin tayini için voltametrik bir yöntem geliştirilmesi düşünülmüştür. İlaç etken maddelerinin fiziksel ve farmakokinetik yapısındaki değişikliklerin hepsi, moleküllerin yükseltgenme/indirgenme davranışlarındaki değişikliklere bağlıdır, dolayısıyla bu değişikliklerin izlenmesinde elektrokimyasal teknikler önemli rol oynamaktadır. Günümüzün modern analitik tekniklerinden olan (yüzeyde tutunma olaylarına dayalı) adsorptif sıyırma, diferansiyel puls ve kare dalga voltametrisi/polarografisi tekniklerinin kullanılması ile geliştirilmiş olan yöntemlerin duyarlı, seçici, basit, hızlı, bir ön işleme gerek duyulmaması ve uygulamada değişikliğe açık olması ilaç dozaj formlarından (tablet, kapsül, şurup, ampul vb.) ve vücut sıvılarından (kan, idrar, anne sütü vb.) analizlerine uygulanabilirliği açısından özel bir yeri vardır. Özellikle adsorptif sıyırma yöntemleri ilaç etken maddelerinin düşük derişimlerdeki analizlerini mümkün kılmaktadır. Bu çalışmada ornidazol ilaç etken maddesinin öncelikle elektrokimyasal davranışı, dönüşümlü voltametri, sabit potansiyelli kulometri gibi yöntemler ile tersinirlik, aktarılan elektron sayısı, adsorpsiyon özellikleri, difüzyon katsayısı gibi özelliklerin incelenmesi düşünülmüştür. Bu verilerin ışığı altında nicel tayini için yöntem 1

16 geliştirilmiştir. Bu amaçla, ph, derişim, tarama hızı, biriktirme süresi, karıştırma hızı, biriktirme potansiyeli gibi deneysel parametreler değiştirilerek, en uygun deneysel koşullar belirlenmiş ve bu koşullarda nicel tayin çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Geliştirilen yöntem, istatiksel olarak değerlendirilip kesinlik, duyarlık, seçicilik gibi parametreler incelenerek yöntemin analitik amaç için uygunluğu araştırılmıştır. Ayrıca geliştirilen yöntemin ornizadol içeren farklı firmalara ait farmasotik preparatları uygulanmıştır. Elde edilen veriler, standart bir yöntemle karşılaştırmış, aralarında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmamıştır. 2

17 2. KURAMSAL TEMELLER Elektrokimya, çözücülerde homojen olarak ya da elektrot çözücü ara yüzeyinde heterojen olarak meydana gelen yük ayrılması ve yük aktarımı ile ilişkili olan olaylarla ilgilenir. Elektrokimya uzun bir geçmişe sahiptir ve 200 yıl önce Volta nın elektrik pilini (1799) keşfi ile başlar. Son yıllardaki ilerlemeler oldukça fazladır. Bugün, bilim ve teknolojinin yeni alanlarının geliştirilmesinde önemli rol oynar ve küresel enerji ve çevre sorunlarının çözümüne gerekli katkılar yapar (Izutsu 2002). Elektrokimya, elektriksel ve kimyasal etkilerin birbiri arasındaki ilişkileriyle ilgilenen bir kimya dalıdır. Elektrokimyanın büyük bir kısmı, bir elektrik akımının geçmesinin neden olduğu kimyasal değişikliklerin araştırılmasıyla ve kimyasal reaksiyonlar sonucu elektrik enerjisinin üretilmesiyle ilgilenir. Aslında, elektrokimya, çok sayıda farklı olayların, araçların ve teknolojilerin yer aldığı bir daldır (Bard and Faulkner 2001). 2.1 Voltametri ve Voltametrik Yöntemlerin Sınıflandırılması Voltametri Voltametri, potansiyel, akım, elektrik yük miktarı ile madde miktarı arasındaki ilişkiye dayanan elektroanalitik bir yöntemdir. Voltametrik yöntemlerin bir kısmında potansiyel sabit tutulur veya çeşitli şekillerde değiştirilerek madde miktarına bağlı olarak oluşan akım miktarı incelenir. Bu elektroanalitik tekniklerle maddelerin, kalitatif ve kantitatif analizleri yapılabileceği gibi elektrot reaksiyonlarının mekanizmaları da incelenebilir. Ayrıca maddelerin çözeltilerdeki kararlılıkları ve çeşitli fizikokimyasal sabitlerinin de tayinini yapmak mümkündür. Voltametride, çalışma elektrodunun potansiyeli zamanla değiştirilirken akım ölçülür. Elektroda, zamanın bir fonksiyonu olarak farklı potansiyellerin uygulanmasıyla oluşan farklı şekillerdeki potansiyel-zaman fonksiyonlarına uyarma sinyali denir. 3

18 Aşağıda, voltametride yaygın olarak kullanılan uyarma sinyallerinden ve kimyasal sistemlerin incelenmesinde uygulanan çeşitli elektrokimyasal yöntemlerden bu tez çalışmasında kullanılanlar kısaca anlatılmaktadır Dönüşümlü voltametri (CV) Bu yöntemde, potansiyel, üçgensel potansiyel döngüsü (Şekil 2.1) verecek şekilde, Şekil 2.2 de görüldüğü gibi, E 1 den E 2 ye ileri ve E 2 den E 1 e geriye doğru doğrusal olarak taranırken oluşan akım ölçülür. Hücrede oluşan akımın potansiyelin fonksiyonu olarak kaydedilmesiyle elde edilen akım-potansiyel eğrilerine dönüşümlü voltamogram denir. Bir voltamogram örneği Şekil 2.2 de verilmiştir. Bu şekilde, Yük + ne - İnd reaksiyonu için çözeltide sadece Yük ün bulunduğu çeşitli dönüşümlü voltamogram örnekleri görülmektedir. Eğri 1, Yük + ne - İnd reaksiyonu tersinir olduğunda elde edilir. İleri doğru taramada, doğrusal taramalı voltametrideki (LSV) gibi, Yük ün İnd e indirgenmesi ile katodik bir pik elde edilir. Geriye doğru taramada, ileri doğru tarama süresince meydana gelen İnd in Yük e tekrar yükseltgenmesinden kaynaklanan, anodik bir pik gözlenir. Tersinir reaksiyonlar için, katodik ve anodik pik akımlarının büyüklükleri ( i k p = i a p ) eşittir ve katodik pik potansiyeli (E k p ) anodik pik potansiyelinden (E a p ) (58/n) mv daha negatiftir. Bunlar, tersinirlik için önemli parametrelerdir. Ayrıca, formal redoks potansiyelini elde etmek için kullanılan yarı dalga potansiyeli, E 1/2 = (E k p + E a p )/2 şeklinde bulunur. Tersinirliğin azalması ile iki pik potansiyeli arasındaki fark artar. Eğri 2, önemli derecede tersinmez olan sistemler içindir. Eğri 1 ile karşılaştırıldığında, katodik pik çok daha negatif, anodik pik ise çok daha pozitif potansiyeldedir. Sistem tamamen tersinmez ise, anodik pik ölçülebilen potansiyel aralığında görünmez. Tersinmez CV eğrisinden, genellikle bir simulasyon yöntemi ile elektrot reaksiyonu için kinetik parametreler (hız sabiti ve transfer katsayısı) elde edilebilir. 4

19 Şekil 2.1 Dönüşümlü voltametri için uyarma sinyalinin dalga şekli Eğri 3, İnd in tersinir olarak Yük e tekrar yükseltgenebildiği, tekrar yükseltgenmeden önce, İnd in bir kısmının elektroaktif olmayan A türüne dönüşebildiği bir durum içindir k (Yük İnd A ). Katodik pik Eğri 1 deki gibi aynı şekilde görünür, fakat anodik pik akımı Eğri 1 dekinden daha küçük olur. Anodik pik akımındaki azalmadan, k hız sabitini elde edebiliriz. CV de, potansiyel tarama hızı geniş bir aralıkta değiştirilebilir (Izutsu 2002). Dönüşümlü voltametri, susuz çözeltilerdeki elektrokimyasal çalışmalarda en kullanışlı yöntemlerden biridir. Özellikle, kararsız bir ara ürün veya ürün içeren elektrot reaksiyonlarının incelenmesinde faydalıdır. Elde edilen voltamogramlar incelenerek reaksiyon mekanizmaları tahmin edilebilir ve kararsız türlerin termodinamik ve kinetik özellikleri belirlenebilir. Ayrıca, kimyasal ve elektrokimyasal reaksiyonların her biri farklı reaksiyon hızlarına ve tersinirliklere sahiptir. Bunların hepsi, voltamogramlara yansır. Potansiyel aralığı, tarama hızı, sıcaklık, elektrodun cinsi, çözeltinin bileşimi gibi çeşitli parametreleri değiştirerek bir elektrot reaksiyonunun dönüşümlü voltamogramı alınırsa ve voltamogramlar uygun bir şekilde analiz edilirse, elektrot reaksiyonuyla ilgili bilgi edinilebilir (Izutsu 2002). 5

20 Şekil 2.2 Yük İnd reaksiyonuna ait tersinir (Eğri 1), tersinmez (α = 0,5 ) (Eğri 2) ve tersinir fakat İnd türünün elektroinaktif bir türe dönüştüğü bir sistem (Eğri 3) için dönüşümlü voltamogramlar Dönüşümlü voltametri tekniğinin, nicel amaçla kullanımı seyrek olmakla beraber, elektrokimyasal reaksiyonlar hakkında nitel bilgi edinilmesinde en yaygın olarak kullanılan teknik olmasının nedeni, redoks olaylarının termodinamiği, heterojen elektron-transfer reaksiyonlarının kinetiği ve takip eden kimyasal reaksiyonlar ve adsorpsiyon olaylarıyla ilgili güvenilir bilgileri hızlı bir şekilde sağlamasıdır. Elektroanalitik çalışmalarda genellikle ilk olarak uygulanan deneysel basamaktır. Özellikle, elektroaktif türlerin redoks potansiyellerinin yerinin hızlı bir şekilde belirlenmesini ve ortamın redoks reaksiyonuna etkisinin değerlendirilmesini sağlar (Wang 2000). 6

21 Tersinir sistemler Tersinir bir çift için pik akımı (25 C), Randles-Sevcik eşitliğiyle verilir (Eşitlik 2.1): i ( 2,69x10 5 ) n 3 2 ACD 1 2 v 1 2 p = (2.1) Burada n, aktarılan elektron sayısı; A, elektrodun alanı (cm 2 ); C, derişim (mol/cm 3 ); D, difüzyon katsayısı (cm 2 /s) ve v, tarama hızıdır (V/s). Buna göre, akım, derişimle doğru orantılıdır ve tarama hızının kareköküyle artar. Basit bir tersinir çift için, anodik pik akımının katodik pik akımına oranı 1 dir. Bu oran, redoks reaksiyonuna eşlik eden kimyasal reaksiyonların varlığından oldukça güçlü bir şekilde etkilenir. Potansiyel eksenindeki piklerin konumu, redoks işleminin formal potansiyeline bağlıdır. Tersinir bir sistem için formal potansiyel, aşağıdaki gibi verilir (Eşitlik 2.2): E 0 a k E p + E p = (2.2) 2 Tersinir bir sistemde, pik potansiyelleri arasındaki fark aşağıdaki eşitlikle verilir (Eşitlik 2.3): E a E k 0,059 E p = p p = V (2.3) n Bu yüzden, pik potansiyelleri farkı, aktarılan elektron sayısının belirlenmesinde ve Nernstian bir davranış kriteri olarak kullanılabilir. Buna göre, hızlı bir 1e - lu reaksiyon, 59 mv luk bir E p gösterir. Katodik ve anodik piklerin her ikisi de tarama hızından bağımsızdır. Çok elektronlu bir indirgenme gerçekleşiyorsa, sistemin tersinir olması için 7

22 voltamogramda, birbirinden iyi bir şekilde ayrılmış ve E 0 değerleri birbirinden sırayla artış gösteren çok sayıda pikin olması gerekir (Wang 2000). Bir reaksiyonun tersinir olduğunun belirlenmesinde, dönüşümlü voltametri çalışmalarından yararlanılır ve aşağıdaki kriterlerin sağlanması elektrot reaksiyonunun tersinir olduğunu gösterir. Bu kriterler şunlardır: E k p -E a p = 59/n mv veya E p -E p/2 = 57/n mv tur. E p tarama hızı ile değişmez. i a p / i k p = 1 dir ve bu oran tarama hızıyla değişmez. i p /v 1/2, tarama hızıyla değişmez. Dalga şekli tarama hızıyla değişmez Tersinmez ve yarı-tersinir sistemler Elektron transferinin yavaş olduğu tersinmez sistemler için, piklerin büyüklüğü tersinir sistemlere göre daha azalır ve pikler birbirinden epeyce ayrılır (Wang 2000). Tersinmez sistemlerde, tarama hızıyla pik potansiyelinde kayma olur (Eşitlik 2.4): E p = E 0 RT αn F α k 0, 78 ln D αnα Fv + ln RT (2.4) Burada, α, transfer katsayısıdır ve n α yük-transfer basamağındaki elektron sayısıdır. Bu yüzden, E p, E 0 dan daha yüksek potansiyellerde oluşur. Pik potansiyeli ve yarı-pik potasiyeli 48/αn mv tan farklı olur. Pik akımı, aşağıdaki eşitlikten (Eşitlik 2.5) görüldüğü gibi, çözeltinin derişimiyle orantılıdır fakat α transfer katsayısına bağlı olarak pik yüksekliği daha düşüktür. α =0,5 ise, tersinir pik akımının tersinmez pik akımına oranı 1,27 dir. 8

23 i p = ( 2,99x10 5 ) n( αn ) 1 2 ACD 1 2 v 1 2 α (2.5) Standart hız sabitinin 10-1 > k 0 > 10-5 cm/s olduğu yarı-tersinir sistemler için akım, hem yük transferi hem de kütle aktarımıyla kontrol edilir. Dönüşümlü voltamogramın şekli, k 0 / παd nin bir fonksiyonudur (α = nfv/rt). k 0 / παd arttıkça, sistem tersinirliğe yaklaşır. k 0 / παd nin, yüksek tarama hızlarındaki küçük değerleri için sistem tersinmez davranış gösterir. Yarı-tersinir sistemlerde, pik potansiyelleri, tersinir sistemlerle karşılaştırıldığında, birbirinden oldukça ayrıdır. Bir reaksiyonun yarı-tersinir olduğunun belirlenmesinde de dönüşümlü voltametri çalışmalarından elde edilen verilerden yararlanılır. Bu amaçla, aşağıdaki kriterler incelenir (Nicholson and Shain 1964, Greef et al. 1990, Bard and Faulkner 2001). Yarıtersinir bir sistem için: i p /v 1/2 tarama hızına bağlı değildir. i a p / i k p = 1 dir. (α = 0,5 ise) E k p tarama hızı ile değişir. Bu değişme genellikle tarama hızının artması ile negatif değerlere kayma yönündedir. E k p -E a p farkı düşük tarama hızlarında 59/n e yaklaşır. Yüksek tarama hızlarında bu değerden daha büyüktür ve tarama hızı ile artar. Tarama hızı arttıkça pik genişlemesi olur Adsorpsiyonun dönüşümlü voltametri ile incelenmesi Dönüşümlü voltametri aynı zamanda, elektroaktif türlerin arayüzeydeki davranışının incelenmesinde de kullanılır. Reaktif ve ürünün her ikisi de, adsorpsiyon-desorpsiyon olayında yer alabilir. Bu durumda, alınan çoklu voltamogramlarda, katodik ve anodik pik akımlarının dereceli olarak artması, elektrot yüzeyinde adsorpsiyonun göstergesidir. Reaktif veya ürünün her ikisi değil de, sadece biri elektrot yüzeyine kuvvetli adsorbe olabilir. Bu durumda, reaktif elektrot yüzeyine kuvvetli adsorbsiyonu varsa difüzyon 9

24 pikinden daha negatif bir potansiyelde bir arka pik gözlenirken, ürünün elektrot yüzeyine kuvvetli adsorbsiyonu varsa difüzyon pikinden daha pozitif bir potansiyelde bir ön pik gözlenir (Wang 2000) Diferansiyel puls voltametri (DPV) Puls voltametri teknikleri, Barker ve Jenkin tarafından (1952), voltametrik çalışmalarda tayin sınırını düşürmek amacıyla önerildi. Böylece, faradayik ve faradayik olmayan akım arasındaki oran arttırılarak, tayin sınırları 10-8 M a kadar düşürüldü. Kısaca DPV olarak gösterilen diferansiyel puls voltametrisi, organik ve anorganik türlerin eser miktarlarının ölçülmesinde son derece kullanışlı bir tekniktir. Diferansiyel puls voltametrisinde, doğrusal bir potansiyel artışına göre ayarlanmış sabit büyüklükte pulslar (de/dt), çalışma elektroduna belli bir süre uygulanır (Şekil 2.3). İki kez akım ölçülür. Birincisi, puls uygulanmadan önce yani tam pulsun başladığı anda potansiyelde bir artış olmadan, ikincisi, pulsun bitmesine yakın bir bölgede ölçülür. Bu iki akım arasındaki fark, I puls olarak verilir. Sonunda, uygulanan potansiyele karşı bu akım farklarının grafiğe geçirilmesiyle diferansiyel puls voltamogramı elde edilir (Monk 2001, Wang 2000). Voltamogramlardaki pik akımlarının yüksekliği, aşağıdaki eşitlikte (Eşitlik 2.6) de görüleceği gibi ilgili analitin derişimiyle doğru orantılıdır: nfacd σ i p = π t 1+ σ (2.6) Burada, σ = exp[(nf/rt)( E/2)] dir ve E puls genişliğidir. DPV, en çok kullanılan elektroanalitik yöntemlerden biridir. Normal puls voltametrisiyle karşılaştırıldığında iki üstünlüğü vardır. Birincisi, her bir analitin analitik pikleri birbirinden kolayca ayrılabildiği için tek bir voltamogramda pek çok analitin belirlenebilmesini sağlamaktadır. İkinci üstünlüğü ise, diferansiyel akımla 10

25 çalışılması ve böylece voltametrik bir pikin elde edilmesiyle analitik duyarlılığın 5, M 'dan 1, M'a gelişmesidir. Şekil 2.3 Diferansiyel puls voltametrisinde puls tipi uyarma sinyalinin dalga şekli Kare dalga voltametri (SWV) Kare dalga voltametrisi, diferansiyel pulsdan daha sık tercih edilen elektroanalitik yöntemdir. Kısaca SWV olarak gösterilir ve çalışma elektroduna uygulanan potansiyel, büyük genişlikli bir diferansiyel teknik olmasını sağlayan simetrik kare dalgalar şeklindedir. Her bir kare dalga döngüsü boyunca, akım iki kez ölçülür. Birincisi, ileri yöndeki pulsun sonunda (t 1 ) ikincisi ise geri yöndeki pulsun sonundadır (t 2 ). Bu iki akım arasındaki fark, uygulanan potansiyelin bir fonksiyonu olarak grafiğe geçirildiğinde kare dalga voltamogramı elde edilir (Şekil 2.4). Şekil 2.4 Kare dalga voltametride puls tipi uyarma sinyalinin dalga şekli 11

26 SWV nin en büyük üstünlüğü oldukça hızlı bir teknik olmasıdır. Etkin tarama hızı, kare dalganın frekansı (f) ve basamak yüksekliği ( E s ) değiştirilerek belirlenir. Böylece, birkaç saniye içinde voltamogramlar kaydedilebilmektedir. Bu, ortalama 2 3 dakikayı bulan diferansiyel puls voltamogramının tamamlanması ile karşılaştırıldığında, kare dalga voltametrisinin analiz süresini oldukça kısalttığının bir göstergesidir (Wang 2000). SWV yönteminin ikinci büyük üstünlüğü de, kare dalga yoluyla toplam akıma kapasitif katkıların minimuma indirilmiş olmasıdır. Böylece, tarama hızı çarpıcı bir şekilde arttırılabilir, 1 V/s'lik tarama hızına kolaylıkla ulaşılabilir. SWV'de net akım ( I) hem ileri hem de geri puls akımlarından daha büyüktür. Bu nedenle, voltametrik pik genellikle oldukça kolay okunmaktadır. Bu da, yöntemin doğruluğunu arttırmakta ve diferansiyel puls voltametrisinden daha yüksek duyarlılığın elde edilmesini sağlamaktadır (Monk 2001). Böylece, 1, M'a yakın çok düşük tayin sınırlarına inilebilmektedir. Kare dalga ve diferansiyel puls voltametrisi karşılaştırılırsa, kare dalga akımlarının benzer diferansiyel puls cevaplarından, tersinir ve tersinmez sistemler için sırasıyla 4 ve 3,3 kat daha yüksek olduğu söylenebilir (Borman 1982) Sabit potansiyelli elektroliz (Bulk elektroliz, BE) Çalışma elektrodunun potansiyelinin sabit tutulup çözeltideki yükseltgenmiş Yük türünün, elektrot yüzeyinde tamamen indirgenerek İnd türüne dönüştüğü ve elektroliz süresince, Yük türünün derişiminin zamanla azalıp sıfıra yaklaştığı elektrolizdir (Izutsu 2002). Diğer yöntemlerdekinin aksine çalışılan elektrodun yüzey alanının oldukça büyük olduğu bir yöntemdir. Bir saat veya daha fazla zaman alabilir ve bu süre sonunda, elektroaktif türün derişiminin başlangıç derişiminin %1 ine ulaştığında elektrolizin tamamlandığı kabul edilir. Bulk elektroliz, yüzey alanının çözelti hacmine oranının oldukça büyük olduğu, yüksek akımlar ve uzun zaman skalasıyla karakterize edilen (Bard and Faulkner 2001) ve deney sonunda devreden geçen toplam yük 12

27 miktarını vererek elektrot reaksiyonunda aktarılan elektron sayısının hesaplanmasında kullanılan yöntemdir Sıyırma voltametrisi Çevre ve klinik örneklerdeki maddelerin tayini için duyarlı yöntemlere duyulan ihtiyaç günden güne artmaktadır. Sıyırma voltametrisi bu ihtiyaçtan doğmuş ve son yirmi yılda hızlı bir şeklide gelişmekte olan bir yöntemdir. Karışım analizlerine uygulanabilirliği, cihazların ucuzluğu ve ölçüm kolaylığı sebebiyle analizcilerin dikkatleri bu yöntem üzerinde yoğunlaşmaktadır. Voltametrik sıyırma tekniklerine, sulu ve susuz ortamlarda maddelerin eser miktarda tayinlerinde başvurulur. Atomik absorpsiyon, nötron aktivasyon, florometrik ve kromatografik yöntemlerle birlikte voltametrik sıyırma yöntemleri eser analizlerde başvurulan beş önemli yöntemler arasında sayılmaktadır. Bu yöntemlerden anorganik analizlerde en çok uygulama alanı olan iki yöntemden biri atomik absorpsiyon, diğeri ise sıyırma yöntemleridir. Atomik absorpsiyona yalnız anorganik tayinlerde başvurulduğu halde sıyırma teknikleri hem anorganik hem de organik tayinlerde kullanılabilmektedir. Ayrıca atomik absorpsiyon, destructive (bozucu, yıkıcı) bir yöntem iken sıyırma yöntemleri nondestructive (bozucu, yıkıcı olmayan) yöntemlerindendir. Aynı numunenin analizi sıyırma tekniklerinde defalarca tekrarlanabilir. Bir diğer avantaj da sıyırma tekniklerinde kullanılan cihazların daha basit ve daha ucuz olmasıdır. Elektroanalitik yöntem içerisinde en duyarlısı sıyırma yöntemidir. Sıyırma yöntemi iki farklı şekilde uygulanır. Birincisinde, analizi yapılacak madde seyreltik çözeltiden indirgenme veya yükseltgenme suretiyle alınarak elektrot yüzeyinde biriktirilir. Bu basamakta yapılan bir elektrokimyasal ön deriştirme işlemidir. Bu basamak birçok yöntemde başvurulan çözücü ekstraksiyonuna karşılık gelen bir işlem olarak görülebilir. Elektroda uygulanan sabit potansiyelde çözeltideki madde indirgenerek elektrot yüzeyinde çözünmez duruma dönüştürülür. Daha sonra elektroda pozitif (anodik) veya negatif (katodik) yönde potansiyel taraması uygulanır. Bu tarama esnasında elektrot yüzeyinde toplanan madde indirgenme veya yükseltgenme ile elektrot yüzeyinden sıyrılarak tekrar çözeltiye geri kazanılır. Yönteme sıyırma voltametrisi adı verilmesinin sebebi işte bu basamak dolayısıyladır. Bu esnada oluşan akım ölçülerek madde miktarı tayin edilir. 13

28 İkinci sıyırma tekniği, adsorptif sıyırma voltametrisi (AdSV) dir. Bu teknikte çözeltide bulunan madde sabit potansiyelde herhangi bir kimyasal değişikliğe uğratılmadan doğrudan doğruya elektrot yüzeyine fiziksel adsorpsiyonla toplanır. Toplanan bu madde yine bir potansiyel taraması ile indirgenmeye veya yükseltgenmeye uğratılarak oluşan akım ölçülür. Son yedi-sekiz yılda geliştirilen bu yöntem ile hem çok duyarlı bir analitik yöntem elde edilmiş hem de voltametride kötü haber olarak bilinen adsorpsiyon olayı bir avantaj haline dönüştürülmüştür. Her iki sıyırma tekniği de iki işlem basamağından meydana gelir. İlk işlem basamağı biriktirme basamağıdır. Her iki durumda da sabit bir potansiyelde bir ön deriştirme işlemi yapılır. Ancak bu ön deriştirme işlemi birinde kimyasal bir reaksiyon ile yapılırken, diğerinde fiziksel adsorpsiyonla yapılmaktadır. İkinci işlem olan sıyırma basamağında ise her iki teknikte de biriktirilen maddenin özelliğine göre anodik veya katodik yönde bir potansiyel taraması yapılarak madde elektrokimyasal değişikliğe uğratılır ve bunun sonucunda akım elde edilir. Potansiyel taraması anodik yönde yapılırsa yöntem anodik sıyırma voltametrisi (ASV), katodik yönde yapılırsa katodik sıyırma voltametrisidir (KSV). Sıyırma esnasında istenilen bir voltametrik yöntem kullanılabilir. Yapılan potansiyel taramasına göre yöntem de sıyırma voltametrisi, doğrusal taramalı sıyırma voltametrisi veya diferansiyel puls sıyırma voltametrisi vb. gibi adlar alır (Wang 2000). Her iki tekniğinde potansiyel-zaman profili şematik olarak Şekil 2.6 da verilmiş ve her basamakta yapılan işlemler kısaca özetlenmiştir. 14

29 Şekil 2.6 Sıyırma tekniklerinde potansiyel-zaman profili ve akım potansiyel eğrileri Sıyırma analizlerinin duyarlığı, toplama basamağında ürünün elektrot yüzeyindeki derişimine bağlıdır. Bundan dolayı damlayan cıva elektrot, sıyırma voltametrisinde kullanılmaz. Çünkü cıvayla birlikte biriktirilen madde de çözeltiye geri taşınmış olur. Bunun için sıyırma yöntemlerinde sabit bir cıva damlası veya bir katı elektrot kullanılır. Katodik ve anodik sıyırma voltametrisinde hem indirgenme hem de yükseltgenme olduğundan dolayı elektrot reaksiyonlarının tersinir olması gereklidir. Yukarıda anlatıldığı gibi sıyırma voltametrisinde iki işlem basamağı vardır. İlk basamakta elektrot yüzeyinde biriktirilen ürünün ikinci basamakta eski haline gelebilmesi, durumunda ancak sıyırma teknikleri kullanılabilir. Ürünün bozunması halinde veya elektroinaktif bir duruma geçmesi halinde bu teknikleri uygulamak mümkün olmaz Anodik sıyırma voltametrisi Biriktirme adımında elektrot potansiyeli, analizi yapılacak olan metalin indirgenme potansiyelinden daha katodik bir potansiyelde, belli bir süre (t) tutulur. Bu süre boyunca çözelti karıştırılır. Elektrot alanı ve biriktirme süresi küçük olduğu için biriktirme adımında akımın (ib) değişmediği varsayılabilir. Biriken metalin mol sayısı, (ib xtb /nf) 15

30 değerine eşdeğerdir. Biriken maddenin elektrot yüzeyine ulaşma hızı, maddenin derişimine, elektrot çözeltisinin difüzyon özelliklerine ve kullanılan elektrotun alanına bağlı olarak değişir. Doğru sonuçlar alabilmek için biriktirme koşullarının (karıştırma hızı, biriktirme süresi ve sıcaklık) analiz boyunca aynı kalması gereklidir (Copeland and Skogerboe 1974, Bond 1980). Sıyırma analizinde asılı cıva elektrodunun (ACE) kullanıldığı durumlarda biriktirme adımının ardından karıştırma durdurularak bir süre beklenir. Bu durulma süresinde madde derişimi çözelti içinde homojen şekilde dağılma fırsatını bulur ve bundan sonra okunacak olan akımın difüzyon akımı olması sağlanır (Copeland and Skogerboe 1974, Andruzzi et al. 1982). Sıyırma analizinde cıva film elektrodunun kullanıldığı durumlarda, karıştırma, elektrotun döndürülmesi ile kontrol edilmektedir. Genellikle bu elektrot ile durgunluk süresi verilmez ve karıştırma, sıyırma adımı boyunca da devam eder (Copeland and Skogerboe 1974). Sıyırma adımında, elektrot potansiyeli anodik yönde ilerlerken elektrotta birikmiş olan madde, yükseltgenme potansiyeline ulaştığında bir akım oluşturur. Sıyırma veya yükseltgenme akımı elektrot potansiyelinin fonksiyonu olarak okunmaktadır. Sıyırma akımı, maddenin elektrottaki ve çözeltideki derişimi ile doğru orantılıdır (Copeland and Skogerboe 1974, Bard and Faulkner 1980, Bond 1980). Anodik sıyırma voltametrisinde anodik yönde potansiyel taraması yapılırken katodik sıyırma voltametrisinde ise biriktirme anodik yönde, sıyırma ise katodik yönde yapılmaktadır (Bond 1980). Katodik sıyırma voltametrisi yönteminin, selenyum ve arsenik metalleri için çok duyarlı olduğu kanıtlanmıştır (Saltman 1983). 16

31 Katodik sıyırma voltametrisi (KSV) Katodik sıyırma voltametrisiyle anyonlar ve moleküller tayin edilebilmektedir. Katodik sıyırma voltametrisinde biriktirme basamağında, elektrot üzerinde toplama basamağında gerçekleşen anodik reaksiyon, maddenin iyonlarına yükseltgenmesidir. Oluşan maddenin iyonları da çözünmeyen tuzları halinde elektrot yüzeyi üzerinde çöker. Gerekli anodik toplama potansiyeli, ilgili anyonlara bağlıdır. Katodik sıyırma voltametrisi çok sayıda ilaç ve pestisit olarak kullanılan organik bileşiğin analizi için uygundur. Bunlar genelde S 2- anyonu içerirler. Toplama basamağında bu anyon ile çözünmeyen bir civa tuzu oluşur. Bütün katodik sıyırma işlemlerinde, toplama basamağında elektrot yüzeyi üzerinde çözünmeyen bir tabaka oluşur. Eğer çok madde toplanırsa sıyırma piki bozulur. Bu nedenle KSV, çok seyreltik çözeltilerin analizi için uygun bir yöntemdir Adsorptif sıyırma voltametrisi (AdSV) AdSV, maddelerin analizlerinde son bir kaç yıldır önemli derecede ilgi çekmiş yöntemlerden biridir. Bu ilginin nedeni yöntemin mükemmel duyarlılığı, doğruluğu, hızı ve düşük maliyetidir. AdSV; ASV ve KSV ile tayin edilmesi çok zor veya mümkün olmayan eser miktardaki maddelerin tayininde başvurulan bir yöntemdir. Ayrıca bu yöntemle hem inorganik hem de organik maddelerin tayini yapılabilmektedir. Voltammetrik yöntemlerde adsorpsiyon genel olarak iyon ya da moleküllerin elektrot yüzeyine tutunmasını ifade eder. Bu tutunma olayı voltammetrik ölçüm sonuçlarını etkiler ve genelde ASV de bu olaya istenmeyen durum gözüyle bakılır ve olmaması istenir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, türlerin elektrot yüzeyine kontrollü adsorpsiyonunun bir avantaj olarak kullanılabileceğini göstermiştir. 17

32 Adsorptif sıyırma voltametrisi, önderiştirme, karıştırılan bir çözeltiden elektrot yüzeyine fiziksel adsorpsiyonla sağlanır. Bu yöntem ile elektroaktif ve yüzey aktif özellikte birçok önemli madde hassas olarak tayin edilebilmektedir. Ayrıca çalışma elektrodunun yüzeyi modifiye edilerek, kimi bileşikler için adsorpsiyon daha seçimli hale getirilebilir. Çalışma koşulları optimize edilerek uygun çözücü, ph, iyon şiddeti, karıştırma hızı ve sıcaklıkta çalışılır. Kalibrasyon grafiğinin doğrusal aralığı önderiştirilen bileşiğin büyüklüğüne, hidrofobik özelliğine ve elektrot yüzeyine yönelimine göre değişir. Genellikle de seyreltik çözeltilerde ve kısa sürelerde biriktirme uygulanır. Bu da analizler için tercih edilir bir durumdur Elektrotlar Sıyırma voltametrisinde asılı cıva elektrotu (ACE) güncel bir çalışma elektrotudur, ACE temel olarak cıva damlasının boyutlarını ayarlayan mikrometre ve kılcal bir borudan oluşmaktadır, ACE basitlik, ekonomi ve tekrarlanabilirlik sunmaktadır, ACE nin iki dezavantajı vardır. Bunlardan ilki, elektrot yüzey alan/hacim oranının düşük oluşudur. Küçük yüzey alanı ön elektrolizin etkinliğini azaltırken, büyük hacim, metallerin cıva damlasının içinden difüzyonları için uzun süre gerektirir. Bu son olay piklerin genişlemesine neden olarak birbirine yakın piklerin ayrılmalarını zayıflatır. Biriktirme süresi çok uzun tutulduğunda metaller kılcalın içine doğru yayılmaya başlarlar. İkinci dezavantaj ise ACE kullanırken cıva damlasının düşmemesi için karıştırma hızı düşük tutulmalıdır. Bu durum, biriktirme adımının etkinliğini azaltmakta ve daha uzun biriktirme süresi gerektirmektedir. Pratik olarak ACE ile ortaya çıkan sorunlar doğrusal taramalı voltametri kullanıldığında daha belirgindir. Yeni şekiller (puls, a.c, gibi) ile ACE birleştirildiğinde duyarlık önemli sorun olmaktan çıkar (Bond 1980). Yüzey alanı/hacim oranı cıva film elektrotunda (CFE) çok büyüktür. Bu elektrot, yüksek duyarlık sunmasının yanı sıra cıva filminden yüzeye doğru difüzyon çok hızlı olduğundan iyi bir ayrılma sağlamaktadır. Bu durum, cıva film elektrotuna, asılı cıva 18

33 elektrotuna göre özel bir üstünlük sunmaktadır. CFE nun dezavantajı ise bazı tiplerinin tekrarlanabilirliğinin az oluşu ve cıva filminde metaller daha yüksek derişimler de bulundukları için intermetalik etkileşmelerin daha etkin olmasıdır(braggio and Barnaby 1996). Cıva filmine destek olarak en çok karbon elektrotlar kullanılmaktadır. Genellikle cıva nitrat çözeltisi analiz çözeltisine eklenerek metal ve cıvanın birlikte birikmesi sağlanır (Bond 1980). Her iki elektrotun üstünlükleri Çizelge 2.1 de gösterilmektedir. Bu konuda deneyim sahibi olan araştırıcılar CFE nin en doğru ve duyarlı sonuçları vermekle birlikte, ACE diferansiyel puls yöntemi ile birleştirildiğinde en uygun ve güvenilir elektrot olduğu sonucuna varmışlardır. Bazı durumlarda ACE ile iyi sonuçlar alınabilirken, diğer durumlarda CFE uygun olmaktadır (Bond 1980). Çizelge 2.1. Diferansiyel puls voltametrisi kullanılarak ACE ile hızlı doğru akım taramalı CFE nin karşılaştırılması ACE nin Üstünlükleri Çözelti kimyasının denetimi daha basittir. Genelde, pik yüksekliğinin, destek elektrolite olan bağımlılığı daha azdır. Asılı duran cıva damlasının hacminin daha büyük oluşu daha az intermetalik bileşik oluşmasına izin vererek etkileşmelerin azalması sonucunu yaratır. Çeşitli potansiyel taramaları gerekli değildir. CFE nin Üstünlükleri Daha duyarlıdır. Ancak genellikle boş örneğin değeri duyarlığın tamamının kullanılmasını engeller. Nispeten düşük derişimlerde daha tekrarlanabilir sonuçlar alınmaktadır. Elektrotun uyumlu dönüşü ile karıştırmanın tekrarlanabilirliği magnetik karıştırıcıdan daha fazladır. Daha iyi ayrılma sağlar. Pikler daha dardır. 19

34 Çizelge 2.1. Diferansiyel puls voltametrisi kullanılarak ACE ile hızlı doğru akım taramalı CFE nin karşılaştırılması (devamı) Voltametrik hücrenin havadan korunması dönen elektrot kullanılmasına oranla daha kolaydır. Nispeten yüksek derişimlerde, daha tekrarlanabilir sonuçlar alınmaktadır Daha basit elektronik alet gereklidir. Elektrot titreşimden etkilenmez. Elektrotun yeniden doldurulması gerekmez. Eşit boyutta cıva damlası üretmek için el becerisi ve yetenek gereği ortadan kalkar. Elektrot materyali veya cıva ile katışma sorunu ortadan kalkar Elektrot seçimi Sıyırma tekniklerinde yaygın olarak kullanılan elektrotlar; 1. Asılı cıva elektrodu, 2. Cıva film elektrodu, 3. Camsı karbon elektrodu, 4. Diğer katı elektrotlardır Elektrot olarak cıva kullanılırsa, metal analizlerinde metalik halde toplanan ürün, cıva ile amalgam oluşturarak cıvada çözünür. Bundan dolayı cıva damla elektrotlarında katı elektrotlara göre, elektrot yüzeyi üzerindeki ürünü geri kazanmak daha kolaydır. Buna ilaveten cıva elektrotlar daha geniş bir negatif potansiyel bölgesinde kullanılabilirler. Genelde cıva film elektrodu ile asılı cıva damla elektrottan daha duyarlı ölçümler yapılır. Konsantrasyonu 1 ppb den yüksek olan çözeltilerin analizinde cıva damla elektrodu, I ppb den daha düşük çözeltilerin analizinde ise cıva film elektrodu tercih edilir. Asılı duran cıva elektrodun katı elektrotlara göre diğer bir üstünlüğü ise yeni bir elektrot yüzeyi oluşturmanın hızlı ve basit oluşudur. Yüzeyi arındırılmış yeni bir elektrot yüzeyi oldukça önemlidir. Yeni bir damla kullanılmadığında bu türlü adsorpsiyonlardan dolayı 20

35 cıva üzerinde toplamanın etkinliği azalır. Ayrıca analiz sırasında daha önceki işlemde adsorbe olmuş türler yeniden indirgenme veya yükseltgenme gösterirler. Bu nedenlerden dolayı yeni bir damla oluşturarak bu indirgenme ürünleri uzaklaştırılır. Grafit elektrot mekanik bakımdan asılı cıva elektrottan daha kararlıdır. Cıva elektrot cıva iyonlarının sıyırma voltametrisiyle belirlenmesinde kullanılmamasına rağmen grafit kullanılır. Grafit, altın ve platinden daha geniş bir katodik çalışma bölgesine sahip iken Hg den daha geniş anodik çalışma bölgesine sahiptir. Grafit, cıva film elektrodun yapımında cıva filmini tutmak için mükemmel bir substrattır Çözeltinin-karıştırılması ve biriktirme Süresi Biriktirme basamağı sırasında çözeltiyi karıştırmak, analiz edilecek maddenin elektrot yüzeyine ulaşma hızını arttırır. Ancak karıştırmanın kontrol edilen bir hızda olması gerekir. Çözeltide ve elektrot yüzeyindeki reaksiyonlardan dolayı elektrot yüzeyinde biriktirilen maddenin sıyırma işleminden sonra tekrar çözeltiye geçmesi gerekir. Bu ise karıştırma hızı ve biriktirme süresi ile doğrudan orantılıdır. Karıştırma çok yavaş olursa daha az madde birikir ve ürünün geri kazanılma verimi artar. Ancak bu durum duyarlılığın azalmasına ve daha uzun bir zaman harcanmasına yol açar. Sıyırma voltametrisinde bazen çözeltiyi hiç karıştırmadan, yalnız difüzyonla madde göçü sağlanarak ta biriktirme yapılabilir. Biriktirme basamağında karıştırma hızının ve süresinin ayarlanması hem maddenin geri kazanılması hem de duyarlıkla ilgili parametreler olduğundan bu iki parametrenin optimum değerlerinin seçilmesi gerekir. Çok hızlı bir karıştırma geri kazanma verimini düşürebilir. Ayrıca karıştırma işleminin homojenliğini bozar. ACE kullanılıyorsa damlanın kopmasına sebep olabilir. Çözeltinin saçılmasına yol açabilir. Bütün bu sebeplerden dolayı optimum bir karıştırma hızı seçilmelidir. Çözeltiyi karıştırma yerine hızı kolay bir şekilde ayarlanan dönen elektrotlar da kullanılabilmektedir. 21

36 Biriktirme süresinin belirlenmesi de sıyırma voltametresinde en önemli parametrelerden birini oluşturur. Analizin duyarlılığı biriktirme zamanı ile doğru orantılıdır. Teorik olarak, elektrot yüzeyinde ne kadar çok madde biriktirilirse duyarlık ta o kadar yüksektir. Çözeltideki maddenin tamamının elektrot yüzeyine toplanması durumunda maksimum duyarlık elde edilir. Ancak bu, uzun biriktirme süresine yol açabileceği gibi daha başka sakıncaların da ortaya çıkmasına da neden olur. Uzun biriktirme süresi, yukarıda da açıklandığı gibi elektrot yüzeyine çok madde birikmesine ve bu maddenin geri kazanılmasına engel olur. Bir diğer önemli sakınca da uzun bekleme sonucunda elektrot yüzeyinde arzu edilmeyen kimyasal veya bozunma reaksiyonları meydana gelebilir. Ürün kararsız olabilir ve elektroinaktif bir şekle bozunabilir. Bunlara ilaveten beklenmeyen başka olaylarda çıkabilir. Eğer duyarlılık yeterli ise çözeltide bulunan maddenin % 2 sini elektrot yüzeyinde toplayacak bir biriktirme süresinin ve karıştırma hızının seçilmesi yeterlidir. Pik yüksekliğinin maksimum olduğu 10 veya 6 s de elektrot yüzeyi kompleksin ve aynı zamanda ligandm adsorpsiyonu ile doygunluğa ulaşır. Daha uzun zamanlarda ise pik yüksekliğinde hafif de olsa düşme gözlenmiştir. Bu azalmanın nedeni gerek yükseltgenmiş ligand ve gerekse kompleksin polimerleşmesi sonucu olduğu şeklinde yorumlanmıştır. Bu polimerleşme sonucunda ise elektrot yüzeyinin etkinliği azalır Biriktirme potansiyelinin seçimi Biriktirme esnasında elektroda uygulanan potansiyel, pik yüksekliğini etkiler. Bunun için normal sıyırma voltametrisi ile analizi yapılacak maddenin yarı dalga potansiyelinden bir kaç yüz milivolt daha büyük bir potansiyelin uygulanması gerekir. Çünkü normal sıyırma voltametrisinde maddeler elektrot yüzeyine bir reaksiyon ile biriktirilir. Adsorptif sıyırma voltametrisinde ise uygulanacak potansiyelin herhangi bir kimyasal reaksiyona yol açmayacak değerde tutulması gerekir. Çünkü AdSV de maddelerin elektrot yüzeyinde hiç bir değişikliğe uğramadan, çözeltide bulundukları gibi fiziksel adsorpsiyonla ; birikmeleri istenir. AdSV de bu potansiyelin, artık akım 22

37 bölgesinde seçilmesi gerektiği açıktır. Her iki teknikte de biriktirme potansiyeli seçilirken de polarografideki yarı dalga potansiyeli kriter alınır ve normal sıyırmada bu değerin 200 mv plato bölgesi tarafı, AdSV de ise 200 mv artık akım tarafında bir potansiyel seçilir. Sıyırma tekniklerinde karışımlarda bulunan maddelerin aynı anda analizini, yapmak mümkündür. Biriktirme potansiyeli özellikle karışım analizlerinde önemlidir. Birkaç tane metal iyonu bulunan bir çözeltiden biriktirme yapılırken sıyırma esnasında tayin edilecek maddenin pikini kapatacak maddenin biriktirilmesinin engellenmesi gerekir. Girişim yapacak bileşenlerin bilinip, biriktirme potansiyelinin buna göre seçilmesi lazımdır. Çok sayıda maddenin bulunduğu bir çözeltide ne kadar negatif bir biriktirme potansiyeli uygulanırsa girişim yapma ihtimali de o kadar artırılmış olur Sıyırma basamağı Bu basamakta elektrot yüzeyine bir reaksiyonla veya fiziksel adsorpsiyonla biriktirilmiş madde elektroda uygulanan bir potansiyel ile tekrar çözeltiye geri kazanılır. Potansiyel uygulaması çok çeşitli şekillerde yapılabilir. Sıyırma tekniği, bu basamakta uygulanan potansiyel-zaman profiline göre adlandırılır. Ayrıca potansiyelin tarama yönüne bağlı olarak da tekniğin adı anodik veya katodik sıyırma voltametrisi adını alır. 23

38 2.1.8 Kaynak araştırması Nitro grubu içeren bileşikler biyolojik indirgenmeye sahip olduklarından biyolojik olarak son derece önemli maddelerdir. Bu etkilerinden dolayı antibakteriyel ve antiprotozoan olarak kullanılmaktadır. Bu maddeler aynı zamanda hem radyoduyarlaştırıcı hem de sitotoksi etki olarak kanser tedavisinde de kullanım alanına sahiptirler. Bu önemli ilaç sınıfından olan ornidazol ün elektrokimyası ile ilgili çalışmalar bulunmaktadır. Ancak sıyırma yöntemleriyle tayini konusunda herhangi bir bulguya rastlanmamıştır. Özkan vd. (1997) yılında ornidazol ün elektrokimyasal indirgenmesini, aktive edilmiş camsı elektrotta, doğrusal taramalı voltametri yöntemiyle incelenmişlerdir. Ornidazol ün 0,2 M H 2 SO 4 ve asetat tamponu ortamında 4e - lu tersinmez belirgin bir indirgenme piki olduğunu belirlemişlerdir. Tersinmez indirgenme pik akımı ve pik potansiyeli üzerine ph, derişim, tarama hızı ve çözücü etkisi araştırılmıştır. ph arttıkça ornidazol ün pik akımının azaldığı ve tarama hızı arttıkça pik potansiyelinin negatife kaydığı belirtilmiştir. Ornidazol ün indirgenme pikinin yüksek tarama hızlarında (100 mv/s) ikiye yarıldığını, düşük tarama hızlarında (25 mv/s) ise tek pike dönüşerek keskinleştiği söylenmiştir. Aktive edilmiş karbon elektrotta, camsı karbon elektroda göre daha yüksek akımda indirgenme piki gözlemişlerdir. Ornidazol, aktive edilmiş karbon elektrotta 0,2 M H 2 SO 4 ortamında, (4x x10-6 ) derişim aralığında tayin edilebilir iken asetat tamponunda (6x x10-4 ) aralığında tayin edilmiştir. Asetat tamponunda ve 0,2 M H 2 SO 4 ortamında kalibrasyon grafiklerinin eğimlerinin birbirine yakın olduğunu belirtmişlerdir. Geliştirdikleri yöntemi farmasotik preperatlara başarıyla uygulamışlardır. Özkan vd. (1998) yılında yaptıkları çalışmada ise, metronidazol ün elektrokimyasal indirgenmesini, aktive edilmiş camsı karbon elektrotta, doğrusal taramalı voltametri ve dönüşümlü voltametri yöntemleriyle incelemişlerdir. Bileşiğin, 4e - lu tek bir indirgenme piki verdiğini belirtmişlerdir. Pik akımı ve potansiyeli üzerine ph, derişim, tarama hızı, çözücü etkisini araştırmışlardır. İlacın, optimum şartlarda Britton-Robinson tamponunda 24

39 (ph 10) ( ) M derişim aralığında tayin edilebileceğini göstermişlerdir. Alt tayin sınırını 3, mol/dm -3 olarak belirtmişlerdir. Geliştirdikleri yöntemi, HPLC yöntemi ile karşılaştırmışlardır. Bartlett et al. (2005) yılında metronidazol ün elektrokimyasını karbon fiber mikro disk elektrotta, Britton-Robinson tamponunda ph 9 da kare dalga adsorptif sıyırma voltametrisi yöntemiyle araştırmışlardır. Biriktirme potansiyeli ve biriktirme süresini optimize ederek önderiştirme işlemini gerçekleştirmişlerdir. Optimum biriktirme potansiyelinin -0,4 V, biriktirme süresini ise 60 s olarak belirlemişlerdir. Maddeyi bu şartlarda kare dalga voltametrisi yöntemi yardımıyla katodik yönde sıyırarak tayin etmişlerdir. Alt tayin sınırını 5x10-7 mol/dm -3 olarak belirlemişlerdir. Geliştirdikleri yöntemi idrar numunelerine uygulamışlardır. Cavalcanti et al. (2004) yılında metronidazol ve türevlerinin elektrokimyasal indirgenmesini hem aprotik hem de protik ortamda, camsı karbon elektrotta incelemişlerdir. 2-metil-5-nitroimidazol de azot substitüenti olarak I, Br, Cl, OAc,OMs ve NH + 4 bulunan bileşikleri sentezlemişler ve indirgenme mekanizmalarını 0,1 M tetra bütil amonyum fosfat (TBAP)/DMSO ortamında fosfat tamponunda araştırmışlardır. I, Br ve NH + 4 hariç diğer metronidazol türevlerinin dönüşümlü voltamogramlarının benzer olduğunu ve ilk indirgenme pikinin yarı tersinir nitro radikal anyonunda, ikinci pikin ise kararsız hidroksilamine ait olduğunu belirtmişlerdir. İndirgenmenin ECE mekanizmasına göre yürüdüğünü söylemişlerdir. Ancak amonyum tuzu içeren bileşikte, kendi içinde protonlanmanın meydana geldiğini ve indirgenmenin NH + 4 >Br>I>Cl>OMs>OH>OAc sırasında kolaylaştığını göstermişlerdir. Sulu ortamda ise, incelenen bütün bileşiklerin elektrokimyasal davranışı, metronidazol ile benzer ve 4e - /4H + şeklinde tersinmez tek dalga şeklinde olduğunu belirtmişlerdir. Sulu ortamda indirgenmenin NH + 4 >Br OMs>I>OH>OAc sırasında kolaylaştığını gözlemişlerdir. Shaofang et al. (2004) yılında metronidazol ün elektrokimyasal davranışını ve tayinini nano malzeme ile kaplı camsı karbon elektrotta Britton-Robinson tamponunda ph 9,0 da incelemişlerdir. Bu elektrotta metronidazol ün -0,71 V da tek bir indirgenme piki 25

40 vermektedir. İndirgenme pik akımının, kaplanmamış camsı karbon elektroda göre fark edilebilir bir şekilde arttığını belirtmişlerdir. Bütün deneysel parametreler (film kalınlığı, biriktirme potansiyeli, girişim etkisi v.b.) optimize edilmiş ve 2 dakika biriktirme süresinde -1,5 V biriktirme potansiyelinde tayin sınırının 6x10-9 mol l -1 olduğu belirtilmiştir. Geliştirilen yöntemi, tabletlere başarıyla uygulamışlar ve elde edilen sonuçları spektrofotometrik yöntem ile karşılaştırmışlardır. Son olarak metronidazolün indirgenme mekanizmasının 4e - /4H + lu bir elektrot reaksiyonu sonucu hidroksilamin oluşması şeklinde olduğunu belirtmişlerdir. R-NO 2 + 4e - + 4H + R-NHOH + H 2 O Salimi et al. (2007) yılında yaptıkları çalışmada, metronizdazol ve ranitidin tayinini, tek duvarlı karbon nanotüp ile kaplı camsı karbon elektrotta, diferansiyel puls ve doğrusal taramalı voltametri ve dönüşümlü voltametri yöntemleri yardımıyla gerçekleştirmiştir. Karbon nanotüp ile modifiye edilmiş elektrotta elde edilen sinyalin camsı karbon elektrot ile elde edilenden daha yüksek olduğunu gözlenmiştir. Bunun sebebini ise modifiye edilmiş elektrotta bulunan poröz iletken bir tabakaya metronidazol ün kolaylıkla geçebildiği ve böylece daha yüksek bir duyarlılık sağlanması olduğunu söylemişlerdir. Katalitik indirgenme akımı ve potansiyeli üzerine ph nın etkisi incelenmiş ve ph 6 8 aralığında akımda azalma, ph 9 10 arasında ise voltametrik sinyal da tekrar bir artma gözlemişlerdir. Ancak pik potansiyelinde herhangi bir değişiklik olmamıştır. Diferansiyel puls voltametrisi, duyarlılığının ve pik ayrımının yüksek olmasından dolayı analitik tayin için kullanılmıştır. Metronidazol ve ranitidin, aynı anda diferansiyel puls voltametrisi ile birbirinden ayrılarak tayin edilmiştir. Geliştirilen yöntem, serum örneklerine başarıyla uygulanmıştır. Ayrıca Metronidazol için tek başına amperometrik sinyal gözlenmiştir. Potansiyel -0,2 V da sabit tutularak kronamperometrik akımların metronidazol derişimiyle değişimi incelenmiş ve akımların metronidazolün 0,1 200 µm aralığında tayin edilebileceğini tayin sınırının 6,3x10-8 mol l -1, ranitidin için ise 0,3 270 µm derişim aralığında doğrusal ve tayin sınırının ise 7,73x10-8 mol l -1 olarak verilmiştir. 26

41 Brett et al. (1997) yılında yaptıkları çalışmada metronidazolün elektrokimyasal indirgenmesini, dönüşümlü voltametri ve diferansiyel puls voltametrisi ile incelemişlerdir. Metronidazolün indirgenmesi, modifiye edilmiş elektrotta -0,472 V da iken camsı karbon elektrotta ise -0,571 V da gözlenmiştir. Buna göre indirgenmenin kolaylaştığı ve akımın iki katına çıktığı belirtilmiştir. Bu indirgenme pikinin 4e - /4H + elektrot reaksiyonu ile hidroksilamine ait olduğu ve hidroksilaminin, pozitif potansiyelde +0,948 V da amine yükseltgenebileceğini göstermişlerdir. Metronidazolün indirgenmesi üzerine ph nın etkisi incelenmiştir. Asidik ve nötral ortamlarda Ep-pH bağımlı iken bazik ortamda ph den bağımsız olması mekanizmayı desteklemiştir. Modifiye edilmiş elektrotta alt tayin sınırı 1,67 µm iken camsı karbon elektrotta 3,44 µm olarak tespit edilmiştir. Guzman et al. (2003) yılında antibakteriyal nitrobileşiklerinden nitrofurontonin (NFA) ve nitrofurazon nun (NFZ) elektrokimyasal davranışını, 0,05 M Fosfat tampon ortamında (ph 7,8), aktive edilmiş karbon fiber mikro elektrot ile araştırmışlardır. 1, M NFZ, NFA çözeltileri sırasıyla -518 mv ve -444 mv de keskin katodik pikler vermiştir. Maddelerin karbon fiber mikro elektrotta (CFME) elde edilen indirgenme pik potansiyellerinin, karbon pasta elektrot ile enzim modifiye edilmiş elektrotta elde edilen değerlerden daha pozitif potansiyellerde olduğu belirtilmiştir. Pik potansiyelleri ve pik akımları üzerine, tarama hızının ( mv/s) etkisi incelenmiş ve pik potansiyeli, tarama hızı arttıkça negatif değerlere kaymıştır. Bu sonuca göre elektrot reaksiyonlarının, tersinmez olduğu sonucuna varılmıştır. İp v -1/2 ile değişiminde ise düşük tarama hızlarında doğrusal iken yüksek tarama hızlarında doğrusallıktan sapma gözlenmiştir. Bu değişimin sebebi ise adsorpsiyondan kaynaklanmıştır. Maddelerin, CFME elektrotta, kare dalga adsorptif sıyırma voltametrisi ile tayini için optimum şartlar belirlenmiştir. Biriktirme süresinin 60 s ve biriktirme potansiyelinin 100 mv olduğu şartlarda NFA için (4, , )M derişim aralığında tayin edilmiştir. Alt tayin sınırı olarak 1,2x10-7 M belirlenmiş ve bu değerin, NFA nın tayini için yeteri kadar küçük olduğu söylenmiştir. Ayrıca NFA nın bir metaboliti olan, 1-aminohidrantoin in -0,9 ile +0,1 V potansiyel aralığında herhangi bir katodik cevabına rastlanmamıştır. Bu sonuca göre de bu iki maddenin, bir arada bulunduğu bir ortamda NFA nın elektrokimyasal olarak tayin edilebileceği 27

42 belirtilmiştir. Bu maddelerin katodik indirgenme mekanizmaları, yapılarında bulunan nitro gurubunun 4e - lu bir indirgenme ile hidroksilamin türevine dönüşmesi şeklinde olduğu belirtilmiştir. Bollo et al. (2004) yılında 4-sübstitüe üç farklı megazol türevinin elektrokimyasal olarak davranışını, hem protik hem de aprotik ortamda dönüşümlü voltametri, diferansiyal puls polarografisi yöntemleriyle incelemişlerdir. Sübstitüent olarak -Br içeren megazol (GC141) ile CF 3 içeren (GC146) ve sübstitüent bulunduran megazol (GC172) maddeleri için etanol + BR tamponu: 30 / 70, 0,3 M KCl ortamında ph: 2,6 ve 10 da belirgin sinyaller gözlenmiştir. Daha önceki yaptıkları çalışmalardan ilk sinyalin nitro grubuna ait olduğu söylenmiştir. Nitro nun indirgenme piki üzerine ph nın etkisi incelenmiş ve ph 10 a kadar pik potansiyelinin negatife kaydığı, ph 10 dan sonra ise sabit olduğu söylenmiştir. Her bir nitro bileşiğinin aynı derişimde elde edilen sınır akım değerleri birbirine yakın ve benzer bulunmuştur. Buna göre üç nitroimidazol bileşiğinin elektro indirgenmesinde aynı sayıda elektron içerdiği sonucuna varılmıştır. Bütün bileşiklerde indirgenmenin, ArNO + 4e + 4H ArNHOH + H O şeklinde olabileceği belirtilmiştir. Aprotik ortamda ise bütün bileşiklerde nitro radikal anyonun oluşmasında dolayı 1 e - lu bir indirgenmenin olduğu belirtilmiştir. Oluşan nitroradikal anyonun bozunma reaksiyonu dönüşümlü voltametri sonuçlarından elde edilen a ip nin logv ile değişimi incelenerek mekanizma önerilmiştir. c ip 28

43 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Ornidazol Ornidazol antimikrobiyal etkisi olan 5-nitroimidazol türevi bir ilaçtır. Protozoal enfeksiyonların tedavisinde, ayrıca anaerobik bakteriyel enfeksiyonların tedavisi ve profilaksisinde kullanılır. Ornidazol ün ortalama eliminasyon yarı ömrü 12 saattir ve bu değer bazı nitroimidazol türevlerinin eliminasyon yarı ömründen daha uzundur. Bu özellik, dozaj sıklığının azaltılması ve birçok klinik enfeksiyonun tedavisinin sürekliliği açısından önemli bir avantajdır. Ornidazol, DNA zincirinde hasar oluşturarak veya DNA sentezini inhibe ederek etki gösterir. Vücutta, serebrospinal sıvıda dahil olmak üzere tüm sıvı ve dokularda geniş olarak dağılır. Ornidazol karaciğerde metabolize olur. Atılımı, çoğunlukla konjugantları ve metabolitleri halinde idrarla, daha az olarak ise feçes ve safrayla olur. Ornidazol, 1-(3-klor-2-hidroksipropil)-2-metil-5-nitroimidazol açık formülü aşağıda gösterilmiştir. Ornidazol ün molekül formülü C 7 H 10 ClN 3 O 3 ve molekül kütlesi dir. Erime noktası, o C dir. 29

44 Ornidazol sarı beyaz renkte, kokusuz toz şeklindedir. Kloroformda kolay çözünür. Suda az çözünür. 3.2 Kullanılan Kimyasal Maddeler Kullanılan kimyasal maddeler, temin edildikleri firma ve saflık dereceleri belirtilerek, Çizelge 3.1 de alfabetik sırayla verilmiştir. Deneylerimizde kullanılan ornidazol hammaddesi Abdi İbrahim İlaç firmasından temin edilmiştir. Çizelge 3.1 Kullanılan kimyasal maddeler, temin edildikleri firma ve saflık dereceleri Kullanılan Kimyasal Maddeler Temin Edildiği Firma Saflık Argon gazı Oksan Koll.ŞTİ. 99,99% Asetik asit Merck 99,50% Azot gazı Oksan Koll.ŞTİ. 99,99% Borik asit Merck 99,50% Cıva Analar BDH Chemicals Yüksek saflıkta Etanol Riedel de Haën 99,80% Fosforik asit Pancreac 85% Hidroklorik asit Pancreac 37% Metanol Merck > % 99,5 Sodyum hidroksit Merck Yüksek saflıkta 3.3 Kullanılan Diğer Cihaz ve Malzemeler Ortamdaki oksijeni uzaklaştırmak amacıyla yüksek saflıktaki argon veya azot gazı kullanıldı. Sulu ortam çalışmalarında, ortamın ph sını ölçmek için Orion kombine cam ph elektrodu (912600) ve onun bağlı bulunduğu Thermo Orion Model 720A ph-iyon metre kullanıldı. ph-iyonmetre, potasyum hidrojen ftalattan ve sodyum bikarbonattan 30

45 hazırlanan ve ph ları sırasıyla 4,13 ve 8,20 olan tampon çözeltilerle 25 C ta kalibre edildi. Çözeltileri karıştırmak için Chiltern MS21S Model magnetik karıştırıcı kullanıldı. Sulu çözeltiler, GFL 2104 marka saf su cihazından elde edilen bidestile su ile hazırlandı ve tartımlar GEC AVERY marka, 0,1 mg duyarlılıkla tartım yapan elektronik terazi ile yapıldı. Karıştırma ve çözme işlemleri Ultrasonic LC30H marka Ultrasonik banyoda yapıldı. Spektrofotometrik çalışmalarda PG Instruments Ltd firmasının T80+ UV/VIS Spectofotometer Model UV spektrofotometrisi kullanıldı. 3.4 Elektrokimyasal Ölçme Sistemi Ornidazol ün elektrokimyasal davranışlarının incelendiği bu çalışmada, dönüşümlü voltametri (CV), diferansiyel puls voltametrisi (DPV), kare dalga voltametrisi (SWV), sabit potansiyelli kulometri (bulk elektroliz, BE) gibi tekniklerden yararlanmak amacı ile CH Instruments Electrochemical Workstation CHI760B markalı elektrokimyasal sistem kullanıldı. CH Instruments Electrochemical Workstation 760B ana ünitesine BAS CGME (Controlled Growth Mercury Electrode) hücre standı (Şekil 3.1) bağlanarak tüm deneyler bu hücrelerde gerçekleştirildi. Uygulanan teknikleri otomatik olarak gerçekleştirmek ve bilgisayar kontrollü olan bu elektrokimyasal ölçme sisteminden elde edilen verileri değerlendirmek için ana üniteye bağlı bilgisayar sistemindeki CHi yazılımından yararlanıldı. 31

46 Şekil 3.1 Çalışmanın yapıldığı elektrokimyasal sistem: CH Instruments Electrochemical Workstation CHI760B ve BAS CGME hücre standı Elektrokimyasal sistemde, deneye başlamadan önce hazırlanan çözeltilerden gaz geçirilmesi ve çözeltilerin karıştırılması otomatik olarak yapılabilmektedir. Uygun görülen deney parametreleri sisteme girilip onaylandıktan sonra deney tamamlandığında deney verileri, grafik olarak elde edilebilmekte ve grafikler, daha önce elde grafiklerle üst üste çakıştırılarak karşılaştırılabilmektedir. Ayrıca, kullanılan yazılımlar, gerektiğinde deney verilerinin kopyalanarak başka bilgisayarlara aktarılıp Microsoft Excel, PowerPoint, Paint gibi programlardan yararlanma olanağı sağlamaktadır. 3.5 Kullanılan Elektrotlar Deneylerde, çalışma elektrodu olarak CGME hücre standında yer alan cıva kılcalındaki (BAS MF 2092, 100 µm) asılı cıva elektrotu, karşıt elektrot olarak 0,5 mm çapında Pt tel (BAS MW 1032) yararlanıldı. Sulu ortamda gerçekleştirilen elektrokimyasal çalışmalarda, Ag/AgCl referans elektrodu (BAS MF 2052 RE-5B) kullanıldı. Sabit 32

47 potansiyelli kulometrik çalışmalarda BAS MF-1056 bulk elektroliz hücresine ait kafes görünümlü gözenekli karbon elektrot (BAS MF-2077) ile geniş yüzey alanı sağlayan cıva havuzu kullanıldı. Helezon şeklinde sarılmış 23 cm uzunluğunda, 0,5 mm çapında Pt telden (BAS MW-1033) yararlanıldı. Çalışmada kullanılan sulu ortam Ag/AgCl referans elektrodu, kullanılmadığı zaman 3,0 M NaCl çözeltisinde saklandı. 3.6 Kullanılan Çözeltiler Destek elektrolit stok çözeltilerinin hazırlanması Sulu ortam çalışmalarında, ph 1,81 11,98 arasında kullanılabilen Britton-Robinson (BR) tamponu destek elektrolit ortamı olarak kullanıldı. Bu tampon hazırlanırken 2,29 ml asetik asit, 2,69 ml % 85 lik fosforik asit ve 2,472 g borik asit karıştırılıp su ile hacmi litreye tamamlandı. Hazırlanan BR tamponuna uygun hacimlerde 1 M NaOH ilave edilerek istenilen ph a sahip çözeltiler elde edildi İncelenen ornidazol çözeltilerinin hazırlanması Ornidazol çözeltileri BR tamponu ortamında 10,0 ml 1, M olarak hazırlandı. Bu amaçla, maddelerden gerekli tartımlar alınarak çözünmeleri sağlandı. Dönüşümlü voltametri, diferansiyel puls voltametrisi, kare dalga voltametrisi ile deneyleri maddelerin, çalışılan ortama bağlı olarak Bölüm de belirtilen destek elektrolitlerde hazırlanmış stok çözeltilerinden alınan 10,0 ml lik çözeltilerinde yapıldı. 33

48 3.6.3 Sabit potansiyelli kulometri (BE) çalışmalarında kullanılan çözeltilerin hazırlanması Bulk elektroliz deneylerinde kullanmak üzere ornidazol maddesinden 0,219 g (10-3 M) alınarak Britton-Robinson tamponunda çözüldü ve bulk elektroliz yapıldı. 3.7 Dönüşümlü Voltametri Deneylerinin Yapılışı Ornidazol maddesinin dönüşümlü voltametri deneyleri için Şekil 3.2 de gösterilen BAS CGME (Controlled Growth Mercury Electrode) hücre standına, deneyde kullanılacak çalışma elektrodu, referans elektrot ve karşıt elektrot yerleştirilerek üçlü elektrot sistemi oluşturuldu. Çalışma elektrotu asılı cıva elektrotu, referans elektrot Ag/AgCl elektrot, karşıt elektrot platin tel kullanılmıştır. Çözeltiden 5 dakika argon veya azot gazı geçirilerek ortamdan oksijenin uzaklaşması sağlandıktan sonra farklı potansiyel aralıklarında dönüşümlü voltamogramları alındı. Akımın pratik olarak çok düşük olduğu ve değişmediği potansiyel aralığı, potansiyel penceresi olarak belirlendi. Şekil 3.2 BAS CGME (Controlled Growth Mercury Electrode) hücre standı 34

49 Daha sonra çalışma elektrodu, referans elektrot ve karşıt elektrot, incelenen ornidazol, Bölüm de anlatılan çözeltilerine daldırılarak sistemden 5 dakika argon veya azot gazı geçirildi. Ardından, belirlenen potansiyel aralıklarında dönüşümlü voltamogramları alındı ve maddelerin indirgenme ve yükseltgenme piklerinin incelenmesi için en uygun potansiyel aralığı seçildi. Maddelerin voltamogramlarına tarama hızının etkisini incelemek amacıyla, deney çözeltilerinin, farklı tarama hızlarında ve her tarama hızı çalışmasından önce çözeltiden belirli bir süre argon veya azot gazı geçirilerek voltamogramları alındı. Ayrıca, aynı çözeltiler kullanılarak çoklu voltamogramları da elde edildi. Her tarama öncesinde cıva damlası yenilenmiştir. 3.8 Diferansiyel Puls Voltametri Deneylerinin Yapılışı Her madde için gerçekleştirilen diferansiyel puls voltametri çalışmaları, Bölüm de belirtilen çözeltilerde gerçekleştirilmiştir. DPV kullanılarak ornidazol çözeltisinin adsorptif diferansiyel puls voltametri ile analizinde ve puls voltametrisi ile analizinde puls genliği 5,10,25,50 ve 100 mv değerler denenmiş ve puls genliğinin artmasıyla pik potansiyelinin pozitif değerlere kaydığı ve pik akımının arttığı gözlenmiştir. Ancak çok küçük ve çok büyük puls genlikleri ile tekrarlanabilir sonuçlar alınamaması üzerine çalışmalarda 50 mv puls genliği değerinde voltamogramlar alınmıştır. Elde edilen voltamogramlardaki pik akımı ve pik potansiyelleri kaydedilmiştir. Pik akımının derişimle ilişkisini belirlemek amacıyla, Bölüm de belirtildiği şekilde hazırlanan farklı derişimlerdeki ornidazol çözeltileri için elde edilen pik akımları derişime karşı grafiğe geçirilerek kalibrasyon eğrileri çizilmiştir. 3.9 Kare Dalga Voltametri Deneylerinin Yapılışı Maddelerin kare dalga voltametri çalışmaları, Bölüm de belirtilen çözeltilerinde gerçekleştirildi. Dönüşümlü voltametri çalışmalarında kullanılan aynı elektrokimyasal hücrede, daha önceden belirlenen potansiyel aralığında, SWV tekniğinin en önemli 35

50 parametresi olan frekansı 15 Hz değerinde, kare dalga genliğini 25 mv değerinde ve basamaklı adım yüksekliğini 4 mv değerinde sabit tutarak voltamogramlar alındı. Elde edilen voltamogramlardaki pik akımı ve pik potansiyelleri kaydedildi. Pik akımının derişimle ilişkisini belirlemek amacıyla, Bölüm de belirtildiği şekilde hazırlanan farklı derişimlerdeki ornidazol çözeltileri için elde edilen pik akımları derişime karşı grafiğe geçirilerek kalibrasyon eğrileri çizildi Bulk Elektroliz Deneylerinin Yapılışı Ornidazol ün dönüşümlü voltametri çalışmalarından elde edilen indirgenme potansiyelleri dikkate alınarak bulk elektroliz deneyleri gerçekleştirildi. Bu amaçla, maddenin indirgenmesinin tamamlandığı potansiyelden mümkün olduğu kadar daha negatif bir potansiyel, çalışma potansiyeli olarak seçildi ve her madde için ilgili ortama ait Bölüm te belirtilen çözelti hazırlanarak, Bölüm 3.5 de belirtilen düzenekler kullanıldı. Önce, ornidazole ait çözeltinin elektroliz öncesi dönüşümlü voltamogramı alındı. Elde edilen voltamograma göre belirlenen potansiyel değeri parametrelere girildi ve deneye başlamadan önce sistemden 10 dakika argon gazı geçirildi. Akım oranı 1/1000 oluncaya kadar bulk elektroliz yapıldı. Elektroliz süresince çözelti manyetik karıştırıcı ile sürekli karıştırıldı. Maddenin renginin değiştiği ve sabit kaldığı anlar kaydedildi. Gerektiğinde bu anlara karşılık gelen yük miktarından yararlanarak Q = nfn formülüne göre n hesaplandı. 36

51 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bu çalışmada, ilaç etken maddenin (ornidazol) elektrokimyasal davranışı ve olası reaksiyon mekanizması Britton-Robinson tamponunda, dönüşümlü voltametri, bulk elektroliz teknikleriyle incelendi. Ayrıca, ornidazol için, adsorptif sıyırma diferansiyel puls voltametri (AdSDPV) ve adsorptif sıyırma kare dalga voltametri (AdSSWV) teknikleri yardımıyla yöntem geliştirildi. Yöntemin geçerliliği için; ornidazol içeren ticari tabletlerden ornidazol ün geri kazanım çalışmaları yapıldı. Geliştirilen yöntem ayrıca UV spektroskopi ile yapılan çalışmalar ile kıyaslandı. Bu çalışmalardan elde edilen bulgular ve yorumlar aşağıda ayrıntılı bir şekilde verilmiştir. 4.1 Dönüşümlü Voltametri Çalışmaları Ornidazol ün elektrokimyasal davranışlarını incelemeden önce, Britton-Robinson ortamı için potansiyel penceresi belirlendi. Bu amaçla, BR tamponu ortamında 1x10-4 M olarak hazırlanan ve ph ı 5 olan çözeltinin dönüşümlü voltamogramı alındı ve Şekil 4.1 de verildi. Şekil 4.1 den de görüleceği gibi 0 ile -1,2 V aralığında çözücü sistemine ait herhangi bir indirgenme-yükseltgenme pikine rastlanmadı. Bu nedenle, çalışmaya uygun potansiyel penceresinin 0 - (-1,2) V olarak seçilmesine karar verildi. Britton- Robinson (BR) tamponu ile hazırlanan ornidazol çözeltilerinin, 0,1 V/s tarama hızında, 0-(-1,2) V potansiyel aralığında, asılı cıva elektrot kullanılarak alınan dönüşümlü voltamogramı Şekil 4.1 de verilmektedir. 37

52 Şekil 4.1 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında, asılı cıva elektrotta ph 5 de elde edilen dönüşümlü voltamogramları (v: 0,1 V/s, a: destek elektrolit, b: ornidazole ait katodik pik) Şekil 4.1 de elektrokimyasal davranışı incelenen ornidazole ait, asidik bölgede elde edilen voltamogramlarda, bir katodik pik gözlenirken anodik pike rastlanmadı. Asidik ortamda (ph 5) katodik pik potansiyeli için -0,354 V dur. Voltamogramlarda bir anodik pikin gözlenmemesi, ornidazol ün indirgenmesinin tersinmez olabileceğinin bir göstergesidir. Ancak, anodik pike rastlanmaması mutlaka elektron aktarım basamağının tersinmez olduğunu göstermez. Çünkü elektron aktarım basamağını takip eden hızlı bir kimyasal reaksiyon gerçekleşirse, anodik pik gözlenemeyebilir. Ayrıca, farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltametri deneylerinden elde edilen voltamogramlardan yararlanılarak da bu düşüncemiz doğrulandı (Şekil 4.2). 1, M ornidazol maddesinin, Britton-Robinson ortamında, asılı cıva elektrotta, 0,01-10 V/s arasındaki farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogramlarında, tarama hızı arttıkça pik akımlarının arttığı ve pik potansiyellerinin negatife kaydığı gözlendi (Şekil 4.2, Çizelge 4.1). 38

53 Şekil 4.2 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında, asılı cıva elektrotta 0,01; 0,025; 0,050; 0,100; 0,500; 1 V/s lik tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogramları (ph 5) E k p lerin yüksek tarama hızlarında negatife kayması kriteri de, sistemin tersinmezliğinin bir göstergesidir (Nicholson and Shain 1964, Greef et al. 1990, Bard and Faulkner 2001). Ayrıca (i k p /v 1/2 ) akım fonksiyonunun tarama hızına bağlı olması da sistemin tersinmez olabileceğini düşündürdü (Şekil 4.3). Çizelge 4.1 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında, asılı cıva elektrotta, dönüşümlü voltamogramlarından elde edilen pik potansiyellerinin tarama hızına göre değişimi (ph 5) Ornidazol Tarama hızı, V/s E p k, V 0,050-0,294 0,100-0,308 0,150-0,321 0,200-0,335 0,250-0,355 0,500-0,374 0,700-0,383 1,000-0,394 5,000-0,451 10,000-0,481 39

54 7,0 6,5 6,0 k /v 1/2 5,5 ip 5,0 4,5 4, v, V/s Şekil 4.3 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta, farklı tarama hızlarındaki alınan dönüşümlü voltamogamlarından elde edilen i p k /v 1/2 akım fonksiyonunun tarama hızıyla (v) değişimi grafiği Tekrarlanabilirliğinin incelenmesi Ornidazol ün dönüşümlü voltamogramlarından elde edilen piklerin, tekrarlanabilir olup olmadığını kontrol etmek amacıyla, ph BR tamponu ortamında, yaklaşık 5 de sabit tutularak hazırlanan 1, M ornidazol çözeltilerinde, 0,1 V/s tarama hızında, her taramadan önce 5 dakika argon gazı geçirilerek dönüşümlü voltamogramları alındı (Şekil 4.4). Aynı çözeltide ard arda alınan bu voltamogramların çakıştırılmasıyla piklerin tekrarlanabilir olduğu görüldü. 40

55 Şekil 4.4 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta ard arda alınan dönüşümlü voltamogramları (ph 5, v: 0,1 V/s) Ornidazol ün adsorpsiyon özelliği Organik maddelerin önemli bir kısmı, elektrot yüzeyine adsorbe olur ve bu moleküllerin elektrot yüzeyine adsorbe olması elektrot reaksiyonlarını önemli ölçüde etkilemektedir. Çeşitli voltametrik teknikler için geliştirilmiş olan difüzyon eşitlikleri ise, adsorpsiyon olayı söz konusu olduğunda geçerli olmaz. Bazı durumlarda ise maddenin elektrot yüzeyine adsorbe olması bir avantaj haline dönüştürülerek hassas olarak tayin edilebilmesi mümkündür. Bu nedenle, ornidazol ün elektrot yüzeyine adsorplanıp adsorplanmadığının belirlenmesi gerekir. Bu amaçla kullanılan en önemli elektrokimyasal yöntemlerden biri dönüşümlü voltametridir. Ornidazol ün elektrot yüzeyine adsorbe olup olmadığı farklı tarama hızlarında dönüşümlü voltamogramları alınarak pik akımlarının tarama hızıyla değişiminden yararlanıldı. Bu amaçla log i p log v grafikleri şekil 4.5 te çizildi. Bilindiği gibi, difüzyon dikkate alınarak türetilen ve dönüşümlü voltamogramdaki pik akımını veren Randless-Sevcik eşitliğinden, log i k p ve log v arasında, eğimi 0,5 olan bir doğru elde edilir. Maddenin elektrot yüzeyinde adsorpsiyonu söz konusu ise, bu bağıntıdan ve dolayısıyla 0,5 den sapmalar meydana gelir ve genellikle bu durumda grafiklerin eğimi 0,5 den büyük olur 41

56 (Bard and Faulkner 2001). Ayrıca çoklu CV deneylerinde ilk döngüde akım A iken ikinci ve sonraki döngülerde akım azalmakta ve sabit kalmaktadır. Bu durum reaktifin elektron yüzeyine adsorbe olması neticesinde pik akımında bir azalmaya sebep olduğu düşünülmüştür (Şekil 4.6),(Bard 2001). -7,4-7,5 y = 0,8731x - 6,5514 R 2 = 0,9718 log i p k -7,6-7,7-7,8-1,5-1,4-1,3-1,2-1,1-1 -0,9 log v Şekil 4.5 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogamlarından elde edilen log i p k - log v grafiği (ph 5) Şekil 4.6 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta, alınan 5 dönüşümlü voltamogamı (v: 0,1 V/s, ph 5) 42

57 4.2 Elektrot Reaksiyonunda Aktarılan Elektron Sayısı (n), Difüzyon Katsayısı (D) Aktarılan elektron sayısının (n) sabit potansiyelli kulometriyle (BE) bulunması İncelenen ornidazol ün elektrot reaksiyonunda aktarılan elektron sayıları Bölüm 3.10 da anlatıldığı gibi bulk elektroliz yöntemi ile belirlendi. Bulk elektroliz ile aktarılan elektron sayısını bulmak için gerekli potansiyelleri belirlendi. Bu amaçla, Şekil 4.1 de verilen voltamogramdan yararlanıldı. Maddenin, bulk elektroliz için hazırlanan çözeltisinin elektroliz öncesi dönüşümlü voltamogramları alındı. Bulk elektrolizin yapılacağı uygun potansiyel değeri, pikin tamamlandığı ve yeni bir pikin gözlenmediği bölgeden seçildi. Ornidazol için üç bulk elektroliz yapılarak, aktarılan elektron sayısı standart sapmasıyla birlikte Çizelge 4.2 de verildi. Çizelge 4.2 Ornidazol ün sabit potansiyelli kulometriyle bulunan elektron sayısı Madde Bulk elektrolizle hesaplanan elektron sayıları, n Ornidazol 4,2 ± 0,08 Sabit potansiyelli kulometri deneyleri sonucunda n: elektron sayısı 4 olarak bulunmuştur Garrido yöntemi ile difüzyon katsayısının (D) bulunması Ornidazol ün elektrot yüzeyine adsorbe olması sebebiyle difüzyon eşitliklerinden yararlanılarak maddenin difüzyon katsayısını hesaplamak mümkün olmadığından, Garrido tarafından adsorpsiyon göz önüne alınarak türetilen aşağıdaki eşitlikten yararlanılarak difüzyon katsayısı hesaplanmıştır (Garrido 1986). 43

58 i = 1.06x10 n ACvD t p 6 2 1/2 1/2 p Bu eşitlikte; n= Aktarılan elektron sayısı A= Asılı duran cıva elektrodu alanı (cm 2 ) C= Maddenin çözeltideki derişimi (mol/cm 3 ) v= Tarama hızı (V/s) D= Difüzyon katsayısı (cm 2 /s) t p = Damlanın başlangıcından pik potansiyeline ulşana dek geçen adsorpsiyon zamanı (s) dir. Düşük tarama hızlarında maddenin elektrot yüzeyine difüzlenmesi için yeterli zaman olduğundan mv/s tarama hızlarında difüzyon katsayıları hesaplanmıştır. Düşük tarama hızlarında elde edilen değerlerin ortalaması alındığında ornidazol ün difüzyon katsayısı 2,19 cm 2 /s olarak hesaplanmıştır (Çizelge 4.3). Çizelge 4.3 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogamlarından elde edilen difüzyon katsayıları (ph 5) V (mv/s) D (cm 2 /s) 10 1, , , , , , , , , ,

59 4.3 Önerilen Reaksiyon Mekanizması Nitro, bilinen en güçlü elektron çekici gruplardan biridir. Yapıya sübstitüent olarak (-NO 2 ) girmesi, indüktif ve mezomerik etki yoluyla indirgenmeyi kolaylaştırmaktadır. Nitro grubu içeren ornidazolün de kolaylıkla indirgeneceği açıktır. Bu zamana kadar elde edilen dönüşümlü voltametri ve bulk elektroliz sonuçlarına dayanarak asılı cıva elektrotta sulu ortamda olası bir reaksiyon mekanizması önerildi. Nitro grubu içeren ornidazol ün, 4 e - lu tersinmez tek bir indirgenme gösterdiği belirlendi. ph nın artmasıyla pik potansiyelinin negatife kaydığı görüldü. Bu da elektrot reaksiyonunda hidrojen iyonunun (protunun) yer aldığını göstermektedir (Malik 1982, Kameswara-Rao et al. 1988, Ismail 1991). Bu sonuçlara ve literatürdeki verilere göre nitro grubunun 4 e - alarak hidroksilamine indirgendiği söylenebilir. Oluşan hidroksilamin yükseltgenebilir olmasına rağmen, cıva elektrodunun pozitif potansiyel penceresinin dar olması sebebiyle yükseltgenme pikine rastlanmamıştır. Bu nedenle, indirgenme reaksiyonu tersinmez olarak gerçekleşmemektedir. Bu durum, literatürlerde ornidazol için elde edilen sonuçlara uyuşmaktadır (Özkan 1997, Özkan 1998, Guzman 2003). Bu sonuçlara göre aşağıdaki elektrot reaksiyon olası mekanizması önerildi. N CH 3 N CH 3 N Cl + 4e - + 4H + N Cl + H 2 O O N + O - OH HO N H OH Şekil 4.7 Ornidazol ün olası elektrot reaksiyon mekanizması 45

60 4.4 Ornidazol ün Sıyırma Voltametrisi ile Tayini Deneysel şartların belirlenmesi Ornidazol ün özellikle tıp alanında önemli bir ilaç etken madde olması ve vücuda alındıktan sonra etki mekanizmalarının elektrokimyasal olarak gerçekleştiğinin bilinmesi, elektrot yüzeyine adsorbe olmasından dolayı maddelerin sulu ortamda adsorptif sıyırma voltametrisi yötemleriyle tayin edilip edilemeyeceği ile ilgili çalışmalara yöneltti. Bu amaçla ornidazol ü belli bir biriktirme potansiyelinde, biriktirme süresinde ve karıştırma hızında adsorbe olması sağlandı. Bu yolla önelektroliz başlatılmış oldu. Sıyırma basamağında katodik yönde adsorptif kare dalga ve adsorptif diferansiyel puls voltogramları tayini için yöntem geliştirme hedeflendi. Bunun için deneysel optimum şartlar belirlendi Pik akımına ph ın etkisi Organik moleküllerin elektrot tepkimelerinin çoğunda proton görev alır. Bu nedenle akım-potansiyel ilişkileri ph a bağımlı olur. Voltametrik çalışmalarda bu bağımlılığın oluşturacağı hatalardan kurtulmak için çözeltilerin tamponlanması gerekir. Seçilen tampon çalışma penceresini daraltmayacak nitelikte olmalıdır. Analitlerin akımpotansiyel ilişkilerinin ph a bağlılığı göz önüne alındığında, destek elektrolitin ph ı ayarlanmalıdır. 1, M ornidazol ün pik akımına, ph ın etkisini incelemek amacıyla, AdsDPV ve AdsSWV voltamogramlarından yararlanıldı. BR tamponu ve 1 M NaOH kullanılarak farklı ph lar da hazırlanan 10,0 ml lik çözeltilerde çalışıldı. Pik akımlarının ph ile değişimi grafiğe geçirildi (Şekil 4.8 ve 4.9). Şekil 4.8 ve 4.9 da görüldüğü gibi ph 4 6 arasında pik akımı değerleri birbirine yakındır. ph 5 de ise en yüksek pik akımı değeri elde edilmiştir. Bu verilere göre en yüksek akım değerinin elde edildiği ph optimum ph olarak belirlenmiştir. 46

61 8 7 ip, A (10-8 ) ph Şekil 4.8 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta alınan AdSDPV yöntemi ile pik akımlarının ph ile değişimi i p, A(10-8 ) ph Şekil 4.9 1, M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta alınan AdSSWV yöntemi ile pik akımlarının ph ile değişimi 47

62 Pik akımına biriktirme potansiyelinin etkisi Şekil 4.10 daki AdSDPV yöntemi ile biriktirme potansiyelinin pik akımı ile değişim grafiğine bakıldığında 0 mv da pik akımının maksimum değerde olduğu görülmektedir. 0 mv dan 100 mv a kadar akım belli bir ölçüde azalmış ve 100 mv ve 200 mv değerleri arasında sabit kaldığı görülmüştür. 200 mv dan başlayarak akım değeri yavaş yavaş azalmaya başlamış ve 400 mv da neredeyse hiç gözlenmemiştir. Bu nedenle en uygun biriktirme potansiyeli 0 mv olarak belirlenmiştir. 7,4 7,2 ip, A (10-7 ) 7 6,8 6,6 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Biriktirme Potansiyeli, (V) Şekil , M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSDPV yöntemi ile biriktirme potansiyelinin pik akımı ile değişimi (ph 5) Ornidazol ün AdSSWV yöntemi ile de en uygun biriktirme potansiyeli belirlenmiştir. AdSSWV yöntemi ile biriktirme potansiyelinin pik akımı ile değişim grafiğine bakıldığında 0 mv da pik akımının maksimum değerde olduğu görülmektedir. 0 mv dan sonra akım değerinde bir düşüş başlamış ve 400 mv da neredeyse hiç gözlenememiştir. Şekil 4.10 ve 4.11 göz önüne alındığında her iki yöntem için en uygun potansiyel değeri 0 mv olarak belirlenmiştir. 48

63 10,2 10 9,8 ip, A (10-7 ) 9,6 9,4 9, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Biriktirme Potansiyeli, (V) Şekil , M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSSWV yöntemi ile biriktirme potansiyelinin pik akımı ile değişimi (ph 5) Pik akımına biriktirme süresinin etkisi Biriktirme süresinin pik akımı üzerine etkisi her iki yöntemle incelendiğinde, Şekil 4.12 ve 4.13 den de görüldüğü gibi 15 s ye kadar akım değeri artmaktadır. 15 s den sonra ise akım değeri sürekli düşüş göstermektedir. Buna dayanarak en uygun biriktirme süresi olarak 15 s seçilmiştir. 8,5 8 ip, A (10-7 ) 7,5 7 6, Biriktirme Süresi (s) Şekil , M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSDPV yöntemi ile biriktirme süresinin pik akımı ile değişimi (ph 5, B.P: 0 V) 49

64 1,5 1,4 ip, A (10-6 ) 1,3 1,2 1, Biriktirme Süresi (s) Şekil , M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSSWV yöntemi ile biriktirme süresinin pik akımı ile değişimi (ph 5, B.P: 0 V) Pik akımına karıştırma hızının etkisi Ornidazol ün pik akımı üzerine karıştırma hızının etkisi ( rpm) AdSDPV ve AdSSWV yöntemleriyle incelendi. Sonuçlar Şekil 4.14 ve 4.15 de verildi. Şekil 4.14 ve 4.15 den de görüldüğü üzere karıştırma hızı değiştikçe pik akımı 250 rpm ve 350 rpm arasında akım değeri fazla bir artış göstermemektedir. 350 rpm den itibaren 400 rpm e kadar ani bir artış gösteren akım değeri 400 rpm ile 450 rpm arasında fazla bir artış göstermemektedir. 450 rpm den başlayarak 550 rpm e kadar tekrar ani bir artış göstererek pik akımı 550 rpm de maksimum değerine ulaşmaktadır. Maksimum değerine ulaşan pik akımı 550 rpm den sonra ani bir düşüş göstermektedir. Bu nedenle en uygun karıştırma hızı 550 rpm olarak alınmıştır. 50

65 1,36 1,34 ip, A (10-6 ) 1,32 1,3 1, Karıştırma Hızı (rpm) Şekil , M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSDPV yöntemi ile karıştırma hızının pik akımı ile değişimi (ph 5, B.P: 0 V, B.S: 15 s) 10,3 10,2 ip, A (10-7 ) 10,1 10 9, Karıştırma Hızı (rpm) Şekil , M ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSSWV yöntemi ile karıştırma hızının pik akımı ile değişimi (ph 5, B.P: 0 V, B.S: 15 s) 51

66 4.5 Kalibrasyon Eğrisinin Hazırlanması Çözeltiler, ornidazol stok çözeltisinden (1, M) uygun miktarlarda alınıp 5 ile 50 µl arasındaki derişimler de olacak şekilde BR tamponu ile seyreltilerek hazırlanmıştır. Doğrusallık aralığını saptamak için elektrokimyasal hücreye hazırladığımız 5 ml BR tamponu üzerine artan derişimler de standart çözeltilerden eklenmiş ve voltamogramlar kaydedilmiştir (Şekil 4.16 ve 4.17). Derişime karşı pik akımı değerleri grafiğe geçilerek kalibrasyon eğrileri çizilmiştir (Şekil 4.18 ve 4.19). Oluşan eğrilerin istatistik değerlendirilmesi yapılmıştır. Şekil 4.16 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSDPV yöntemi ile pik akımlarının derişim artışı (ph 5, B.P: 0 V, BS: 15 s, K.H 550 rpm) 52

67 Şekil 4.17 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSSWV yöntemi ile pik akımlarının derişim artışı (ph 5, B.P: 0 V, BS: 15 s, K.H 550 rpm) y = x R 2 = ip, A (10-8 ) C, M (10-6 ) Şekil 4.18 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSDPV yöntemi ile pik akımlarının derişim artışı ile oluşturulan kalibrasyon eğrisi (ph 5, B.P: 0 V, BS: 15 s, K.H 550 rpm) 53

68 30 25 y = 2,6453x - 0,7474 R 2 = 0,9997 ip, A (10-8 ) C, M (10-6 ) Şekil 4.19 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSSWV yöntemi ile pik akımlarının derişim artışı ile oluşturulan kalibrasyon eğrisi (ph 5, B.P: 0 V, BS: 15 s, K.H 550 rpm) Kalibrasyon grafikleri kullanılarak etken madde miktarının tayini Geliştirilen yöntemin doğruluk ve kesinliğini kontrol etmek amacı ile geri kazanım çalışmaları yapıldı. Ornidazol ün geri kazanım sonuçları ve istatistik değerlendirmeleri Çizelge 4.4 ve 4.5 de verilmiştir. 54

69 Çizelge 4.4 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSDPV yöntemi ile analizlerine ait bulgular (ph 5) Deney No Eklenen Ornidazol miktarı (µg) Bulunnan Ornidazol miktarı (µg) % Geri Kazanım 1 8,785 8, ,96 2 8,785 8, ,81 3 8,785 8,762 99,74 4 8,785 8, ,56 5 8,785 8,773 99,86 6 8,785 8,678 98,79 X = Ortalama X = 8,81 X = %100,29 s = Standart Sapma s = 0,095 s = 1,08 V= Varyasyon Katsayısı V= % 1,09 V= %1,08 Çizelge 4.5 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSSWV yöntemi ile analizlerine ait bulgular (ph 5) Deney No Eklenen Ornidazol miktarı (µg) Bulunnan Ornidazol miktarı (µg) % Geri Kazanım 1 8,785 8,84 100,59 2 8,785 8,76 99,74 3 8,785 8,75 99,55 4 8,785 8,85 100,69 5 8,785 8,78 99,89 6 8,785 8,82 100,35 X = Ortalama X = 8,8 X = % 100,135 s = Standart Sapma s = 0,042 s = 0,47 V= Varyasyon Katsayısı V=% 0,48 V= % 0,47 55

70 4.6 Standart Katma Yöntemi Ornidazol içeren tabletlerin analize hazırlanması Ornidazol içeren A firmasının tabletlerinden 10 adet alındı, hepsi birden tartıldı ve havanda iyice toz haline getirildi. Yaklaşık 500 mg ornidazol e eşdeğer toz numune tartılarak 100 ml lik bir erlene aktarıldı. Üzerine 100,0 ml BR tamponu eklenerek 15 dakika ultrasonik karıştırıcıda karıştırıldı. Ornidazol ün tam olarak çözünmemesinden dolayı süzme işlemi yapıldı. Süzme işleminde sonra gerekli seyreltme işlemleri yapıldı. Bu işlem sırasıyla B ve C firmalarının tabletlerine de uygulandı Standart katma eğrisinin hazırlanması Çözeltiler, ornidazol stok çözeltisinden (1, M) uygun miktarlarda alınıp 5 ile 50 µl arasındaki derişimler de olacak şekilde BR tamponu ile seyreltilerek hazırlanmıştır. Doğrusallık aralığını saptamak için elektrokimyasal hücreye 5 ml BR tamponu üzerine önce 5 µg bölüm de hazırlanan A firmasının tabletinin çözeltisinden ekleme yapılmıştır. Bu işlemden sonra artan derişimler de standart çözeltilerden eklenerek voltamogramlar kaydedilmiştir. Derişime karşı pik akımı değerleri grafiğe geçilerek kalibrasyon eğrileri çizilmiştir. Oluşan eğrilerin istatistik değerlendirilmesi yapılmıştır. 56

71 y = 2,576x + 15,054 R 2 = 0,9964 ip, A (10-8 ) C, M (10-6 ) Şekil 4.20 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSDPV yöntemi ile pik akımlarının derişim artışı ile oluşturulan eğri (ph 5, B.P: 0 V, BS: 15 s, K.H 550 rpm) y = 3,500x + 19,984 R 2 = 0, ip, A (10-8 ) C, M (10-6 ) Şekil 4.21 Ornidazol ün BR tamponu ortamında asılı cıva elektrotta AdSSWV yöntemi ile pik akımlarının derişim artışı ile oluşturulan eğri (ph 5, B.P: 0 V, BS: 15 s, K.H 550 rpm) 57

72 4.6.3 Standart katma grafikleri kullanılarak numune madde miktarının tayini Çizelge 4.6 Ornidazol ün BR tamponu ortamında, asılı cıva elektrotta, adsorptif diferansiyel puls yöntemi ile analizlerine ait bulgular (ph 5) A Firması B Firması C Firması Deney No Ornidazol miktarı (µg) Ornidazol miktarı (µg) Ornidazol miktarı (µg) 1 8,67 8,75 8,76 2 8,97 8,97 8,64 3 8,71 8,96 8,92 4 8,79 8,96 8,92 5 8,81 8,86 8,89 6 8,89 8,97 8,86 7 8,73 8,97 8,8 8 8,76 8,97 8,7 Alınan Miktar: 8,79 µg Alınan Miktar: 8,79 µg Alınan Miktar: 8,79 µg X = 8,79 X = 8,93 X = 8,81 *Güven Aralığı =8,79 ± 0,16 *Güven Aralığı =8,93 ± 0,13 *Güven Aralığı =8,81 ± 0,17 s = 0,099 s = 0,080 s = 0,105 V= % 1,12 V= % 0,90 V= % 1,19 * % 95 güven seviyesinde 58

73 Çizelge 4.7 Ornidazol ün BR tamponu ortamında, asılı cıva elektrotta, adsorptif kare dalga yöntemi ile analizlerine ait bulgular (ph 5) Deney No A Firması B Firması C Firması Ornidazol miktarı (µg) Ornidazol miktarı (µg) Ornidazol miktarı (µg) 1 8,85 8,77 9,09 2 8,73 8,92 8,95 3 8,94 8,92 9,06 4 8,81 8,83 9,08 5 8,94 8,87 9,07 6 8,84 8,91 8,84 7 8,98 8,66 8,95 8 8,85 8,85 8,83 Alınan Miktar: 8,79 µg Alınan Miktar: 8,79 µg Alınan Miktar: 8,79 µg X = 8,87 X = 8,84 X = 8,98 *Güven Aralığı =8,87 ± 0,13 *Güven Aralığı =8,84 ± 0,14 *Güven Aralığı =8,98 ± 0,17 s = 0,082 s = 0,090 s = 0,107 V= % 0,92 V= % 1,01 V= % 1,19 * % 95 güven seviyesinde Etken madde kalibrasyon grafikleri (Şekil 4.16 ve 4.17) ile standart katma yöntemi ile elde ettiğimiz grafiklerin (Şekil 4.20 ve 4.21) eğiminin birbirine yakın olduğu görülmektedir. Bu da tabletlerde bulunan katkı maddelerinin yöntem üzerine bozucu etki yapmadığını düşündürmektedir. Bu iki yöntemin, doğrudan kalibrasyon ve standart katmanın kesinlikleri arasında bir fark olup olmadığı araştırıldı ve amaçla F testi uygulandı. Çizelge 4.4 ve 4.6 deki verilerden yararlanarak, aşağıdaki hesaplamalar yapıldı: 59

74 Doğrudan kalibrasyon yöntemindeki standart sapma değeri, s 1 = 0,095; standart katma yöntemindeki standart sapma değeri, s 2 = 0,099 bulundu. Buradan: ( s1 ) ( s ) 2 ( 0,099) ( 0,095) 2 2 F = = = 1, hesaplandı. % 95 güven seviyesinde F kritik = 4,88 dir. Buna göre F < F kritik olduğundan her iki yöntemin kesinliği arasında önemli bir fark olmadığı söylenebilir. Ayrıca bu iki yöntem arasında fark olup olmadığı da araştırıldı ve bu amaçla çizelge 4.2 ve 4.4 deki verilerden yararlanılarak aşağıdaki formül yardımıyla birleşik standart sapma (s b ) hesaplandı. s b = N1 N 2 2 N3 ( xi x1) ( xj x2) ( xk x3) i= 1 j= 1 k= 1 N + N + N =... N Tabletlerdeki ornidazol için doğrudan kalibrasyon yönteminden elde edilen % geri kazanım, x 1 = % 100,29 ve standart katma yöntemiyle elde edilen % geri kazanım, x 2 = % 100,04 dür. % 95 güven seviyesinde 12 serbestlik derecesi için t = 2,18 dir. Bu durumda, ts. b ( N1+ N2) ( N. N ) 1 2 = 2,18 1, = 1,32 Olduğundan % 95 güven seviyesinde iki yöntem arasında anlamlı bir fark yoktur. 60

75 İstatistik sonuçlar iki yöntem arasında anlamlı bir fark olmadığını gösterdiğinden spektrofotometrik çalışmalarda ornidazol tabletlerinin tayini için, doğrudan kalibrasyon yönteminin daha basit ve kısa olduğundan kullanılması daha uygun görülmüştür. Çünkü standart katma yöntemi, özellikle çok sayıda numune analizinin yapılacağı durumlarda çok zaman alıcı bir yöntemdir. Kalite kontrolleri sırasında çok sayıda numunenin analizinin yapılması gerektiğinden, tabletlerde ornidazol tayini için doğrudan kalibrasyon yönteminin daha uygun olabileceği söylenebilir. 4.7 Gözlenebilme Sınırı ve Alt Tayin Sınırı Kalibrasyon grafiğindeki en düşükten bir üstteki ornidazol derişiminde (1x10-6 mol L), 4 ayrı çözeltide dörder tekrar yapıldı. Buradan elde edilen birbirine yakın 5 akım değeri seçildi. Bu değerlerin ortalaması alındı ve standart sapma (s) hesaplandı. Bu değer kullanılarak 3s/m formülünden LOD, 10s/m formülünden ise LOQ bulundu (Çizelge 4.8). Çizelge 4.8 Ornidazol ün AdsDPV ve AdsSWV yöntemleri elde edilen alt tayin ve gözlenebilme sınırları Yöntem Eğim Standart Sapma Gözlenebilme Sınırı (LOD) Alt Tayin Sınırı (LOQ) AdsDPV 1, ,05 7, , AdsSWV 2, ,03 3, , Ultraviyole (UV) Spektroskopisi Çalışmaları Kalibrasyon eğrisinin hazırlanması 1, M ornidazol stok çözeltisinden uygun miktarda seyreltme yapılarak çözeltiler hazırlanmıştır. Elde edilen çözeltilerin referans çözeltisi olarak kullanılan Britton- Robinson tampon çözeltisine (ph 5) karşı spektrumları alındı (Şekil 4.22). Şekilden 61

76 okunan sinyal değerleri derişime karşı grafiğe geçirilerek kalibrasyon grafiği oluşturuldu (Şekil 4.23). Şekil 4.22 Ornidazol ün BR tamponu ortamında UV Spektroskopi yöntemi ile Abs değerlerinin derişim artışı ile oluşturulan şema nın 3B görüntüsü (ph 5) 0,12 0,1 0,08 y = 0,0096x + 0,0077 R 2 = 0,9894 Abs 0,06 0,04 0, C (10-6 ) M Şekil 4.23 Ornidazol ün BR tamponu ortamında UV Spektroskopi yöntemi ile Abs değerlerinin derişim artışı ile oluşturulan kalibrasyon eğrisi (ph 5) 62