ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ TRAZODON UN ELEKTROKİMYASAL DAVRANIŞI VE ADSORPTİF SIYIRMA YÖNTEMLERİYLE TAYİNİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ TRAZODON UN ELEKTROKİMYASAL DAVRANIŞI VE ADSORPTİF SIYIRMA YÖNTEMLERİYLE TAYİNİ CEREN KAÇAR KİMYA ANABİLİM DALI ANKARA 2010 Her hakkı saklıdır

2 TEZ ONAYI CEREN KAÇAR tarafından hazırlanan Trazodon un Elektrokimyasal Davranışı ve Adsorptif Sıyırma Yöntemleriyle Tayini adlı tez çalışması 06/08/2010 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman: Doç. Dr. Zehra DURMUŞ Jüri Üyeleri: Başkan: Prof. Dr. Esma KILIÇ Ankara Üniversitesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. Alev DOĞAN Gazi Üniversitesi, Eğitim Fakültesi Üye : Doç. Dr. Zehra DURMUŞ Ankara Üniversitesi, Kimya Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım. Prof. Dr. Orhan ATAKOL Enstitü Müdürü

3 ÖZET Yüksek Lisans Tezi CEREN KAÇAR TRAZODON UN ELEKTROKİMYASAL DAVRANIŞI VE ADSORPTİF SIYIRMA YÖNTEMLERİYLE TAYİNİ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Zehra DURMUŞ Bu çalışmada sakinleştirici ve antidepresan etkiye sahip trazodon un (TRD) elektrokimyasal davranışı, camsı karbon elektrotta (CKE), Britton-Robinson tamponu (BR) ortamında dönüşümlü voltametri (CV) ve sabit potansiyelli kulometri (BE) yöntemleri ile incelendi. TRD nin adsorpsiyon özellikleri incelenerek yükseltgenme reaksiyonunda aktarılan elektron sayısı, difüzyon katsayısı gibi bazı elektrokimyasal parametreleri hesaplandı. Ayrıca TRD nin farmasötik örnekler ve serum örneklerinde tayini için diferansiyel puls anodik adsortif sıyırma voltametrisi (DPAAdSV), doğrusal taramalı anodik adsortif sıyırma voltametrisi (DTAAdSV) ve kare dalga anodik adsortif sıyırma voltametrisi (KDAAdSV) yöntemleri geliştirildi. Bu yöntemler ile elde edilen pik akımı-derişim grafiklerinden doğrusallık aralığı DPAAdSV için 6, M- 7, M, DTAAdSV ve KDAAdSV için 8, M - 8, M olarak belirlendi. Yapılan kalibrasyon çalışmalarının analitik parametreleri en küçük kareler yöntemi ile değerlendirildi ve her üç yöntem için gözlenebilme sınırı ve alt tayin sınırı değerleri belirlendi. Geliştirilen yöntemlerin validasyonu yapıldı. Bu yöntemler farmasötik örnekler ile serum ortamında bulunan trazodon'un tayini için kullanıldığında; güvenilir, tekrarlanabilir, yüksek doğruluk ve kesinliğe sahip sonuçlar elde edildi. Geliştirilen yöntemlerin uygulama sonuçları ve validasyon parametreleri söz konusu ilaç etken maddesi için önerilen standart yöntemlerin sonuçları ve parametreleri ile istatistiksel olarak karşılaştırıldığında sonuçlar arasında %95 güven seviyesinde anlamlı bir fark olmadığı görüldü. Ağustos 2010, 75 sayfa Anahtar Kelimeler: Trazodon, dönüşümlü voltametri, adsorptif sıyırma diferansiyel puls voltametrisi, adsorptif sıyırma kare dalga voltametrisi i

4 ABSTRACT Master Thesis ELECTROCHEMICAL BEHAVIOR OF TRAZODONE AND ITS ADSORPTIVE STRIPPING DETERMINATION CEREN KAÇAR Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Zehra DURMUŞ In this study, electrochemical behavior of trazodone (TRD), which posses sedative and anti-depressant activity, was investigated on glassy carbon electrode (GCE) in Britton- Robinson buffer (BR) by cyclic voltammetry (CV) and controlled-potential coulometry (BE). Adsorption properties of TRD were investigated. Some electrochemical parameters such as; number of electron transferred in the oxidation of TRD and diffusion coefficient were determined. Furthermore, differential pulse anodic adsorptive stripping voltammetric (DPAAdSV), linear sweep anodic adsorptive stripping voltammetric (LSAAdSV) and square-wave anodic adsorptive stripping voltammetric (SWAAdSV) methods were developed to its direct determination in pharmaceutical preparations and human serum samples. Linear working concentration range for these methods was evaluated as 6, M- 7, M for DPAAdSV and 8, M - 8, M for both LSAAdSV and SWAAdSV. Limit of detection and limit of quantitation were calculated from analytical parameters of calibration studies by using least squared method. Validation of methods was also performed. Results of applications of developed methods to pharmaceutical preparations and human serum samples were found to have high accuracy and precision, reproducible and high confidence. These results were also compared with those of standart methods proposed for determination of TRD and results were found to be insignificant at 95% confidence level. August 2010, 75 pages Key Words: Trazodone, cyclic voltammetry, adsorptive stripping differential pulse voltammetry, adsorptive stripping square wave voltammetry ii

5 TEŞEKKÜR Tez çalışmam sırasında ve tezimin hazırlanmasında bana her konuda yardımcı olan, bilgisini, tecrübesini, hoşgörüsünü esirgemeyen danışmanım Sayın Doç. Dr. Zehra DURMUŞ a, Çalışmalarım sırasında bana destek olan ve yardımlarını esirgemeyen saygıdeğer hocam Sayın Prof. Dr. Esma KILIÇ a, Araştırmamdaki deneylerime, tecrübesi ile katkıda bulunan Arş. Gör. İbrahim H. TAŞDEMİR e ve maddi manevi destekleriyle bana güç vererek her zaman yanımda olduklarına inandığım Yard. Doç. Dr. Funda ÖZTÜRK e, Öğretim Görevlisi Derya KOYUNCU ZEYBEK'e, Arş. Gör. Bülent ZEYBEK e içtenlikle teşekkür ederim. Hayatımın her döneminde bana verdiği manevi destek, göstermiş olduğu sabır ve anlayıştan dolayı canım anneme ve her zaman yanımda olduğuna inandığım sevgili babama, sonsuz teşekkürlerimi sunarım. CEREN KAÇAR Ankara, Ağustos 2010 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT.ii TEŞEKKÜR...iii SİMGELER DİZİNİ.vii ŞEKİLLER DİZİNİ...ix ÇİZELGELER DİZİNİ....xii 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER Voltametrik Yöntemler Dönüşümlü voltametri (CV) Adsorpsiyonun dönüşümlü voltametri ile incelenmesi Diferansiyel puls voltametri (DPV) Kare dalga voltametri (KDV) Sıyırma voltametrisi Anodik sıyırma voltametrisi (ASV) Katodik sıyırma voltametrisi (KSV) Adsorptif sıyırma voltametrisi (AdSV) Elektrokimyasal Reaksiyonlar Tersinir reaksiyonlar Tersinmez ve yarı tersinir reaksiyonlar Bulk Elektroliz (BE) Kronoamperometri (KA) Kronokulometri (KK) KAYNAK ARAŞTIRMASI MATERYAL VE YÖNTEM Kullanılan Kimyasal Maddeler Kullanılan Elektrokimyasal Ölçme Sistemleri ve Yazılımlar Kullanılan Elektrotlar Kullanılan Diğer Cihaz ve Malzemeler.27 iv

7 4.5 Camsı Karbon ElektrodunTemizlenmesi Kullanılan Çözeltiler ve Hazırlanması Destek elektrolit stok çözeltilerinin hazırlanması Standart TRD çözeltilerinin hazırlanması Farmasötik örneklerin ve biyolojik sıvıların hazırlanması Sabit potansiyelli kulometri (BE) çalışmasında kullanılan çözeltilerin hazırlanması Elektrokimyasal Deneylerin ve Ölçümlerin Yapılışı ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA TRD'nin Camsı Karbon Elektrot Yüzeyindeki Elektrokimyasal Davranışı TRD'nin adsorpsiyon özelliği Elektrot reaksiyonunda yer alan H + sayısının bulunması ve ph nın pik akımına ve pik potansiyeline etkisi Aktarılan elektron sayısının (n) bulunması Garrido yöntemi ile difüzyon katsayısının (D) bulunması Önerilen reaksiyon mekanizması TRD'nin Sıyırma Voltametrisi ile Tayini İçin Yöntem Geliştirme Cihaz parametrelerinin optimizasyonu Yöntem parametrelerinin optimizasyonu Pik akımına biriktirme potansiyelinin etkisi Pik akımına biriktirme süresinin etkisi Geliştirilen Yöntemlerin Analitik Uygulamaları Kalibrasyon grafikleri ve doğrusal çalışma aralığının belirlenmesi Kalibrasyon grafikleri kullanılarak farmasötik örneklerden ve serum örneklerinden madde miktarı tayini Standart katma yöntemi ile kalibrasyon çalışması Standart katma ile elde edilen kalibrasyon grafikleri kullanılarak farmasötik örneklerden madde miktarı tayini Geliştirilen Yöntemlerin Validasyon Parametrelerinin İncelenmesi Doğrusal çalışma aralığı Yöntemin doğruluğu Tekrarlanabilirlik...57 v

8 Aynı çözeltide (gün içi) pik akımı ve pik potansiyeli için tekrarlanabilirlik Farklı çözeltilerde (günler arası) pik akımı ve pik potansiyeli için tekrarlanabilirlik Yöntemin kesinliği Yöntemin duyarlılığı Yöntemin seçiciliği Gözlenebilme sınırı Alt tayin sınırı Sağlamlık Spektrofotometrik Tayin Yönteminin Geliştirilmesi Kalibrasyon eğrisinin hazırlanması Farmasötik örneklerin analizi Farklı Yöntem Sonuçlarının ve Parametrelerinin İstatistiksel Olarak Karşılaştırılması SONUÇ KAYNAKLAR...72 ÖZGEÇMİŞ...75 vi

9 SİMGELER DİZİNİ A Elektrodun yüzey alanı, cm 2 BE Bulk elektroliz, sabit potansiyelli kulometri BP Biriktirme potansiyeli BR Britton-Robinson tamponu BS Biriktirme süresi BSS Bağıl standart sapma C Ana çözeltideki elektroaktif maddenin analitik derişimi, mol/cm 3, mol/l CKE Camsı karbon elektrot CV Dönüşümlü voltametri D Difüzyon katsayısı, cm 2 /s DPAAdSV Diferansiyel puls anodik adsortif sıyırma voltametrisi DPV Diferansiyel puls voltametrisi DTAAdSV Doğrusal taramalı anodik adsortif sıyırma voltametrisi DTV Doğrusal taramalı voltametri E Uygulanan Potansiyel E bir E 0 E p a E p k E p Biriktirme potansiyeli, V Standart potansiyel, V Pik potansiyeli, V Anodik pik potansiyeli, V Katodik pik potansiyeli, V f Kare dalganın frekansı, (s -1 ) F Faraday sabiti, C/mol e - i d İnd i p a i p k i p KA KDAAdSV KDV Difüzyon akımı, A İndirgenmiş tür Pik akımı, A Anodik pik akımı, A Katodik pik akımı, A Kronoamperometri Kare dalga anodik adsortif sıyırma voltametrisi Kare dalga voltametrisi vii

10 KH Karıştırma hızı KK Kronokulometri k s (k 0 ) Heterojen reaksiyon hız sabiti, cm/s n Aktarılan elektron sayısı Pt Platin R Gaz sabiti, 8,314 joule/mol K SS Standart sapma T Mutlak sıcaklık t Zaman t bir t p TRD UV YBSK Yük X α Biriktirme süresi, s Potansiyel taramasının başlangıcından pik oluşumuna kadar geçen süre, s Trazodon Ultra viyole Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi Yükseltgenmiş tür Ortalama Elektrot reaksiyonunun yük transfer katsayısı Γ Elektrot yüzeyine adsorbe olan madde miktarı, mol/cm 2 ΔE a Puls genliği, V ΔE i Kare dalga voltametrisinde uyarma sinyalinin basamak yüksekliği ΔE p Pik potansiyelleri arasındaki fark, V ΔI Net akım, A ΔI puls Puls voltameteilerinde puls öcesi ve puls sonrası ölçülen akımların farkı, π Pi sayısı, 22/7 v Tarama hızı, V/s, mv/s viii

11 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Şekil 2.2 Şekil 2.3 Şekil 2.4 Şekil 2.5 Şekil 4.1 Şekil 4.2 Şekil 5.1 Şekil 5.2 Şekil 5.3 Şekil 5.4 Şekil 5.5 Şekil 5.6 Şekil 5.7 Şekil 5.8 Şekil 5.9 Şekil 5.10 Dönüşümlü voltametri için uyarma sinyalinin dalga şekli...5 Yük İnd reaksiyonuna ait tersinir (Eğri 1), tersinmez (Eğri 2) ve tersinir fakat İnd türünün elektroinaktif bir türe dönüştüğü bir sistem (Eğri 3) için dönüşümlü voltamogramlar...6 Diferansiyel puls voltametride puls tipi uyarma sinyalinin dalga şekli...8 Kare dalga voltametride puls tipi uyarma sinyalinin dalga şekli...9 Sıyırma tekniklerinde potansiyel-zaman profili...11 Çalışmanın yapıldığı BAS C3 elektrot hücre standı Bioanalytical Systems (BAS) Electrochemical Analyzer BAS 100B cihazına ait potansiyelli kulometri çalışmaları için bulk elektrolizi hücresi..27 TRD'nin kimyasal yapısı , M TRD nin, BR ortamında, CKE de elde edilen dönüşümlü voltamogramları (v: 0,1 V/s, ph: 7,0) , M TRD nin, BR ortamında (ph 7,0), CKE de farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogramları (Tarama hızının pik potansiyeline etkisini gösteren grafik iç grafik olarak verilmiştir) , M TRD nin, BR ortamında (ph 7,0), CKE de, farklı tarama hızlarındaki alınan dönüşümlü voltamogamlarından elde edilen akım fonksiyonunun (i p a / v 1/2 ) tarama hızıyla (v) değişimi grafiği , M TRD nin, BR ortamında, CKE de, farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogamlarından elde edilen log i p a - log v grafiği (ph 7,0) , M TRD nin, BR de, CKE de 5 ardışık döngü ile alınan dönüşümlü voltamogamı (v: 0,250 V/s, ph 7,0) , M TRD nin, BR ortamında, CKE de (a) DPV (b) CV (c) KDV yöntemi ile elde edilen pik akımlarının ph ile değişimi , M TRD çözeltisinin çeşitli ph lardaki kare dalga voltamogramları (potansiyel-ph grafiği iç grafik olarak verilmiştir)...39 TRD nin olası elektrot reaksiyon mekanizması , M TRD nin, BR ortamında, CKE de, DPAAdSV yöntemi ile elde edilen pik akımlarının biriktirme potansiyeli ile değişimi (ph 7,0)...44 ix

12 Şekil 5.11 Şekil 5.12 Şekil , M TRD nin, BR ortamında, CKE de, DTAAdSV yöntemi ile elde edilen pik akımlarının biriktirme potansiyeli ile değişimi (ph 7,0) , M TRD nin, BR ortamında, CKE de, KDAAdSV yöntemi ile elde edilen pik akımlarının biriktirme potansiyeli ile değişimi (ph 7,0) , M TRD nin, BR ortamında, CKE de, DPAAdSV yöntemi ile Elde edilen pik akımlarının biriktirme süresi ile değişimi (E bir : 400 mv, ph 7,0)...46 Şekil 5.14 Şekil , M TRD nin, BR ortamında, CKE de, DTAAdSV yöntemi ile Elde edilen pik akımlarının biriktirme süresi ile değişimi (E bir : 300 mv, ph 7,0) , M TRD nin, BR ortamında, CKE de, KDAAdSV yöntemi ile Elde edilen pik akımlarının biriktirme süresi ile değişimi (E bir : 400 mv, ph 7,0)...48 Şekil 5.16 TRD nin farklı derişimlerdeki DPAAdSV voltamogramları (ph: 7,0; E bir : 400 mv, t bir : 30 s. Akım-derişim grafiği iç grafik olarak verilmiştir)..49 Şekil 5.17 TRD nin farklı derişimlerdeki DTAAdSV voltamogramları (ph: 7,0; E bir : 300 mv, t bir : 15 s. Akım-derişim grafiği iç grafik olarak verilmiştir)..50 Şekil 5.18 TRD nin farklı derişimlerdeki KDAAdSV voltamogramları (ph: 7,0; E bir : 400 mv, t bir : 10 s. Akım-derişim grafiği iç grafik olarak verilmiştir)..50 Şekil 5.19 Şekil 5.20 Şekil 5.21 Şekil 5.22 Şekil 5.23 Şekil 5.24 Şekil 5.25 Şekil 5.26 TRD nin tayini için geliştirilen DPAAdSV yönteminin serum ve tablet örneklerine uygulanması sonucu elde edilen voltamogramlar...52 TRD nin tayini için standart katma yöntemi ile elde edilen kalibrasyon grafiği (DPAAdSV)...53 TRD nin tayini için standart katma yöntemi ile elde edilen kalibrasyon grafiği (DTAAdSV)...54 TRD nin tayini için standart katma yöntemi ile elde edilen kalibrasyon grafiği (KDAAdSV)...54 DPAAdSV yöntemi ile aynı gün, aynı çözeltide yapılan ölçümlere ait voltamogramlar (E bir : 400 mv, t bir : 30 s, C TRD : 1, M, ph 7,0)...57 DTAAdSV yöntemi ile aynı gün, aynı çözeltide yapılan ölçümlere ait voltamogramlar (E bir : 300 mv, t bir : 15 s, C TRD : 1, M, ph 7,0)...58 KDAAdSV yöntemi ile aynı gün, aynı çözeltide yapılan ölçümlere ait voltamogramlar (E bir : 400 mv, t bir : 10 s, C TRD : 1, M, ph 7,0)...58 DPAAdSV yöntemi ile farklı günlerde, hazırlanan farklı çözeltilerde yapılan ölçümlere ait voltamogramlar (E bir : 400 mv, t bir : 30 s, C TRD : 1, M, ph 7,0)...59 x

13 Şekil 5.27 Şekil 5.28 Şekil 5.29 DTAAdSV yöntemi ile farklı günlerde, hazırlanan farklı çözeltilerde yapılan ölçümlere ait voltamogramlar (E bir : 300 mv, t bir : 15 s, C TRD : 1, M, ph 7,0)...60 KDAAdSV yöntemi ile farklı günlerde, hazırlanan farklı çözeltilerde yapılan ölçümlere ait voltamogramlar (E bir : 400 mv, t bir : 10 s, C TRD : 1, M, ph 7,0)...60 Farklı derişimlerdeki TRD moleküllerinin absorbans değerleri ve kalibrasyon eğrisi...64 xi

14 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 4.1 Çizelge 5.1 Çizelge 5.2 Çizelge 5.3 Çizelge 5.4 Çizelge 5.5 Çizelge 5.6 Çizelge 5.7 Çizelge 5.8 Çizelge 5.9 Çizelge 5.10 Çizelge 5.11 Kullanılan kimyasal maddeler, temin edildikleri firma ve saflık dereceleri , M TRD nin, BR ortamında, CKE de farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogamlarından elde edilen yüzey kaplama katsayıları ve difüzyon katsayıları Voltametrik sıyırma yöntemleri için optimum cihaz parametreleri...43 Voltametrik sıyırma yöntemleri için optimum yöntem parametreleri...48 Geliştirilen yöntemlerin tablet örneklerine uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar...51 Geliştirilen yöntemlerin serum örneklerine uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar...52 Geliştirilen yöntemlerin tablet örneklerine uygulanmasıyla standart katma kalibrasyon grafikleri kullanılarak elde edilen sonuçlar...55 Geliştirilen yöntemlerin bazı validasyon parametreleri TRD nin BR tamponu ortamında, UV Spektroskopi yöntemi ile analizlerine ait bulgular...65 Doğrudan kalibrasyon ve standart katma yöntemlerinin DPAAdSV, DTAAdSV ve KDAAdSV yöntemleri için hesaplanan bazı değerler...66 DPAAdSV, DTAAdSV ve KDAAdSV yöntemlerinin doğruluklarını birbirleri ile karşılaştırmak için hesaplanan t deneysel ve t kritik değerleri...67 Geliştirilen DPAAdSV, DTAAdSV ve KDAAdSV yöntemleri ile UV spektroskopisi yöntemini karşılaştırmak için hesaplanan F ve t değerleri...69 xii

15 1. GİRİŞ Son yıllarda ilaç kullanımının artması nedeniyle farmasötik örneklerde ve serum, idrar, plazma gibi biyolojik sıvılarda ilaç ve/veya ilaç ile ilgili maddelerin analizi çalışmaları büyük önem kazanmış, daha hızlı, kolay ve düşük derişimlerde tayin için yöntem arayışları hızla artmıştır. Analizi yapılacak biyolojik ve farmasötik ürünler genellikle aranan madde dışında birçok bileşenin yer aldığı karışık bir matriks içerirler. Bu nedenle yüksek basınçlı sıvı kromotografisi (YBSK) yöntemi oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Özellikle yüksek sıcaklıklarda bozulan ve bu nedenle gaz kromatograsfisi ile analiz edilemeyen numunelere analiz imkanı sağlaması YBSK'nin en büyük avantajlarındandır. Ancak YBSK, fazla miktarda çözücü harcanması, çok zaman alması ve yüksek maliyetli olması, bir iç standarda gerek duyulması gibi dezavantajlara da sahiptir. Bu nedenle herhangi bir ekstraksiyona gerek kalmadan hızlı, basit, ucuz, doğru ve düşük derişimlere inebilen voltametrik yöntemlerin kullanımı son yıllarda artmaktadır. Voltametrik yöntemler, YBSK yöntemine alternatif bir yöntem olarak literatürlerde yerini almıştır. Ayrıca, ilaç etken maddelerinin fiziksel ve farmakokinetik yapısındaki değişikliklerin hepsi, moleküllerin yükseltgenme/indirgenme davranışlarındaki değişikliklere dayanması nedeniyle etki mekanizmalarına ışık tutması açısından elektrokimyasal teknikler önemli rol oynamaktadır. Günümüzün modern analitik tekniklerinden olan (yüzeyde tutunma olaylarına dayalı) adsorptif sıyırma, diferansiyel puls ve kare dalga voltametrisi/polarografisi tekniklerinin kullanılması ile geliştirilmiş olan yöntemlerin, duyarlı, seçici, basit, hızlı ve uygulamada değişikliğe açık olması ilaç dozaj formlarından (tablet, kapsül, şurup, ampul vb.) ve vücut sıvılarından (kan, idrar, anne sütü vb.) analizlere uygulanabilirliği açısından özel bir yeri vardır. Özellikle adsorptif sıyırma yöntemleri ilaç etken maddelerinin düşük derişimlerdeki analizlerini mümkün kılmaktadır. 1

16 Bu çalışmada günümüz hastalıkları arasında önemli bir yeri olan depresif bozukluğun tedavisinde kullanılan TRD nin öncelikle elektrokimyasal davranışı, dönüşümlü voltametri, sabit potansiyelli kulometri gibi yöntemler ile incelenmesi ve çalışmalar sonunda; tersinirlik, aktarılan elektron sayısı, adsorpsiyon özellikleri, difüzyon katsayısı gibi elektrokimyasal parametrelerinin belirlenmesi amaçlandı. Bu sonuçlara dayanarak, elektrot yüzeyinde gerçekleşen olası bir reaksiyon mekanizmasının önerilmesi amacıyla ayırma yöntemi ve IR spektroskopisinden yararlanılması düşünüldü. Daha sonra TRD'nin nicel tayini için voltametrik sıyırma yöntemleri geliştirildi. Bu amaçla, ph, derişim, tarama hızı, biriktirme süresi, biriktirme potansiyeli gibi deneysel parametreler değiştirilerek, en uygun deneysel koşullar belirlenerek bu koşullarda nicel tayin çalışmaları gerçekleştirildi. Geliştirilen yöntemler istatiksel olarak değerlendirilip kesinlik, duyarlık, seçicilik gibi parametreler incelenerek yöntemin analitik amaç için uygunluğu araştırıldı. Ayrıca, geliştirilen yöntemler, TRD içeren farmasötik örneklere ve serum örneklerine uygulandı ve elde edilen veriler, standart bir yöntemle karşılaştırılarak aralarında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadığı belirlendi. 2

17 2. KURAMSAL TEMELLER Elektrokimya, çözücülerde homojen olarak ya da elektrot-çözücü ara yüzeyinde heterojen olarak meydana gelen yük ayrılması ve yük aktarımı ile ilişkili olan olaylarla ilgilenir. Elektrokimya uzun bir geçmişe sahiptir ve 200 yıl önce Volta nın elektrik pilini (1799) keşfi ile başlar. Son yıllarda elektrokimya alanında ilerlemeler oldukça fazladır. Günümüzde elektrokimya, bilim ve teknolojinin yeni alanlarının geliştirilmesinde önemli rol oynamakta ve küresel enerji ve çevre sorunlarının çözümüne gerekli katkılar yapmaktadır (Izutsu 2002). 2.1 Voltametrik Yöntemler Voltametri, potansiyel, akım, elektrik yük miktarı ile madde miktarı arasındaki ilişkiye dayanan elektroanalitik bir yöntemdir. Voltametrik yöntemlerin bir kısmında potansiyel sabit tutulur veya çeşitli şekillerde değiştirilerek madde miktarına bağlı olarak oluşan akım miktarı incelenir. Bu elektroanalitik tekniklerle maddelerin, nitel ve nicel analizleri yapılabileceği gibi elektrot reaksiyonlarının mekanizmaları da incelenebilir. Ayrıca maddelerin çözeltilerdeki kararlılıkları ve çeşitli fizikokimyasal sabitlerinin de tayinini yapmak mümkündür. Voltametride, çalışma elektrodunun potansiyeli zamanla değiştirilirken akım ölçülür. Elektroda, zamanın bir fonksiyonu olarak farklı potansiyellerin uygulanmasıyla oluşan farklı şekillerdeki potansiyel-zaman fonksiyonlarına uyarma sinyali denir. Aşağıda, voltametride yaygın olarak kullanılan uyarma sinyallerinden ve kimyasal sistemlerin incelenmesinde uygulanan çeşitli elektrokimyasal yöntemlerden bu tez çalışmasında kullanılanlar kısaca anlatılmaktadır. 3

18 2.1.1 Dönüşümlü voltametri (CV) Bu yöntemde, potansiyel, üçgensel potansiyel döngüsü (Şekil 2.1) verecek şekilde, Şekil 2.2 de görüldüğü gibi, E 1 den E 2 ye ileri ve E 2 den E 1 e geriye doğru doğrusal olarak taranırken oluşan akım ölçülür. Hücrede oluşan akımın potansiyelin fonksiyonu olarak kaydedilmesiyle elde edilen akım-potansiyel eğrilerine dönüşümlü voltamogram denir. Bir voltamogram örneği Şekil 2.2 de verilmiştir. Bu şekilde, Yük + ne - İnd reaksiyonu için çözeltide sadece Yük ün bulunduğu çeşitli dönüşümlü voltamogram örnekleri görülmektedir. Eğri 1, Yük + ne - İnd reaksiyonu tersinir olduğunda elde edilir. İleri doğru taramada, doğrusal taramalı voltametrideki (DTV) gibi, Yük ün İnd e indirgenmesi ile katodik bir pik elde edilir. Geriye doğru taramada, ileri doğru tarama süresince meydana gelen İnd in Yük e tekrar yükseltgenmesinden kaynaklanan, anodik bir pik gözlenir. Tersinir reaksiyonlar için, katodik ve anodik pik akımlarının büyüklükleri ( i k p = i a p ) eşittir ve katodik pik potansiyeli (E k p ) anodik pik potansiyelinden (E a p ) (58/n) mv daha negatiftir. Bunlar, tersinirlik için önemli parametrelerdir. Ayrıca, formal redoks potansiyelini elde etmek için kullanılan yarı dalga potansiyeli, E 1/2 = (E k p + E a p )/2 şeklinde bulunur. Tersinirliğin azalması ile iki pik potansiyeli arasındaki fark artar. Eğri 2, önemli derecede tersinmez olan sistemler içindir. Eğri 1 ile karşılaştırıldığında, katodik pik çok daha negatif, anodik pik ise çok daha pozitif potansiyeldedir. Sistem tamamen tersinmez ise, anodik pik ölçülebilen potansiyel aralığında görünmez. Tersinmez CV eğrisinden, genellikle bir simulasyon yöntemi ile elektrot reaksiyonu için kinetik parametreler (hız sabiti ve transfer katsayısı) elde edilebilir. 4

19 Şekil 2.1 Dönüşümlü voltametri için uyarma sinyalinin dalga şekli Eğri 3, İnd in tersinir olarak Yük e tekrar yükseltgenebildiği, tekrar yükseltgenmeden önce, İnd in bir kısmının elektroaktif olmayan A türüne dönüşebildiği bir durum içindir (Yük İnd k A ). Katodik pik Eğri 1 deki gibi aynı şekilde görünür, fakat anodik pik akımı Eğri 1 dekinden daha küçük olur. Anodik pik akımındaki azalmadan, k hız sabiti bulunabilir. CV de, potansiyel tarama hızı geniş bir aralıkta değiştirilebilir (Izutsu 2002). Dönüşümlü voltametri, sulu ve susuz çözeltilerdeki elektrokimyasal çalışmalarda en kullanışlı yöntemlerden biridir. Özellikle, kararsız bir ara ürün veya ürünler içeren elektrot reaksiyonlarının incelenmesinde faydalıdır. Elde edilen voltamogramlar incelenerek reaksiyon mekanizmaları tahmin edilebilir ve kararsız türlerin kinetik parametlereri belirlenebilir. Ayrıca, kimyasal ve elektrokimyasal reaksiyonların her biri farklı reaksiyon hızlarına ve tersinirliklere sahiptir. Bunların hepsi, voltamogramlara yansır. Potansiyel aralığı, tarama hızı, sıcaklık, elektrodun cinsi, çözeltinin bileşimi gibi çeşitli parametreleri değiştirerek bir elektrot reaksiyonunun dönüşümlü voltamogramı alınıp, alınan voltamogramlar gerektiği gibi analiz edildiğinde, elektrot reaksiyonuyla ilgili bilgi edinilebilir (Greef 1990, Izutsu 2002). 5

20 Şekil 2.2 Yük İnd reaksiyonuna ait tersinir (Eğri 1), tersinmez (Eğri 2) ve tersinir fakat İnd türünün elektroinaktif bir türe dönüştüğü bir sistem (Eğri 3) için dönüşümlü voltamogramlar Dönüşümlü voltametri tekniğinin, nicel amaçla kullanımı seyrek olmakla beraber, elektrokimyasal reaksiyonlar hakkında nitel bilgi edinilmesinde en yaygın olarak kullanılan teknik olmasının nedeni, redoks olaylarının termodinamiği, heterojen elektron-transfer reaksiyonlarının kinetiği ve takip eden kimyasal reaksiyonlar ve adsorpsiyon olaylarıyla ilgili güvenilir bilgileri hızlı bir şekilde sağlamasıdır. Elektroanalitik çalışmalarda genellikle ilk olarak uygulanan deneysel basamaktır. Özellikle, elektroaktif türlerin redoks potansiyellerinin hızlı bir şekilde belirlenmesini ve deneysel parametrelerin redoks reaksiyonuna etkisinin değerlendirilmesini sağlar (Wang 2000). 6

21 Adsorpsiyonun dönüşümlü voltametri ile incelenmesi Dönüşümlü voltametri aynı zamanda, elektroaktif türlerin arayüzeydeki davranışının incelenmesinde de kullanılır. Reaktif ve ürünün her ikisi de, adsorpsiyon-desorpsiyon olayında yer alabilir. Bu durumda, alınan çoklu voltamogramlarda, katodik ve anodik pik akımlarının dereceli olarak değişmesi (artması veya azalması), elektrot yüzeyinde adsorpsiyonun göstergesidir. Reaktif veya ürünün her ikisi değil de, sadece biri elektrot yüzeyine kuvvetli adsorbe olabilir. Bu durumda, reaktifin elektrot yüzeyine kuvvetli adsorbsiyonu varsa difüzyon pikinden daha negatif bir potansiyelde bir arka pik gözlenirken, ürünün elektrot yüzeyine kuvvetli adsorbsiyonu varsa difüzyon pikinden daha pozitif bir potansiyelde bir ön pik gözlenir (Wang 2000) Diferansiyel puls voltametri (DPV) Puls voltametri teknikleri, Barker ve Jenkin tarafından (1952), voltametrik çalışmalarda tayin sınırını düşürmek amacıyla önerildi. Böylece, faradayik ve faradayik olmayan akım arasındaki oran arttırılarak, tayin sınırları 10-8 M a kadar düşürüldü. Kısaca DPV olarak gösterilen diferansiyel puls voltametrisi, organik ve anorganik türlerin eser miktarlarının ölçülmesinde son derece kullanışlı bir tekniktir. Diferansiyel puls voltametrisinde, doğrusal bir potansiyel artışına göre ayarlanmış sabit büyüklükte pulslar (de/dt), çalışma elektroduna belli bir süre uygulanır (Şekil 2.3). İki kez akım ölçülür. Birincisi, puls uygulanmadan önce yani tam pulsun başladığı anda potansiyelde bir artış olmadan, ikincisi, pulsun bitmesine yakın bir bölgede ölçülür. Bu iki akım arasındaki fark, I puls olarak verilir. Sonunda, uygulanan potansiyele karşı bu akım farklarının grafiğe geçirilmesiyle diferansiyel puls voltamogramı elde edilir (Wang 2000). Voltamogramlardaki pik akımlarının yüksekliği, aşağıdaki eşitlikte (Eşitlik 2.6) de görüleceği gibi ilgili analitin derişimiyle doğru orantılıdır: nfacd 12 1 i p t 1 (2.1) 7

22 Burada, = exp[(nf/rt)( E/2)] dir ve E puls genişliğidir. DPV, elektroaktif türlerin nicel analizi için en yaygın kullanılan elektroanalitik yöntemlerden biridir. Bu yöntemle analite bağlı olarak gözlenebilme sınırı 10-8 M'a kadar indirilebilmektedir (Wang 2000). Şekil 2.3 Diferansiyel puls voltametrisinde puls tipi uyarma sinyalinin dalga şekli Kare dalga voltametri (KDV) Kare dalga voltametrisi, diferansiyel pulsdan daha sık tercih edilen elektroanalitik yöntemdir. Kısaca KDV olarak gösterilir ve çalışma elektroduna uygulanan potansiyel, büyük genişlikli bir diferansiyel teknik olmasını sağlayan simetrik kare dalgalar şeklindedir. Her bir kare dalga döngüsü boyunca, akım iki kez ölçülür. Birincisi, ileri yöndeki pulsun sonunda (t 1 ) ikincisi ise geri yöndeki pulsun sonundadır (t 2 ). Bu iki akım arasındaki fark, uygulanan potansiyelin bir fonksiyonu olarak grafiğe geçirildiğinde kare dalga voltamogramı elde edilir (Şekil 2.4). 8

23 Şekil 2.4 Kare dalga voltametride puls tipi uyarma sinyalinin dalga şekli KDV nin en büyük üstünlüğü oldukça hızlı bir teknik olmasıdır. Etkin tarama hızı, kare dalganın frekansı (f) ve basamak yüksekliği ( E s ) değiştirilerek belirlenir. Bu yolla tarama hızı çarpıcı bir şekilde arttırılabilir, 1 V/s'lik tarama hızına kolaylıkla ulaşılabilir. Böylece, birkaç saniye içinde voltamogramlar kaydedilebilmektedir. Bu, ortalama 2 3 dakikayı bulan diferansiyel puls voltamogramının tamamlanması ile karşılaştırıldığında, kare dalga voltametrisinin analiz süresini önemli ölçüde kısalttığının bir göstergesidir (Wang 2000). SWV yönteminin ikinci büyük üstünlüğü de, kare dalga yoluyla toplam akıma kapasitif katkıların minimuma indirilmiş olmasıdır. SWV'de net akım ( I) hem ileri hem de geri puls akımlarından daha büyüktür. Bu nedenle, voltametrik pik genellikle oldukça kolay okunmaktadır. Bu da, yöntemin doğruluğunu arttırmakta ve diferansiyel puls voltametrisinden daha yüksek duyarlılığın elde edilmesini sağlamaktadır (Monk 2001). Böylece, 1, M'a yakın çok düşük tayin sınırlarına inilebilmektedir. Kare dalga ve diferansiyel puls voltametrisi karşılaştırılırsa, kare dalga akımlarının benzer diferansiyel puls cevaplarından, tersinir ve tersinmez sistemler için sırasıyla 4 ve 3,3 kat daha yüksek olduğu söylenebilir (Borman 1982) Sıyırma voltametrisi Çevre ve klinik örneklerdeki maddelerin tayini için duyarlı yöntemlere duyulan ihtiyaç günden güne artmaktadır. Sıyırma voltametrisi bu ihtiyaçtan doğmuş ve son yirmi yılda 9

24 hızlı bir şeklide gelişmekte olan bir yöntemdir. Karışım analizlerine uygulanabilirliği, cihazların ucuzluğu ve ölçüm kolaylığı sebebiyle analizcilerin dikkatleri bu yöntem üzerinde yoğunlaşmaktadır. Voltametrik sıyırma tekniklerine, sulu ve susuz ortamlarda maddelerin eser miktarda tayinlerinde başvurulur. Atomik absorpsiyon, nötron aktivasyon, florometrik ve kromatografik yöntemlerle birlikte voltametrik sıyırma yöntemleri eser analizlerde başvurulan beş önemli yöntemler arasında sayılmaktadır. Bu yöntemlerden anorganik analizlerde en çok uygulama alanı olan iki yöntemden biri atomik absorpsiyon, diğeri ise sıyırma yöntemleridir. Atomik absorpsiyona yalnız anorganik tayinlerde başvurulduğu halde sıyırma teknikleri hem anorganik hem de organik tayinlerde kullanılabilmektedir. Ayrıca atomik absorpsiyon, bozucu, yıkıcı (destructive) bir yöntem iken sıyırma yöntemleri bozucu olmayan, yıkıcı olmayan bir (nondestructive) bir yöntemdir. Aynı numunenin analizi sıyırma tekniklerinde defalarca tekrarlanabilir. Bir diğer avantaj da sıyırma tekniklerinde kullanılan cihazların daha basit ve daha ucuz olmasıdır. Elektroanalitik yöntemler içerisinde en duyarlısı sıyırma yöntemidir. Sıyırma yöntemi iki farklı şekilde uygulanır. Birincisinde, analizi yapılacak madde seyreltik çözeltiden indirgenme veya yükseltgenme suretiyle elektrot yüzeyinde biriktirilir. Bu basamakta bir elektrokimyasal ön deriştirme işlemi yapılmaktadır. Bu basamak, birçok yöntemde başvurulan çözücü ekstraksiyonuna karşılık gelen bir işlem olarak görülebilir. Elektroda uygulanan sabit potansiyelde çözeltideki madde indirgenerek vaya yükseltgenerek elektrot yüzeyinde çözünmez duruma dönüştürülür. Daha sonra elektroda pozitif (anodik) veya negatif (katodik) yönde potansiyel taraması uygulanır. Bu tarama esnasında elektrot yüzeyinde toplanan madde indirgenme veya yükseltgenme ile elektrot yüzeyinden sıyrılarak tekrar çözeltiye geri aktarılır. Yönteme sıyırma voltametrisi adı verilmesinin sebebi işte bu basamaktır. Bu esnada oluşan akım ölçülerek madde miktarı tayin edilir. İkinci sıyırma tekniği, adsorptif sıyırma voltametrisi (AdSV) dir. Bu teknikte çözeltide bulunan madde sabit potansiyelde herhangi bir kimyasal değişikliğe uğratılmadan doğrudan doğruya elektrot yüzeyine fiziksel adsorpsiyonla toplanır. Toplanan bu madde yine bir potansiyel taraması ile indirgenmeye veya yükseltgenmeye uğratılarak oluşan akım ölçülür. Son yedi-sekiz yılda geliştirilen bu yöntem ile hem çok duyarlı bir analitik yöntem elde edilmiş hem de voltametride kötü haber olarak bilinen adsorpsiyon olayı bir avantaj haline dönüştürülmüştür. 10

25 Her iki sıyırma tekniği de iki işlem basamağından meydana gelir. İlk işlem basamağı biriktirme basamağıdır. Her iki durumda da sabit bir potansiyelde bir ön deriştirme işlemi yapılır. Ancak bu ön deriştirme işlemi birinde kimyasal bir reaksiyon ile yapılırken, diğerinde fiziksel adsorpsiyonla yapılmaktadır. İkinci işlem olan sıyırma basamağında ise her iki teknikte de biriktirilen maddenin özelliğine göre anodik veya katodik yönde bir potansiyel taraması yapılarak madde elektrokimyasal değişikliğe uğratılır ve bunun sonucunda akım elde edilir. Potansiyel taraması anodik yönde yapılırsa yöntem anodik sıyırma voltametrisi (ASV), katodik yönde yapılırsa katodik sıyırma voltametrisidir (KSV). Sıyırma esnasında istenilen bir voltametrik yöntem kullanılabilir. Yapılan potansiyel taramasına göre yöntem de sıyırma voltametrisi, doğrusal taramalı sıyırma voltametrisi veya diferansiyel puls sıyırma voltametrisi vb. gibi adlar alır (Wang 2000). Her iki sıyırma tekniğinde potansiyel-zaman profili şematik olarak Şekil 2.5 de verilmiştir. Şekil 2.5 Sıyırma tekniklerinde potansiyel-zaman profili 11

26 Sıyırma analizlerinin duyarlığı, toplama basamağında ürünün elektrot yüzeyindeki derişimine bağlıdır. Bundan dolayı damlayan cıva elektrot, sıyırma voltametrisinde kullanılmaz. Çünkü cıvayla birlikte biriktirilen madde de çözeltiye geri taşınmış olur. Bunun için sıyırma yöntemlerinde sabit bir cıva damlası veya bir katı elektrot kullanılır. Yukarıda anlatıldığı gibi sıyırma voltametrisinde iki işlem basamağı vardır. İlk basamakta elektrot yüzeyinde biriktirilen ürünün ikinci basamakta eski haline gelebilmesi durumunda ancak sıyırma teknikleri kullanılabilir. Ürünün bozunması halinde veya elektrokimyasal olarak aktif olmayan bir türe dönüşmesi halinde bu teknikleri uygulamak mümkün olmaz Anodik sıyırma voltametrisi (ASV) Biriktirme adımında elektrot potansiyeli, analizi yapılacak olan metalin indirgenme potansiyelinden daha katodik bir potansiyelde, belli bir süre (t) tutulur. Bu süre boyunca çözelti karıştırılır. Biriken metalin mol sayısı, (i b t b /nf) değerine eşdeğerdir. Biriken maddenin elektrot yüzeyine ulaşma hızı, maddenin derişimine, elektrot çözeltisinin difüzyon özelliklerine ve kullanılan elektrotun alanına bağlı olarak değişir. Doğru sonuçlar alabilmek için biriktirme koşullarının (karıştırma hızı, biriktirme süresi ve sıcaklık) analiz boyunca aynı kalması gereklidir (Copeland ve Skogerboe 1974, Bond 1980). Sıyırma analizinde camsı karbon elektrodunun (CKE) kullanıldığı durumlarda biriktirme adımının ardından karıştırma durdurularak bir süre beklenir. Bu durulma süresinde madde derişimi çözelti içinde homojen şekilde dağılma fırsatını bulur ve bundan sonra okunacak olan akımın difüzyon akımı olması sağlanır (Copeland ve Skogerboe 1974, Andruzzi vd. 1982). Sıyırma analizinde cıva film elektrodunun kullanıldığı durumlarda, karıştırma, elektrotun döndürülmesi ile kontrol edilmektedir. Genellikle bu elektrot ile durgunluk 12

27 süresi verilmez ve karıştırma, sıyırma adımı boyunca da devam eder (Copeland ve Skogerboe 1974). Sıyırma adımında, elektrot potansiyeli anodik yönde ilerlerken elektrotta birikmiş olan madde, yükseltgenme potansiyeline ulaştığında bir akım oluşturur. Sıyırma veya yükseltgenme akımı elektrot potansiyelinin fonksiyonu olarak okunmaktadır. Sıyırma akımı, maddenin elektrottaki ve çözeltideki derişimi ile doğru orantılıdır (Copeland ve Skogerboe 1974, Bard ve Faulkner 1980, Bond 1980). Anodik sıyırma voltametrisinde anodik yönde potansiyel taraması yapılırken katodik sıyırma voltametrisinde ise biriktirme anodik yönde, sıyırma ise katodik yönde yapılmaktadır (Bond 1980) Katodik sıyırma voltametrisi (KSV) Katodik sıyırma voltametrisiyle anyonlar ve moleküller tayin edilebilmektedir. Katodik sıyırma voltametrisinde biriktirme basamağında, elektrot üzerinde toplama basamağında gerçekleşen anodik reaksiyon, maddenin iyonlarına yükseltgenmesidir. Oluşan maddenin iyonları da çözünmeyen tuzları halinde elektrot yüzeyi üzerinde çöker. Gerekli anodik toplama potansiyeli, ilgili anyonlara bağlıdır. Katodik sıyırma voltametrisi çok sayıda ilaç ve pestisit olarak kullanılan organik bileşiğin analizi için uygundur. Bunlar genelde S 2- anyonu içerirler. Toplama basamağında bu anyon ile çözünmeyen bir cıva tuzu oluşur. Bütün katodik sıyırma işlemlerinde, toplama basamağında elektrot yüzeyi üzerinde çözünmeyen bir tabaka oluşur. Eğer çok madde toplanırsa sıyırma piki bozulabilir. Bu nedenle KSV, çok seyreltik çözeltilerin analizi için uygun bir yöntemdir (Brainina 1972). Ayrıca katodik sıyırma voltametrisi yönteminin, selenyum ve arsenik metalleri için çok duyarlı olduğu kanıtlanmıştır (Saltman 1983). 13

28 Adsorptif sıyırma voltametrisi (AdSV) Adsorptif sıyırma voltametrisi, maddelerin analizlerinde son bir kaç yıldır önemli derecede ilgi çekmiş yöntemlerden biridir. Bu ilginin nedeni yöntemin mükemmel duyarlılığı, doğruluğu, hızı ve düşük maliyetidir. Ayrıca bu yöntemle hem inorganik hem de organik maddelerin tayini yapılabilmektedir. Voltammetrik yöntemlerde adsorpsiyon genel olarak iyon ya da moleküllerin elektrot yüzeyine tutunmasını ifade eder. Bu tutunma olayı voltammetrik ölçüm sonuçlarını etkiler ve genelde ASV de bu olaya istenmeyen durum gözüyle bakılır ve olmaması istenir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, türlerin elektrot yüzeyine kontrollü adsorpsiyonunun bir avantaj olarak kullanılabileceğini göstermiştir. Adsorptif sıyırma voltametrisinde, önderiştirme, karıştırılan bir çözeltiden elektrot yüzeyine fiziksel adsorpsiyonla sağlanır. Bu yöntem ile elektroaktif ve yüzey aktif özellikte birçok önemli madde hassas olarak tayin edilebilmektedir. Ayrıca çalışma elektrodunun yüzeyi modifiye edilerek, kimi bileşikler için adsorpsiyon daha seçimli hale getirilebilir. Çalışma koşulları optimize edilerek uygun çözücü, ph, iyon şiddeti, karıştırma hızı ve sıcaklıkta çalışılır. Kalibrasyon grafiğinin doğrusal aralığı önderiştirilen bileşiğin büyüklüğüne, hidrofobik özelliğine ve elektrot yüzeyine yönelimine göre değişir. Genellikle de seyreltik çözeltilerde ve kısa sürelerde biriktirme uygulanır. Bu da analizler için tercih edilir bir durumdur (Wang 2000). 2.2 Elektrokimyasal Reaksiyonlar Tersinir reaksiyonlar Tersinir bir çift için pik akımı (25 C), Randles-Sevcik eşitliğiyle verilir (Eşitlik 2.2): 14

29 ( 2,69x10 5 ) nacd 23 v 2121 pi (2.2) Burada n, aktarılan elektron sayısı; A, elektrodun alanı (cm 2 ); C, derişim (mol/cm 3 ); D, difüzyon katsayısı (cm 2 /s) ve v, tarama hızıdır (V/s). Buna göre, akım, derişimle doğru orantılıdır ve tarama hızının kareköküyle artar. Basit bir tersinir çift için, anodik pik akımının katodik pik akımına oranı 1 dir. Bu oran, redoks reaksiyonuna eşlik eden kimyasal reaksiyonların varlığından oldukça güçlü bir şekilde etkilenir. Potansiyel eksenindeki piklerin konumu, redoks çiftlerinin formal potansiyeline bağlıdır. Tersinir bir sistem için formal potansiyel, aşağıdaki gibi verilir (Eşitlik 2.3): a k E 0 p E p E (2.3) 2 Tersinir bir sistemde, pik potansiyelleri arasındaki fark aşağıdaki eşitlikle verilir (Eşitlik 2.4): pe a p E k p E,0 059 V (2.4) n Bu yüzden, pik potansiyelleri farkı, aktarılan elektron sayısının hesaplanmasında ve redoks çiftinin Nerst davranışı gösterip göstermediğinin belirlenmesinde kullanılır. Buna göre, hızlı bir 1e - lu reaksiyon, 59 mv luk bir E p gösterir. Katodik ve anodik piklerin her ikisi de tarama hızından bağımsızdır. Çok elektronlu bir indirgenme gerçekleşiyorsa, sistemin tersinir olması için voltamogramda, birbirinden iyi bir şekilde ayrılmış ve E 0 değerleri birbirinden sırayla artış gösteren çok sayıda pikin olması gerekir (Wang 2000). 15

30 2121 Bir reaksiyonun tersinir olduğunun belirlenmesinde, dönüşümlü voltametri çalışmalarından yararlanılır ve aşağıdaki kriterlerin sağlanması elektrot reaksiyonunun tersinir olduğunu gösterir. E k p -E a p = 59/n mv veya E p -E p/2 = 57/n mv tur. E p tarama hızı ile değişmez. i a p / i k p = 1 dir ve bu oran tarama hızıyla değişmez. i p /v 1/2, tarama hızıyla değişmez. Dalga şekli tarama hızıyla değişmez Tersinmez ve yarı tersinir reaksiyonlar Elektron transferinin yavaş olduğu tersinmez sistemler için, piklerin büyüklüğü tersinir sistemlere göre azdır ve pikler birbirinden epeyce ayrılır (Wang 2000). Tersinmez sistemlerde, tarama hızıyla pik potansiyelinde kayma olur (Eşitlik 2.5): RT k n Fv E p E 0, 78 ln ln (2.5) 1 2 n F D RT Burada,, transfer katsayısıdır ve n yük-transfer basamağındaki elektron sayısıdır. Bu yüzden, E p, E 0 dan daha yüksek potansiyellerde oluşur. Pik potansiyeli, yarı-pik potasiyelinden 48/ n mv kadar farklı olur. Pik akımı, aşağıdaki eşitlikten (Eşitlik 2.6) görüldüğü gibi, çözeltinin derişimiyle orantılıdır fakat transfer katsayısına bağlı olarak pik yüksekliği daha düşüktür. =0,5 ise, tersinir pik akımının tersinmez pik akımına oranı 1,27 dir. ( 2,99x10 5 )() 21 pi nnacd v (2.6) 16

31 Standart hız sabitinin 10-1 > k 0 > 10-5 cm/s olduğu yarı-tersinir sistemler için akım, hem yük transferi hem de kütle aktarımıyla kontrol edilir. Dönüşümlü voltamogramın şekli, k 0 / D nin bir fonksiyonudur ( = nfv/rt). k 0 / D arttıkça, sistem tersinirliğe yaklaşır. k 0 / D nin, yüksek tarama hızlarındaki küçük değerleri için sistem tersinmez davranış gösterir. Yarı-tersinir sistemlerde, pik potansiyelleri, tersinir sistemlerle karşılaştırıldığında, birbirinden oldukça ayrıdır. Bir reaksiyonun yarı-tersinir olduğunun belirlenmesinde de dönüşümlü voltametri çalışmalarından elde edilen verilerden yararlanılır. Bu amaçla, aşağıdaki kriterler incelenir (Nicholson ve Shain 1964, Greef vd. 1990, Bard ve Faulkner 2001). Yarıtersinir bir sistem için: i p /v 1/2 tarama hızına bağlı değildir. i a p / i k p = 1 dir. ( = 0,5 ise) E k p tarama hızı ile değişir. Bu değişme genellikle tarama hızının artması ile negatif değerlere kayma yönündedir. E k p -E a p farkı düşük tarama hızlarında 59/n e yaklaşır. Yüksek tarama hızlarında bu değerden daha büyüktür ve tarama hızı ile artar. Tarama hızı arttıkça pik genişlemesi olur. 2.3 Bulk elektroliz (BE) Çalışma elektrodunun potansiyelinin sabit tutulup çözeltideki yükseltgenmiş Yük türünün, elektrot yüzeyinde tamamen indirgenerek İnd türüne dönüştüğü ve elektroliz süresince, Yük türünün derişiminin zamanla azalıp sıfıra yaklaştığı elektrokimyasal yöntemdir (Izutsu 2002). Diğer yöntemlerdekinin aksine çalışılan elektrodun yüzey alanının oldukça büyük olduğu bir yöntemdir. Bir saat veya daha fazla zaman alabilir ve bu süre sonunda, elektroaktif türün derişiminin başlangıç derişiminin %1 ine ulaştığında elektrolizin tamamlandığı kabul edilir. Bulk elektroliz, yüzey alanının çözelti hacmine oranının oldukça büyük olduğu, yüksek akımlar ve uzun zaman skalasıyla karakterize edilen (Bard ve Faulkner 2001) ve deney sonunda devreden geçen toplam yük miktarını 17

32 vererek elektrot reaksiyonunda aktarılan elektron sayısının hesaplanmasında kullanılan yöntemdir. 2.4 Kronoamperometri (KA) Kontrollü potansiyel tekniklerinden biri olan kronoamperometri, karıştırılmayan bir çözeltide, çalışma elektrodunun potansiyelini, faradayik bir reaksiyonun gerçekleşmediği bir potansiyelden elektroaktif türün elektrot yüzeyindeki derişiminin neredeyse sıfır olduğu potansiyele kadar basamaklandırmaya dayanır. Kronoamperometri deneyi sonucunda, zamanın bir fonksiyonu olarak akımın ölçüldüğü, akım-zaman grafikleri elde edilir. Bu grafikler aynı zamanda, kütle aktarımı genellikle difüzyon kontrollü olduğu için, elektrot yüzeyinin yakınlarındaki derişim gradientini yansıtır. Akımın zamanla değişimi Cottrell eşitliğiyle (Eşitlik 2.7) verilir: nfacd 12 i= d πt 1212 (2.7) Kronoamperometri genellikle elektroaktif türlerin difüzyon katsayılarının veya çalışma elektrodunun yüzey alanının hesaplanmasında kullanılır. Aynı zamanda, elektrot reaksiyonlarının mekanizmasının belirlenmesiyle ilgili çalışmalarda da kronoamperometri verilerinden yararlanılır (Wang 2000). 2.5 Kronokulometri (KK) Kronokulometri de kronoamperometri gibi potansiyel basamak tekniğidir. Yükün zamana bağlılığını veren grafikler elde edilir (Wang 2000). Genel elektrot reaksiyonunda akım difüzyon kontrollü ise, Cottrell eşitliğiyle ifade edilen akım-zaman ilişkisinin integrali alınarak, toplam yük ile zaman arasındaki ilişki için aşağıdaki eşitlik (Eşitlik 2.8) elde edilir. Qt () 12 2nFAD Ct (2.8) 18

33 Bu eşitlik yardımıyla çizilen Q-t 1/2 grafiklerinin eğiminden, elektrot reaksiyonunda aktarılan elektron sayısı ve difüzyon katsayısı hesaplanabilir (Bard ve Faulkner 2001). Yük ölçümüne dayanan bu teknikten yararlanılarak, elektrot yüzeyine adsorplanan madde miktarı da hesaplanabilir (Wang 2000). Önce, ortamda elektroaktif madde yokken yalnız elektrolitin kronokulometrik Q-t 1/2 eğrisi elde edilerek, Q eksenini t=0 anında kestiği noktadan çift tabakanın yük miktarı (Q dl ) bulunur. Daha sonra elektroaktif maddenin kronokulometrik Q-t 1/2 eğrisi elde edilerek, yine kesim noktasından adsorplanan türle ilgili toplam yük miktarı bulunur. İkisi arasındaki fark alınarak aşağıdaki eşitlik (Eşitlik 2.9) yardımıyla elektrot yüzeyine adsorplanan maddenin mol/cm 2 olarak derişimi ( ) hesaplanır (Anson 1966, Bard and Faulkner 2001): 21 2nFAD tc 21 ( tq ) Qdl nfa (2.9) 21 19

34 3. KAYNAK ARAŞTIRMASI TRD, 2-[3-[4-(3-Klorofenil)-1-piperazinil] propil]-1,2,4-triazolo[4,3-a]piridin-3(2h)- monohidroklorid, sakinleştirici ve antidepresan etkisiyle psikoaktif bir bileşendir. TRD triazolopiridin türevi bir antidepresandır ve yapısında piperazin ve triazol halkası bulundurmaktadır. TRD, anksiyete (endişe, kaygı) ve uyku bozukluğu gibi durumlarda rahatlatıcı olarak kullanılabilir. TRD karaciğerde yaygın şekilde metabolize olur. Alındıktan sonra 24 saat içinde % 70'i idrar, % 30'u safra yolu ile çoğu metabolit şeklinde, % 1'i ise değişmeden tamamen atılır. Çeşitli ilaç örnekleri ve biyolojik sıvılarda bulunan TRD nin tayini için spektrofotometri, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve gaz kromatografisi gibi değişik analitik yöntemler kullanılmıştır. Ancak, daha az maliyetli tekniklerin kullanımına yönelik bir eğilim olduğundan ve organik çözücülerin kullanımı sonucu yüksek ekolojik maliyetlerden dolayı farklı yöntem arayışına gidilmiştir. Modern elektroanalitik teknikler, özellikle de gelişmiş duyarlılık ve seçiciliği ile adsorptif sıyırma voltametrisi (AdSV) birçok organik tür için tercih edilmektedir (Wang 2000). Yüksek analitik duyarlılığı nedeniyle AdSV çeşitli farmasötik ve biyolojik sıvılarda ilaç etken maddelerinin belirlenmesi ve tayininde başarıyla kullanılmaktadır. Literatürlerde TRD nin tayini ile ilgili spektrofotometrik, kromatografik ve voltametrik yöntemler bulunmaktadır. TRD ile ilgili çalışmalar kısaca aşağıda özetlendi. N. El-Enany ve arkadaşları, 2002 yılında TRD nin voltametrik davranışını, doğru akım (DC t ), diferansiyel puls (DPP) ve alternatif akım (AC t ) polarografisi kullanarak incelemişlerdir. TRD nin ph aralığında tersinmez ve difüzyon kontrollü katodik dalgalar verdiğini gözlemlemişlerdir. ph 10'da ise geliştirdikleri yöntemler ile elde ettikleri akım-derişim grafiklerinden doğrusallık aralığını DC t için 4-32 µg ml -1, DPP için 0,8-24 µg ml -1 olarak belirlemişlerdir. Geliştirdikleri DPP tekniği ile idrar ve 20

35 serum örnekleri içerisindeki TRD miktarını herhangi bir ekstraksiyon işlemine gerek duyulmadan belirlemişlerdir. İdrar örneklerindeki geri kazanım sonuçları ± 0.79 iken serum örneklerinde ise ± 0.71 (n=4) olarak verilmiştir. L.J. Nunez-Vergara ve arkadaşları, 1986 yılında TRD nin voltametrik ve kromatografik davranışlarını inceleyen bir çalışma yapmışlardır. Bu çalışmada bir triazolopiridin türevi olan ve antidepresan etkiye sahip olan TRD nin geniş bir tarama hızı aralığında, iki basamakta tersinmez şekilde yükseltgendiğini gözlemlemişlerdir. Voltametrik ve kromatografik yöntemleri karşılaştırmışlar. Her iki yönteminde tablet analizlerine uygulanabilecek kadar duyarlı olduğunu belirtmişler ve analitik amaçlar için kullanıldığında voltametrik yöntemin en büyük avantajının tablet içersindeki TRD yi hızlı tayin edebilmesi olduğunu söylemişlerdir. Kromatografik çalışmalarda; TRD nin yüksek molekül kütlesi ve yapısında bulunan polar sübstitüentlerden dolayı gaz-sıvı kromatografisinde analizi gerçekleştirilmiştir. TRD için alıkonma süresi 6,3 ± 0,1 dakika bulunmuştur (kullanılan kolon: SE-30, kolon sıcaklığı; başlangıç: 200 C o, bitiş: 290 C o, 15 C o /dakika). Bulunan piklerin kararlılığının %99,7 olduğu ve alt tayin sınırının ise bu yöntemle 2, M olarak bulunmuştur. Voltametrik çalışmalarda ise TRD nin elektroyükseltgenme davranışı camsı karbon elektrot (CKE) ve karbon pasta elektrot (KPE) kullanılarak incelenmiştir. TRD, mv.s -1 tarama hızı aralığında, her iki elektrot kullanıldığında da sitrat-fosfat tamponunda (%20 metanol içeren) ph 3,0 de iki basamakta ve tersinmez olarak yükseltgenmiştir. İlk yükseltgenme basamağının çok iyi tanımlanarak nicel analiz yapılmasına olanak verdiğini belirtmişlerdir. Bu yöntemle, alt tayin sınırını 1, M'a kadar indirmenin mümkün olduğu belirtilmiştir. Ortalama geri kazanım CKE için %97,37 (SS 4,37) ve KPE için %99,08 (SS 3,98) olarak belirlenmiştir. K. Harikrishna ve arkadaşları 2006 yılında TRD hidroklorid in saf ve farmasötik örneklerdeki halinin spektrofotometrik olarak tayin edilebilmesi için iki tane basit, hızlı ve duyarlı yöntem geliştirmişler. Bu yöntemler TRD nin bromokresol yeşili (BKY) ve metil oranj (MO) ile yaptığı kompleklere dayanır. BKY nin ph nın 1.50 olduğu KCl HCl tamponunda 415 nm de, MO nun ise ph nın 3,29 olduğu NaOAc HCl tamponunda 422 nm de maksimum absorpsiyon yaptığı gözlenmiştir. Reaksiyonun 21

36 koşulları, maksimum renk yoğunluğunun görüldüğü duruma göre optimize edilmiştir. TRD nin derişiminin artmasıyla birlikte absorpsiyonunda doğrusal olarak arttığı görülmüştür. Doğrusal çalışma aralığı BKY için µg/ml ve MO için 1 20 µg/ml olarak bulunmuştur. Alt tayin sınırı BKY için 16,25 ng/ml iken MO için 24,77 ng/ml dir. Gözlenebilme sınırı ise BKY için 4,88 ng/ml, MO için 7,44 olarak belirlenmiştir. Önerilen yöntemlerin geri kazanım değerleri BKY için %99,38 ±0,84, MO için %99,23 ±0,66 olarak verilmiştir. Gehad G. Mohamed ve arkadaşları, 2006 yılında TRD yi molibden ve tiyosiyanat yardımıyla iyon çifti oluşturarak spektrofotometrik olarak tayin etmişlerdir. Yapılan optimizasyon sonucunda iyon çifti dizilişinin tamamlanabilmesi için 20 dakika, 20 C o de beklenmesi gerektiği görülmüştür. Bu koşullarda yapılan çalışmalar sonucunda maksimum absorpsiyonun 470 nm de gözlendiği belirtilmiştir. Oluşan kompleks metilen klorür ile ekstrakte edilerek TRD, 2-28 µg ml -1 derişim aralığında tayin edilebileceğini belirtmişlerdir. Rajesh ve arkadaşlarının 2009 yılında TRD nin elektrokimyasal davranışını, çok-duvarlı karbon nanotüp (MWCNTs) çalışma elektrodu üzerinde dönüşümlü voltametri yöntemiyle incelemişlerdir. TRD nin 0,79 V ve 1,10 V'da olmak üzere iki yükseltgenme pikinin olduğunu ve karbon nanotüplerin katalitik etkisiyle TRD ye ait bu piklerin akımlarının arttığını ve elektrot yüzeyine adsorbe olduğunu gözlemlemişlerdir. TRD nin ph 7,0'de diferansiyel puls voltametrisiyle 0,2-10 µm derişim aralığında tayin edilebileceğini ve gözlenebilme sınırının ise 24 nm olduğunu belirtmişlerdir. Bu elektrot ile önerilen yöntem, farmasötik örneklere başarıyla uygulanmıştır. L. Mercolini ve arkadaşları, 2008 yılında plazma içerisindeki TRD nin ve ana metaboliti olan 3-(1-klorofenil) piperazin in (m-cpp) yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemi ile hızlı ve uygun tayininin geliştirilmesini hedeflemişlerdir. TRD nin ikinci nesil bir antidepresan olduğu ve seratonin karşıtı etkisinin olduğu belirtilmiştir. TRD nin metabolitinin bu ilaçla yapılan tedavinin yan etkisiyle ilgili olduğu bu nedenle metabolitin tayininin tedavinin takibi açısından önemli olduğu 22

37 belirtilmiştir. Ayırmanın C8 ters faz kolonu kullanılarak yapıldığı ve hareketli fazın trietilen amin içeren fosfat tamponu (ph 3.5) (%70) ve asetonitril (%30) karışımı olduğu belirtilmiştir. UV dedktörü 255 nm ye ayarlanmış ve iç standart olarak loksapin kullanılmıştır. Plazma örneklerine uygulanan orjinal ön işlem prosedürü C8 ters faz kartuşları ile yapılan katı-faz ekstraksiyonuna dayalı olarak geliştirilmiştir (50 mg, 1 ml). Elde edilen ekstraksiyon ürünlerinin değerlerinin %90 arttığı ve kesinliğin BSS ile ifade edilirse % 5.6 düştüğü görülmüştür. Önerilen yöntemin TRD tedavisi gören hastalardan alınan plazma örneklerine başarıyla uygulandığı ve geri kazanımların %91 in üzerinde olduğu söylenmiştir. Gehad G. Mohamed ve arkadaşları, 2007 yılında saf halde ve çeşitli farmasötik örnekler içindeki trazodon (TRD), amineptin (APH) ve amitriptilin (ATPH) hidroklorürler gibi trisiklik antidepresanların tayini için basit ve hızlı bir spektrofotometrik yöntem geliştirmeyi hedeflemişlerdir. Spektrofotometrik tayin için elektron vericiler olan TRD, APH ve ATHP ve elektron alıcı olan farmasötik örnekler arasındaki yük transfer (CT) reaksiyonundan faydalanılmıştır. Yük transferi için gerekli olan optimum deney koşulları, zaman, sıcaklık, stokiyometri ve çözücüler belirlenmiştir. Bu yöntem TRD, APH ve ATHP'nin sırasıyla , ve µg ml -1 derişim aralığında tayinini mümkün kılmaktadır. Duyarlılık TRD, APH ve ATHP için sırasıyla 0.090, and g cm 2 olarak bulunmuştur. TRD, APH ve ATHP için standart sapma değerleri sırasıyla , , olarak ve BSS değerleri ise , , olarak bulunmuştur. İlgili standart sapmaların düşük olması yöntemin yüksek kesinliğini ve duyarlılığını gösterir. Ortalama geri kazanım değerleri TRD, APH ve ATHP için sırasıyla % , % , % olarak verilmiştir (korelasyon katsayısılarının yüksek olduğu belirtilmiştir). Geliştirilen yöntemin çeşitli ilaç dozaj formlarına uygulanabileceği belirtilmiştir. S. Carda-Broch ve arkadaşları, 2007 yılında farmasötik preperatlarda ve idrardaki TRD nin basit ve güvenilir sıvı kromatografik yöntemle florimetrik dedektör kullanılarak tayini için bir yöntem geliştirmeyi hedeflemişlerdir.bc18 kolonu ve sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 1-bütanol'un miseller hareketli fazı kullanılmıştır. 23

38 Seçilen hareketli faz; 0.2 M SDS ve %8 1-bütanol'un ph 3,0 olan fosfat tamponundaki karışımıdır. Toplam analiz süresi 10 dakikadır. Bu yöntemin en büyük avantajlarından bir tanesi idrar örnekleri için herhangi bir ekstraksiyon işlemine ihtiyaç duyulmamasıdır. Alt tayin sınırı biyolojik sıvılar için 9.5 ng/ml olarak bulunmuştur. Farmasötik örneklerden yapılan geri kazanımların yüksek yüzdelerde olduğu belirtilmiştir. Kalibrasyon grafiğinin tekrarlanabilirliği idrar ortamında µg/ml aralığında incelenmiştir. İdrar örneklerinden yapılan geri kazanımların iyi olduğu belirtilmiştir. D. Dogrukol-Ak ve arkadaşları 1999 yılında durgun veya dönen platin elektrot kullanarak TRD nin voltametrik davranışlarını ve DP dönen elektrotlar ile tablet içindeki TRD nin tayinini incelemişlerdir. Çalışmalar 0,2 M KCl ve 0,2 M asetat veya fosfat tamponu içeren destek elektrolit ortamında yapılmıştır mv da adsorpsiyon gözlenmemiştir. Voltametrik akımı etkileyen faktör difüzyonel olup durgun koşullarda dönme için rpm ve 2 10 mv potansiyel aralığındadır. Elde edilen akıma dönme koşullarında rpm aralığında, durgun koşullarda ise 2-10 mv potansiyel aralığında difüzyon etki etmektedir. Çalışma aralığı 1, , M olarak bulunmuştur. Gözlenebilme sınırı durgun elektrot kullanıldığında 2, M (s b = 5,03; n=5), dönen elektrot kullanıldığında ise 1, M (s b = 2,12; n=5) olarak bulunmuştur. Yapılan istatistik hesaplamalar sonucunda %95 güven seviyesinde kabul edilebilir sonuçlar elde edilmiştir. 24

39 4. MATERYAL VE YÖNTEM 4.1 Kullanılan Kimyasal Maddeler Kullanılan kimyasal maddeler, temin edildikleri firma ve saflık dereceleri belirtilerek, Çizelge 4.1 de alfabetik sırayla verildi. Deneylerimizde kullanılan TRD hammaddesi Sigma Aldrich ve Çınay Kimya San. ve Tic. A.Ş. tarafından temin edildi. Çizelge 4.1 Kullanılan kimyasal maddeler, temin edildikleri firma ve saflık dereceleri Kullanılan Kimyasal Maddeler Temin Edildiği Firma Saflık Argon gazı Oksan Koll.ŞTİ. 99,99% Asetik asit Merck 99,50% Azot gazı Oksan Koll.ŞTİ. 99,99% Borik asit Merck 99,50% Fosforik asit Pancreac 85% Hidroklorik asit Pancreac 37% Sodyum hidroksit Merck Yüksek saflıkta Trazodon hidroklorür Sigma < 99% HPLC 4.2 Kullanılan Elektrokimyasal Ölçme Sistemleri ve Yazılımlar TRD nin elektrokimyasal davranışlarının incelendiği çalışmalar Electrochemical Analyzer BAS 100B marka elektrokimyasal çalışma sistemi kullanılarak yapıldı. Bu elektrokimyasal sisteme BAS C3 elektrot hücre standı (Şekil 4.1) bağlanarak tüm deneyler bu hücrelerde gerçekleştirildi. Uygulanan teknikleri otomatik olarak gerçekleştirmek ve bilgisayar kontrollü olan bu elektrokimyasal ölçme sisteminden elde edilen verileri değerlendirmek için ana üniteye bağlı bilgisayar sistemindeki BAS 100W yazılımından yararlanıldı. 25

40 Şekil 4.1 Çalışmanın yapıldığı BAS C3 elektrot hücre standı Elektrokimyasal sistemde, deneye başlamadan önce hazırlanan çözeltilerden gaz geçirilmesi ve çözeltilerin karıştırılması otomatik olarak yapılabilmektedir. Uygun görülen deney parametreleri sisteme girilip onaylandıktan sonra deney tamamlandığında deney verileri, grafik olarak elde edilebilmekte ve grafikler, daha önce elde grafiklerle üst üste çakıştırılarak karşılaştırılabilmektedir. Ayrıca, kullanılan yazılımlar, gerektiğinde deney verilerinin kopyalanarak başka bilgisayarlara aktarılıp Microsoft Excel, PowerPoint, Paint gibi programlardan yararlanma olanağı sağlamaktadır. 4.3 Kullanılan Elektrotlar Deneylerde, çalışma elektrodu olarak camsı karbon mikroelektrot (GC; BAS MF- 2012), karşıt elektrot olarak 0,5 mm çapında Pt tel (BAS MW 1032) yararlanıldı. Sulu ortamda gerçekleştirilen elektrokimyasal çalışmalarda, Ag/AgCl referans elektrodu (BAS MF 2052 RE-5B) kullanıldı. Sabit potansiyelli kulometrik çalışmalarda BAS MF-1056 bulk elektroliz hücresine (Şekil 4.2) ait kafes görünümlü gözenekli karbon elektrot (BAS MF-2077) kullanıldı. Sabit potansiyelli kulometrik çalışmalarda da karşıt elektrot olarak helezon şeklinde sarılmış 23 cm uzunluğunda, 0,5 mm çapında Pt telden (BAS MW-1033) yararlanıldı. 26

41 Çalışmada kullanılan sulu ortam Ag/AgCl referans elektrodu, kullanılmadığı zaman 3,0 M NaCl çözeltisinde saklandı. Şekil 4.2 Bioanalytical Systems (BAS) Electrochemical Analyzer BAS 100B cihazına ait sabit potansiyelli kulometri çalışmaları için bulk elektroliz hücresi 4.4 Kullanılan Diğer Cihaz ve Malzemeler Ortamdaki oksijeni uzaklaştırmak amacıyla yüksek saflıktaki argon veya azot gazı kullanıldı. Kullanılan elektrotların yüzeylerini temizlemek amacıyla elektrot temizleme kitinden (BAS MF-2060) yararlanıldı. Sulu ortam çalışmalarında, ortamın ph sını ölçmek için Orion kombine cam ph elektrodu (912600) ve onun bağlı bulunduğu Thermo Orion Model 720A ph-iyon metre kullanıldı. ph-iyonmetre, potasyum hidrojen ftalattan ve sodyum bikarbonattan hazırlanan ve ph ları sırasıyla 4,13 ve 8,20 olan tampon çözeltilerle 25 C de kalibre edildi. Çözeltileri karıştırmak için Chiltern MS21S Model magnetik karıştırıcı kullanıldı. Sulu çözeltiler, GFL 2104 marka saf su cihazından elde edilen bidestile su ile hazırlandı ve tartımlar GEC AVERY marka, 0,1 mg duyarlılıkla tartım yapan elektronik 27

42 terazi ile yapıldı. Karıştırma ve çözme işlemleri Ultrasonic LC30H marka Ultrasonik banyoda yapıldı. Spektrofotometrik çalışmalarda PG Instruments Ltd firmasının T80+ UV/VIS Spectofotometer Model UV spektrofotometrisi kullanıldı. 4.5 Camsı Karbon Elektrodun Temizlenmesi Elektrokimyasal çalışmalarda kullanılan çalışma elektrotlarının yüzeylerinin son derece temiz olması gerekmektedir. Bu nedenle, her bir maddeyle ilgili yeni bir elektrokimyasal çalışmaya başlamadan önce kullanılacak elektrotlar, Bölüm 3.3 te belirtilen temizleme kitinden (BAS MF-2060) yararlanılarak temizlendi. Bu temizleme kitlerinde 1, 3 ve 15 m boyutlarındaki alüminadan hazırlanmış yüzey temizleme süspansiyonları ve üzerinde dairesel hareketler çizilerek temizleme yapılmasını sağlayan yüzey temizleme petleri bulunmaktadır. Elektrotları temizlemeye başlamadan önce, uygun temizleme pedi seçilerek, kullanılacak kısmı az miktarda saf suyla ıslatıldı. Üzerine yüzey temizleme süspansiyonundan veya su ile karıştrılarak elde edilmiş alüminyum oksit (alümina, Al 2 O 3, 0.05 m) süspansiyonundan birkaç damla damlatılarak dairesel hareketlerle elektrot yüzeyi temizlendi. Elektrot yüzeyinde kalması muhtemel parçalar bidistile su ile yıkanarak uzaklaştırıldıktan sonra uygun bir kurutma kağıdı ile kurulandı. Yüzeyi temizlenen elektrot belirli aralıklarla destek elektrolit çözeltisine daldırılarak ultrasonik banyoda bir süre tutuldu ve böylece kullanıma hazır hale getirildi. CKE her voltamogram kaydından önce mekanik olarak temizlendi. 4.6 Kullanılan Çözeltiler ve Hazırlanması Destek elektrolit stok çözeltilerinin hazırlanması Sulu ortam çalışmalarında, ph 1,81 11,98 arasında kullanılabilen Britton-Robinson (BR) tamponu destek elektrolit ortamı olarak kullanıldı. Bu tampon hazırlanırken 2,29 ml asetik asit, 2,69 ml % 85 lik fosforik asit ve 2,472 g borik asit karıştırılıp bidistile 28

43 su ile hacmi litreye tamamlandı. Hazırlanan BR tamponuna uygun hacimlerde 1 M NaOH ilave edilerek istenilen ph a sahip çözeltiler elde edildi Standart TRD çözeltilerinin hazırlanması Çalışmalarda kullanılan TRD çözeltilerinin hazırlanması amacıyla öncelikle standart maddeden uygun miktarda tartıldı ve tartılan madde bidistile su ile belirli bir hacime tamamlanarak çözüldü. Bunun sonucunda 1, M stok çözelti elde edildi. Hazırlanan bu çözeltiden uygun miktarlar alınarak hacmi Bölüm de belirtilen destek elektrolit BR tamponuyla 25 ml'ye tamamlandı ve çeşitli derişimlerde stok çözeltiler elde edildi Farmasötik örneklerin ve biyolojik sıvıların hazırlanması Farmasötik örnek olarak kullanılan Desyrel tabletler Çınay Kimya tarafından üretilmiştir ve her tablette 50 mg TRD bulunduğu belirtilmiştir. Tablet çözeltileri hazırlanırken 5 tabletin kütlesi hassas bir şekilde belirlendikten sonra ortalama tablet kütlesi hesaplandı. 5 adet tablet porselen havanda ezilerek homojen toz haline getirildi. Bir tabletin ortalama kütlesine eşdeğer miktarda toz örnek ölçülü bir balona alınarak üzerine 100 ml bidistile su ilave edildi. Ölçülü balon 1,5 saat boyunca ultrasonik banyoda tutuldu ve TRD nin tamamen çözünmesi sağlandı. Daha sonra bu karışıma santrifüj işlemi yapıldı ve çökelek ile çözeltinin ayrılması sağlandı. Çözelti kısmı ölçülü bir balona aktarıldı ve hacmi bidistile su ile 100 ml ye tamamlandı. Elde edilen bu çözelti Desyrel stok çözeltidir. Bu çözeltiden 2 ml alınarak BR tamponu ile 500 ml ye tamamlandı ve bu çözeltiden elektrokimyasal hücreye değişik miktarlarda aktarılarak çalışma çözeltileri oluşturuldu. TRD, alındıktan sonra 24 saat içinde % 70'i idrar, % 30'u safra yolu ile çoğu metabolit şeklinde, % 1'i ise değişmeden tamamen atıldığı bilenen bir maddedir. Bu nedenle TRD'nin idrar örneklerinden geri kazanımı yapılmadı, biyolojik sıvı olarak sadece serum kullanıldı. Serum çözeltilerinin hazırlanmasında ise, sağlıklı ve TRD 29

44 kullanmayan insanlardan temin edilen serum örnekleri kullanıldı. Bu örnekler üzerine belirli oranlarda (1:1) asetonitril ilave edilerek serum proteinleri çöktürüldü ve çöken proteinler santrifüj yardımıyla ayrıldı. Proteinleri çöktürülüp ayrılan serum örneğinden 1 ml alındı ve içerisinde 9 ml tamponlanmış (ph 7,0) BR çözeltisi bulunan hücreye eklenerek serum çözeltisi hazırlandı. Bu çözeltiye farklı miktarda tablet çözeltisinden ilaveler yapılarak elektrokimyasal ölçümler yapıldı Sabit potansiyelli kulometri (BE) çalışmasında kullanılan çözeltilerin hazırlanması Bulk elektroliz deneylerinde kullanmak üzere ph 7,0 olan Britton-Robinson tamponunda 1, M TRD çözeltisi hazırlandı ve bulk elektroliz yapıldı. 4.7 Elektrokimyasal Deneylerin ve Ölçümlerin Yapılışı Elektrokimyasal deneyler Şekil 4.1 de gösterilen BAS C3 elektrot hücre standında, 20 ml lik hücreler kullanılarak yapıldı. Hücrelere belli hacimlerde tampon çözeltisi veya serum içeren tampon çözeltisi konuldu ve deneyde kullanılacak çalışma elektrodu, referans elektrot ve karşıt elektrot yerleştirilerek üçlü elektrot sistemi oluşturuldu. Çalışma elektrotu olarak camsı karbon elektrot (CKE), referans elektrot olarak Ag/AgCl elektrot, karşıt elektrot olarak platin tel kullanıldı. Çözeltiden çalışma başlangıcında 10 dakika, ölçüm aralarında 30 sn argon veya azot gazı geçirilerek ortamdan oksijenin uzaklaşması sağlandı. Herhangi bir TRD ilavesi olmadan tanık ortam olarak elektrokimyasal ölçümler alınıp zemin sinyali olarak kaydedildi. Bu ölçümlerde çalışmanın yapılacağı potansiyel penceresi belirlendi ve daha sonra değişen miktarlarda standart veya tablet çözeltilerinden ilaveler yapılarak belirlenen potansiyel değerleri arasında elektrokimyasal ölçümler alındı. Bulk elektroliz çalışmalarında 1, M TRD içeren 75 ml çözelti bulk elektroliz hücresine yerleştirildi. Yaklaşık 1,0 saat karıştırıldı ve argon gazı geçirildi. Bulk elektroliz yapılmadan önce söz konusu çözeltiden elektrokimyasal ölçümler alınarak 30

45 kaydedildi. Bulk elektroliz potansiyeli pik potansiyelinden yaklaşık 100 mv daha yüksek tutularak, karıştırılarak bulk elektroliz yapıldı. Sistemden geçen akım ilk akımıın %1 i değerine düştüğünde bulk elektroliz sonlandırıldı. Sonlanan bulk elektroliz çözeltisi kullanılarak başlangıçta olduğu gibi tekrar elektrokimyasal ölçümler yapıldı ve bulk elektroliz ile pik akımında ve pik potansiyelinde meydana gelen değişmeler kaydedildi. 31

46 5. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Bu çalışmada, bir triazolopridin türevi olan ve antidepresan olarak kullanılan TRD nin (Şekil 5.1) voltametrik yöntemlerle elektrokimyasal yükseltgenme davranışı incelendikten sonra hem tabletlerde hem de biyolojik örneklerde analizinin gerçekleştirilmesi ve olası reaksiyon mekanizmasının bulunması hedeflendi. Bu amaçla, molekül yapısında yükseltgenme tepkimeleri için elverişli fonksiyonel grupların bulunmasından yola çıkılarak voltametrik yöntemlerle elektrokimyasal yükseltgenme davranışları, CKE yüzeyinde incelendi. CKE, mükemmel mekanik ve elektriksel özellikleri, geniş potansiyel aralığı, kimyasal olarak inert olması ve gazlar için geçirmezlik özelliği göstermesinden dolayı yaygın olarak kullanılır (Uslu ve arkadaşları, 2006). Ayrıca katı elektrotlar, cıva elektrotların aksine yükseltgenme tepkimelerinin incelenmesini mümkün kılar. Bu nedenle, çalışma elektrodu olarak CKE seçildi. Şekil 5.1 TRD nin kimyasal yapısı İlk olarak TRD nin dönüşümlü voltametri yöntemi ile elektrokimyasal davranışı incelendi. Daha sonra diferansiyel puls anodik adsorptif sıyırma voltametri (DPAAdSV), doğrusal taramalı anodik adsorptif sıyırma voltametri (DTAAdSV) ve kare dalga anodik adsorptif sıyırma voltametri (KDAAdSV) yöntemleri ile tayini için optimum deneysel koşulları (ph, biriktirme potansiyeli, biriktirme süresi) belirlenmesi için çalışmalar yapıldı. Bu yöntemlerin geçerliliği için TRD içeren ticari tabletlerden geri kazanım çalışmaları yapıldı. Ayrıca geliştirilen yöntemlerin sonuçların UV 32