ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ EZETİMİB İN ELEKTROKİMYASAL DAVRANIŞI VE ADSORPTİF SIYIRMA YÖNTEMLERİYLE TAYİNİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ EZETİMİB İN ELEKTROKİMYASAL DAVRANIŞI VE ADSORPTİF SIYIRMA YÖNTEMLERİYLE TAYİNİ Dilek Şura ÖZDEN KİMYA ANABİLİM DALI ANKARA 2011 Her Hakkı Saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi EZETİMİB İN ELEKTROKİMYASAL DAVRANIŞI VE ADSORPTİF SIYIRMA YÖNTEMLERİYLE TAYİNİ Dilek Şura ÖZDEN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Zehra DURMUŞ Bu çalışmada, ince bağırsakta kolesterol absorbsiyonunu seçici olarak engelleyen ve plazmadaki LDL kolesterolünü düşürerek kolesterol tedavisi için kullanılan ezetimib (EZE) in camsı karbon yüzeyindeki elektrokimyasal davranışı; dönüşümlü voltametri (DV), kare-dalga voltametrisi (KDV) ve sabit potansiyelli kulometri yöntemleri ile Britton-Robinson (BR) tamponu ortamında incelenmiştir. Ezetimib in, adsorpsiyon ve difüzyon özellikleri incelenerek elektrot tepkimesinde aktarılan elektron sayısı, difüzyon katsayısı, yük transfer katsayısı gibi bazı elektrokimyasal parametreleri hesaplanmıştır. Buna ilaveten ezetimib in farmasötik örnekler ve biyolojik sıvılarda tayini için diferansiyel puls anodik adsorptif sıyırma voltametrisi (DPAAdSV) ve kare dalga anodik adsorptif sıyırma voltametrisi (KDAAdSV) yöntemleri geliştirilmiştir. Geliştirilen yöntemlerin validasyonu yapılmıştır. Doğrusal çalışma aralığı DPAAdSV yöntemi için 4, M - 7, M iken; KDAAdSV yöntemi için ise 4, M - 6, M olarak hesaplanmıştır. Yapılan kalibrasyon çalışmalarının analitik parametreleri en küçük kareler yöntemi ile değerlendirilmiştir ve her iki yöntem için gözlenebilme sınırı ve alt tayin sınırı değerleri belirlenmiştir. Farmasötik örnekler ve biyolojik ortamlarda uygulanan bu yöntemlerle, güvenilir, tekrarlanabilir, yüksek doğruluk ve kesinliğe sahip sonuçlar elde edilmiştir. Geliştirilen yöntemler istatistiksel olarak değerlendirilmiş ve kesinlik, duyarlık, seçicilik gibi parametreler incelenerek % 95 güven seviyesinde elde edilen sonuçlar arasında anlamlı bir fark olmadığı görülmüştür. Mart 2012, 76 sayfa Anahtar Kelimeler: Ezetimib, voltametri, elektrokimyasal davranış, adsorptif sıyırma voltametrisi, yöntem validasyonu. i

3 ABSTRACT Master Thesis ELECTROCHEMICAL BEHAVIOURS OF EZETIMIBE AND ITS DETERMINATION WITH ADSORPTIVE STRIPPING METHODS Dilek Şura ÖZDEN Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Zehra DURMUŞ In this study, electrochemical behaviour of ezetimibe (EZE) used for treatment of cholesterol by lowering LDL cholesterol in plasma and selectively blocking the adsorption of cholesterol in the small intestine was investigated on glassy carbon electrode by using cyclic voltammetry (CV), square-wave voltammetry (SWV) and constant potential bulk electrolysis (BE) in Britton-Robinson (BR) buffer. Adsorption and diffusion properties of EZE were investigated. Some electrochemical parameters such as diffusion coefficient, number of transferred electron in electrochemical step, charge transfer coefficient were calculated. Moreover, differential pulse anodic adsorptive stripping voltammetric (DPAAdSV) and square-wave anodic adsorptive stripping voltammetric (SWAAdSV) methods were developed to its direct determination in pharmaceutical preparations and biological samples including human serum and human urine. Developed methods for the determination of EZE was validated. Linear working concentration range for DPAAdSV method was evaluated between 4, M - 7, M and for SWAAdSV was evaluated between 4, M - 6, M. Limit of quantification and detection for these developed methods were calculated from analytical parameters of calibration studies by using least squared method. Results of these applied methods were found to have accuracy, precision, reproducible and high confidence. Developed methods were evaluated statistically and some parameters were examined such as presicion, selectivity, sensitivity. Obtained results were found to be insignificant at 95 % confidence level. March 2012, 76 pages Key Words: Ezetimibe, voltammetry, electrochemical behaviour, adsorptive stripping voltammetry, method validation. ii

4 TEŞEKKÜR Tez çalışmamın her aşamasında, bilgi ve deneyimleriyle bana her konuda ışık tutan, motivasyonumu sağlayan ve hoşgörüsünü esirgemeyen danışmanım Ankara Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Anabilim Dalı Öğretim Üyesi sayın Prof. Dr. Zehra DURMUŞ a, Çalışmalarım sırasında bilgi birikimi ve deneyimleri ile yardımlarını esirgemeyen Ankara Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Anabilim Dalı Öğretim Üyesi sayın Prof. Dr. Esma KILIÇ a, Çalıştığım ilaç etken maddesinin temin edilmesini sağlayan Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı Öğretim Üyesi sayın Prof. Dr. Erdal DİNÇ e, araştırmalarım sırasında, deneylerime tecrübesi ile katkıda bulunan Amasya Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Yard. Doç. Dr. İbrahim H. TAŞDEMİR e, Arş. Gör. Dr. Ayça DEMİREL ÖZEL e, Arş. Gör. Ceren KAÇAR a ve Arş. Gör. Dilek ESKİKÖY e, Analitik Kimya Anabilim Dalı ndaki değerli hocalarıma ve arkadaşlarıma, Hayatımın her döneminde manevi desteğini, sabrını, hoşgörüsünü ve anlayışını esirgemeyen canım annem ve sevgili abim Hasan Niyazi ÖZDEN e teşekkür ederim. Dilek Şura ÖZDEN Ankara, Mart 2012 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET.i ABSTRACT.ii TEŞEKKÜR iii SİMGELER DİZİNİ...vii ŞEKİLLER DİZİNİ....ix ÇİZELGELER DİZİNİ... xii 1. GİRİŞ 1 2. KURAMSAL TEMELLER Ezetimib Kimyasal ve fiziksel özellikleri Farmakolojik özellikleri Farmakokinetik özellikleri İlaç Analiz Yöntemleri Elektroanalitik yöntemler Dönüşümlü voltametri (DV) Diferansiyel puls voltametrisi (DPV) Kare-dalga voltametrisi (KDV) Sıyırma voltametrisi (SV) Bulk Elektroliz (BE) Kronoamperometri (KA) Kronokulometri (KK) KAYNAK ARAŞTIRMASI MATERYAL VE YÖNTEM Tez Çalışmasında KullanılanMateryaller Kimyasal maddeler Kullanılan cihazlar ve elektrotlar Kullanılan çözeltiler ve hazırlanışı Standart EZE çözeltileri Destek elektrolit çözeltileri Farmasötik ve biyolojik örneklerin analize hazırlanışı...29 iv

6 Bulk Elektroliz (BE) çalışmasında kullanılan çözeltilerin hazırlanması Elektrokimyasal Deneylerin Yapılışı ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA EZE nin Elektrokimyasal Davranışı EZE nin adsorpsiyon özelliği ph nın pik akımına ve pik potansiyeline etkisi Aktarılan elektron sayısının bulunması Difüzyon ve yüzey kaplama katsayısının bulunması Önerilen olası reaksiyon mekanizması EZE Tayini için Voltametrik Yöntem Geliştirme Cihaz parametrelerinin optimizasyonu Yöntem parametrelerinin optimizasyonu Biriktirme potansiyeli ve biriktirme süresi optimizasyonu Elektroanalitik Yöntemlerin Uygulamaları Kalibrasyon grafiği ve doğrusal çalışma aralığının belirlenmesi Geliştirilen yöntemlerin farmasötik ve biyolojik örneklerde uygulamaları Elektroanalitik Yöntemlerin Validasyonu Doğrusal çalışma aralığı Doğruluk Tekrarlanabilirlik Aynı çözelti (gün içi) için pikin tekrarlanabilirliği Farklı çözeltiler (günler arası) için pikin tekrarlanabilirliği Kesinlik Duyarlılık Seçicilik Gözlenebilme sınırı Alt tayin sınırı Sağlamlık...67 v

7 5.5 Farklı Yöntem Sonuçlarının ve Parametrelerinin İstatistiksel Olarak Karşılaştırılması SONUÇ...71 KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ...76 vi

8 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ A Elektrodun yüzey alanı, cm 2 BE Bulk elektroliz, sabit potansiyelli kulometri BP Biriktirme potansiyeli BR Britton-Robinson tamponu C Ana çözeltideki elektroaktif maddenin analitik derişimi, mol/cm 3 CV Dönüşümlü voltametri D Difüzyon katsayısı, cm 2 /s DPAdSV Diferansiyel puls adsorptif sıyırma voltametrisi DPV Diferansiyel puls voltametrisi E Uygulanan potansiyel, V EZE Ezetimib E 0 E p a E p k E p Standart potansiyel, V Pik potansiyeli, V Anodik pik potansiyeli Katodik pik potansiyeli F Faraday sabiti, C/mol e - ƒ Uyarma sinyalinin frekansı, 1/s HOAc Asetik asit i d İnd i p a i p k i p KDAdSV KDV KH k n s b s m Difüzyon akımı, A İndirgenmiş tür Pik akımı, A Anodik pik akımı, A Katodik pik akımı, A Kare-dalga adsorptif sıyırma voltametrisi Kare-dalga voltametrisi Karıştırma hızı, tur/s Heterojen reaksiyon hız sabiti, cm/s Aktarılan elektron sayısı Birleşik standart sapma Eğimin standart sapması vii

9 T Mutlak sıcaklık, K t Zaman, s UV Ultra Viyole YBSK Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi Yük Yükseltgenmiş tür Γ Elektrot yüzeyine adsorbe olan madde miktarı, mol/ cm 2 ΔE a Puls genliği, V ΔE i Kare-dalga voltametrisinde uyarma sinyalinin basamak yüksekliği ΔE p Pik potansiyelleri arasındaki fark, V ΔI Net akım, A ΔI puls Puls voltametrilerinde ölçülen akımların farkı, A Π Pi sayısı, 22/7 v Tarama hızı, V/s, mv/s viii

10 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Şekil 2.2 Şekil 2.3 Şekil 2.4 Şekil 2.5 Şekil 2.6 Şekil 4.1 Şekil 5.1 Şekil 5.2 Şekil 5.3 Şekil 5.4 Şekil 5.5 Şekil 5.6 Şekil 5.7 Şekil 5.8 Şekil 5.9 EZE molekülünün kimyasal yapısı...3 Elektroanalitik yöntemlerin sınıflandırılması...6 Dönüşümlü voltametri için uyarma sinyali ve voltamogramı...7 Diferansiyel puls voltametrisinde puls tipi uyarma sinyalinin dalga şekli.12 Kare-dalga voltametride puls tipi uyarma sinyali..13 Sıyırma tekniklerinde potansiyel-zaman profili ve akım potansiyel eğrileri.16 Elektrokimyasal çalışmalarda kullanılan elektrotlar, çalışma ünitesi ve Standı..27 EZE nin molekül yapısı...32 Farklı derişimlerde EZE nin, BR ortamında, CKE de elde edilen dönüşümlü voltamogramları (: 0,100 V/s, ph: 10,0)..33 0,5 mm EZE nin, BR ortamında (ph:10,0) CKE yüzeyinde farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogramları: iç grafik, anodik pik potansiyelinin tarama hızının logaritması ile değişimi ,5 mm EZE nin BR ortamında CKE yüzeyinde farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogramlarından elde edilen log i p -log v grafiği (ph:10,0)..36 0,5 mm EZE nin BR de, CKE yüzeyinde 5 ardışık döngü ile alınan dönüşümlü voltamogramları (: 0,100 V/s, ph: 10,0)..37 0,5 mm EZE içeren çözeltilerin farklı ph değerlerinde alınan kare dalga voltamogramları: iç grafik, pik potansiyelinin ph ile değişimi..39 EZE nin olası reaksiyon mekanizması..43 DPAAdSV yöntemi ile elde edilen pik akımlarının pik potansiyeli ile Değişimi..45 KDAAdSV yöntemi ile elde edilen pik akımlarının pik potansiyeli ile Değişimi..45 ix

11 Şekil 5.10 DPAAdSV yöntemi ile elde edilen pik akımlarının biriktirme süresi ile değişimi (KH: 600 rpm, E bir : 400 mv) 46 Şekil 5.11 KDAAdSV yöntemi ile elde edilen pik akımlarının biriktirme süresi ile değişimi (KH: 600 rpm, Ebir: 400 mv).47 Şekil 5.12 EZE nin diferansiyel puls anodik adsorptif sıyırma voltamogramları (iç grafik: pik akımının EZE derişimi ile değişimi, ph: 10,0; E bir : 400 mv, t bir :45 s) 48 Şekil 5.13 EZE nin kare-dalga anodik adsorptif sıyırma voltamogramları (iç grafik: pik akımının EZE derişimi ile değişimi, ph:10,0; E bir : 400 mv; t bir : 45 s).49 Şekil 5.14 EZE tayini için standart katma yöntemi ile elde edilen diferansiyel puls anodik adsorptif sıyırma voltamogramları (iç grafik: EZE tayini için standart katma kalibrasyon grafikleri; ph: 10,0; E bir : 400 mv; t bir : 45 s).50 Şekil 5.15 EZE tayini için standart katma yöntemi ile elde edilen kare-dalga anodik adsorptif sıyırma voltamogramları (iç grafik: EZE tayini için standart katma kalibrasyon grafikleri; CKE; ph: 10,0; E bir : 400 mv; t bir : 45 s).50 Şekil 5.16 DPAAdSV ve KDAAdSV yöntemleri ile EZE içeren Ezetec tablet çözeltilerinin derişimle değişen pik akımları ve voltamogramları (ph:10,0;cke; E bir : 400 mv; t bir : 45s) Şekil 5.17 (a) Proteini çöktürülmemiş serum numunesine EZE eklenen ve daha sonra proteini çöktürülen örnek, (b) proteini çöktürülmüş serum numunesine EZE eklenen serum örneğinin DPAAdSV voltamogramı (C EZE : 2, M; ph: 10,0; CKE; E bir : 400 mv; t bir : 45 s)...54 Şekil 5.18 (a) Proteini çöktürülmemiş serum numunesine EZE eklenen ve daha sonra proteini çöktürülen örnek, (b) proteini çöktürülmüş serum numunesine EZE eklenen serum örneğinin KDAAdSV voltamogramı (C EZE : 2, M; ph:10,0; CKE; E bir : 400 mv; t bir : 45 s)...54 Şekil 5.19 EZE ve Ezetec tabletini içeren idrar çözeltilerinin derişimle değişen pik akımlarının diferansiyel puls anodik adsorptif voltamogramları (ph: 10,0;CKE; E bir : 400 mv; t bir : 45 s) x

12 Şekil 5.20 DPAAdSV yöntemi için aynı günde yapılan ardışık ölçümlere ait voltamogramlar (E bir : 400 mv; t bir : 45 s, ph: 10,0; C EZE : M)..63 Şekil 5.21 KDAAdSV yöntemi için aynı günde yapılan ardışık ölçümlere ait voltamogramlar (E bir : 400 mv; t bir : 45 s, ph: 10,0; C EZE : M)...63 Şekil 5.22 DPAAdSV yöntemi için farklı günlerde yapılan ardışık ölçümlerin voltamogramları (E bir : 400 mv; t bir : 45 s; ph: 10,0; C EZE : M)...64 Şekil 5.23 KDAAdSV yöntemi ile farklı günlerde yapılan ardışık voltamogramları (E bir : 400 mv; t bir : 45 s; ph: 10,0; C EZE : M)...65 xi

13 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 4.1 Kullanılan kimyasal maddeler 26 Çizelge 5.1 0,5 mm EZE çözeltisinin bazı pik parametrelerinin tarama hızı ile değişimi (DV, CKE).. 35 Çizelge 5.2 0,5 mm EZE nin çeşitli tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltamogramlarından hesaplanan difüzyon katsayıları ve yüzey kaplama katsayıları...42 Çizelge 5.3 Voltametrik sıyırma yöntemleri için belirlenen optimum cihaz Parametreleri..44 Çizelge 5.4 Voltamerik sıyırma yöntemleri için optimize edilen yöntem parametreleri...48 Çizelge 5.5 Ezetec tabletlerinde iki farklı yöntemle EZE tayininde doğrudan kalibrasyon yöntemi ile elde edilen bulgular.51 Çizelge 5.6 Ezetec tabletlerinde iki farklı yöntemle EZE tayininde standart ekleme yöntemi ile elde edilen bulgular..52 Çizelge 5.7 KDAAdSV yöntemi ile serum ve idrar numunelerinde EZE tayininde standart ekleme yöntemi ile elde edilen bulgular...56 Çizelge 5.8 DPAAdSV yöntemi ile serum ve idrar numunelerinde EZE tayininde standart ekleme yöntemi ile elde edilen bulgular..57 Çizelge 5.9 KDAAdSV yöntemi ile serum ve idrar numunelerinde EZE tayininde doğrudan kalibrasyon yöntemi ile elde edilen bulgular..58 Çizelge 5.10 DPAAdSV yöntemi ile idrar ve serum numunelerinde EZE tayininde doğrudan kalibrasyon yöntemi ile elde edilen bulgular.59 Çizelge 5.11 EZE tayini için elde edilen kalibrasyon eğrilerinin en küçük kareler yöntemi kullanılarak değerlendirilmesiyle hesaplanan regresyon parametreleri..60 Çizelge 5.12 Standart ekleme ve doğrudan kalibrasyon yöntemlerinin DPAAdSV ve KDAAdSV yöntemleri için karşılaştırılan bazı değerleri..68 Çizelge 5.13 DPAAdSV ve KDAAdSV yöntemlerinin doğruluklarını kendi aralarında ve UV spektroskopi yöntemi ile karşılaştırmak için hesaplanan t ve F değerleri xii

14 1. GİRİŞ Kalp ve damar hastalıkları Türkiye'de ve diğer ülkelerde ölüm ve kalıcı sakatlıklara yol açması sebebiyle önemlidir. Yüksek kan kolesterol düzeyinin kalp hastalıkları ile ilişkili olduğu ve kan kolesterol düzeyindeki düşüşün kalp hastalıkları riskini önemli ölçüde azalttığı bilinen bir gerçektir. Kalp ve damar hastalıklarını kolaylaştıran faktörlere kardiyovasküler risk faktörleri adı verilir. Kanda kolesterol ve düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterolünün (LDL-K) yüksek olması hasta için risktir ve kolesterol yüksekliği bir kardiyovasküler risk faktörüdür. Yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterolünün (HDL-K) düşük olması da bir risktir. Bu riske sahip hastalarda kalp krizi, felç, damar tıkanması, böbrek yetmezliği gibi hastalıkların ortaya çıkma olasılığı daha fazladır. Türkiye de 6 milyon kişide kan kolesterol düzeyi sınırda ( mg/dl) ve 2 milyon kişide (240 mg/dl) yüksektir. Gelişmiş ülkelerde ölüm nedenleri arasında kalp ve damar hastalıkları ilk sıradadır ve yüksek kolesterol, yüksek tansiyon, şişmanlık gibi sorunların düzeltilmesi ile bu ölümler önlenebilir veya geciktirilebilir. Kolesterolü düşürmek için çeşitli ilaçlar kullanılmaktadır. Bunlar içerisinde statin olarak adlandırılan rosuvastatin, atorvastatin, simvastatin gibi ilaçlar en çok kullanılan ve son zamanlarda LDL-Kolesterolünü en çok düşüren ilaçlardır. Bu ilaçlar karaciğerde kolesterol yapımını azaltarak etki gösterirler. Kullanılan dozlar LDL-K de %25-50 azalma sağlarken, yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterolünde ise %5-10 oranında yükselme sağlar. Statinler dışında farklı ilaçlar da kullanılabilir. Özellikle kolesterolün bağırsaklardan kana geçişini azaltan bir ilaç olan ezetimib, yeni kullanılmaya başlanmıştır. İlaç analizleri için çeşitli analitik yöntemler geliştirilmiştir. İlaçların ve biyolojik öneme sahip moleküllerin analizinde yöntem geliştirmek, olası girişim etkileri ve ortamın yapısı bakımından oldukça önemlidir. İlaç analizlerinde karşılaşılan bu tür sorunları bertaraf edebilmek için, ayırma, saflaştırma, özütleme, deriştirme gibi bazı ön işlemler uygulanmaktadır. Bu tür ön işlemler ise analiz süresini uzatmakla beraber, analizin maliyetini yükseltmektedir. 1

15 Ezetimib(EZE) nin farmasötik preparatlarda ve biyolojik örneklerde en yaygın analizlendiği yöntemler; kromatografik, spektroskopik, miseller kapiler elektroforez ve yeni geliştirilen voltametrik yöntemlerdir. Kromatografik yöntemlerden yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (YBSK) gibi yöntemler, bir ön işlem olan ekstraksiyona gerek duyulması, fazla organik çözücü harcanması, karmaşık ve pahalı cihazlara gereksinim duyulması bakımından bazı dezavantajlara sahiptir. Bu yüzden ilaç analizlerinde alternatif yöntem olarak elektroanalitik yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler elektronikteki gelişmelere paralel olarak ilaç analizlerinde sağladığı bazı üstünlüklerden dolayı giderek artan bir uygulama alanına sahiptir. Bu yöntemler, kolay uygulanabilir, basit, hızlı, diğer yöntemlerden daha az kimyasala ihtiyaç duyulması bakımından pek çok avantaja sahiptirler. Bu yöntemlerin üstün yanlarından biri de, ilaç etken maddelerinin indirgenme ve yükseltgenme reaksiyonlarındaki rolü ile moleküler biyoloji alanında ve fizyolojik önem taşıyan pek çok bileşiğin farmakolojik etki mekanizmalarının açıklanmasında kullanılmasıdır. Geliştirilen yöntemlerle çok düşük derişimlerde analiz yapmak mümkündür. Diferansiyel puls ve kare-dalga adsorptif sıyırma voltametrisi gibi elektroanalitik yöntemler ile nanomolar gibi çok daha düşük miktardaki maddelerin tayini yapılabilmektedir. Bu tez çalışmasında, kolesterol düşürücü etkiye sahip bir ilaç etken maddesi olan EZE in, öncelikle elektrokimyasal davranışı, dönüşümlü voltametri, sabit potansiyelli kulometri gibi yöntemler ile tersinirlik, aktarılan elektron sayısı, adsorpsiyon özellikleri, difüzyon katsayısı ve olası reaksiyon mekanizması gibi elektrokimyasal parametrelerinin belirlenmesi ve bu etken maddelerin nicel tayini için anodik adsorptif sıyırma yöntemlerinin geliştirilmesi düşünülmüştür. Bu amaçla, ph, derişim, tarama hızı, biriktirme süresi, biriktirme potansiyeli gibi deneysel koşullar değiştirilerek en uygun deneysel parametreler belirlenmiştir. Geliştirilen yöntemler, istatistiksel olarak değerlendirilip kesinlik, duyarlık, seçicilik gibi parametreler incelenerek yöntemin analitik amaç için uygunluğu ve ilaç tabletlerinde, biyolojik örneklerde uygulanabilirliği araştırılmıştır. 2

16 2. KURAMSAL TEMELLER EZE in kimyasal, fiziksel ve farmakolojik özellikleri bu bölümde incelenirken, maddenin tayininde geliştirilen voltametrik yöntemlere de yer verilmiştir. 2.1 Ezetimib (EZE) Kimyasal ve fiziksel özellikleri Şekil 2.1 EZE molekülünün kimyasal yapısı Ezetimib, C 24 H 21 F 2 NO 3 molekül yapısına sahiptir ve molekül kütlesi 409,4 g/mol dür. IUPAC tarafından verilen sistematik adı 1-(4-florofenil)-3(R)-3-(4-florofenil)-3-((Shidroksipropil)-4(S)-(4-hidroksifenil)-2-azetidinon dur. Erime noktası C ( F) arasındadır. Kristal formda beyaz renkli bir tozdur. Suda ve asetonitrilde çözünürlüğü az iken, metanol, etanol, 1-propanol ve 2-propanolde çözünürlüğü yüksektir. pka değeri yaklaşık 9,75 ± 0,30 dur (Kul 2011) Farmakolojik özellikleri Kolesterol emilim inhibitörlerinden olan ezetimib, ince bağırsağın tüylü çeperinde toplanır ve bağırsak kolesterolünün karaciğere gitmesini engeller. Karaciğer kolesterol depolarında azalma sağlar. Ezetimib safra asidi salgısını artırmaz ve statinler gibi karaciğerde kolesterol sentezini azaltır (Van Heek 2000, Yola 2009). 3

17 2.1.3 Farmakokinetik özellikleri EZE, oral yolla alındıktan sonra emilir ve aktif metaboliti olan EZE-glukoronid e konjuge olur (Van Heek 2000). EZE yarı ömrü 22 saattir. İnsan plazma proteinlerine % 90 dan daha yüksek oranda bağlanır. EZE ve EZE-glukoronid plazmadan yavaş elimine olurlar. İnce bağırsak ve karaciğerde EZE-glukoronid konjugasyonundan sonra metabolize olur (Van Heek 2002). Tedavi edici kullanımı ve dozu Hasta lipid düşürücü bir diyet uygulamalıdır ve Ezetec ile tedavi sırasında diyete devam etmelidir. Günde 1 defa Ezetec 10 mg önerilir, tek başına ya da bir statinle birlikte kullanılabilir. Ezetec aç ya da tok karnına günün herhangi bir saatinde alınabilir. Orta ve şiddetli karaciğer bozukluğu olan hastalarda ezetimib tedavisi önerilmez (Yola 2009). 2.2 İlaç Analiz Yöntemleri Bu tez çalışmasında kullanılan yöntem olan voltametri, basit, hızlı, cihaz kullanım maliyetleri daha düşük ve daha duyarlı bir yöntem olarak pek çok üstün özelliklere sahiptir. Özellikle son yıllarda kromatografik ve spektofotometrik yöntemlere alternatif olarak geniş bir uygulama alanına yayılmıştır (Wang 1988, Bersier 1983). Geliştirilen yöntemlerle çok düşük derişimlerde (10-10 ve M) farmasötik analizler mümkündür (Radi 2002, Ozkan 2010). Son yıllarda geliştirilen puls-dalga formları, sıyırma teknikleri v.b. elektroanaliz teknikleri ile ilaç ve metabolitinin biyolojik sıvılarda doğrudan analizi mümkündür. Elektroanalitik yöntemler, diğer yöntemlere göre kolay uygulanabilir bir yöntemdir ve analizden önce analitlerin ön saflaştırma işlemine ihtiyaç yoktur (Wang 1988, Hegde 2008, Yola 2011). 4

18 2.2.1 Elektroanalitik yöntemler Elektroanalitik yöntemler; elektrot-çözelti sistemine bir elektriksel etki uygulanarak akım, potansiyel, yük gibi elektriksel niceliklerin ölçümüne dayanır (Wang 2006). Elektroanalitik kimya, bir elektrokimyasal hücredeki analit çözeltisinin elektrokimyasal özelliklerine dayanan nitel ve nicel yöntemleri kapsamaktadır. Elektroanalitik yöntemler ile elektrot ara yüzeylerinde meydana gelen yük aktarımının stokiyometrisi ve hızı, kütle aktarım hızı, adsorpsiyon derecesi, kimyasal tepkimelerin hızı ve denge sabitleri gibi bilgilere ulaşılabilir (Erdoğan 2011). Elektroanalitik yöntemler; net akımın sıfır olduğu denge durumundaki statik (i=0) yöntemler ve denge durumundan uzakta net akımın gözlendiği dinamik (i 0) yöntemler olarak iki ana başlıkta sınıflandırılmaktadır (Kissinger 1984). En yaygın olan sınıflandırma şekil 2.2 de görülmektedir. Şekil 2.2 de görülen tekniklerin çoğunda akım gözlenmektedir. Bu teknikler genellikle akım kontrollü ya da potansiyel kontrollüdür ve büyük genlikli veya küçük genlikli olarak uygulanır. Elektroanalitik yöntemler, çevrenin ve endüstriyel materyallerin izlenmesinde ve bilimsel çalışmalarda geniş ölçüde kullanılmaktadır. En yaygın kullanılan elektroanalitik yöntemlerden biri de voltametridir. Voltametri çok sayıda metal iyonunun ve organik bileşiğin tayininde M gibi düşük tayin aralıklarına olanak sağlamaktadır (Brainina ve Neyman 1993). Voltametri; durgun bir ortamda çalışma elektroduna uygulanan potansiyele karşı elektrodun akım cevabının incelenmesine dayanan potansiyel kontrollü elektrokimyasal tekniklerden biridir. Elektrokimyasal tepkimelerin kinetiğinin ve mekanizmasının incelenmesinde voltametri, güvenilir ve sıklıkla kullanılan bir yöntemdir (Kissinger 1984, Gosser 1993). 5

19 Elektroanalitik Teknikler Statik Teknikler (i=0) Potansiyometri Seçici elektrotlar Potansiyometrik titrasyonlar Potansiyel Kontrollü Teknikler Dinamik Teknikler (i 0) Akım Kontrollü Teknikler Kronopotansiyometri Yük Kontrollü Teknikler Kronoamperometri Kronokulometri Sabit Potansiyel Kulometrisi Voltametri Hidrodinamik Voltametri Dönen disk elektrot Voltametrisi Puls Voltametrisi Sabit Elektrot Voltametrisi Dönüşümlü Voltametri Sıyırma Voltametrisi Şekil 2.2 Elektroanalitik yöntemlerin sınıflandırılması Voltametrik yöntemler, elektrokimyasal hücreye zamana bağlı değiştirilebilen potansiyellerde uyarma sinyalleri uygulandığında, elde edilen karakteristik akım cevapları ve uyarma sinyallerinin dalga şekillerine bağlı olarak; polarografi, diferansiyel puls voltametri, kare dalga voltametri ve dönüşümlü voltametri gibi çeşitli yöntemlere ayrılır. Bu tez çalışmasında kullanılan çeşitli voltametrik yöntemler aşağıda kısaca anlatılmaktadır Dönüşümlü voltametri Dönüşümlü voltametri, çözeltide ve çözelti elektrot ara yüzeyinde elektroaktif türlerin incelenmesi ve oluşan elektrokimyasal tepkimeler hakkında bilgi edinmek için 6

20 kullanılan en yaygın yöntemdir. Bu yöntemde, potansiyel, şekil 2.3 de görüldüğü gibi sabit bir hızla belli bir potansiyel değerine, E 1 den E 2 ye çıkarılır ve daha sonra ilk potansiyel değerine, E 2 den E 1 e geriye doğru doğrusal olarak taranır; oluşan akım ölçülür. Potansiyel taraması E 1 ve E 2 arasında yapılırsa, yöntem doğrusal taramalı voltametri (DTV) adını alır. E 2 potansiyeline ulaşıldıktan sonra aynı tarama yönüne göre ters yönden tarama yapılırsa, yöntem dönüşümlü voltametri adını alır. Oluşan akımın, potansiyelin fonksiyonu olarak kaydedilmesiyle elde edilen akım-potansiyel eğrileri voltamogram olarak adlandırılır (Greef vd. 1990, Gosser 1993). Şekil 2.3 Dönüşümlü voltametri için uyarma sinyali ve voltamogramı Şekil 2.3 de bir voltamogram örneği verilmiştir. Bu şekilde, Yük +ne - İnd reaksiyonu için çözeltide sadece Yük ün bulunduğu dönüşümlü voltamogram örnekleri verilmektedir. Eğri 1, Yük +ne - İnd reaksiyonu tersinir olduğunda elde edilir. İleri doğru taramada, doğrusal taramalı voltametrideki (DTV) gibi, Yük ün İnd e indirgenmesi ile katodik bir pik elde edilir. Geriye doğru taramada, ileri doğru tarama süresince meydana gelen İnd in Yük e tekrar yükseltgenmesinden kaynaklanan, anodik bir pik gözlenir. Tersinir reaksiyonlar için, katodik ve anodik pik akımlarının büyüklükleri ( i k p = i a p ) eşittir ve katodik pik potansiyeli (E k p ) anodik pik potansiyelinden (E a p ) (58/n) mv daha negatiftir. Bunlar tersinirlik için önemli parametrelerdir. Ayrıca, formal redoks potansiyelini elde etmek için kullanılan yarı 7

21 k a dalga potansiyeli, (E 1/2 = E p +E p )/2 şeklinde bulunur. Tersinirliğin azalması ile iki pik potansiyeli arasındaki fark artar. Eğri 2, önemli derecede tersinmez olan sistemler içindir. Eğri 1 ile karşılaştırıldığında, katodik pik çok daha negatif, anodik pik ise çok daha pozitif potansiyeldedir. Sistem tamamen tersinmez ise, anodik pik ölçülebilen potansiyel aralığında görünmez. Tersinmez CV eğrisinden, genellikle bir simulasyon yöntemi ile elektrot reaksiyonu için hız sabiti ve transfer katsayısı gibi kinetik parametreler elde edilebilir. Eğri 3, İnd in tersinir olarak Yük e tekrar yükseltgenebildiği, tekrar yükseltgenmeden önce, İnd in bir kısmının elektroaktif olmayan A türüne dönüşebildiği bir durum içindir (Yük İnd A). Katodik pik Eğri 1 deki gibi aynı şekilde görünür, fakat anodik pik akımı Eğri 1 dekinden daha küçük olur. Anodik pik akımındaki azalmadan, k hız sabitini elde edebiliriz. CV de, potansiyel tarama hızı geniş bir aralıkta değiştirilebilir (Izutsu 2002). Sulu ve susuz çözeltilerdeki elektrokimyasal çalışmalarda en kullanışlı yöntemlerden biri olan dönüşümlü voltametri, kararsız bir ara ürün veya ürün içeren elektrot reaksiyonlarının incelenmesinde sıklıkla tercih edilmektedir. Dönüşümlü voltametride tarama hızları değiştirilerek pik akımlarının tarama hızı ile değişmesinden akımın karakteri (adsorpsiyon, difüzyon) ve elektron aktarım tepkimesinden önce veya sonra kimyasal tepkimelerin olup olmadığı belirlenebilir. Ayrıca ileri ve geri tarama piklerinden tepkimenin mekanizması hakkında fikir edinilebilir ve ileri taramadan yararlanarak kinetik veriler elde edilebilir. Bu yöntemle, elektroaktif türlerin redoks potansiyellerinin yeri hızlı bir şekilde belirlenebilir ve ortamın redoks reaksiyonuna etkisi incelenebilir (Wang 2000). Dönüşümlü voltametri verileri ile bir elektrot tepkimesinin tersinirlik testi yapılabilir. Elektrot yüzeyinde gerçekleşen elektrokimyasal tepkimeler elektrot yüzeyinde davranışlarına göre tersinir, tersinmez ya da yarı tersinir olarak adlandırılırlar. Tersinir sistemlerde, ileri yönde potansiyel taraması sırasında oluşan yükseltgenme piki, potansiyel taraması geriye çevrildiğinde, yükseltgenme sırasında oluşan ürünün elektrot yüzeyinde yeniden indirgenmesi ile yeniden bir pikin gözlendiği durumlardır. 8

22 Tersinir bir pik için pik akımı (25 C), Randles-Sevcik eşitliğiyle verilir (Eşitlik 2.1): i p = (2, ) n 3/2 ACD 2.1) 1/2 v 1/2 (2.1) Burada n, aktarılan elektron sayısı; A, elektrodun alanı (cm 2 ); C, derişim (mol/cm 3 ); D, difüzyon katsayısı (cm 2 /s) ve v, tarama hızıdır (V/s). Buna göre, akım, derişimle doğru orantılıdır ve tarama hızının kareköküyle artar. Basit bir tersinir çift için, anodik pik akımının katodik pik akımına oranı 1 dir. Bu oran, redoks reaksiyonuna eşlik eden kimyasal reaksiyonların varlığından oldukça güçlü bir şekilde etkilenir. Potansiyel eksenindeki piklerin konumu, redoks işleminin formal potansiyeline bağlıdır. Tersinir bir sistem için formal potansiyel, aşağıdaki gibi verilir (Eşitlik 2.2). E = E p a + E p k / 2 (2.2) Tersinir bir sistemde, pik potansiyelleri arasındaki fark aşağıdaki Eşitlik 2.3 ile verilir: ΔE p = E p a E p k = 0,059/n V (2.3) Bu yüzden, pik potansiyelleri farkı, aktarılan elektron sayısının belirlenmesinde ve redoks çiftinin Nerst davranışı gösterip göstermediğinin belirlenmesinde kullanılabilir. Buna göre, hızlı bir 1 e - lu reaksiyon, 59 mv luk bir ΔE p gösterir. Katodik ve anodik piklerin her ikisi de tarama hızından bağımsızdır. Çok elektronlu bir indirgenme gerçekleşiyorsa, sistemin tersinir olması için voltamogramda, birbirinden iyi bir şekilde ayrılmış ve E değerleri birbirinden sırayla artış gösteren çok sayıda pikin olması gerekir (Wang 2000). Bir reaksiyonun tersinir olduğunun belirlenmesinde, dönüşümlü voltametri çalışmalarından yararlanılır ve bazı kritelerin sağlanması elektrot reaksiyonunun tersinir olduğunu gösterir. Bu kriterler aşağıdaki gibi sıralanabilir: E p k -E p a = 59/n mv veya E p -E p /2 = 57/ n mv tur. E p tarama hızı ile değişmez. İ p a /i p k =1 dir ve bu oran tarama hızıyla değişmez. 9

23 İ p /v 1/2, tarama hızıyla değişmez. Dalga şekli tarama hızıyla değişmez. Tersinmez sistemlerde, elektron aktarım hızı yeterince büyük olmadığından elektrot yüzeyinde denge sağlanamaz ve Nerst eşitliği geçersizdir. Düşük tarama hızlarında elektron aktarım hızı kütle aktarım hızından fazla olduğundan sistem tersinir gibi görünebilir. Tarama hızının artmasıyla kütle aktarım hızı elektron aktarım hızı ile karşılaştırılabilir bir büyüklüğe gelir. Anodik ve katodik pik potansiyelleri tarama hızının artmasıyla birbirinden uzaklaşır (Greef vd. 1990, Wang 2000). Tersinmez sistemlerde, pik potansiyeli tarama hızı ile kayar ve bu şekilde karakterize olur (Eşitlik 2.4). E p = E 0 RT αn F α k 0, 78 ln D αnα Fv + ln RT (2.4) Bu eşitlikte; α, transfer kat sayısı; n α, yük-transfer basamağındaki elektron sayısıdır. E p, E dan daha yüksek potansiyellerde gözlenmektedir. Pik potansiyeli ve yarı-pik potansiyeli arasındaki fark 48/αn mv dur. Tersinmez sistemler için pik akımı, aşağıdaki Eşitlik 2.5 den görüldüğü gibi, çözeltinin derişimi ile orantılıdır fakat α transfer kat sayısına bağlı olarak pik yüksekliği daha düşüktür. α=0,5 ise, tersinir pik akımının tersinmez pik akımına oranı 1,27 dir. i p = (2, )n(αn α ) 1/2 ACD 1/2 v 1/2 (2.5) Yarı tersinir sistemlerde standart hız sabiti 10-1 k cm/s aralığındadır ve akım hem elektron akımı hem de kütle aktarımı ile kontrol edilir. Dönüşümlü voltamogramın şekli, k 0 / απd nin bir fonksiyonudur (α= nfv/rt). k 0 / απd arttıkça, sistem 10

24 tersinirliğe yaklaşır. k 0 / απd nin, yüksek tarama hızlarındaki küçük değerleri için sistem tersinmez davranış gösterir. Yarı-tersinir sistemlerde, pik potansiyelleri, tersinir sistemlerle karşılaştırıldığında, birbirinden oldukça ayrıdır (Wang 2006). Bir reaksiyonun yarı- tersinir olduğunun belirlenmesinde de dönüşümlü voltametri çalışmalarından elde edilen verilerden yararlanılır. Bu amaçla, aşağıdaki kriterler incelenir (Kissinger 1984, Gosser 1993, Bard 2001). İ p /v 1/2 tarama hızına bağlı değildir. İ p a /i p k =1 dir (α=0,5 ise). k E p tarama hızı ile değişir. Bu değişme genellikle tarama hızının artması ile negatif değerlere kayma yönündedir. E k a p -E p farkı düşük tarama hızlarında 59/n e yaklaşır. Yüksek tarama hızlarında bu değerden daha büyüktür ve tarama hızı ile artar. Tarama hızı arttıkça pik genişlemesi olur Diferansiyel puls voltametrisi (DPV) Puls teknikleri, Barker ve Jenkin tarafından (1952), voltametrik çalışmalarda tayin sınırını düşürmek amacıyla önerilmiştir. Diferansiyel puls voltametrisinde, faradayik akımın yüksek, kapasitif akımın ise düşük değerlerde olması ile iki akım arasındaki oran ve duyarlılık artırılmış ve tayin sınırları 10-8 M a kadar düşürülmüştür. Kısaca DPV olarak gösterilen diferansiyel puls voltametrisi, organik ve anorganik türlerin eser miktarlarının ölçülmesinde son derece kullanışlı bir tekniktir. Diferansiyel puls voltametrisinde, doğrusal bir potansiyel artışına göre ayarlanmış sabit büyüklükte pulslar (de/dt), çalışma elektroduna belli bir süre uygulanır (Şekil 2.4). İki kez akım ölçülür. Birincisi, puls uygulanmadan önce, yani tam pulsun başladığı anda potansiyelde bir artış olmadan, ikincisi, pulsun bitmesine yakın bir bölgede ölçülür. Bu iki akım arasındaki fark, ΔI puls olarak verilir. Sonunda, uygulanan potansiyele karşı bu akım 11

25 farklarının grafiğe geçirilmesiyle diferansiyel puls voltamogramı elde edilir (Greef vd. 1990, Wang 2000, Izutsu 2002). Voltamogramlardaki pik akımlarının yüksekliği, Eşitlik 2.6 da görüleceği gibi ilgili analitin derişimiyle doğru orantılıdır: nfacd σ i p = π t 1+ σ (2.6) Bu eşitlikte; σ, exp[(nf/rt)(δe/2)]; (1-σ)/(1+σ): 1 (yüksek puls genliklerinde); ΔE, puls genliği dir. DPV, en çok kullanılan elektroanalitik yöntemlerden biridir. Bu yöntemle, analite bağlı olarak gözlenebilme sınırı 10-8 M a kadar indirilebilmektedir (Wang 2000). DPV de potansiyel-zaman profili şekil 2.4 de verilmiştir (Scholz vd. 2010). Şekil 2.4 Diferansiyel puls voltametrisinde puls tipi uyarma sinyalinin dalga şekli 12

26 Kare-dalga voltametrisi (KDV) KDV, ilk defa 1930 yılında Kemula tarafından adsorpsiyon olaylarının incelenmesi için düşünülmüş, fakat analitik kullanımı 1952 yılında Fujinaga ve arkadaşları tarafından fark edilmiştir. KDV ne en büyük katkı, hem teorik hem de cihaz geliştirilmesi bakımından Barker tarafından yapılmıştır. KDV, çalışma elektroduna uygulanan potansiyel, büyük genişlikli bir diferansiyel teknik olmasını sağlayan simetrik kare dalgalar şeklindedir. Her bir kare dalga döngüsü boyunca, akım iki kez ölçülür. Birincisi, ileri yöndeki pulsun sonunda (t 1 ) ikincisi ise geri yöndeki pulsun sonundadır (t 2 ). Bu iki akım arasındaki fark, uygulanan potansiyelin bir fonksiyonu olarak grafiğe geçirildiğinde Şekil 2.5 de görüldüğü gibi bir kare dalga voltamogramı elde edilir (Scholz vd. 2010). Şekil 2.5 Kare-dalga voltametride puls tipi uyarma sinyali Bir kare dalganın tamamlanma süresi periyot adını alır ve τ ile gösterilir. τ, yaklaşık 5 ms civarındadır. Birbirini takip eden kare dalgalar arasındaki yükseklik farkına basamak yüksekliği (sinyal potansiyel basamağı) denir ve ΔE s ile gösterilir. Genelde ΔE s 10 mv dur. Her bir dalganın alt ve üst noktaları arasındaki farkın yarısı kare dalga yüksekliği (puls genliği) olarak bilinir ve E SW şeklinde gösterilir. Çoğu zaman τ yerine, 1/ τ a eşit olan frekans kullanılır ve ƒ ile gösterilir. 13

27 KDV, oldukça hızlı bir teknik olması bakımından üstün bir yöntemdir. Etkin tarama hızı, kare dalganın frekansı (ƒ) ve basamak yüksekliği (ΔE s ) değiştirilerek belirlenir. Böylece, birkaç saniye içinde voltamogramlar kaydedilebilmektedir. Bu, ortalama 2-3 dakikayı bulan diferansiyel puls voltamogramının tamamlanması ile karşılaştırıldığında, kare dalga voltametrisinin analiz süresini oldukça kısalttığının bir göstergesidir (Wang 2000, Scholz 2001). KDV yönteminin bir diğer üstünlüğü ise, kare dalga yoluyla toplam akıma kapasitif katkıların minimuma indirilmiş olmasıdır. Böylece tarama hızı çarpıcı bir şekilde arttırılabilir, 1 V/s lik tarama hızına kolaylıkla ulaşılabilir. KDV de net akım (ΔI) hem ileri hem de geri puls akımlarından daha büyüktür. Bu nedenle, voltametrik pik genellikle oldukça kolay okunmaktadır. Bu da, yöntemin doğruluğunu arttırmakta ve diferansiyel puls voltametrisinden daha yüksek duyarlılığın elde edilmesini sağlamaktadır (Kissinger 1984). Böylece M gibi düşük tayin sınırlarına inilebilmektedir Sıyırma voltametrisi (SV) Sıyırma voltametrisi, elektroanalitik yöntemler içinde en duyarlı yöntemdir. Yüksek duyarlılık ve seçiciliğe sahip olmasından dolayı, eser miktar tayinlerinde kullanılır. Sıyırma voltametrisi, karışım analizlerine uygulanabilirliği, cihazların ucuzluğu ve ölçüm kolaylığı, çevre, klinik ve endüstriyel numunelerde duyarlı analizlere elverişli olması sebebiyle analizcilerin dikkatini çekmektedir. Voltametrik sıyırma tekniklerine, sulu ve susuz ortamlarda maddelerin eser miktarda tayinlerinde başvurulmaktadır. Atomik absorpsiyon, nötron aktivasyon, florometrik ve kromatografik yöntemlerle birlikte voltametrik sıyırma yöntemleri eser analizlerde başvurulan beş önemli yöntem arasında sayılmaktadır. Bu yöntemlerden anorganik analizlerde en çok uygulama alanı olan iki yöntemden biri atomik absorpsiyon, diğeri ise sıyırma yöntemleridir. Atomik absorpsiyona yalnız anorganik tayinlerde başvurulduğu halde, sıyırma teknikleri hem anorganik hem de organik tayinlerde kullanılabilmektedir. Aynı numunenin analizi sıyırma tekniklerinde defalarca tekrarlanabilir. Elektrot yüzeyinde herhangi bir şekilde biriktirilen madde analizi için sıyırma voltametrisi uygulanabilir. Sıyırma yöntemi iki farklı şekilde uygulanabilir. İlk olarak, 14

28 analizi yapılacak madde seyreltik çözeltiden indirgenme veya yükseltgenme suretiyle alınarak elektrot yüzeyinde elektrokimyasal yolla veya adsorbe edilerek biriktirilir. Bu basamakta yapılan bir elektrokimyasal ön deriştirme işlemidir. Bu sırada çözelti karıştırılır. Analizi yapılacak maddenin çözeltiden indirgenmesi ya da yükseltgenmesi sonucu biriktirilir veya çözeltide bulunan madde sabit potansiyelde herhangi bir kimyasal değişikliğe uğramadan doğrudan elektrot yüzeyine fiziksel adsorpsiyonla biriktirilir. İkinci adım olan sıyırma basamağında ise elektrot yüzeyinde biriktirilmiş olan madde voltametrik yöntemlerden biri ile sıyırılır. Yönteme sıyırma voltametrisi adı verilmesinin sebebi işte bu basamaktan ileri gelmektedir. Bu esnada oluşan akım ölçülerek madde miktarı tayin edilir (Brainina ve Neyman 1993). İkinci sıyırma tekniği, adsorptif sıyırma voltametrisi (AdSV) dir. Bu teknik ile çözeltide bulunan madde sabit potansiyelde herhangi bir kimyasal değişikliğe uğratılmadan doğrudan doğruya elektrot yüzeyine fiziksel adsorpsiyonla toplanır. Toplanan bu madde yine bir potansiyel taraması ile indirgenmeye veya yükseltgenmeye uğratılarak oluşan akım ölçülür. Son yıllarda geliştirilen bu yöntem ile hem çok duyarlı bir analitik yöntem elde edilmiş hem de voltametride kötü haber olarak bilinen adsorpsiyon olayı bir avantaj haline dönüştürülmüştür. Her iki sıyırma tekniği de iki işlem bsamağından meydana gelir. İlk işlem basamağı biriktirme bsamağıdır. Her iki durumda da sabit bir potansiyelde bir ön deriştirme işlemi yapılır. Ancak bu ön deriştirme işlemi birinde kimyasal bir reaksiyon ile yapılırken, diğerinde fiziksel adsorpsiyonla yapılmaktadır. İkinci işlem olan sıyırma basamağında ise, her iki teknikte de biriktirilen maddenin özelliğine göre anodik veya katodik yönde bir potansiyel taraması yapılarak madde elektrokimyasal değişikliğe uğratılır ve bunun sonucunda akım elde edilir. Potansiyel taraması anodik yönde yapılırsa yöntem anodik sıyırma voltametrisi (ASV), katodik yönde yapılırsa katodik sıyırma voltametrisidir (KSV). Sıyırma esnasında istenilen bir voltametrik yöntem kullanılabilir. Yapılan potansiyel taramasına göre yöntem de sıyırma voltametrisi, doğrusal taramalı sıyırma voltametrisi veya diferansiyel puls sıyırma voltametrisi vb. gibi adlar alır (Wang 2000). 15

29 Her iki yöntemin verildiği potansiyel-zaman profili şekil 2.6 da verilmiş ve her basamakta yapılan işlemlere kısaca yer verilmiştir. Şekil 2.6 Sıyırma tekniklerinde potansiyel-zaman profili ve akım potansiyel eğrileri Sıyırma voltametride elektrot yüzeyine biriken madde miktarı, maddelerin ve çözeltilerin özelliğine, elektrot materyaline ve boyutuna, potansiyele, zamana, ph ya, iyonik güce, maddenin elektrot yüzeyine taşınmasına, sıcaklığa, biriktirme süresi ve potansiyeli ve çözeltinin karıştırılma hızına bağlıdır. Sıyırma analizlerinin duyarlılığı, toplama basamağında ürünün elektrot yüzeyindeki derişimine bağlıdır. Bundan dolayı damlayan cıva elektrot, sıyırma voltametrisinde kullanılmaz. Sebebi cıva ile birlikte biriktirilen maddenin de çözeltiye geri taşınmasıdır. Bunun için sıyırma yöntemlerinde sabit bir cıva damlası veya bir katı elektrot kullanılır. Sıyırma analizinde camsı karbon elektrodunun (CKE) kullanıldığı durumlarda biriktirme adımının ardından karıştırma durduralarak bir süre beklenir. Bu durulma süresinde madde derişimi çözelti içinde homojen şekilde dağılma fırsatını bulur ve bundan sonra okunacak olan akımın difüzyon akımı olması sağlanır (Copeland ve Skogerboe 1974, Andruzzi vd. 1982). Biriktirme anında elektrot potansiyeli, analizi yapılacak olan tür indirgenme potansiyelinden daha katodik bir potansiyelde, belli bir süre (t) tutulur. Bu süre boyunca çözelti karıştırılır. Biriken türün mol sayısı, (i b t b / nf) değerine eşdeğerdir. Biriken 16

30 maddenin elektrot yüzeyine ulaşma hızı, maddenin derişimine, elektrot çözeltisinin difüzyon özelliklerine ve kullanılan elektrotun alanına bağlı olarak değişir. Doğru sonuçlar alabilmek için karıştırma hızı, biriktirme süresi ve sıcaklık gibi biriktirme koşullarının analiz boyunca aynı kalması gereklidir (Bond 1980). Anodik ve katodik sıyırma voltametri, önderiştirme ve sıyırma basamaklarında farklılık gösteren sıyırma voltametrinin iki farklı çeşididir. Anodik sıyırma voltametrisinde, katodik ön deriştirme işleminden sonra daha pozitif potansiyellere doğru potansiyel taraması yapılır ve yükseltgenme akımı ölçülür. Katodik sıyırma voltametri bunun tam tersidir ve indirgenme akımı ölçülür. Katodik sıyırma voltametrisiyle anyonlar ve moleküller tayin edilebilmektedir. KSV de biriktirme basamağında, elektrot üzerinde toplama bsamağında gerçekleşen anodik reaksiyon, maddenin iyonlarına yükseltgenmesidir. Oluşan maddenin iyonları da çözünmeyen tuzları halinde elektrot yüzeyi üzerinde çöker. Gerekli anodik toplama potansiyeli, ilgili anyonlara bağlıdır. Bütün katodik sıyırma işlemlerinde, toplama basamağında elektrot yüzeyi üzerinde çözünmeyen bir tabaka oluşur. Eğer çok madde toplanırsa sıyırma piki bozulur. Bu sebeple KSV, çok seyreltik çözeltilerin analizi için uygun bir yöntemdir. Adsorptif sıyırma voltametrisinde (AdSV), maddenin elektrot üzerine adsorbe edilerek biriktirilmesi adımında, elektrot potansiyeli, analizi yapılacak maddenin indirgenme potansiyelinden daha pozitif potansiyelde belli bir süre sabit tutulur. Bu süre boyunca analiz edilecek maddeler elektrot yüzeyine adsorbe olarak birikirler. Bu süre zarfında çözelti karıştırılır. Elektrot alanı küçük ve biriktirme süresi kısa olduğu için elektrot yüzeyine adsorbe edilerek biriktirme adımında, akımın değişmediği varsayılır. Biriken maddelerin elektrot yüzeyine ulaşma hızları, maddelerin derişimine, elektrot çözeltisinin difüzyon özelliklerine ve kullanılan elektrotun alanına bağlı olarak değişir (Wang 1985). Adsorptif sıyırma voltametrisinde tayin edilecek madde, adsorptif olarak elektrot yüzeyinde biriktirildikten sonra katodik ya da anodik yönde taranarak elektrot 17

31 yüzeyinden ayrılır. Katodik yönde yapılan taramaya, katodik adsorptif sıyırma voltametri (KAdSV); anodik yönde yapılan taramaya, anodik adsorptif sıyırma voltametri (AdSV) denir. 2.3 Bulk Elektroliz (BE) Çalışma elektrodunun potansiyelinin veya akımının sabit tutulup çözeltideki yükseltgenmiş türün, elektrot yüzeyinde tamamen indirgenerek dönüştürüldüğü ve elektroliz süresince, başlangıç türünün derişiminin zamanla azalıp sıfıra yaklaştığı elektrolizdir (Izutsu 2002). Bulk elektoliz yönteminde çalışılan elektrodun yüzey alanı diğer yöntemlere kıyasla oldukça büyüktür. Bir saat veya daha fazla zaman alabilir ve bu süre sonunda, elektroaktif türün derişiminin başlangıç derişiminin %1 ine ulaştığında elektrolizin tamamlandığı kabul edilir. Bulk elektroliz, yüzey alanının çözelti hacmine oranının oldukça büyük olduğu, yüksek akımlar ve uzun zaman skalasıyla karakterize edilen (Bard ve Faulkner 2001) ve deney sonunda devreden geçen toplam yük miktarını vererek elektrot reaksiyonunda aktarılan elektron sayısının hesaplanmasında kullanılan yöntemdir. Bulk elektroliz, elektrolizin belirli bir potansiyelde yapıldığı sabit potansiyelli bulk elektroliz ve elektrolizin belirli bir akımda sabit tutulduğu sabit akımlı bulk elektroliz olmak üzere iki farklı uygulamaya sahiptir. 2.4 Kronoamperometri (KA) Kontrollü potansiyel tekniklerinden biri olan kronoamperometri, karıştırılmayan bir çözeltide, çalışma elektrodunun potansiyelini, faradayik bir reaksiyonun gerçekleşmediği bir potansiyelden elektroaktif türün elektrot yüzeyindeki derişiminin neredeyse sıfır olduğu potansiyele kadar değiştirilmesine dayanır. Kronoamperometri deneyi sonucunda, zamanın bir fonksiyonu olarak akımın ölçüldüğü, akım-zaman grafikleri elde edilir. Bu grafikler aynı zamanda, kütle aktarımı genellikle difüzyon 18

32 kontrollü olduğu için, elektrot yüzeyinin yakınlarındaki derişim gradientini yansıtır. Akımın zamanla değişimi Cottrell eşitliğiyle verilir: i d = nfacd 1/2 / π 1/2 t 1/2 (2.7) Kronoamperometri genellikle elektroaktif türlerin difüzyon katsayılarının veya çalışma elektrodunun yüzey alanının hesaplanmasında kullanılır. Aynı zamanda, elektrot reaksiyonlarının mekanizmasının belirlenmesiyle ilgili çalışmalarda da kronoamperometri verilerinden yararlanılır (Wang 2000). 2.5 Kronokulometri (KK) Kronokulometride bir potansiyel basamak tekniğidir. Deney boyunca oluşan akımın zamana karşı grafiğe geçirilmesiyle toplam yük bulunur. Toplam yük zamana karşı grafiğe geçirilir. Genel elektrot reaksiyonunda eğer akım difüzyon kontrollü ise, Cottrell eşitliğiyle ifade edilen akım-zaman ilişkisinin integrali alınarak, toplam yük ile zaman arasındaki ilişki için aşağıdaki Eşitlik 2.8 ile elde edilir. Q(t)= 2nFAD 1/2 C t 1/2 / π 1/2 (2.8) Bu eşitlik yardmıyla çizilen Q- t 1/2 grafiklerinin eğiminden, elektrot reaksiyonunda aktarılan elektron sayısı ve difüzyon katsayısı hesaplanabilir (Bard and Faulkner 2001). Yük ölçümüne dayanan bu teknikten yararlanılarak, elektrot yüzeyine adsorplanan madde miktarı da hesaplanabilir (Wang 2000). Öncelikle, ortamda elektroaktif madde yokken yalnız elektrolitin kronokulometrik Q- t 1/2 eğrisi elde edilerek, Q eksenini t=0 anında kestiği noktadan çift tabakanın yük miktarı (Q dl ) bulunur. Daha sonra elektroaktif maddenin kronokulometrik Q-t 1/2 eğrisi elde edilerek, yine kesim noktasından adsorplanan türle ilgili toplam yük miktarı bulunur. 19

33 İkisi arasındaki fark alınarak aşağıdaki Eşitlik 2.9 yardımıyla elektrot yüzeyine adsorplanan maddenin mol/cm 2 olarak derişimi (Г) hesaplanır (Anson 1966, Bard ve Faulkner 2001): Q(t)= 2nFAD 1/2 C t 1/2 / π 1/2 + Q dl + nfaг (2.9) 20

34 3. KAYNAK ARAŞTIRMASI EZE, kolesterolün bağırsakta absorpsiyonunu engelleyerek, sistemik kolesterolün azaltılmasında rol oynayan antihiperlipidemik ilaçların ilk üyesidir. İnce bağırsakta ve karaciğerde EZE-glukoronid konjugasyonu ile metabolize olur. Biyolojik olarak son derece önemli olan bu ilaç etken maddenin analitik açıdan analizi ile ilgili pek çok çalışma bulunmaktadır. Bu konuda yapılan çalışmaların bir kısmı aşağıda özetlenmiştir. Rathınaraj vd. (2010), tarafından ezetimib ve simvastatin in farmasötik örneklerde nicel tayini için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile bir yöntem geliştirilmiştir. Ayırma 250mm x 4,6mm iç çaplı ve parça boyutu 5µ olan bir phenomenex C 18 kolonu üzerinde, 1M amonyum asetat buffer ve asetonitril karışımını içeren bir hareketli faz (55:45, v/v) kullanılarak, 1,8 ml/dk akış hızında gerçekleştirilmiştir. 230 nm dalga boyunda tayin yapılmış, ezetimib ve simvastatin için alıkonma süreleri sırasıyla 4,5 ve 20,1 dk bulunmuştur. Ezetimib ve simvastatin için kalibrasyon eğrileri µg/ml aralığında doğrusal bulunmuştur. Shrikrishna vd. (2011), tarafından ezetimib in farmasötik preparatlarda tayini için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi geliştirilmiştir. Bu amaçla, ODS-3V (4,6 250 mm) kolonu ile tampon: asetonitril (50:50) hareketli fazı kullanılarak, 1,5 ml/dk akış hızında bir sistem sağlanmıştır. 230 nm dalga boyuna ayarlanan UV dedektör, ezetimib için iyi bir kromatografik ayrılma göstermiştir. Ezetimib doğrusal çalışma aralığı 10 ppm-50 ppm arasında belirlenmiş, lineer regrasyon katsayısı 1,00 olarak bulunmuştur. Metodun doğruluğu ilaç geri kazanım çalışmaları ile belirlenmiş ve kabul edilebilir limitle % arasında, lineer korelasyon katsayısı ise 1,00 bulunmuştur. Nagavalli vd. (2011), çalışmalarında EZE, atorvastatin kalsiyum (ATR) ve fenofibratın (FEN) saf ve farmasötik preparatlarda eş zamanlı tayinleri için, yüksek performans ters faz sıvı kromatografisi (RP-HPLC; A metodu) ve yüksek performans ince tabaka kromatografisi (HPTLC; B metodu) geliştirilmiştir. A metodunda, ATR, EZE ve FEN in analizinde, Phenomenax Luna ODS 5µ (150 4,6 mm iç çapında) bir kolon ve bir UV 21

35 dedektör kullanılmıştır. Hareketli faz olarak metanol: asetonitril: su (50:30:20 v/v/v) karışımı kullanılmıştır. ATR, EZE, FEN in alıkonma süreleri sırasıyla 1,77±0,02; 2,62±0,01; 9,26±0,03 bulunmuştur. ATR ve EZE doğrusal derişim aralığı 2-10 µg/ml arasında, FEN ise µg/ml derişim aralığında belirlenmiştir. Bu sonuçlara göre korelasyon katsayısı tüm ilaçlar için 0,999 dan daha yüksek bulunmuştur. ATR, EZE ve FEN için gözlenebilme sınırları sırasıyla 0,2359, 0,2298, 2,0307 iken, alt tayin sınırları 0,7149, 0,6964, 6,1538 bulunmuştur. Yöntemin doğruluğunu belirlemek için geri kazanım çalışmaları yapılmış ve buna göre ATR, EZE ve FEN için % 96,5-98,70; % 97,0-101,50; % 97,1-100,60 bulunmuştur. B metodunda, ATR, EZE ve FEN in analizinde, silika jel 60 F 254 İnce tabaka kromatografi plakası kullanılmıştır. Hareketli faz olarak kloroform: toluen: metanol: asetik sirke asidi (6:3:1:0,5 v/v/v/v) karışımı tercih edilmiştir. ATR, EZE ve FEN in ince tabaka kromatografisindeki alıkonma süreleri sırasıyla 0,48±0,02; 0,56±0,03; 0,87±0,02 belirlenmiştir. ATR ve EZE doğrusal derişim aralığı ng/spot, FEN ise ng/spot derişim aralığında gözlemlenmiştir. Bu sonuçlara göre korelasyon katsayısı tüm ilaçlar için 0,999 dan daha yüksek bulunmuştur. ATR, EZE ve FEN için gözlenebilme sınırları sırasıyla 0,0677, 0,0478, 0,1379 iken, alt tayin sınırları 0,2051, 0,0145, 0,4180 bulunmuştur. Yöntemin doğruluğunun değerlendirilmesinde yapılan geri kazanım çalışmaları ile % 99,34-99,85, % 99,04-100,29, % 99,30-100,47 sonuçları elde edilmiştir. Sharma vd. (2010), EZE ve simvastatin (SIM) in farmasötik preparatlarda spektrofotometrik analizinde, 3,0 M üre çözeltisi kullanılarak iki farklı yöntem geliştirilmiştir. EZE ve SIM sırasıyla 267 ve 277 nm dalga boyunda maksimum absorbans göstermiştir ve izobestik nokta 258 nm dalga boyunda görülmüştür. EZE ve SIM in doğrusal çalışma aralıkları sırasıyla 5-35 µg/ml, 5-40 µg/ml iken, korelasyon katsayısı ise 0,9999 ve 0,9987 olarak bulunmuştur. Eş zamanlı denklemler yöntemi ile EZE ve SIM in sırasıyla gözlenebilme sınırları 0,0621 ve 0,1631 µg/ml, alt tayin sınırları ise 0,1193 ve 0,3725 µg/ml bulunmuştur. Yöntemin doğruluğunun 22

36 değerlendirilmesi için geri kazanım çalışmaları yapılmıştır. Bunun sonucunda EZE ve SIM için sırasıyla geri kazanım değerleri % 100,10 ve % 99,99 olarak belirlenmiştir. EZE ve SIM in spektrofotometrik analizinde II. yöntem olarak absorbans oranları yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntemle EZE ve SİM için elde edilen gözlenebilme sınırları sırasıyla 0,1092 ve 0,0541 µg/ml iken, alt tayin sınırları ise 0,4015 ve 0,3318 µg/ml bulunmuştur. EZE ve SIM için geri kazanım değerleri sırasıyla % 99,90 ve % 100,6 olarak belirlenmiştir. Uçaktürk vd. (2009), çalışmalarında, EZE in insan plazmasında nicel tayini için, elektron iyonizasyonuna dayalı gaz kromatografi-kütle spektrofotometrisi (GC-MS) yöntemi geliştirilmiştir. EZE nin türevlendirme çalışması N-metil-N-trimetilsililtrifloroasetamid ile gerçekleştirilmiştir. Çalışmada 5973 N kütle seçici dedektörle donanımlı bir 6890 N Agilent GC dedektör seçilmiş ve ayırma için ise HP-5ms (% 5 fenil metil polisiloksan, 30m 0,25mm iç çaplı, 0,25 µm film kalınlığında) kapiler kolon kullanılmıştır. Taşıyıcı gaz olarak 0,8 ml/dk sabit akış hızında helyum kullanılmıştır. EZE için doğrusal çalışma aralığı ng/ml arasında belirlenmiştir ve bu çalışmalara dayalı olarak alt tayin sınırı ve gözlenebilme sınırı sırasıyla 15 ve 10 ng/ml bulunmuştur. Korelasyon katsayısı 0,9977±0,0004 iken, gün içi ve günler arası kesinliği % 6 dan daha az, gün içi ve günler arası doğruluğu dört farklı konsantrasyonda (15, 40, 100, 250 ng/ml) % -4,04 ve % 9,71 arasında bulunmuştur. Yardımcı vd. (2010), tarafından, EZE ve SIM in farmasötik preparatlarda eş zamanlı tayinleri için misel elektrokinetik kapiler kromatografi (MEKC) yöntemi geliştirilmiştir. Elektrokinetik kapiler kromatografi yönteminde eriyik silika kapiler kolon (56 cm 50 µm iç çaplı) kullanılmıştır. Optimum sıcaklık 30 C belirlenmiş, 25 mm sodyum dodesil sülfat ve asetonitril (%10, v/v) içeren ph 9,0 ayarlı 25 mm borat tamponu kullanılmıştır. Optimum şartlar sağlanarak, 10 dk dan daha az bir sürede EZE ve SIM analitlerinin ayrılması sağlanmıştır. Numunelere 238 nm dalga boyunda +30,0 kv voltaj uygulanmıştır ve 50 mbar basınçta 3s de injeksiyon sağlanmıştır. Bu çalışmalar sonucunda EZE ve SIM in her ikisi içinde gözlenebilme sınırı ve alt tayin sınırı sırasıyla 1,0 ve 2,0 µg/ml bulunmuştur. 23

37 Yola vd. (2011), çalışmalarında, EZE in elektrokimyasal indirgenmesi, asılı cıva damla çalışma elektrodu (HMDE), Ag/AgCl referans elektrot ve platin karşıt elektrotları ile kare dalga voltametrisi yöntemine dayalı olarak K 2 HPO 4 -Na 2 B (25:25, v/v) tamponunda farklı ph larda incelenmiştir. Kare dalga voltametrisi yöntemine göre optimum cihaz şartları; 50 Hz frekans, 3 mv potansiyel artış, 20 mv genlik şeklinde belirlenmiştir. Bu şartlarda EZE için (-1290)-(-1322) mv potansiyel aralığında tek bir indirgenme piki gözlenmiştir. Bu yöntemde EZE için doğrusal çalışma aralığı 0,33-6,54 µg/ml belirlenmiştir ve bu çalışmalardan yararlanarak gözlenebilme sınırı ve alt tayin sınırı sırasıyla 0,099 ve 0,30 µg/ml bulunmuştur. Yöntemin doğruluğunu belirlemek için geri kazanım çalışmaları yapılmış ve buna göre geri kazanım değerleri % 99,10 ile 101,30 arasında bulunmuştur. Ayrıca yapılan çalışmada EZE nin elektrokimyasal indirgenme mekanizmasında 2e-, 2H + transferi olduğu belirlenmiştir. Dönüşümlü voltametri, kronoamperometri, kronokulometri yöntemleri yardımıyla akımın difüzyon kontrollü olduğu belirlenmiştir. Kul vd. (2011), tarafından, EZE in elektrokimyasal yükseltgenmesi, bor katkılı elmas elektrot (BDD) ve camsı karbon çalışma elektrotları (CKE) ile Ag/AgCl referans elektrot ve platin karşıt elektrotları kullanılarak klasik voltametrik yöntemlerle (DPV ve KDV) incelenmiştir. EZE nin camsı karbon ve bor katkılı elmas elektrotların her ikisi ile nicel tayini için, farmasötik preparatlarda ve serum çözeltilerinde diferansiyel puls (DPV) ve kare dalga voltametrisi (KDV) yöntemleri geliştirilmiştir. EZE stok çözeltisi, asetonitril ile hazırlanmıştır. Sülfürik asit (0,1 M ve 0,5 M H 2 SO 4 ) çözeltisi, fosfat tamponu (0,2 M H 3 PO 4 ; 0,2 M KH 2 PO 4-2H 2 O; ph 2,0-8,0), Britton-Robinson tamponu (0,04 M H 3 BO 3 ; 0,04 M H 3 PO 4 ; 0,04 M CH 3 COOH; ph 2,0-12,0) ve asetat tamponu (0,2 M CH 3 COOH; ph 3,5-5,5) yöntem validasyonu için kullanılmıştır. Bu çalışmalar sonucunda en iyi destek elektrolit 0,1 M H 2 SO 4 (% 20 asetonitril) belirlenmiş ve optimum ph 2,02 seçilmiştir. Bu şartlarda EZE nin serumda analizinde camsı karbon elektrotta diferansiyel puls yönteminde 0,972 V da kesin bir pik gözlenirken, kare dalga yönteminde 1,004 V da gözlenmiştir. Buna göre EZE doğrusal çalışma aralığı DPV için µm arasında iken, KDV için 2-80 µm arasında bulunmuştur. Yöntem doğruluğunun değerlendirilmesi için yapılan geri kazanım çalışmaları sonucunda DPV yöntemi ile % 99,12 iken, KDV % 99,43 olarak bulunmuştur. 24

38 Ayrıca bor katkılı elmas elektrot ile validasyon parametreleri incelenmiştir. EZE nin serumda analizinde bor katkılı elmas elektrotta DPV yöntemi için 1,152 V da bir pik gözlenirken, KDV yöntemi için 1,192 V da gözlenmiştir. Buna göre doğrusal çalışma aralığı DPV için µm arasında iken, KDV için 4-80 µm arasında belirlenmiştir. Geri kazanım çalışmaları sonucunda DPV için % 100,04 iken, KDV için % 99,80 olarak bulunmuştur. Sharma vd. (2008), tarafından, EZE in farmasötik preparatlarda analizi için birinci, ikinci, üçüncü türevli UV spektrofotometrik yöntemleri geliştirilmiştir. Standart ve tablet çözeltileri metanol ile hazırlanmıştır. UV spektrofotometri yöntemi ile 233 nm dalga boyunda kantitatif tayinler yapılmış ve doğrusal çalışma aralığı 6-16 µg/ml arasında belirlenmiştir. Birinci, ikinci, üçüncü türevli spektrofotometrik yöntemlerle, EZE ilacı sırasıyla 259,5 nm, 269 nm ve 248 nm dalga boylarında tayin edilmiştir. Bu yöntemler için doğrusal çalışma aralığı sırasıyla 4-14 µg/ml, 4-14 µg/ml, 4-16 µg/ml arasında bulunmuştur. Yöntem doğruluklarını belirlemek için geri kazanım çalışmaları yapılmıştır ve UV, birinci, ikinci, üçüncü türev spektrofotometrik yöntemleri için sırasıyla 98,45-100,85; 98,07-99,83; 100,13-100,70; 100,49-101,46 değerlerinde bulunmuştur. 25

39 4. MATERYAL VE YÖNTEM Bu bölümde, deneysel çalışmalarda kullanılan materyaller, cihazlar, donanımları, ilaç etken maddesi ve kimyasal maddeler, çözeltilerin hazırlanışı, tablet serum ve idrar çözeltilerinin analize hazırlanışından bahsedilmiştir. 4.1 Tez Çalışmasında Kullanılan Materyaller Kimyasal maddeler Kullanılan kimyasal maddeler, saflık dereceleri ve temin edildikleri firma çizelge 4.1 de belirtilmiştir. Çizelge 4.1 Kullanılan kimyasal maddeler Kimyasal maddenin adı Formülü Saflık derecesi Temin edildiği firma Alüminyum oksit Al 2 O 3 - Merck Asetik asit CH 3 COOH > % 99,5 Merck Asetonitril CH 3 CN > % 99,9 Sigma-Aldrich Azot gazı N 2 > % 99,9 Oksan Koll. ŞTİ. Borik asit B(OH) 3 > % 99,5 Merck Ezetimib C 24 H 21 F 2 NO 3 Ankara Üni. Eczacılık Fak. Fosforik asit H 3 PO 4 > % 85,0 Pancreac Hidroklorik asit HCl > % 37,0 Pancreac Methanol CH 3 OH > % 99,9 Riedel-de Haen Nitrik asit HNO 3 > % 65,0 Merck Sodyum hidroksit NaOH > % 99,0 Merck Kullanılan cihazlar ve elektrotlar EZE nin camsı karbon elektrot yüzeyindeki elektrokimyasal çalışmaları CHI 660C marka çalışma ünitesi, BAS C3 katı elektrot standı kullanılarak yapılmıştır (Şekil 4.1). 26

40 Şekil 4.1 Elektrokimyasal çalışmalarda kullanılan elektrotlar, çalışma ünitesi ve standı Şekil 4.1 de görülen elektrokimyasal sistemde, voltametrik çalışmalar için 3 mm çapında camsı karbon çalışma elektrot (CKE) (BAS MF 2012); Pt tel karşıt elektrot (CHI 115); Ag/AgCl (CHI 111) referans elektrot kullanılmıştır. Bulk elektroliz çalışması için BAS MF-1056 bulk elektroliz hücresine ait (Şekil 4.1), kafes görünümlü gözenekli karbon elektrot BAS MF-2077 kullanılmıştır. CKE da Ezetimib in reaksiyon mekanizmasında aktarılan elektron sayısını tayin edebildiğimiz yöntem olan bulk elektrolizde de karşıt elektrot olarak helezon şeklinde sarılmış Pt tel (BAS MW- 1033) ve Ag/AgCl referans elektrot kullanılmıştır. Deneysel çalışmalarda kullanılan Ag/AgCl referans elektrodu, kullanılmadığı zamanlarda 3,0 M KCl çözeltisi içerisinde 27