Ders:BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ. Konu: EMBRİYO KÜLTÜRÜ. Hazırlayan: Selin KARAKÜTÜK

Transkript

1 Ders:BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ Konu: EMBRİYO KÜLTÜRÜ Hazırlayan: Selin KARAKÜTÜK ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ

2 İÇİNDEKİLER 1. Bitki Doku Kültürü Tanımı 2. Bitki Doku Kültürünün Amaçları 3. Bitki Doku Kültürünün Dezavantajları 4. Doku Kültürü Sistemlerinin Tipleri 5. Embriyo Kültürü Tanımı 6. Embriyo Kültürü Yöntemleri 6.1. Olgun Tohumlardan 6.2. Olgunlaşmamış Tohumlardan 7. Embriyo Kültürünün Amacı 8. Embriyo Kültürünün Çalışma Mekanizması

3 9. Embriyo Kültüründe Başarıyı Etkileyen Faktörler 9.1. Genotip 9.2. Gelişme Dönemi 9.3. Ana Bitki 9.4. Besi Ortamı 9.5. Sıcaklık 9.6. Oksijen 9.7. Işık 10. Embriyo Kültürünün Pratikte Kullanım Alanları

4 1. Bitki Doku Kültürü Nedir Aseptik koşullarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, hücre (meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri), doku (çeşitli bitki kısımları=eksplant) veya organ (apikal meristem, kök vb.) gibi bitki kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi ) üretilmesidir.

5 2. Bitki Doku Kültürünün Amaçları Bitkilerin klonal olarak hızlı çoğaltılması, Geleneksel yöntemlerle kolay çoğaltılmayan bitkilerin çoğaltılması, Patojenlerden ari bitki elde edilmesi, Islah amaçlı çalışmalar, Somaklonal varyasyonların oluşturulması, Haploid bitkilerin elde edilmesi, Bitki gen kaynaklarının muhafazası, Biyokimyasal ürünlerin elde edilmesidir.

6 3. Doku Kültürü ile Üretmenin Dezavantajları Az materyal kullanıldığı zaman gen fakirliğine yol açar. Bunu engellemek için çok sayıda ağaçtan yararlanmak gerekir. Pahalı bir yöntemdir.

7 4. Doku Kültürü Sistemlerinin Tipleri Bitkicikler Fideler Kallus Somatik embriyolar

8 Kültür yöntemi ile hücreler uzun bir süre farklılaşmamış hücre kümeleri şeklinde veya rejenere olmuş tam bitkiler şeklinde korunabilmektedirler. Günümüzde en çok kullanılan kültür yöntemleri; embriyo kültürü, kallus kültürü, anter kültürü, ovül ve ovaryum kültürleri, meristem kültürü, apikal meristem kültürü, protoplast kültürü, sürgün kültürü, kök kültürü, süspansiyon kültürler ve çeşitli bitki organlarına ait kültürlerdir.

9 5. EMBRİYO KÜLTÜRÜ NEDİR Yüksek bitkilerin tohumlarından ve tohum taslaklarından embriyoların izole edilerek belli ortamlarda kültüre alınması embriyo kültürü olarak tanımlanmaktadır. Bu teknik ilk defa 1904 yılında Hannig tarafından uygulanmıştır. Embriyo kültürü embriyonal büyüme ve farklılaşma üzerine besinlerin, bitki büyüme düzenleyicilerinin ve diğer kimyasal ve fiziksel faktörlerin etkilerini incelemek için yararlı bir tekniktir.

10 6. Embriyo kültürü 2 değişik şekilde yapılmaktadır; 6.1. Olgun tohum embriyolarının kültürü: Gelişmesini tamamlamış tohumlardan izole edilen olgun embriyolar, tohumun çimlenmesini engelleyen dormansiyi ortada kaldırmak amacıyla kültüre alınır.

11 Embriyo kültürü 2 değişik şekilde yapılmaktadır devamı Olgunlaşmamış erken bölünme fazındaki proembriyoların kültürü: Olgunlaşmamış embriyoların kültürü, genellikle normal koşullarda gelişmesini tamamlayamayan embriyolardan yaşama gücündeki bitkilerin elde edilmesi amacıyla yapılır.

12 7. Embriyo kültüründe amaç; Çimlenmesi çok daha zor olan tohumların çimlendirilmesi, Genetik çalışmalarda ıslah süresinin kısaltılması, Yeterince gelişememiş ve hibrit embriyoların yaşatılması, Haploid bitki üretilmesi, Hastalıksız bitki üretimi, Tohumla üretimi zor olan bitkilerin üretimidir.

13 8. Embriyo Kültürü Tekniğinin Çalışma Mekanizması

14 9. Embriyo Kültüründe Başarıyı Etkileyen Faktörler 9.1. GENOTİP Bazı bitki türlerinde embriyoların in vitro kültürü çok iyi iken bazı türlerde çok güçtür. Hatta aynı türlerin genotipleri arasında bu açıdan büyük farklılıklar vardır.

15 9.2. EMBRİYOLARIN İZOLASYON SIRASINDAKİ GELİŞME DÖNEMİ Çok küçük olgunlaşmamış embriyoların in vitro kültürde geliştirilerek bunlardan bitki elde edilmesi çok zordur. Gelişmeleri ilerlemiş durumdaki embriyoların in vitro kültürü daha kolaydır.

16 9.3. ANA BİTKİLERİN YETİŞME KOŞULLARI Embriyo kültürü amacıyla kullanılacak donor bitkiler genellikle serada yetiştirilir. Aynı zamanda tarla koşullarında yetiştirilen bitkiler de bu amaçla kullanılabilir. Donor bitkilerin büyüme koşullarının iyileştirilmesi endosperm gelişmesinin daha iyi olmasını, dolayısıyla da embriyoların daha iyi büyümesini sağlar.

17 9.4. BESİ ORTAMININ BİLEŞİMİ Olgunlaşmamış embriyolar olgun embriyolara göre daha kompleks besi ortamlarına gereksinim duyarlar. Aynı zamanda hem olgunlaşmamış hem de olgun embriyoların in vitro kültüründe besi ortamı makro ve mikro elementleri ile şeker içermelidir. Genellikle PH ı 5-6 arasında değişen katı ortamlar kullanılır. Agarın genellikle %0,6-0,8 konsantrasyonları kullanılır. Yüksek agar konsantrasyonları embriyo büyümesini engeller.

18 Embriyo kültürü için çok değişik mineral besi ortamları kullanılmaktadır. Embriyolar mineral solüsyonlara çok hassas olup, büyümeyi teşvik eden mineral solüsyonlar embriyolarda toksik etki yapabilmekte, toksik etki yapmayan mineral solüsyonlar ise embriyoların normal farklılaşmasını sağlayamamaktadır. Bundan dolayı embriyo kültürü için kullanılan mineral solüsyonlarda bu durumların dikkate alınması gerekmektedir.

19 Embriyo kültüründe şeker kaynağı olarak genellikle sakkaroz kullanılır. Fakat bazı durumlarda fruktoz ve glikoz daha iyi sonuç verebilmektedir.

20 Genellikle embriyo kültüründe büyüme düzenleyicilerine ihtiyaç duyulmaz. Fakat bazı durumlarda ise besi ortamına ilave edilen düşük dozdaki IAA (indolacetic acid) nın embriyo büyümesini olumlu yönde etkilediği belirlenmiştir. Yani kısacası, doğal olarak oluşan endospermlerin hormonlar içerdiği ve bu hormonların embriyonun büyüme ve gelişmesini etkilediği, endosperm gelişmesinin normal olmadığı durumlarda (tür ve cinsler arası melezlemelerde) besi ortamının büyüme düzenleyicileri içermesi gerektiği söylenebilir.

21 Embriyo kültüründe besi ortamına hindistan cevizi sütü, meyve ve sebze püreleri ile kazein hidrolizat gibi maddelerin ilavesi bazı durumlarda embriyo büyüme ve gelişmesini olumlu yönde etkileyebilir. Embriyoların in vitro kültürü sırasında büyüme ve gelişme sonucu embriyoların besin maddesi gereksinimleri değişeceği için bazı durumlarda alt kültür gerekli olabilmektedir.

22 9.5. SICAKLIK Embriyo kültüründe optimum sıcaklık bitki türüne göre farklılık gösterir. Normal olarak genellikle embriyolar C de kültür edilir OKSİJEN Oksijen embriyo kültüründe önemli bir faktördür. Bazı durumlarda oksijen gereksinimi normal havanın oksijen içeriğinden daha fazla olabilir.

23 9.7. IŞIK Bazı durumlarda izole edilmiş embriyolar 7-14 gün süre ile karanlık koşullara ihtiyaç duymaktadırlar. Bu karanlık dönemden sonra ışık koşullarında klorofil oluşumu gerçekleşir.

24 10. EMBRİYO KÜLTÜRÜNÜN PRATİKTE KULLANIM ALANLARI Embriyo kültürü pratikte aşağıdaki amaçlarla kullanılır. a) Tohumlarının Çimlendirilmesi Mümkün Olmayan Türlerin Tohumlarının Çimlendirilmesi: Bazı bitkilerin tohumlarını doğal koşullarda çimlendirmek mümkün değildir. Bu durumda bu türlerin tohumlarından embriyolar izole edilerek in vitro koşullarda çimlendirilmesi gerekir.

25 b) Mutlak Olarak Parazit Halde Yaşayan Bitkilerin Tohumlarının Çimlendirilmesi: Mutlak olarak parazit halde yaşayan bitkilerin tohumlarını konukçu bitki olmaksızın çimlendirmek mümkün değildir. Bu durumda embriyo kültürü tekniği ile bu bitkilerin embriyolarından tam teşekküllü bitkiler elde edilebilir.

26 c) Yetiştirme ve Islah Sürecinin Kısaltılması: Tohum dormansisi gösteren birçok bitki vardır. Bu türlerde endospermdeki bazı engelleyiciler, çimlenme için özel ışık ve sıcaklıklara gereksinim duyulması veya embriyonun tam olarak olgunlaşmamış olması nedeniyle tohumlar kısa sürede çimlenemez. Embriyo kültürü tekniği ile bu türlerde çok kısa sürede çimlenme sağlanır ve bu türlerin yetiştirilme süreçleri kısalır.

27 d) Uyuşmazlık Nedeniyle Embriyoların Gelişemediği Durumlarda Normal Embriyo Gelişmesini Sağlamak: Türler ve cinsler arası melezlemelerde ve farklı poliploidi düzeyindeki bitkilerin melezlenmesinde genellikle endosperm çok zayıf gelişir. Bu durumda embriyo gelişmesini tamamlayamadan ölür. Böyle durumlarda genellikle melezlemeden 2-3 hafta sonra embriyolar izole edilerek in vitro kültür koşullarında kültüre alınır ve bu melez embriyoların normal gelişmeleri sağlanarak melez bitkiler elde edilebilir.

28 e) Erken Olgunlaşan Taş Çekirdekli Meyvelerde Zayıf Embriyo Gelişiminin Engellenmesi: Şeftali, kiraz, kayısı ve erik gibi erken olgunlaşan taş çekirdekli meyvelerde, embriyoya su ve besin maddesi taşınması embriyo tam olarak olgunlaşmadan kesintiye uğrar. Bu durumda embriyo tam olarak olgunlaşamaz ve bu nedenle erken olgunlaşan bu tip meyvelerden melez bitki elde edilemez. Böyle durularda, embriyo kültürünün kullanılması ile melez bitkiler elde edilebilir.

29 f) Haploid Bitkilerin Elde Edilmesi: Embriyo kültürü tekniğinin en önemli kullanım alanlarından birisi de haploid bitki elde edilmesidir. Maternal haploid tekniği olarak bilinen bu teknik, özellikle buğday ve arpada başarı ile uygulanmakta olan bir tekniktir. Bu yöntem ilk defa arpada uygulanmıştır. Bu yöntemle haploid bitki elde edilmesinde, kültür arpası yumrulu arpa ile melezlenmektedir.

30

31 g) Embriyo gelişiminin deneysel olarak incelenmesi: Embriyo kültürü pratik kullanım alanlarının yanında, embriyo gelişmesi için gerekli koşullar, fitohormonlar ve çevre koşullarının embriyo gelişmesine etkisi ve embriyonun beslenmesi gibi konuların incelenmesine de olanak sağlamaktadır.

32 SONUÇ Embriyo kültürü bitkilerde farklı amaçlarla kullanılan bir tekniktir. Tohum dışında embriyonun gelişiminin incelenmesi, yaşama yeteneğine sahip olmayan embriyoları kurtarma ve haploid bitki geliştirme gibi amaçlar için kullanılabilir. Embriyo kültürü sayesinde daha kısa sürede daha etkin sonuçlar alınabilmektedir. Bitki ıslah çalışmalarında klasik ıslah yöntemlerinin embriyo kültürü tekniği ile kombine edilmesi sonucu günümüzde olduğu gibi gelecekte de alternatif yeni çalışmaların yapılabileceği aşikardır.

33 TEŞEKKÜR EDERİM

34 KAYNAKLAR -Hatipoğlu, Rüştü (1999), Bitki Biyoteknolojisi, Adana: Çukurova Üniversitesi Yayınları. -Kurt, Orhan (2006), Embriyo Kültürü, Samsun: OMÜ Zir. Fak. Dergisi. -Çapan, Sevgin (2006), Embriyo Kültürlerinde Kromozom Sayısı ve Mitoz Aktivitesinin İncelenmesi, Edirne: Yüksek Lisans Tezi. -URL-1, Doku Kültürü Tekniği. 3 Aralık URL-2, Doku Kültürü ile Çoğaltma. 3 Aralık 2015.

35 KALLUS KÜLTÜRÜ DERSİN ADI: BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ Hazırlayan: Mehmet DURSUN

36 İÇİNDEKİLER 1. Kallus nedir? 2. Bitki Biyoteknolojisinde Kallus Kültürü Kullanım Amaçları 3. Kallus Gelişim Aşamaları. 4. Kalluslarda Farklılaşma 5. Kallusların Alt Kültüre Alınması 6. Kallus Çeşitleri 7. Kallus Tipleri 8. Organogenesis 9. Somatik Embriyo Rejenerasyonu 10. Sonuç

37 1. Kallus Nedir? Kallus organize olmamış hücrelerin yığınıdır. Bitkilerde çeşitli sebeblerden ötürü oluşan yaralanmalar sonucu gelişen kontrolsüz bölünen hücre yığınları. Yara doku

38 2. Bitki Biyoteknolojisinde Kallus Kültürü Kullanım Amaçları? 1. İn vitro çoğaltım 2. Ortaya çıkan somoklonal varyasyondan yararlanma 3. Hücre kültürlerinin oluşturulması

39 2.1. İn Vitro Çoğaltım

40 2.2. Ortaya Çıkan Somoklonal Varyasyonlardan Yararlanma

41 Kallusu meydana getiren hücrelerde somoklonal varyasyon meydana gelebilir. Bu varyasyon iki şekilde olabilir. 1) Epigenetik 2) Genetik

42 2.3. Hücre Kültürlerinden Yaralanma

43

44 4. Kalluslarda Farklılaşma

45

46 5. Kallus İndüksiyonu

47 Kallus kültürlerinin düzenli aralıklar ile büyüme eğrisi doğrultusunda (3-6 hafta) alt kültüre alınması gereklidir. Uzun süreli alt kültüre almalar ile somsklonal varyasyon oranı artar.

48 6. Kallus Çeşitleri Yapraktan kallus oluşumu Vasküler dokudan kallus oluşumu Kökten kallus oluşumu Embriyodan kallus oluşumu

49 7. Kallus Tipleri Friable(gevşek) Rhizogenik Sert sarı yapışkan beyaz kırmızı yeşil

50

51

52 Brokoli bitkisinde indirek somatik emriyo ve organogenesis(qin ve ark., 2007)

53 Pinus spp de indirek somatik embriyo oluşumu ve organogenesis

54 Sonuç Kallus kültürü bitki doku kültürü yöntemlerinin ilk basamağını oluşturmaktadır. Farklı türden bitkilerin veya aynı türün farklı varyeteleri arasındaki rejenerasyon farklılıkları hakkında bilgilerimiz artıkca doku kültürü yöntemleride o nisbetle artacağını ümit ederiz..

55 Referanslar; Bitki Biyoteknolojisi(c.Nealstewert) Bitki Biyoteknoloji(prof. Dr. Rüştü Hatipoğlu)

56 TEŞEKKÜRLER

57 Haploid bitki üretımi MARAT Imanzhanov

58 İçindekiler 1. Haploid Bitkiler 2. Gametler 3. Erkek Gametten Haploid Bitki Elde Etme (Androgenesis) 4. Anter Kültürünün Yapılışı 4.1 Direkt 4.2 İndirekt 5. Androgenesisi Etkileyen Faktörler 6. Genotip

59 7. Donör Bitkinin Yetişme Koşullari 8. Anterlerin Gelişme Dönemi 9.Anterlere Yapılan Ön Uygulamalar 10. Besin Ortamının Bileşimi Ve Yapısı 11. Inkübasyon Koşulları 12.Dişi Gametten Haploidi Uyartimi (Gynogenesis Ve Parthenogenesis) 13. Haploid Bitkilerde Kromozom Katlama 14. Antep Kültürünün Yapılışı Resimle 15. Haploidlerin Sağladiği Avantajlar

60 1.Haploid bitkiler Somatik hücrelerindeki kromozom sayısı, ait oldukları bitki türünün gamet hücrelerinde bulunan kromozom sayısı kadar olan bitkiler. Haploidler, her bir lokustaki allelerden sadece bir seriyi içermekte ve bu özellikleri ile ıslah çalışmalarında önemli yer tutmaktadırlar. Haploid bitkilerin kromozom sayılarının katlanması sayesinde %100 homozigot saf hatlar elde edilebilmektedir.

61 2. Gametler Haploid bitkilerin elde edilmesinde kullanılan başlangıç materyalleri gametlerdir. Esas olarak, haploidlerin elde edilebilmesi için iki yöntem bulunmaktadır; - ya erkek gametten ya da - dişi gametten in vitro koşullarda bitki oluşumu sağlanabilmektedir.

62

63 3.Erkek Gametten Haploid Bitki Elde Etme (Androgenesis) In vitro kültüre alınan genç anterlerden haploidlerin başarıyla oluşturulması ilk kez 1964 yılında Datura stramonium bitkisinde Guha ve Maheshwari tarafından gerçekleştirilmiştir 1967yılında Bourgin ve Nitsch in tütün bitkisinde anter kültür yoluyla haploid embriyolar elde etmesinden sonra, özellikle ekonomik önemi fazla olan tahıllar, sebzeler ve şeker pancarı başta olmak üzere günümüze değin pek çok bitki türünde anter kültürü yoluyla haploid eldesi üzerinde çalışmalar yapılmış ve 25 familyaya ait 200 bitki türünde in vitro androgenesis tekniğinden başarılı sonuçlar elde edilmiştir.

64 4.Anter Kültürünün Yapılışı Henüz olgunlaşmamış ve içerisinde birinci polen mitozu aşamasına gelmiş tek çekirdekli mikrosporları bulunduran anterler, anter kültürü için uygun başlangıç materyalidir. Belirlenen aşamadaki anterleri bulunduran çiçek tomurcukları, yüzeysel dezenfeksiyon işleminen tabi tutulduktan sonra steril koşullarda tomurcukların içerisinden çıkartılan anterler, önceden hazırlanmış ve otoklavlanarak sterilize hale getirilmiş besin ortamlarının üzerine yerleştirilmektedir.

65 Çoğunlukla petri kutularına, agarla katılaştırılmı besin ortamlarına yerleştirilen anterlerin dikimişlemi tamamlandıktan sonra petri kutularının kenarları bir film şeritle kapatılarak herhangi bir enfeksiyona karşı, dış ortamdaki atmosferle olan ilişki kesilmektedir. Petri kutuları içerisindeki anterler inkübasyon için değişik koşullara alınabilmekte, tütün gibi anter kültürüne son derece olumlu yanıt veren bitkilerde 24-28oC sıcaklıkta ve fotoperiyodik bir düzende aydınlatılan bir iklim dolabında yapılan inkübasyon yeterli olmaktadır.

66 Androgenesis direkt ve indirekt androgenesis olmak üzere ikiye ayrılmaktadır. Kültürün 40. gününden sonra anterlerin içerisinden embriyolar çıkarak gözle görülebilir aşamaya ulaşmaktadır. Buna direkt androgenesis adı verilmektedir. Bunun dışında, bazı türlerde önce kallus oluşmakta, daha sonra kallustan organogenesis veya embriyogenesis yoluyla HAPLOID BITKILER oluşabilmektedir. Bu ikinci oluşum yoluna indirekt androgenesis denilmektedir.

67

68 5.Androgenesisi Etkileyen Faktörler Anter kültüründen elde edilen başarı, yani elde Edilen haploid embriyo sayısı birçok faktörün etkisi altında bulunmaktadır. Bu faktörlerin bir bölümü, anterlerin alındığı Donör bitkiden kaynaklanmakta olup diğer bir bölümü de anter kültürü tekniğinin uygulanması

69 6. Genotip Anter kültüründe başarı, çok büyük bir oranda anterlerin alındığı bitkilerin genotipine bağlıdır. Şimdiye dek çalışılmış olan tüm bitki türlerinde; aynı kültür koşulları altında, anter yanıtları bakımından genotipler arasında büyük farklılıklar bulunmuştur.

70 Herhangi bir genotipten yüksek oranda haploid embriyon elde etmek için; her genotip için kültür koşullarını optimize etmek ve anter kültüründe embriyo oluşturma başarısı yüksek genotiplerle embriyon oluşturma kapasitesi düşük olan genotipleri melezlemek gerekmektedir.

71 7. Donör Bitkinin Yetişme Koşulları Donör bitkinin genotipi son derece elverişli olsa bile, mikrosporlardan in vitro koşullarda haploid embriyo uyartımını başarabilmek, bu bitkilerin yetiştirildiği koşullara da bağlıdır. Bitkilerin yetiştirildiği dönemdeki sıcaklık, Işık yoğunluğu ve günlük ışıklanma süresi, Havadaki CO2 konsantrasyonu, bitkinin beslenme Koşullarıbaşta olmak üzere tüm çevresel faktörler, o bitkilerden alınan anterlerden elde edilecek başarı üzerinde etkili olabilmektedir.

72 8. Anterlerin Gelişme Dönemi Çoğu bitki türünün anter kültürlerinde en iyi sonuçlar, tek çekirdekli mikrospor döneminin erken veya geç aşamasındaki mikrosporları içeren anterlerden alınmaktadır. Mikrosporlar içerisinde nişasta depolanmaya Başladıktan sonra, gelişmeyi sporofitik yöne kaydırmak ve haploid embriyo elde etmek için yapılacak uyarılar etkili olamamaktadır.

73 Mikrospor Gelişme Aşamasını Belirlemek Için Kullanılan Yöntemler; Ezme preparasyon tekniği Asetokarmin ile hızlı boyama Flouresans mikroskobu Preparat hazırlanmasında Buna uygunmerkürik asit, DAPI gibi boyaların kullanılması Parafine gömerek Kesit alma Bunun ardından preparatları hematoksilin Metilen mavisi Değişik boyalarla boyama

74 9. Anterlere Yapılan Ön Uygulamalar Anter kültüründe en etkili ön uygulama, tomurcuklara yapılan soğuk şoklarıdır C ler arasında, 72 saat ile 4 haftaya kadar tutulantomurcuklar; arpa, patates, mısır, buğday ve biber gibi. Bazı türlerde polen rejenerasyonu bakımından olumlu Yanıtlar vermiştir.

75 Anter kültürlerde soğuk uygulamasının etki, mekanizması; Nişasta birikiminin bloke edilmesi Tek çekirdekli mikrospor döneminde tutuklanan mikrospor sayısının artırılması Anter duvarının yaşlanmasının geciktirilmesi ve ABA gibi bazı engelleyici maddelerin etkisinin azaltılması.

76 10. Besin Ortamının Bileşimi Ve Yapısı Anter kültüründe genel olarak ilk aşamada gametofitik dokuları sporofitik gelişmeye dönüştürme yönünde uyaracak oksinler gerekliken; bitkiciğe dönüşüm aşamasında sitokininlerin varlığına gereksinim duyulur.

77 Temel besin ortamı olarak, anter kültüründe en fazla Murashige ve Skoog, White ve Nitsch ortamları kullanılmaktadır Karbon kaynağı olarak anter kültürlerinde büyük bir çoğunlukla sakkaroz kullanılmaktadır. Besin ortamına özellikle kültürün ilk günlerinde ilaveт edilen yüksek şeker dozları (%6-12), anter kültüründen haploidlerin elde edilmesinde olumlu etki yapmaktadır.

78 Besin ortamına katılan serin, glutamin gibi aminoasitler, AgNO3 gibi etilen biyosentezini inhibe edici maddeler veya aktif kömür gibi katkı maddeleri de anter kültüründen elde edilecek başarıyı artırma yönünde kullanılan çeşitli kimyasal maddeler arasında yer almaktadır.

79 11. İNKÜBASYON Koşulları İnkübasyon sırasındaki ışık, ya da sıcaklık gibi çevresel koşullar anter kültüründen sağlanacak başarı üzerinde etki yapan diğer bir grup faktördür. Başlangıçta anterler genellikle karanlıkta ve 20 ila 30oC ler arasında kültüre alınmaktadır. Kültürün ilerleyen aşamalarında düşük ışık yoğunluğu (2000 lux) ve değişik günlük ışıklanma sürelerinde bekletilen anterlerde embriyo oluşumu gerçekleştikten sonra; rejenere olan bitkicikler daha yüksek ışık yoğunluğuna ( lux) sahip koşullara aktarılmaktadır.

80 Bazı bitki türlerine ait anter kültürlerinde inkübasyonun ilk günlerinde yüksek sıcaklık uygulamaları, embriyo oluşumu üzerinde çok olumlu etki yapmaktadır.

81 12.Dişi gametten haploidi uyartimi (Gynogenesis ve parthenogenesis) Ovül ve Ovaryum Kültürleri Döllenmemiş yumurtalığın ya da yumurta hücrelerinin kültüre alınmasıyla haploid embriyo ve bitki oluşumuna ovaryum veya ovül kültürleri adı verilmektedir.

82 13.Haploid bitkilerde kromozom Katlama Haploid bitkilerin kromozom setlerinin katlanması ve % 100 homozigot safhatların hızla geliştirilmesi, haploidi tekniğinin esasını oluşturmaktadır. Kromozom katlanması pratikte çoğunlukla kimyasal madde uygulamalarıyla gerçekleştirilmektedir. Günümüzde kromozom katlaması için bitki ıslahçıları tarafından en yaygın kullanılan kimyasal madde, kolhisindir. Kolhisin, uygulandığı dokuların hücrelerinde mitoz bölünmenin metafaz safhasında iğ ipliklerinin oluşumunu engeller ve dolayısı ile replikasyona uğramış kromozomların kutuplara çekilmesini önleyerek, kromozom sayısının iki katına çıkmasını sağlar.

83

84 PLOİDİ BELİRLEME Fenotipik Gözlemler: Bitkilerin kromozom sayısı arttıkça, bitkinin tüm organlarında bir irileşme meydana gelmekte; buna karşılık haploid bitkilerin elde edilmesi halinde bitkinin organları tam olarak oluştuğu halde diploidlere göre daha küçük olmaktadır.

85 Kromozom Sayımları: Bitkilerin genellikle kök uçlarında yapılan kromozom sayımları, güvenirliliği en fazla olan yöntemdir. Sağlıklı ve güçlü bir gelişme gösteren taze kök uçlarından alınan örnekler, kromozom sayımları için en uygun materyaldir.

86 Flow Sitometri: hücrelerin tek tek flouresans dedektörden geçerken emdiklerin ışının analizine dayanan bir yöntemdir. Her bitki türü için yöntemin optimize edilme gereksinimi, bu yöntemin dezavantajlarından biri olsa da; miksoploid hücrelerin varlığının ortaya çıkartılması, bir kişinin günde 100 den fazla bitkide analiz yapabilme olanağını sunması gibi avantajları vardır.

87

88 Stomatal İncelemeler:Değişik bitki türlerinde stomaların iriliği, dolayısıyla birim alanda bulunan stoma sayısı ile ploidi düzeyi arasında güvenilir ilişkiler saptanmıştır. Örneğin kereviz, tütün, brüksel lahanası, havuç, karpuz, kavun, hıyar, biber ve kabakta haploid bitkilerin stomalarının diploidlerine göre daha küçük olduğu, dolayısıyla birim alanda daha fazla stoma bulunduğu saptanmıştır.

89 14. Anter kültürünün yapılışı Normal olarak 7 cm çapındaki bir petri kutusu içerisine türlere ve anter büyüklüğüne göre değişmekle birlikte 5-15 adet anter yerleştirilebilmektedir. Petri kutuları içerisindeki anterler inkübasyon için değişik koşullara alınabilmekte, tütün gibi anter kültürüne son derece olumlu yanıt veren bitkilerde oc sıcaklıkta ve fotoperiyodik bir düzende aydınlatılan bir iklim dolabında yapılan inkübasyon yeterli olurken; patlıcan, biber, lahana grubu sebzelerde kültürün ilk günlerinde yüksek sıcaklık şoklarına gereksinim duyulabilmektedir

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

100 15. Haploidlerin sağladiği Avantajlar 1. Haploidleri kullanmanın en basta gelen avantajı, tambir homozigotiyi çok kısa bir sürede elde etme olanağını sunmasıdır. Dihaploid hatlarınkullanılmasıyla genetik ve ıslah çalısmalarını yapmak kolaylasmakta ve sonuca daha çabuk ulasılabilmektedir. 2. Resesif genler, dominant genler tarafından maskelenemeyeceğinden, homozigot bireylerde genetik açılımı izlemek daha basit bir islem haline gelmektedir. 3. Homozigot bitkilerin üretimi özellikle dioik türlerdeve kendine uyusmazlık sorunu bulunan bitkilerde zorolup anter kültürü, bu bakımdan büyük kolaylık sağlamaktadır.

101 4. Yabancı döllenen türlerde heterozigoti oranı çok yüksekolduğundan bunlarda homozigot hatların elde edilmesiiçin generasyon boyunca kendilemeler yapmak gerekmekte; kendine döllenen türlerde bile aynı amaçla 5-7 generasyon kendileme islemine gereksinimduyulmaktadır. 5. F1 hibrit çesitlerin gelistirilmesinde homozigot hatlararasında üstün kombinasyon yeteneği verenlerininbelirlenmesi yöntemi kullanıldığından, haploidinin hibritçesit ıslahında özel bir önemi bulunmaktadır. 6. Yonca ve patates gibi tetraploidlerin bulunduğu türlerde haploidizasyon, diploid bitkilerin üretiminde kullanılabilmektedir. Elde edilen diploidler ticari olarakilginç olabileceği gibi; bu yolla bazı tetraploidürünlerde; yabani türler ile kültür çesitleri arasındadiploid seviyede melezleme yaparak kombinasyon yolunagidilmektedir. 7. Kombinasyon ıslahında da sonuca çok kısa sürede ulasmayı sağlayan haploidi sayesinde, F1 kademesindeki melez bitkilerden haploid çekerek; farklı genotiplerde bulunan ve tek bir genotiptetoplanması arzu edilen özelliklere sahip bitkiler kazanmak mümkündür.

102 Teşekkürler!

103 DERS: BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ METODLARI KONU: SOMAKLONAL VARYASYON VE MELEZLEME HAZIRLAYAN: Dursune Merve KARATAŞ

104 Somaklonal varyasyon nedir? İn vitro kültürde genetik değişikliklere neden olan faktörler Somaklonal varyasyonun bitki ıslahında kullanılması Somaklonal varyasyonun avantajları Somaklonal varyasyonun dezavantajarı Somatik melezleme nedir? Somatik melezlerin elde edilmesi Somatik melezlemenin bitki ıslahında önemi Somatik melezlemede karşılaşılan problemler

105 Somaklonal varyasyon nedir? Bitkilerin somatik hücrelerden in vitro çoğaltılması ve rejenerasyonunda doğal olarak rejenere olan bitkilerin fenotip ve genotip olarak in vitro kültürde kullanılan eksplantın alındığı bitkiye benzemesi gerekir.çünkü, in vitro kültürde hücrelerin mitoz yoluyla bölünmeleri söz konusudur.fakat kallus kültürlerinden rejenere olan bazı bitkilerde gözlenen değişiklikler in vitro kültürde somatik hücrelerden rejenere olan bitkilerin genetik stabilite göstermesi gerektiği şeklindeki düşüncenin değişikliğine sebep oldu.bugün in vitro kültür sırasında ortaya çıkan ve rejenere olan bitkilerde gözlenen değişikliklere somaklonal varyasyon denir.

106 İn vitro kültür yoluyla çoğaltılan bitkilerde gözlenen varyasyona bitkilerin genetik yapılarında ortaya çıkan değişiklikler neden olabileceği gibi,kalıtsal olmayan faktörler de bu tip varyasyonlara neden olabilir.

107 İn vitro kültürde rejenere olan bitkilerde gözlenen ve nedeni kalıtsal olmayan değişiklikler dölden döle geçmezler.bu tip değişikliklere epigenetik değişiklikler denir Örneğin,in vitro kültür sırasında kullanılan besi ortamı, besi ortamındaki sitokinin ve auxinler bu tip değişikliğe neden olabilirler.

108 İn vitro kültürde rejenere olan bitkilerin genetik yapılarındaki değişiklik nedeniyle ortaya çıkan varyasyon kalıtsaldır ve bu değişiklikler dölden döle geçerek devam eder.in vitro kültürde bitkinin genetik yapısında ortaya çıkan değişiklikler, kromozom sayısı ve kromozom yapısındaki değişiklikler ve gen mutasyonları şeklinde ortaya çıkar.

109 değişikliklere neden olan faktörler Bugüne kadar in vitro kültürde ortaya çıkan genetik değişimlerin nedenleri çok tartışılmıştır.ancak bu değişimlere neden olan faktörler tam açıklanamamıştır.bununla birlikte bazı faktörlerin in vitro kültürde genetik değişimlerin ortaya çıkmasında belirleyici faktörler olduğu ortaya konmuştur.

110 yöntemi Meristem, sürgün ucu ve tomurcuklardan direkt olarak herhangi bir kallus fazı olmaksızın rejenere olan bitkiler büyük bir genetik stabilite gösterirler.bu nedenle mutlak genetik stabiliteye gereksinim duyulan durumlarda in vitro çoğaltma için meristem, sürgün ucu ve tomurcukların kullanılması önerilir. Kallus fazını takip eden bir rejenerasyonda genetik varyabilitenin ortaya çıkma şansı rejenerasyonun organogenesis veya somatik embriyogenesis yoluyla ceryan etmesine bağlıdır.yapılan araştırmalar,genellikle somatik embriyogenesis yoluyla rejenerasyonda çok büyük genetik anormalliklere rastlanmadığını ortaya koymuştur.buna neden olarak, somatik embriyogenesiste somatik embriyoların tek hücre orjinli oldukları ve sadece normal genetik yapıdaki hücrelerden somatik embriyoların oluştuğu gösterilmektedir. Embriyogenik olmayan kallustan organogenesis yoluyla rejenere olan bitkilerde genellikle büyük genetik varyasyonlara rastlanmaktadır.

111 Kullanılan eksplant Bir bitki türünde kromozom sayısı sabittir.fakat, bu sabit kromozom sayısı bitkinin meristematik dokuları ve eşey hücrelerinin oluştuğu dokular için geçerlidir.yapılan araştırmalarda, bir çok bitki türlerinde farklılaşmış somatik dokuların farklı kromozom sayısına sahip hücrelerden oluştuğu ortaya çıkmıştır.

112 Polysomatik türler olarak adlandırılan bu türlerin somatik hücrelerinde endoreduplikasyon ve endomitosis olayları sonucu poliploidizasyon ortaya çıkmaktadır.böyle bir bitkiden alınan eksplanttan in vitro kültürde farklı kromozom sayısına sahip bitkiler ortaya çıkabilmektedir. Genellikle poliploid türler in vitro kültürde diploid türlere göre daha fazla varyasyon göstermektedir.

113 Besi ortamının bileşimi İn vitro kültürde kullanılan besi ortamının bileşimi özellikle auxin ve sitokinin içeriği in vitro kültürde genetik stabiliteyi etkilemektedir. Besi ortamında bulunan kinetin poliploid hücrelerde selektif hücre bölünmesine neden olmaktadır. Büyüme düzenleyicileri dışındaki besi elementi komponentleri de in vitro kültürde genetik stabiliteyi etkileyebilmektedirler.

114 Alt kültür sayısı Genel olarak alt kültür sayısı arttıkça ve kültür süresi uzadıkça in vitro kültürde genetik varyasyonun ortaya çıkma şansı artmaktadır.alt kültür sayısının artması ile birlikte genellikle kallus ve hücre kültürlerinde rejenerasyon kapasitesi azalmaktadır.

115 Somaklonal varyasyonun bitki ıslahında kullanılması Bugüne kadar yapılan araştırmalarda birçok bitki türlerinde somaklonal varyasyon saptanmıştır.ortaya çıkan bu varyasyonun çoğunlukla gerçek mutasyon olduğu ortaya çıkmıştır.bu nedenle bugün kullanılan in vitro kültür yöntemlerinin mutagen bir karaktere sahip oldukları sonucu ortaya çıkmaktadır.

116 Henüz somaklonal varyasyonun bitki ıslahında kullanılması bilinen mutasyon ıslahına göre bir avantaj sağlamamaktadır.bununla birlikte bugün özellikle bazı hastalıkların toksinlere karşı in vitro seleksiyon yöntemleri geliştirilmiş ve bitki ıslahı programlarında kullanılmaya başlanmıştır. Stres faktörü tanımlandığı ve in vitro koşullarda uygulanabildiği takdirde tüm stres faktörleri için in vitro seleksiyon yapmak mümkündür.

117 Somaklonal varyasyonun avantajları Hızlı bir varyasyon kaynağı olarak elverişlidir. Bazı değişmeler yüksek frekanslarda meydana gelebilir. Agronomik özellikler değişebilir. Bazı değişimler homozigottur. Yeni varyantlar ortaya çıkabilir. Yeni varyeteler üretilebilir

118 Somaklonal varyasyonun dezavantajları Bitki biyoteknolojisinde bitki ıslahı teknikleri somatik hücrelerden rejenerasyona dayanmaktadır. Bu tür bitkiler somaklonal varyasyonun etkisi altındadır. Ancak istenmeyen mutantlar ayrılabilir. Fakat bu çok yıllık bitkiler için mümkün olmamaktadır. Bazı istenmeyen mutasyonlar hemen tanınamayacak ve bu yüzden bu mutantlar uzaklaştırılamayacaktır. Somaklonal varyasyon, hücre kültürlerinde sekonder metabolit üretimini de etkilemektedir.

119 Somatik melezleme nedir? Somatik melezleme, iki protoplastın çekirdek, sitoplazma veya her ikisinin de birbiriyle belirli ortam ve şartlarda birleştirilmesidir. Birleşme sonucu oluşan yapılara füzyon ürünleri veya heterokaryon denir. Bu birleşme sonucu oluşan bitki sitoplazmalar (sibrit), çekirdekler (hibrit) veya her iki bakımdan da somatik melez olabilir.

120 Somatik melezlerin elde edilmesi Somatik melezlerin elde edilebimesi için aşağıdaki işlemlerin yapılması gerekmektedir. 1. Hücre duvarlarının enzimlerle parçalanarak protoplastlarının elde edilmesi 2. İki farkli türe ait protoplastların birleşiminin sağlanması 3. Somatik melezlerin selekte edilmesi 4. Melez protoplastların kültür edilmesi 5. Melez bitkilerin rejenerasyonu

121 Somatik melezlerin seleksiyonu Somatik melezlemeden sonra en büyük problem somatik melezleri ayırt etmektir.karışık bir protoplast popülasyonundan melez protoplastların selekte edilmesinde bir çok yöntem kullanılmaktadır.

122 Direkt izolasyon: Bu yöntemde, protoplastlar mikroskop altında incelenerek füzyona uğramış protoplastlar direkt olarak izole edilmektedir. Gözle izolasyon: Bu yöntemde, klorofil içermeyen ve tipik sitoplazmik kenarlara sahip bir protoplast, kloroplast içeren protoplastlarla füzyona uğradığında melez protoplastın kloroplast içermesi ve tipik sitoplazmik kenara sahip olması ile ayırt edilmektedir.

123 Protoplastların boyanması: Bu yöntemde, iki türün protoplastları farklı boyalarla boyanmaktadır.protoplast füzyonundan sonra elde edilen protoplast populasyonu hücre ayırt edici olarak adlandırılan bir düzenekten geçirilir.bu düzenekte protoplastlar lazer ışınından geçer.bu geçiş sırasında hücreler ışık enerjisini absorbe eder.bu enerjinin bir kısmı farklı renklerdeki floresans ışığı olarak etrafa saçılır.etrafa saçılan bu ışığın rengine göre melez protoplastlar ayırt edilir.

124 Fiziksel karakterlere göre seleksiyon: Bu yöntemde, melez protoplastlar ile füzyona uğramamış protoplastlar arasındaki elektrik yükü farklılığından yararlanılarak melez protoplastlar seçilir. Genetik özelliklerinden yararlanarak seleksiyon: Bu yöntemde, örneğin herhangi bir kimyasala karşı rezistant olan bir türün protoplastları ile füzyonu uğratılır.elde edilen protoplast popülasyonu her iki kimyasalı içeren solüsyonda kültür edildiğinde, yalnızca melez protoplastlar yaşayabileceğinden bunlar kolaylıkla ayırt edilebilir. Heterosis etkisinden yararlanma:klorofil eksikliği gösteren protoplastlar normal klorofilli protoplastlarla füzyona uğradıgında ortaya çıkan melez hücreler her iki ebeveynden daha iyi büyüme göstermektedir.

125 Somatik melezlemenin bitki ıslahında önemi Bilinen klasik ıslah yöntemleriyle gerçekleştirilemeyen melezlemeleri somatik melezleme ile gerçekleştirmek mümkündür.örneğin, kültür patatesi (Solanum tuberosum) bir çok hastalığa karşı çok hassastır. Yabani bir patates türü olan Solanum brevidens ise yumru oluşturmayan, fakat bir çok hastalığa dayanıklı bir türdür. Bu iki türü bilinen klasik yöntemle melezleyerek, kültür patatesine hastalığa dayanıklılık karakterlerini aktarmak olanaksızdır.somatik melezleme yoluyla bu iki türün protoplastlarının füzyonu ile hem hastalıklara dayanıklı, hem de yumru oluşturan melez patates bitkilerini elde etmek mümkün olmuştur.

126 Kolkisinin uygulaması ile tetraploid bitkilerin elde edilmesi başarısız olduğunda somatik melezleme alternatif bir yöntem olarak kullanılabilir. Seksüel organları anormal olan veya erkek kısırlık gösteren türler arasında somatik melezlemeler yapmak mümkündür. Generatif döneme erişmeleri çok uzun süren türleri, bu dönemi beklemeden melezlemeye olanak sağlar. Seksüel üremede baba bitkinin yalnızca çekirdekte bulunan genetik karakterleri yavrulara aktarılır.somatik melezlemede ise oluşan melez her iki ebeveynin hem çekirdek, hem de sitoplazmada bulunan genetik karakterlerini taşır.

127 Somatik melezlemede karşılaşılan problemler o Protoplast füzyonundan sonra melez protoplastları ayırt etmek için halen etkin bir seleksiyon yöntemi yoktur. o Oluşan somatik melez genellikle genetik olarak dengesizdir.bu nedenle özellikle çok farklı türlerin somatik melezlemelerinde oluşan melezler yaşama gücünde değildir. o Somatik melezleme sonucu oluşan bitkiler büyük bir varyasyon gösterir.

128 Protoplast füzyonu sonunda bazı durumlarda iki protoplastın çekirdekleri birleşmeyerek ayrı ayrı bölünmeye devam eder. Sonuçta kimerik karakterde kallus oluşur.oluşan bu kallustan rejenere olan bitkiler melez özelliği göstermez.

129 Günümüzde yalnız belirli sayıdaki türler arasında somatik melezlemeler yapmak mümkün olmaktadır.çünkü bir çok türde henüz rejenere olabilir protoplast kültürleri elde edilememiştir. Örneğin buğdaygiller familyasında çeltik dışındaki türlerde rejenere olabilir protoplast kültürlerinin elde edilmesi oldukça güçtür.

130 Sonuçlar Bitki ıslahında doğal varyasyonun daraldığı veya varyasyon meydana getirmenin zor olduğu durumlarda avantajlı olarak değerlendirilen somaklonal varyasyon yeni bir kaynak olarak görülmektedir. Bilinen klasik ıslah yöntemleriyle gerçekleştirilemeyen melezlemeleri somatik melezleme ile gerçekleştirmek mümkündür.

131 BİTKİ DOKU KÜLTÜRÜ Hazırlayan: Yunus Emre Arvas ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ

132 Meristem, Sürgün ve Tomurcuk Kültürü İçindekiler 1. MERİSTEM KÜLTÜRÜ 2. SÜRGÜN UCU 3. TOMURCUK KÜLTÜRÜ 4. MERİSTEM, SÜRGÜN UCU VE TOMURCUK KÜLTÜRÜNÜN BİTKİ YETİŞTİRME VE ISLAHINDAKİ KULLANIM ALANLARI 5. MERİSTEM VE SÜRGÜN UCU, TOMURCUK KÜLTÜRÜNDE BAŞARIYI ETKİLEYEN FAKTÖRLER 6. MERİSTEM VE SÜRGÜN UCU, TOMURCUK KÜLTÜRÜNÜN UYGULANMASI

133 1. Meristem Kültürü Bitkilerin büyüme konileri veya büyüme konisi yanında birkaç yaprak primordiasının steril koşullarda suni besi ortamlarında kültür elde edilerek bunlardan tam teşekküllü bitkiler elde edilmesidir.

134 2. Sürgün ucu kültürü Büyümekte olan sürgünlerin 2 cm den kısa uç kısımlarının steril koşullarda suni besi ortamlarında kültür elde edilerek bunlardan tam teşekküllü bitkiler elde edilmesidir.

135

136 3. Tomurcuk kültürü Büyümekte olan veya dormant durumundaki sürgünlerden izole edilen tepe veya koltuk altı tomurcuklarının steril koşullarda suni besi ortamlarında kültür edilerek bunlardan tam teşekküllü bitkiler elde edilmesidir.

137 4. Meristem, Sürgün Ucu Ve Tomurcuk Kültürünün Bitki Yetiştirme Ve Islahındaki Kullanım Alanları 4.1. Mikroçoğaltım 4.2. Virüssüz bitki eldesi 4.3. Germplazm muhafazası 4.4. Gen transferi

138 4.1. Mikro çoğaltım Organik meristemlerden henüz olgunlaşmamış veya olgunlaşmasını tamamlamış somatik hücrelerden direkt (organogenesis veya somatik embriyogenesis) veya indirekt (kallus, protoplast) yollarla bitkilerin çoğaltılması ve köklendirilmesi işlemine genel olarak mikroçoğaltım denir.

139 Daha az sürgün elde edilmesine rağmen uç ve yan meristemlerden kitle çoğaltım ticari olarak diğerlerinden daha fazla olarak kullanılan bir metottur.

140

141 4.2. Virüssüz Bitki Elde Edilmesi Bitki kullanım alanı ve ıslah metotlarınden biri olan virüssüz bitki eldesi istenilmeyen her türlü hastalıktan, genetik tozlaşmadan vs. arındırılmış ve uzaklaştırılmış olan bitkilerin eldesi ve üretilip çoğaltılmasını sağlar.

142 Virüssüz Bitki Elde Edilmesi Kısacası virüslere dayanıklı çeşitlerin elde edilmesini ve geliştirilmesini amaçlar Virüssüz bitki elde etme yöntemi Virüssüz bitkilerin üretilme aşamaları

143 Yöntemi Bu yöntem 6 adımda gerçekleşir; Sıcaklık Hastalıksız bitki elde edilmesinde meristem kültürü Sıcaklık uygulamasından sonra meristem kültürü

144 Virüssüz Bitki Elde Etme Yöntemi Kimyasal uygulaması ile birlikte meristem kültürü Adventif sürgün oluşumundan sonra meristem kültürü: Meristemlerin virüssüz anaçlara aşılanması

145

146 4.2.1 Sıcaklık: Bazı virüslerin inaktif durumda olması için sıcaklık etkili bir yoldur. Dikkat edilmesi gereken husus bitkinin aktif virüsün inaktif olduğu aralık ve uygulama zamanı seçilmelidir.. Meyve ağaçları, şeker kamışı, kassava bitkilerinde bu uygulama etkindir.

147 Hastalıksız Bitki Elde Edilmesinde Meristem Kültürü I. Çok az miktarlarda bitki büyüme düzenleyicileri ilave edildiğinde uç ve yan meristemlerden birçok yeni bitkicikler elde edilebilmektedir. II. Bu metotla elde edilen bitkiler her bakımdan birbirinin benzeridirler. Örn: Özellikle bahçe bitkilerinde, patates, çim, tütünde bu yöntem kullanılır..

148 4.2.3 Sıcaklık uygulamasından sonra meristem kültürü: Bazı bitkilerde birden fazla virüs olması ihtimaline karşılık hastalıksız meristem kültürü yapabilmek için meristemlerin alınacağı sürgünlere sıcaklık uygulaması yapılır. Böylelikle virüs konsantrasyonu azaltılır yada virüssüz alan çoğaltılmış olur bu işlemin faydasıda daha büyük eksplant kullanılmasını sağlamaktır.

149 4.2.4 Kimyasal Uygulaması İle Birlikte Meristem Kültürü Bu teknik sınırlı bir başarı sağlamış, ve antivirüs kimyasalların virüsler üzerinde farklı sonuçlar ortaya çıkarmış.

150 4.2.5 Adventif Sürgün Oluşumundan Sonra Meristem Kültürü Bu teknik zambaklarda verimli neticeler vermiş.. Alınan verimli materyaller meristem kültür ortamına aktarılmış ve virüssüz bitkiler oluşmuştur.. Zambaklar dışında petunya, tütün, kabak bitkilerinde verimli neticeler alınmıştır.. Bu bitkilerin yapraklarının bir kısmı virüssüz olduğu görülmüş ve bu kısımların in vitro ortamlarda virüssüsz adventif sürügünlerin rejenere oldugu müşahede edilmiş.

151 4.2.6 Meristemlerin Virüssüz Anaçlara Aşılanması Meristemlerin in vitro koşullarda büyütülemediği veye meristemden oluşan sürgünün kök oluşturamadığı durumlarda, meristem anaca aşılanır ve in vitro koşullarda büyütülür veya çoğaltılır.. Zaten bu uygulama mikro aşılama diye biliniyor.. Turunçgillerde, kayısıda bu yöntem uygulanıyor.

152 4.2.2.Virüssüz Bitkilerin Üretilme Aşamaları 1-bitkideki virüsler tanımlanmalı 2- virüsün temizlenmesi için gerekli uygulamalar yapılmalı 3- elde edilen bitkilere virüs testi uygulanmalı 4- bitkiye tekrardan virüs bulaşmaması için gerekli önlemler alınmalı.

153 4.4 Germplazm(genetik Materyal) Muhafazası: Totipotent hücrelerin in vitro kültürü, kallus veya süspansiyon hücreleri şeklinde uzun süreli olarak veya belirli aralıklarla yeniden oluşturularak saklanabilir ve ihtiyaç duyulduğunda bu hücrelerden yeni bitkiler oluşturulabilir.

154 Bu hücreler, meristemler veya minyatür bitkiler düşük sıcaklıkta (4 C), çok az besin maddesine ve alana ihtiyaç duyarak aseptik şartlarda saklanabilir (1-4 yıl) Benzer şekilde çok düşük sıcaklıklarda (-196 C), sıvı azot içinde doku ve hücreler hızlı bir şekilde dondurularak saklanabilir.

155 Genetik Materyalin Muhafazası Esnasında Dikkat Edilmesi Gereken Hususlar A- muhafaza edilen materyal herhangi bir değişikliğe uğramamalı B- muhafaza süresi sonunda materyal tekrardan kullanılabilmelidir yani büyüme ve gelişmesi devam edebilmeli C- muhafaza yöntemi farklı koşullarda farklı bitkiler içinde uygulanabilmeli D- uygulanan muhafaza tekniği materyalde seleksiyon etkisi yapmamalı E- uygulanan yöntem çok pahalı olmamalı ve kolay uygulanabilmeli..

156 Genetik Materyalin Meristem, Sürgün Ucu Ve Tomurcuk Şeklinde Muhafaza Edilmesi Yöntemleri Büyümenin yavaşlatılması Çok düşük sıcaklıkta sıvı azot içerisinde muhafaza(cryopreservation) Cryopreservation tekniğinin uygulanması Steril koşullarda Meristtemlerin izolasyon ve kültüre alınması Dona karşı kimyasalların kullanılması Meristemlerin dondurulması Meristem depolama Buzun çözülmesi ve Meristemlerin yeniden kültürlenmesi

157 Meristemlerin Dondurulması Yavas Dondurma Hızlı dondurma Damla halinde dondurma

158 Yavas dondurma: Bu yöntem fazla miktarda su içeren bitki dondurulmasında kullanılıyor.özel olarak üretilmiş materyaller kullanılıyor.. Meristemler C/dk olacak şekilde yavaş yavaş C kadar soğutuluyor.. Örn: bezelye, çilek Dikkat : Özel yapılmış materyallerdondorucular- sadece burada kullanılıyor..

159 Hızlı Dondurma Bu işlem dona karşı koruyucu maddelerle muhafaza edilmiş meristemlerin sıvı azot içine daldırılması ile olur. Dikkat edilmesi gereken husus dondurma esnasında hücrelerin arasında buzun oluşmasını engelleyerek meristemlerin canlı kalmasını sağlamaktır.

160 Hızlı Dondurma Not: Bu yöntem cok sayıda stoplazması bulunan ama az sayıda vakuol bulunan bitkilerde uygulanır. Örnek: Karanfil-ilk kez 1976-, patates, çilek

161 Damla Halinde Dondurma Bu yöntem kassava meristemlerinin dondurulması için geliştirilmiş. Dona karşı koruyucu kimyasal çözelti steril bir petri kabına 18µm lik şeritler halinde yerleştirilen alimünyum kağıtlar üzerine 2-3µm lik damlalar damlatılır her petri kabına meristem yerleştirilir. Petri kabları 0,5 C/dk soğutma hızı

162 Meristem Depolama Dondurulan meristemler sıvı azot içinde depo edilir. Dikkat edilmesi gereken husus meristem bütünüyle azot içinde kalmalıdır..

163 Meristemlerin Buzunun Çözülmesi ve Yeniden Kültürlenmesi Sıvı azot içindeki meristemler çıkarılır çıkarılmaz c su banyolarına konulur. buzlar çözündükten sonra uygun besi ortamında kültürlere alınır..

164 Genetik Transformasyon Gen transferi: Doku kültürlerinin bitkileri iyileştirmede en önemli ve yaygın olarak kullanılan uygulamalarından birisi de, gen veya genlerin bitkilere aktarılmasıdır. Monokotiledon ve dikotiledon bitkilerde bir DNA parçasının aktarımında çok farklı yöntemler kullanılır.. Dikotiledon bitkilerde genelde agrobacteriyum bakterisi kullanılıyor. Meristem ve sürgün ucu

165 Bu yöntemde genelde yaprak disklerine gen taransformasyonu yapılıyor 1- adventif sürgün oluşumu sırasında kallus oluşursa somaklonal varyasyon riski artar.. 2- kallus fazı olmaksızın yaprak disklerinden sürgünde rejenerasyonu gerçekleşebilir fakat buda bazı genotiplere bağlı kalıp bazı belirli genotiplerde söz konusu olabiliyor..(bazı türlerde)

166 Bununla beraber birçok bitkide kallus oluşmadan fertil bitkiler rejenere oluyor.. Bundan dolayı meristem ve sürgün ucu kültürlerinde agrobacteriyum bakterisi aracılıgıyla gen transferinde yaprak disklerine alternatif olarak görülmektedir..

167 Genetik Transformasyonda Sınırlılık: 1- halen transformasyon frekansının çok düşük olması 2- kimerik transgenik bitkilerin ortaya çıkması meristem ve sürgün uçlarının gen transferinde kullanılmasını sınırlandırmaktadır.

168 Not: yakın zamana kadar meristem ve sürgün uçlarının, gen transferinde kullanılamayacağına inanılıyordu.. Ve ilk olarak petunya bitkisinde agrobacteriyum aracılığıyla gen transferi gerçekleşiyor.. Daha sonra da ise bezelye, ayçiçeği, mısır (transgenik bitki eldesi)

169 4. MERİSTEM VE SÜRGÜN UCU, TOMURCUK KÜLTÜRÜNÜN UYGULANMASI

170 5. Meristem Ve Sürgün Ucu, Tomurcuk Kültüründe Başarı Faktörleri 5.1 Bitki Materyali Eksplantın Büyüklüğü Tomurcuğun Bitki Üzerinde Yeri Mevsim 5.2 Besi Ortamı

171 5.1 Bitki materyali 5.1 Eksplantın büyüklüğü Genel olarak in vitro kültürde kullanılan eksplant büyüdükçe eksplantın in vitro gelişme şansıda artar. İn vitro çoğaltma amacıyla çok küçük meristemler yerine tomurcuk veya sürgün uçlarının kullanılması gerekir, ama eğer amaç virüssüz bitki elde etmek ise olabildiğince küçük meristemler kullanılmalıdır.

172 Tomurcuğun Bitki Üzerindeki Yeri Sürgün ucundan alınan eksplantlar sürgün tabanından alınanlara göre daha genç durumdadırlar.. Genellikle genç gelişme devresi sürgün rejeneresyonu için optimumdur.

173 Mevsim Eksplantın alındığı mevsim oldukça önemlidir. Belirli bir dormansi periyoduna sahip bitkilerde eksplantlar bu dormansi periyodunun sonunda alındığında en iyi sonuçlar elde edilecektir.

174 5.2. Besi Ortamı Besi ortamının mineral madde kompozizyonu ve ilave edilmesi gereken büyüme düzenleyicilerinin çeşidi ve konsantrasyonu bitki türüne ve özelliklede kültür dönemine bağlı olarak değişir.

175 5.2.1 Eksplant Gelişmesi- 1.Dönem- Bu evrede bitkide sitokinin eksikliği olur bitkiye sitokinin ilave edilmesi gerekir.. En fazla istimal edilen sitokininler: kinetin, BA(benziladenin), 2iP dir.

176 Sürgün Çoğaltma Dönemi- 2.Dönem- Burda da amaç mümkün oldukça çok sayıda sürgün elde etmektir.. Yine sitokinin ihtiyacı vardır Köklendirme Dönemi : Bir önceki aşamada elde edilen sürgünlerin köklendirilmesi amaçlanır. Köklendirmede dikkat edilmesi gereken husus mineral maddelerin konsantrasyonu azaltılmalıdır.. Sitokinin ihtiyacı azdır, burada auxin NAA sık sık ilave edilmelidir.

177 5.3. Genotip Belirli bir türün genotipi için geliştirilen meristem, sürgün ucu ve tomurcuk kültürü tekniği söz konusu türün diğer bir çok genotipi için de kullanılır.

178 Örnek olarak Ege Bölgesi nde ekonomik olarak önemli verim ve kalite kayıplarına yol açan virüslerle enfekteli olduğu düşünülen patates çeşitlerinin meristem külrünü inceleyeceğiz.. Materyal 1-Bitkisel Materyal 2- Serolojik Tanı Çalışmalarında Kullanılan Materyal 3- Kültür Ortamlarının Hazırlanmasında Kullanılan Materyal 4- Mini Yumru Üretiminde Kullanılan Materyal

179 Yöntem A- Patates Örneklerinde Virüs Varlığının Saptanmasına Yönelik Çalışmalar B- Meristem Kültürü İçin Laboratuvar Koşullarının Hazırlanması C- Meristem ve Nod Kültürü Besin Ortamlarının Hazırlanması D- Meristem Kültürü ve Nod Kültürü Çalışmaları E- In vitro Patates Fidelerinin

180 1- Bitkisel Materyal Ege Bölgesi nde ekonomik olarak önemli verim ve kalite kayıplarına yol açan virüslerle enfekteli olduğu düşünülen patates çeşitlerine ait yumru örnekleri üreticilerden ve depolardan temin edilmiştir. Bölgemiz ekolojisine uyum sağlamış ve yaygın olarak üretimi yapılan Çizelge 3.1 ve Çizelge 3.2 de kökenleri ve bazı özellikleri yer alan

181

182 Agata, Agria, Granola, Hermes, Konsul, Lady Claire, Lady Rosetta, Latona, Marabel, Marfona, Milva, Russet Burbank, Resy, Sante, Shepody, Van Gogh, Victoria çeşitlerine ait patates örnekleri ayrı kese kağıtlarına konulduktan sonra etiketlenmiştir. Virüs varlığı saptanmak üzere 4 C de soğuk

183 2- Serolojik Tanı Çalışmalarında Kullanılan Materyal Çalışmada kullanılan bitkisel materyallerde ve yumrulardaki virüslerin tanılanmasında serolojik yöntemlerden biri olan DAS- ELISA testi uygulanmıştır. Patates yumrularında, meristem kültüründen gelişen in vitro fidelerde ve bunların toprağa aktarıldığında gelişen bitkilerin yaprak ve mini yumrularında enfeksiyon ve arındırma oranlarının belirlenmesi için kullanılan bu yöntemde BIOREBA AG firmasına ait tanı kitleri, 96 adet çukur içeren tabaklar, pipet ve uçları, çeşitli cam

184 3- Kültür Ortamlarının Hazırlanmasında Kullanılan Materyal Meristem kültürü ve nod kültüründe makro ve mikro elementleri kapsayan çeşitli kimyasal maddeler, hormonlar ve agar içeren besin ortamları kullanılmıştır. Cam tüp, erlen, beher gibi cam malzemeler ve bistüri, makas, pens ve kesiciler gibi metal malzemeler yanında pamuk, filtre kağıdı vb. malzemelerden de yararlanılmıştır.

185 4- Mini Yumru Üretiminde Kullanılan Materyal Enfekteli patates yumrularından alınan meristemlerden gelişen virüsden ari fideler nod kültürü ile çoğaltılmıştır. Yeterli sayıya ulaşıldığında dış koşullara alıştırıldıktan sonra mini yumru elde etmek üzere toprağa aktarılması aşamasında 1:1:1 oranında dezenfekte edilmiş torf: toprak: kum karışımı bulunan değişik çaplara sahip plastik saksı (1 lt lik) ve toprak

186 Yöntem

187 A- Patates Örneklerinde Virüs Varlığının Saptanmasına Yönelik Çalışmalar Üretici tarlaları ve depolardan alınan virüsler ile enfekteli olduğu tahmin edilen yumru örneklerinde mevcut virüslerin tespit edilmesinde, izole edilen meristemlerden gelişen in vitro fidelerde virüs varlığının belirlenmesinde, ayrıca bu fidelerden toprağa aktarılmalarından sonra gelişen in vivo bitkilerden alınan yaprak ve mini yumru örneklerinde virüs enfeksiyon durumunun saptanmasında DAS-ELISA metodu kullanılmıştır.

188 Test edilecek patates yumrularından 3x10 mm boyutlarında silindirik parçalar çıkarılmıştır. Virüs dağılımının homojen olmayabileceği nedeniyle her yumrunun farklı kısımlarından çıkarılan parçalar ekstraksiyon tampon çözeltisinde ezilerek homojenize edilmiştir. Her yumrudan alınan doku örneği için gram başına 10 ml çözelti kullanılmıştır.

189 Tabaklardaki her çukura 200 μl antikor konularak, tabakların üzeri sıkıca kapatılarak 37 C de 2 saat inkübe edilmiştir. İnkubasyonu takiben tabaklar ters çevrilmek suretiyle çukurların içerikleri boşaltılmış ve daha sonra çukurlar 3 kez yıkama tamponu ile yıkanmıştır. Yıkama işleminden sonra örnekler 200 μl hacimle tabaklardaki çukurlara pipet yardımıyla konulmuş ve tabaklar 1 gece süre ile 4 C de

190 Süre sonrasında yıkama işlemi tekrarlanmış, tabaktaki çukurların her birine 200 μl antikor-ap konjugat çözeltisi konulmuş ve tabaklar bantlanarak 37 C de 4 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda tabaklar tekrar yıkanmış ve tabaktaki çukurlara 200 μl substrat çözeltisi konularak oda sıcaklığında 2 saat

191 Sonuçlar Titertek Multiskan MCC 341 ELISA mikroplate okuyucusunda 405 nm dalga boyunda absorbans değerlerinin alınmasıyla elde edilmiştir. Negatif kontrollerin absorbans değerlerinden iki katı ve daha fazla değer veren örnekler pozitif olarak değerlendirilmiştir.

192 B- Meristem Kültürü İçin Laboratuvar Koşullarının Hazırlanması Fidelerin iyi gelişimini sağlamak amacıyla hazırlanan besi ortamının mineraller karbon, nitrojen, vitaminler ve hormonlar yönünden zengin olması nedeniyle bakteri ve fungusların gelişimi için de uygun bir ortam oluşturmaktadır.

193 Çalışmalarda kullanılan saf su ayrı ayrı cam kavanozlar içine konarak otoklavda, 121 C sıcaklıkta 1 atmosfer basınç altında 20 dakika tutularak sterilize edilmiştir. Pens, bistüri, kurutma kağıdı ve cam malzemeler ise alüminyum folyoya sarılıp etüvde C sıcaklıkta 2-3 saat tutulmak suretiyle sterilize edilmiştir.

194 C- Meristem ve Nod Kültürü Besin Ortamlarının Hazırlanması Meristem kültürü ve nod kültüründe kullanılmak üzere (MS) temel ortamının içeriğine, Yıldırım (1987) ile Yıldırım vd. (1995) tarafından önerildiği gibi eklemeler yapılmıştır. Çizelge 3.3 ve Çizelge 3.4 de yer aldığı şekilde inorganik, organik ve gelişim düzenleyicilerin de bulunduğu stok solusyonlar ve katı besin ortamları hazırlanmıştır.

195

196 In vitro şartlarda bitki çoğaltımında önemi olan bitki gelişim düzenleyicilerinden sürgün oluşumunu teşvik eden sitokininler (BA, Kinetin) kök oluşumunu teşvik eden oksinler (IBA, IAA, 2,4-D, NAA) ile MS temel besin ortamına dayalı çoğaltım ortamı desteklenmiştir.

197 Stok solüsyonlardan hazırlanan besin ortamları eşit olarak kültür kaplarına boşaltıldıktan sonra 120 C de 1 atmosfer basınç altında otoklavlanarak sterilize edilmiştir.

198 D- Meristem Kültürü ve Nod Kültürü Çalışmaları Meristem kültüründe kullanmak üzere virüs ile enfekteli yumrular seçilmiştir. Enfekteli olan yumrulardan hemen kullanımı gerekli olmayanlar 4ºC de dormansi kırılıncaya kadar depolanmıştır. Meristem izole edilecek patates yumruları dormansileri kırılmak üzere oda sıcaklığında (24ºC de) dolaylı gün ışığında filizlendirilmiş, 2-3 cm uzunluğundaki sürgünler toplanmıştır.

199 Steril kesim odasındaki laminar kabinde, bitkisel materyal olarak meristemlerin izole edileceği sürgünler 1-2 cm uzunluğunda kesildikten sonra ticari % 2,5 luk NaOCl (sodyum hipoklorit) solüsyonunun içinde ve etil alkol (% 70 lik) içinde birer dakika süre ile tutularak yüzey sterilizasyonu yapılmıştır.

200 Virüs ile enfekteli patates yumrularından meristem izolasyonu. Meristemden gelişen in vitro fideler.

201 şekil: Meristem kültürü aşamaları (Daniel, 2006).

202 Meristemlerin tam bitkiler haline gelmesi aşamalardan geçtikten sonra 5-6 ay kadar bir süre gerekmektedir. Bu süre sonunda meristemden gelişen in vitro fidelere DAS-ELISA testi uygulanarak sağlıklı olanlar belirlenmiştir. Bu evrede klonal kimlik sağlamak için fideler alt kültüre alınmıştır. Meristemden gelişen fideler 6-8 nod evresine geldiğinde steril laminar kabinde kültür tüplerinden çıkarıldıktan sonra kök ve uç kısımları kesilerek atılmıştır. Tekli boğum çelikler nod kültürü için hazırlanan ve kök oluşumu için gerekli kimyasalları içeren özel besin ortamı bulunan cam tüplere, her tüpte birer adet olmak üzere aktarılmıştır.

203 Bitkileri büyüme yanıtına göre her günde alt kültüre alınmıştır. Bu metodla üretilen in vitro bitkiler mini yumru üretimi için kullanılmıştır.

204 E- In vitro Patates Fidelerinin Toprağa Aktarılması Meristemden gelişen in vitro fidelere DAS-ELISA testi uygulanarak sağlıklı olduğu belirlenenler Şekil 3.6 da aşamaları yer alan nod kültürü ile çoğaltılmıştır.

205

206 3-5 haftada 6-7 cm boya ulaşan her fide kültür tüplerinin kapakları açılıp direkt güneş ışığıdan korunarak oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir. Bu şekilde dış ortam koşullarına alıştırılan fideler pens yardımıyla sökülmüş, Şekil 3.6 da görülmekte olduğu gibi saksılarda toprağa aktarılarak sera ve iklim odası koşullarında muhafaza edilmiştir (Sanavy and Moeini, 2003).

207 F- Mini Yumru Elde Edilmesi Toprağa aktarılan fidelerin gelişmesi için ideal ortam koşulları olan, 20-25ºC arası sıcaklık ve %75 üzerindeki nem sağlanmıştır. Laboratuvar koşullarından sonra toprağa aktarım sırasında bitkilerin su kaybını önlemek için direkt güneş ışığından korumak üzere bitkiler gölgede tutulmuştur. Bitki gelişimi için gerekli bakım yapılarak gelişimi sağlanmış ve vejetasyon süresini

208 G- İstatiksel Değerlendirme Bitkilerden elde edilen yumruların ağırlık, boy ve enleri arasındaki farklılığın ve yetiştirme tipine göre olan ayrıcalıkların belirlenmesinde Düzgüneş vd. (1987) nin önerdiği şekilde istatistiki değerlendirme SPSS programı kullanılarak Duncan testine göre gerçekleştirilmiştir.

209

210

211

212 fidelerin sera koşullarında plastik saksıda gelişme evreleri. Meristem izolasyonundan sonra 8. hafta 14.hafta

213 Toprağa aktarımdan sonra 2.hafta 3.hafta

214 5.Hafta 10.hafta

215 Hasat dönemi