ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE Proje Türü Proje No Proje Yöneticisi Proje Konusu : Bağımsız Proje : 12B : Prof. Dr. Alp Can : Sağlık Bilimleri Yukarıda bilgileri yazılı olan projemin sonuç raporunun e-kütüphanede yayınlanmasını; İSTİYORUM İSTEMİYORUM Proje Yöneticisi Prof. Dr. Alp CAN İmza

2 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU İnsan Göbek Kordonu Stroması Mezenkimal Kök Hücrelerinin İmmortal Hale Getirilmesi ve Moleküler Karakterizasyonu Prof. Dr. Alp Can Öğrenci Deniz Balcı 12B /01/ Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara

3 I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri İnsan Göbek Kordonu Stroması Mezenkimal Kök Hücrelerinin İmmortal Hale Getirilmesi ve Moleküler Karakterizasyonu Molecular Characterization and Immortalizing Process of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Yetişkin insan vücudunda ve embriyonda varlığı gösterilen kök hücrelerin in vitro ve in vivo deneylerinde birçoğunun çeşitli dokuları oluşturmak üzere farklılaşabildiği gösterilmiştir. Bunlardan bir grubu da, göbek kordonu içinde yer alan stroma hücreleridir (İGKS-MKH). Bu hücreler özellikle mezenkimal seri hücreleri olan adiposit, kondrosit, osteosit ve myosite olan farklılaşmalar dikkati çekecek kadar ümit vaat edici biçimde ortaya konmuştur. Bunun yanında bu hücreler alıcıda immün yanıt oluşturmamış ve doku reddi ile karşılaşılmamıştır ve bu hücrelerin immün yetmezliği olan SCID farelere verildiğinde teratom oluşturmadığı gözlenmiştir. Bu hücre kaynağı yüksek miktarda elde edilebilme ve multipotent özelliğe sahip olmasıyla önem kazanmıştır. Fakat yaptığımız çalışmalarda in vitro ortama alındıklarında replikatif ömürlerinin sınırlı (P ) olduğu gözlenmiştir. Yaptığımız çalışmalar bu hücrelerin telomeraz aktivitesinin dokudan çıkarıldıklarında ve kültüre edildiklerinde azaldığı yönündedir. Bu nedenle, yaptığımız çalışmada İGKS-MKH lerine retroviral yöntemle Telomerazın katalitik alt birimi olan TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) geni kalıcı olarak aktarılarak, hücreler ölümsüz hale getirilip, sahip oldukları kök hücre özelliklerini koruyup korumadıkları test edilmiştir. Sonuçlarımız, TERT geni ile enfekte edilen İGKS-MKH lerinde TERT geni ifadesinin arttığı ve telomeraz aktivitesinin yükseldiğini göstermektedir. T-İGKS-MKH leri 30 pasaj sonra bile MKH özelliklerini ve tipik hücre morfolojisini korurken, yüksek proliferasyon yeteneği göstermektedir. Öte yandan son dönemde özellikle allojeneik transplantasyonlarda kullanılmak üzere bir dizi MKH serilerinin geliştirildiği izlenmektedir. İnsanda immün yanıt oluşturmadığı kanıtlanan İGKS-MKH nin immortal serilerinin yapımı önemlidir. Bu çalışmada özgün değere sahip bu değerli hücrelere telomeraz aktivitesi kazandırıp ölümsüzleştirerek bu kaynağın potansiyel özelliklerini kaybetmeden korunması sağlanmıştır. Amaç ve Kapsam İGKS-MKH leri in vitro ortama alındıklarında replikatif ömürleri sınırlı olduğundan sürekli bir kaynağa ihtiyaç duyulmaktadır. Bu hücrelerin izolasyonunda ve elde edilmesindeki zorluklar nedeniyle kaynak sıkıntısı çekilmektedir. İGKS-MKH lerine TERT geni aktarımıyla telomeraz aktiviteleri yeniden kazandırılarak, kültüre edilmeleriyle replikatif özellikleri artırılmıştır. İGKS- MKH lerini hücre dizisi haline getirerek sürekli bir hücre kaynağı elde edilmiştir. Piyasada başka kaynaklardan elde edilmiş ölümsüz MKH hatlarına rastlamak mümkün hale gelmiştir. Bu tür bir girişimin diğer bir amacı da, her insandan elde edilen İGKS-MKH nin aynı düzeyde TERT ekspresyonu göstermemesidir. Bir başka deyişle kişiler arasında hücrenin replikatif özelliği çok değişkenlik göstermektedir. Dolayısıyla evrensel bir hücre eldesi mümkün olamamaktadır. Bu çalışmayla TERT ekspresyonu ve transdüksüyon verimliliği yüksek hücreler seçilerek, stabil bir hücre elde edilmesi sağlanmıştır. III. Materyal ve Yöntem

4 Dokuların Toplanması ve Ön İşlem Aşamaları Daha önceki deneyimlerimizden yararlanarak insandan operasyon/doğumhane koşullarında alınan göbek kordonu (yaklaşık 20 cm) özel kompozisyona sahip steril çözelti içinde laboratuvara transfer edildi. Bunun hemen arkasından işleme başlanarak ve temiz oda koşullarında kurulu bulunan laminar akışlı kabin altında damarlar (iki arter ve bir ven) künt diseksiyonla çıkarıldı; ortaya çıkan doku, küçük parçalara ayrıldı. Bu teknikle ilgili ayrıntılı bilgi yakın zamanda yayınlandı (Can and Balci 2011). İnsan Göbek Kordonu Stroma Hücrelerinin İzolasyonu, Kültüre Edilmeleri, Karakterizasyonu ve TERT Transdüksüyonu İnsan göbek kordonu stroması hücrelerinin dokudan izolasyonu konusunda deneyimli olan laboratuvarımız, hücre izolasyonu yapılacak olan doku parçalarından alınan örneklerde enzimatik ve mekanik yollarla hücre izolasyonu yapıp, elde edilen hücrelerin miktarı belirlenerek ve daha önce uygulamış olduğumuz kültür koşulları altında çoğaltıldı (Can and Balci 2011). Her örnek 13 pasaj (P 13 ) süresince pasajlandı. Elde edilen hücrelerin karakterizasyonu için proliferasyon eğrilerinin çıkarılması, morfolojik analizleri, hücre yüzey belirteçlerinin ve hücre içi yapısal proteinlerin yerleşimi/miktarının belirlenmesi, telomer-telomeraz aktivitesinin/ilişkili genlerin miktar analizi Q(RT)-PCR ile yapılarak, MKH özellikleri bakımından uygun olduğu belirlenmiş 3 örnekten elde edilmiş İGKS-MKH leri 4. pasajda, gen aktarımını sağlayacak olan retroviral vektör ve htert geni gibbon ape leukemia virüsü (GALV) içerisine paketlenmiş PG13 packaging hücreleriyle birlikte transdüksüyon işlemine alındı. T-İGKS-MKH leri TERT geni ile birlikte puromycin antibiyotik seçim geni taşıdığından, antibiyotikli besiyerinde kültüre edilerek transfekte hücreler ortamdan seçildi. Seçilen T-İGKS-MK hücreleri kültüre edilerek karakterizasyonu yapıldı. Bunu için proliferasyon eğrilerinin çıkarılması, morfolojik analizlerin yapılması, hücre içi yapısal proteinlerin miktarının belirlenmesi, telomer-telomeraz aktivitesinin/ilişkili genlerin miktar analizi Q(RT)-PCR gerçekleştirildi. İGKS-MKH ve İmmortal İGKS-MKH lerin Mikrodizin Analizi ve Biyoinformatik Analizleri İzole edilerek pasajlar boyunca kültüre edilen İGKS-MK ve T-İGKS-MK hücrelerinden RNA izolasyonu yapılarak, nitelik ve nicelik tayinlerinden sonra izole edilen RNA örneklerinden GeneChip Expression 3 Amplification One Cycle Target Labeling and Control Reagents kullanılarak biotin ile işaretli crna sentezi gerçekleştirildi. İşaretli crna örnekleri Affymetrix HG_U133 Plus 2 GeneChip mikrodizinlerine hibridize edilerek, yıkama boyama işlemlerini takiben Affymetrix GeneChip Scanner 3000 de taranıp GCOS (Gene Chip Operating Software) yazılımında analiz edildi. Bu yazılımın oluşturduğu ham ifade düzeyi değerlerini taşıyan CEL dosyalarının önişlemleri RMA (Robust Microarray analysis Algorithm) algoritması kullanılarak R istatistik hesaplama ve grafik yazılımında diğer biyoinformatik analizler (farklı seviyede olan gen setlerinin belirlenmesi, topaklanma analizi vb.) öncesinde gerçekleştirdi. IV. Analiz ve Bulgular Hücrelerin Kök Hücre Özellikleri ve Morfolojileri İGK dokusundan elde edilen doku parçalarından hem enzimatik hem de eksplant yöntemiyle izole edilen hücrelerin hücre morfolojileri incelendiğinde, izolasyon yönteminin hücre popülasyonunu değiştirdiği gözlendi. Mekanik yöntemle izolasyon sonucu kültür kabına tutunan hücrelerin çoğunluğunun ince-uzun fibroblast görünümündeki tip 2 hücrelerden oluştuğu, tip 1 hücrelerin ise varlığının %10 u geçmediği gözlendi. Enzimatik izolasyon yöntemiyle kültüre edilen hücrelerin morfolojileri incelendiğinde tip 1 geniş sitoplazmalı, yassı ve stres liflerince zengin

5 hücrelerin ortamda mekanik yönteme kıyasla fazla olduğu, bunun yanı sıra tip 2 hücrelerin de ortamda bulunduğu, pasajlar ilerledikçe tip 2 hücrelerin ortamda baskın hale geldiği gözlendi (Tablo 1). Tip 1 (yayvan) Eksplant %10 %90 Enzimatik %25 %75 Tip 2 (ince-uzun) Tablo 1. Eksplant ve mekanik izolasyon sonucu elde edilen İGK-MKH morfolojilerinin karşılaştırılması MKH yüzey belirteçlerinden CD105, CD90 ve CD73 i %90 ın üzerinde ifade ettiği ve Hematopoetik hücre yüzey belirteçler olan CD34, CD45 i ifade etmediği belirlenmiş 3 örnekten elde edilmiş İGKS-MKH leri 4. pasajda PG13 hücreleriyle birlikte transdüksüyon işlemine alındı. Enfekte edilen hücrelerin ortamdan seçilebilmeleri için, hücreler 15 gün süreyle puromycinli ortamda kültüre edildi. Bu seleksiyon sonucunda, efekte edilmeyen, İGKS-MKH, kontrol grubunda hiçbir canlı hücre kalmadığı gözlendi. T-İGKS-MKH grubunda ise, çok sayıda canlı hücre sağkalımı izlendi (Şekil 1). T-İGKS-MKH lerinin seleksiyonu 5 hafta süreyle devam ettirildikten sonra, bu hücrelerin karakterize edilmesi için, antibiyotiksiz normal besi yerine geçilerek pasajlarına devam edildi. Hücrelerin Çoğalma Karakterleri İGKS-MKH ve T-İGKS-MKH lerinin kültür ortamındaki çoğalma yetenekleri seri pasajlar yapılarak incelendiğinde, TERT geni aktarılan ve aktarılmayan hücrelerin erken pasajlardaki çoğalma davranışlarının benzer olduğu gözlendi. Fakat 10. pasajdan sonra İGKS-MKH lerinin çoğalma davranışının giderek düştüğü ve pasaj13 ve pasaj17 arasında en düşük seviyeye ulaştığı izlendi. Buna karşın, T-İGKS-MKH lerinin 30. pasajda çoğalma davranışında bir düşüş olmadığı gözlendi.

6 Şekil 1. Hücrelerin iki hafta süreyle puromycin ile seleksiyonu

7 Popülasyonu İki Ka0na Çıkarma Düzeyi (PDL) 45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 P1 P3 P5 P7 P9 P11 P13 P15 P17 P19 P21 P23 P25 P27 P29 İGK- MKH htert+ İGK- MKH Pasaj Sayısı Şekil 2. İGKS-MKH ve T-İGKS-MKH lerinin büyüme eğrisi. Hücrelerdeki TERT Geni Aktivitesinin ve İfadesinin Analizi Üç farklı kişiden elde edilen T-İGKS-MKH ve İGKS-MKH lerinden TRIzol yöntemi ile RNA izolasyonu yapılarak, htert geni ifadesi, enfekte edilen ve edilmeyen gruplarda LightCycler 480 (Roche, İsviçre) cihazında SYBR green tekniği kullanılarak, QRT-PCR yöntemi ile karşılaştırıldı. Amplifikasyon ürününün özgül olup olmadığı, agaroz jel elektroforezi ile incelendi. Bununla birlikte Real Time PCR cihazlarında primer dimer oluşumu ve özgül olmayan amplifikasyon ürünlerinin tespiti için melting curve (erime eğrisi) analizi yapıldı. Deneylerde tüm cdna örnekleri ve standart örnekler aynı şartlarda ve aynı grup içerisinde üçer kez çalışılarak analizlerde bu üç ölçümün ortalaması kullanıldı. Normalizasyon amacıyla her hücrede aynı miktarda ifade edilen, zorunlu idare geni (housekeeping) RPL13A miktarı deney gruplarındaki hücrelerde ifade düzeyleri karşılaştırılarak incelendi. Kalibratör olarak htert ifade ettiği bilinen HELA hücreleri kullanıldı. Genlerin ifadelerinin bağıl olarak ölçülebilmesi amacıyla standart eğrilerin eğimi hesaplanarak amplifikasyon verimliliği (E) belirlendi ve Pfaffl yöntemi kullanıldı. htert geni aktarılan ve aktarılmayan gruplardaki, ayrıca bir başka mezenkimal kök hücre kaynağı olan kemik iliği BM-MKH lerindeki htert geni ifadesinin HELA hücrelerine kıyasla logaritmik olarak kat artışı Şekil 3 de gösterildi. Buna göre, TERT geni İGKS-MKH lerinde çok düşük seviyede ifade edilirken, T-İGKS-MKH lerinde ise bu ifadenin 2500 kat arttığı gözlendi (Şekil 3).

8 htert Kat Ar0şı ,1 0,01 S63P4 TERT- S73P4 TERT- S78P4 TERT- S63P18 TERT+ S73P18 TERT+ S78P18 TERT+ HELA BM 0,001 0,0001 Şekil 3. HELA hücrerine kıyasla, İGKS-MKH ve T-İGKS-MKH lerindeki TERT geni ifadesi İGKS-MKH ve T-İGKS-MKH lerindeki Telomeraz aktivitesi Elisa tabanlı TRAP analizi ile değerlendirildiğinde, T-İGKS-MKH lerindeki telomeraz aktivitesinin, İGKS-MKH lerine oranla 15 kat artış gösterdiği gözlendi (Şekil 4). 0,6 0,5 Telomeraz Aktivitesi 0,4 0,3 0,2 0,1 0 T-İGKS-MKH İGKS-MKH Pozitif kontrol Şekil 4. İGKS-MKH ve T-İGKS-MKH lerindeki Telomeraz aktivitesi Eliza tabanlı TRAP analizi ile incelendi. T-İGKS-MKH leri enfekte edilmeyen grupla kıyaslandığında *P<0,05 ortalama±sd, n=3. Hücredeki Yapısal Genlerin İfade Analizi İGKS-MKH lerine TERT geni aktarımından sonra, hücrelerin sahip olduğu kök hücre karakterinin korunup korunmadığının anlaşılması için ifade ettiği bilinen bazı pluripotent ve yapısal genler incelendi. Buna göre, İGKS-MKH lerinin ifade ettiği bilinen vimentin ve ASMA düzeyinde anlamlı bir fark gözlenmezken, pluripotensiyle ilişkili olduğu bilinen Nanog düzeyinde 9 katlık bir artış olurken, Oct3/4 düzeyinde 14 katlık bir azalma olduğu gözlendi.

9 15 İGKS-MKH Göre Kat Değişimi Nanog Oct3/4 Vimentin ASMA -20 Hücrelerin Mikrodizin ve Biyoinformatik Analizleri İzole edilerek pasajlar boyunca kültüre edilen İGKS-MKH ve T-İGKS-MKH lerinden RNA izolasyonu yapılarak, nitelik ve nicelik tayinlerinden sonra izole edilen RNA örnekleri ile mikrodizin analizi yapıldı. Analiz sonucunda elde edilen cell dosyalarının biyoinformatik analizleri yapılarak aday genlerin ve yolakların belirlenme süreci devam etmektedir. V. Sonuç ve Öneriler Elde edilen bu sonuçlara göre, puromycin seleksiyonu sonucu kültür ortamında sadece htert geni aktarılan hücrelerin kaldığı ve elde edilen bu hücrelerin htert genini yüksek oranda ifade ettikleri görülmüştür. htert geni aktarılmayan kontrol grubundaki hücreler 10. pasajdan (P10) sonra yaşlanmaya başlamış ve bölünme yeteneklerini kaybetmişlerdir. Buna rağmen htert geni aktarılan gruptaki hücrelerin pasaj sürelerinin kontrol grubuna göre uzadığı görülmüştür. 30. pasajda, htert geni aktarılan gruptaki hücrelerin morfolojilerinin sağlıklı ve proliferasyon dinamiklerinin yüksek olduğu görülmüştür. Bu sonuçlar ışığında, İGKS- MKH leri retroviral gen aktarımıyla başarılı bir şekilde ektopik olarak TERT geni ifade etmeleri sağlanarak, ölümsüz hale getirilmiştir. T-İGKS-MKH leri tipik hücre morfolojilerini ve MKH özelliklerini korumaktadır. T-İGKS-MKH leri daha yüksek çoğalma kapasitesine ulaşarak araştırma çalışmalarda kullanılabilecek önemli bir hücre kaynağı olduğunu göstermektedir. VI. Geleceğe İlişkin Öngörülen Katkılar İGKS-MKH lerinin izole edilmelerindeki teknik zorluklar ve kültür ortamında sınırlı bir çoğalma yeteneğine sahip olmaları, kök hücre kaynakları içerisinde önemli bir yere sahip olan bu hücrelerin araştırma çalışmalarında kullanımını sınırlamaktadır. Bu önemli MKH kaynağı ölümsüz hale getirilerek bu sınırlamalar ortadan kaldırılmıştır. VII. Sağlanan Altyapı Olanakları ile Varsa Gerçekleştirilen Projeler Projeden Altyapı desteği sağlanmamıştır.

10 VIII. Sağlanan Altyapı Olanaklarının Varsa Bilim/Hizmet ve Eğitim Alanlarındaki Katkıları Projeden Altyapı desteği sağlanmamıştır. IX. Kaynaklar Bankowski, E., K. Sobolewski, et al. (2004). "Decreased expression of the insulin-like growth factor-i-binding protein-1 (IGFBP-1) phosphoisoform in pre-eclamptic Wharton's jelly and its role in the regulation of collagen biosynthesis." Clin Chem Lab Med 42(2): Can, A. and D. Balci (2011). "Isolation, culture, and characterization of human umbilical cord stroma-derived mesenchymal stem cells." Methods Mol Biol 698: Can, A. and S. Karahuseyinoglu (2007). "Concise review: human umbilical cord stroma with regard to the source of fetus-derived stem cells." Stem Cells 25(11): Carlin, R., D. Davis, et al. (2006). "Expression of early transcription factors Oct4, Sox2 and Nanog by porcine umbilical cord (PUC) matrix cells." Reprod Biol Endocrinol 4(1): 8. Chou, Y. H., O. Skalli, et al. (1997). "Intermediate filaments and cytoplasmic networking: new connections and more functions." Curr Opin Cell Biol 9(1): Conconi, M. T., P. Burra, et al. (2006). "CD105(+) cells from Wharton's jelly show in vitro and in vivo myogenic differentiative potential." Int J Mol Med 18(6): Counter (1998). "Dissociation among in vitro telomerase activity, telomere maintenance and cellular immortalization." De Lange, T. (2004 ). "T-loops and the origin of telomeres..pdf>." De Lange, T. (2002). "Protection of mammalian telomeres.pdf>." Dominici, M., K. Le Blanc, et al. (2006). "Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement." Cytotherapy 8(4): Eyden, B. P., J. Ponting, et al. (1994). "Defining the myofibroblast: normal tissues, with special reference to the stromal cells of Wharton's jelly in human umbilical cord." J Submicrosc Cytol Pathol 26(3): Fritsch, E. F., R. M. Lawn, et al. (1980). "Molecular cloning and characterization of the human beta-like globin gene cluster." Cell 19(4): Fu, Y. S., Y. C. Cheng, et al. (2006). "Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton's jelly to dopaminergic neurons in vitro: potential therapeutic application for Parkinsonism." Stem Cells 24(1): Hamada, H., M. Kobune, et al. (2005). "Mesenchymal stem cells (MSC) as therapeutic cytoreagents for gene therapy." Cancer Sci 96(3): Harley, C. B. (2008). "Telomerase and cancer therapeutics." Nature Reviews Cancer 8(3): 167-

11 179. Hyungee (2002). "Events in the immortalizing process of primary human mammary epithelial cells by the catalytic subunit of human telomerase.pdf>." Karahuseyinoglu, S., O. Cinar, et al. (2007). "Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: in situ and in vitro surveys." Stem Cells 25(2): Karahuseyinoglu, S., C. Kocaefe, et al. (2008). "Functional structure of adipocytes differentiated from human umbilical cord stroma-derived stem cells." Stem Cells 26(3): Kim, N. (1997). "Clinical implications of telomerase in cancer.pdf>." Kobayashi, K., T. Kubota, et al. (1998). "Study on myofibroblast differentiation in the stromal cells of Wharton's jelly: expression and localization of alpha-smooth muscle actin." Early Hum Dev 51(3): Koh, S. H., K. S. Kim, et al. (2008). "Implantation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a neuroprotective therapy for ischemic stroke in rats." Brain Res 1229: Lee, J., Y. H. Sung, et al. (2008). "TERT promotes cellular and organismal survival independently of telomerase activity." Oncogene 27(26): Liu, Y. C., W. Y. Lin, et al. (2011). "Efficiency of DNA Transfection of Rat Heart Myoblast Cells H9c2(2-1) by Either Polyethyleneimine or Electroporation." Appl Biochem Biotechnol. Nanaev, A. K., G. Kohnen, et al. (1997). "Stromal differentiation and architecture of the human umbilical cord." Placenta 18(1): Parry, E. W. and D. R. Abramovich (1972). "The ultrastructure of human umbilical vessel endothelium from early pregnancy to full term." J Anat 111(Pt 1): Perrem, K., L. M. Colgin, et al. (2001). "Coexistence of Alternative Lengthening of Telomeres and Telomerase in htert-transfected GM847 Cells." Molecular and Cellular Biology 21(12): Rachakatla, R. S., F. Marini, et al. (2007). "Development of human umbilical cord matrix stem cell-based gene therapy for experimental lung tumors." Cancer Gene Ther. Shay, J. W. (2004). "Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase." Carcinogenesis 26(5): Smogorzewska, A. and T. de Lange (2004). "Regulation Of telomerase By telomericproteins." Annual Review of Biochemistry 73(1): Suva, D., G. Garavaglia, et al. (2004). "Non-hematopoietic human bone marrow contains longlasting, pluripotential mesenchymal stem cells." J Cell Physiol 198(1): Takechi, K., Y. Kuwabara, et al. (1993). "Ultrastructural and immunohistochemical studies of Wharton's jelly umbilical cord cells." Placenta 14(2): Yamamoto, M., S. Okumura, et al. (1999). "High efficiency gene transfer by multiple

12 transfection protocol." Histochem J 31(4): Ekler a. Mali Bilanço ve Açıklamaları Projenin kabul edilen toplam bütçesi TL dir. Proje bütçesinden toplam ,66 TL harcanmış ve geriye 1.993,34 TL kalmıştır. b. Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar Projeden, Makine ve Teçhizat alımı yapılmamıştır. c. Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar (varsa Kesim III'de yer almayan analiz ayrıntıları) Bu çalışma süresince yapılan tüm deneyler, ölçümler, incelemeler ve değerlendirmelerde, RT- PCR sonuçları LightCycler 480 versiyon 1,2 yazılımı ile kantite edildi, korelasyon analizi ise XLSTAT 2013 yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Veriler otalama değer biçiminde özetlendi. Her gen için bölgeler içi biyolojik tekrarlar Wilcoxon testi ile karşılaştırıldı. Her gen için bölgeler arası karşılaştırma ise Friedman testi ile gerçekleştirildi. Friedman testi sonucu p değeri anlamlı bulunduğunda, farklılığın hangi bölgeden kaynaklandığına post hoc ikili karşılaştırma testleri ile bakıldı. Analizler Windows için SPSS v15.0 paket programı ile yapıldı. p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. d. Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar) (Altyapı Projeleri için uygulanmaz) Balcı D. İnsan Göbek Kordonu Stroması Mezenkimal Kök Hücrelerinin İmmortal Hale Getirilmesi ve Moleküler Karakterizasyonu Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji Embriyoloji ABD Bölüm seminerleri, Ocak (Sözlü Sunu) e. Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler (Altyapı Projeleri için uygulanmaz) NOT: Verilen sonuç raporu bir (1) nüsha olarak ciltsiz şekilde verilecek, sonuç raporu Komisyon onayından sonra ciltlenerek bir kopyasının yer aldığı CD ile birlikte sunulacaktır. Sonuç raporunda proje sonuçlarını içeren, ISI nın SCI veya SSCI veya AHCI dizinleri kapsamında ve diğer uluslar arası dizinlerce taranan hakemli dergilerde yayınlanmış makaleler, III. Materyal ve Yöntem ve IV. Analiz ve Bulgular bölümleri yerine kabul edilir.