MIKROARRAY TEKNOLOJİSİ. Veysel Sabri HANÇER Moleküler Biyoloji ve Genetik Doktora Programı

Transkript

1 MIKROARRAY TEKNOLOJİSİ Veysel Sabri HANÇER Moleküler Biyoloji ve Genetik Doktora Programı

2 EŞ ANLAMLILAR Biochip DNA chip DNA microarray Gene array 2

3 Neden bu teknolojiye ihtiyaç duyuldu? Bir organizmada bulunan binlerce gen ve bu genlerin ürünleri olan RNA ve proteinlerin ortaklaşa fonksiyon görmeleri hayatın gizemini oluşturmaktadır. 3

4 Milyonlarca DNA bazının dizilişini bilmek, genlerin ne yaptıklarını, nasıl çalıştıklarını, hücreden organizmaya giden aşamaları, hastalıkla hangi mekanizmaların değiştiğini, yaşlanmanın nedenlerini vs. öğrenmek anlamına gelmez. 4

5 Bir hücrenin tipi veya içinde bulunduğu evre, o hücrede eksprese olan gen profili yani sahip olduğu genlerin mrna düzeyindeki değişiklikleri ile belirlenir. Daha önce tanımlanmamış birçok genin ekspresyon profili incelenerek ve diğer bilinen gen profilleri ile karşılaştırarak o genlerin olası fonksiyonları hakkında ipuçları elde edilmektedir. 5

6 Bu bilgiler metabolik yollara ait şemalar ile birleştirildiğinde, değişen şartlar altında bu yolların nasıl etkilendiği öğrenilebilmektedir. Fakat tüm genleri eş zamanlı çalışmak oldukça karmaşık bir olaydır ve geniş kapsamlı teknolojilere ihtiyaç vardır. 6

7 Bir array, nükleik asit örneklerinin düzgün bir şekilde sıralanması ile oluşmaktadır. Bilinen ve bilinmeyen DNA örneklerinin baz eşleşmesi özelliğine göre hibridizasyonu için uygun bir ortam sağlayarak bilinmeyen DNA ların tanımlanabilmesi için kullanılır. 7

8 Affymetrix Gen Çipleri GeneChip Prob Array i Hibridize edilmiş prob Tek zincirli hedef RNA Oligonükleotit prob * * * * * 24µm 1.28cm Spesifik bir oligonukleotidin Milyonlarca kopyası >200,000 farklı tamamlayıcı prob Hibridize edilmiş prob dizilimi 8

9 Fikse edilen örneğe ait noktanın büyüklüğüne göre makroarray ve microarray olmak üzere ikiye ayrılırlar. 300 mikron ve daha büyük noktacıklardan oluşan makroarray,jelde ve blot tarayıcılarda kolayca görülür. Mikroarrayde ise örnek çapı 200 mikrondan küçüktür. Bu nedenle bir array üzerinde binlerce örnek bulunabilir. Microarray çalışmalarında özel robotlara ve görüntüleme donanımlarına ihtiyaç vardır. 9

10 Microarray yüksek hızda çalışan robotlar tarafından imal edilmektedir. Genellikle cam, bazende naylon yüzeyler üzerine DNA dizisi bilinen problar dizilir. 10

11 Cam yüzeyin naylon ve nitroseluloz filtrelere göre avantajları vardır. Örneğin deneyi minyatürize eder, florasan boyaların kullanımına imkan verir, yüzey sert olduğu için örnek difüze olmaz böylece lazer analizine imkan doğar. 11

12 Cam yüzey nötr ph da DNA ile iyonik bağ oluşturan silan, DNA nonkovalent geridönüşmez şekilde bağlanan nitroseluloz temelli polimer veya polilizin ile kaplanabilir. Bu kaplama ile DNA örnekleri cam yüzeyde fikse edilmektedir. 12

13 ARRAY İKİ ŞEKİLDE ÜRETİLEBİLMEKTEDİR 13

14 1.Fotolitografi Silikonize edilmiş olan cam yüzeyde oligonukleotit sentezi gibi bir fotokimyasal reaksiyon gerçekleştiği sırada morötesi ışık kaynak olarak kullanılır. 14

15 Bir engelden geçirilen bu ışık aşamalı olarak reaksiyonu devam ettirir. Bu engelde, birkaç mikrometre genişliğinde ve camın cm2 sinde birkaçyüzbin probun yer alabileceği açıklıklar vardır. 15

16 Ancak bu insitu sentez teknolojisinin dezavantajı 25 nükleotit uzunluk ile sınırlı olmasıdır. 16

17 2.Mekanik Fiksasyon Ink-jet veya XYZ ekseni üzerinde hareket kontrolü olan bir cihaz yoluyla örneklerin fiziksel olarak yüklenmesidir. Yüzey ile direkt ilişki ve çok küçük miktarda sıvı kullanılması nedeniyle buharlaşma ve kontaminasyon problemleri görülmektedir. 17

18 İKİ TİP ARRAY VARDIR 18

19 baz uzunluğundaki cdna probları robotlar ile cam gibi katı yüzeylere tutturulur. Bir seri hedef bu yüzeye uygulanır. Stanford Üniversitesinde geliştirilmiş olan bu yöntem geleneksel DNA microarray olarak kabul edilmektedir. 19

20 mer oligonükleotit veya peptit nükleik asit (PNA) problar sentezlenerek dizilirler. Array, işaretli DNA ile hibridizasyona sokularak komplementer dizi varlığı/miktarı tanımlanır. Bu yöntem fotolitografik ürünler üreterek satan Affimetrix Inc. tarafından geliştirilmiştir. 20

21 mrna saflaştırılması ve RT mrna 1-2 mikrogram olacak şekilde saflaştırılır. mrna daha dayanıklı olan cdna molekülüne revers transkripsiyon ile çevrilir. Bazı RNA ların bir kısmı cdna ya çevrilebilmekte ve tam olmayan bu sentez arraye bağlanmasını bozmaktadır. 21

22 Bu sorun, uçtan yapılan sentez yerine rastgele yapılan primerler ile yapılan cdna sentezinin uygulanmasıyla çözülmektedir. Fakat bu da gereksiz trna ve rrna nın da örnekte yer almasına neden olmaktadır. 22

23 cdna nın florasan işaretlenmesi Microarray e bağlanan cdna nın görülebilmesi, varlığını belli eden bir reporter molekülle işaretlenmesine bağlıdır. İncelenecek örnek iki farklı boya ile boyanır. Genelde rodamin/floresin veya Cy3/Cy5 dir. 23

24 Microarray ile Hibridizasyon Array üzerinde bulunan binlerce DNA dizisi üzerine laboratuarda hazırlanmış cdna lar uygulanır.cdna komplementerini bulduğu noktada hibridize olur ve florasan sayesinde bu noktayı görünür kılar. Array üzerindeki her bir nokta ayrı bir deney olarak yorumlanır. 24

25 Bazı bakteriler ve S. cerevisiae de bilinen her genin genomik DNA sını ve olası ORF yapısını çalışmak mümkündür!!!! 25

26 Hibridize edilen arrayin taranması Tarama okuyucu denilen sistem ile yapılır. Okuyucu, bilgisayar ile kontrol edilen inverted scanning fluorenscent confocal mikroskoptur ve lazer ile çalışır. 26

27 Proba bağlanmış olan florasan işaretli moleküller lazer ile uyarıldıklarında ışıma yaparlar. Array tarayıcının amacı, komplementer noktalara bağlanan probun yaydığı ışını tespit etmektir. 27

28 Çipin Yapımı: PCR PCR saflaştırması ve hazırlanması cdna dizilimleri: süreç SLAYTLARIN HAZIRLANIŞI BASMA RNA hazırlanışı: Hücre kültürü ve ekim İŞLEM SONRASI RNA IZOLASYONU cdna ÜRETİMİ DİZİ MELEZLEMESİ PROB ETİKETLENİŞİ VERİ ANALİZLERİ 28

29 Taranan Görüntünün Yorumlanması Kırmızı sarı yeşil yoğunlukları ölçülerek değerlendirmeler yapılır. Sarı noktacıklar her iki hücre grubunda da eşit miktarda cdna bağlandığını gösterir. Florasan yoğunluğu mrna yoğunluğunu belirtmektedir. 29

30 cdna klonları cdna dizilimleri lazer 2 lazer 1 tarama yazılım PCR ürün çoğaltımı saflaştırma mrna (hedef) emisyon Yüzey görüntüsü ve normalizasyon 0.1nl/nokta mikrodizilim analizler 30

31 Affimetrix arraylerde genelde her gen için 20 prob vardır. Standardizasyon için aktin G6PDH gibi genlerin ekspresyon düzeyleri kullanılır. Diğer arraylerde standardizasyon daha önemli bir sorundur. Standart deney amacına göre değişmektedir. 31

32 Sıklıkla northern blot, real-time PCR, immün boyama gibi yöntemlerle sinyallerin doğruluğunu kontrol etmek gerekmektedir. 32

33 Affymetrix çip fotoğrafı: düşük çözünürlük

34 Processing the data For each experiment, spot intensities are translated into fold changes and displayed as different intensities of Red for log 2 (Cy5/Cy3)>0 Green for log 2 (Cy5/Cy3)<0 34

35 Cluster analysis In Hierarchical Clustering, Distances are used to sort genes and experiments into dendrograms (trees). 35