Dr. Mert Ahmet Kuşkucu. İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

Transkript

1

2 Antiviral direnç testleri: Hizmet alımı öncesi ve sonrasında dikkat edilmesi gereken noktalarla birlikte kalitenin denetlenmesi, sonuçların yorumlanması Dr. Mert Ahmet Kuşkucu İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

3 Sunum Planı; Akılda bulundurulması gerekenler İlaç Sınıfları Direnç Nasıl Gelişiyor? Antiviral direnç testleri Test çeşitleri Test Zamanlaması Testlerde Genel Laboratuvar İş Akışı Laboratuvar Altıyapı gereklikleri; Kalite konusu Analiz Edilecek Bölgelerin Seçimi Test Sonuçlarının Yorumlanması İlk Konu: Elde edilen dizi veri kalitesinin değerlendirilmesi Örneklerle Mutasyon raporlarının değerlendirilmesi ve sonuçların yorumlanması

4 HIV in Yaşam Döngüsü ve Anti-HIV İlaçların Hedefleri İlaç sınıfları: Nükleosid Revers Transkriptaz İnhibitörleri (NRTI) AZT, ddi, d4t, 3TC, FTC, ABC,TDF, (TAF) Non-Nükleosid Revers Transkriptaz İnhibitörleri (NNRTI) EFV, NVP, ETR, RPV Giriş İnhibitörleri (EI) T20, Maraviroc/MVC, Cinicriviroc/CNC) (AMD3100 AMD 070) İntegraz İnhibitörleri(INI) RAL, EVG, DTG Proteaz İnhibitörleri (PI) SQV, IDV, RTV, NFV, fapv, LPV, ATV, TPV, DRV

5 Direnç: Virusun mutasyon yeteneği ile birlikte antiretroviral ilaç varlığında virusun replike olabilmesi Günlük yeni viryon oluşumu; RT hataları nedeni ile yüksek mutasyon hızı Mutasyon/Replikasyon 3-4 Rekombinasyon / replikasyon Direnç gelişimi viruslar arasında farklılık gösterir - RNA lı viruslarda daha hızlı - Direnç mutasyonlarının evrim hızı değişken - Bazen tek bir mutasyon yüksek düzeyde R kazandırabilir - Bazı ilaç sınıflarına karşı R mutasyonların aşamalı bir biçimde birikimi sonucu gelişir - R ile ilişkili bazı mutasyonlar virusun fittness ini düşürür ilave mutasyonlar fittness i restore edebilir David H. Spach, MD. Features of Genotypic and Phenotypic Resistance Assays. HIV Web Study (

6 Direnç Nasıl Gelişir? Zayıf Potens Yanlış Doz Konak Genetik Faktörleri Sosyal/kişisel problemler Rejim ile ilşikli konular Toksisite Zayıf Uyum Zayıf Emilim Hızlı klirens Zayıf Aktivasyon İlaç Etkileşimleri Yetersiz ilaç Düzeyi İlaç varlığına rağmen Viral replikasayon Dirençli Virus

7 David H. Spach, MD. Features of Genotypic and Phenotypic Resistance Assays. HIV Web Study (

8 David H. Spach, MD. Features of Genotypic and Phenotypic Resistance Assays. HIV Web Study (

9 Genetik Bariyer Bir virus bir AV tarafından inhibe edilirken bir yandan da direnç mutasyonları gelişen suşlar seçilir. Bu olayın ne kolaylıkla gerçekleşeceği, gelişecek olan olası mutasyonların virusun fittness ini azaltmaksızın direnç kazandırabilmesine bağlıdır. Bu olgu «genetik bariyer» olarak bilinmektedir.

10 ARV direnç testleri Genotipik testler: - RT-PCR sonrası: - Dizi analizi - Revers hibridizasyon - OLA (Oligonükleotid ligation assay) - Yeni kuşak DNA dizileme - Allel spesifik PCR Fenotipik testler: Ticari

11 Direnç Testleri Uygulama Zamanı - İlk tanı konduğunda (tedavi kararından bağımsız olarak) - Tedavi başarısızlıklarında: İlaç altında iken ya da tercihen ilaç kesildikten sonra ilk 4 hafta içersinde - Tadaviye başlarken - Viral yük > 500 kopya/ml olmalı

12 Avrupa HIV direnç Klavuzu Test tercihi Genotipik Yorumlama - Güncellenen bir veri tabanının kullanılması - Dizilerin saklanması - Yorumlarda klinik bağlamın, tedavi, direnç öyküsünün de göz önüne alınması Kalite kontrol - Her çalışmada PK ve NK kullanılması - Sekans edisyonları izlenebilir olmalı - Çift yönlü dizi analizi - Yılda en az 1 kez dış kalite kontrol - Her ay ya da 50 örnekte bir bilinen bir örneğin test edilmesi - Yorumların belgelenmesi Örneklerin saklanması Direnç testi o an yapılamıyorsa 2 ml örneğin -80 de saklanması Tıbbi bakıma girişte; Viral yük > 1000 ml olmalı; arası VY lerde de denebilir; EACS 2015: Tedavi başarısızlıklarında Tedavi altında iken ya da kesildikten sonra tercihen ilk 4 hafta içerisinde

13 Sanger Sequencing YND Örnek: PLAZMA David H. Spach, MD. Features of Genotypic and Phenotypic Resistance Assays. HIV Web Study (

14 Genotipik HIV Direnç Testi CCTCAGATCACTCTTTGGCAACGACCCATAGTCACAATAAAGATAGCGGGACAACTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAA ATGAATTTGCCAGGAAAATGGAAACCAAAAATAATAGTGGGAATTGGAGGGTTTACCAAAGTAAGACAGTATGATCATGTACAAATAGAAATCTGTGGACATAAA GTTATAGGTGCAGTATTAATAGGACCTACACCTGCCAATATAATTGGAAGAAATCTGTTGACTCAGCTTGGCTGTACTTTAAATTTT PQITLWQRPIVTIKIAGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLPGKWKPKIIVGIGGFTKVRQYDHVQIEICGHKVIGAVLIGPTPANIIGRNLLTQLGCTL NF Differences from Consensus B: L10I, G17R, K20I, E35D, N37S, M46I, I62V, L63P, A71I, G73S, I84V, L90M, I93L

15 HIV Drug Resistance Training Module 0: Welcome and Introductions Module 1: Introduction to HIV Drug Resistance Module 2: The WHO Lab Network Module 3: Principles of PCR and HIVDR Sequencing Module 4: Molecular Lab Set-up and Workflow Module 5: Sequencing Procedures: Commercial and In-House Module 6: Sequencing Interpretation and Analysis Module 7: HIV Genotyping Assay Validation Module 8: Dried Blood Spots for HIVDR Genotyping Module 9: A Systems Approach to Laboratory Quality Module 10: Standard Operating Procedures (SOPs) Module 11: Quality Control and Quality Assurance Module 12: Data Management Module 13: Equipment and Supplies Module 14: Stock Management Module 15: Specimen Management Module 16: Biosafety and Waste Management Module 17: Laboratory Staff Experience and 15T raining

16 A Systems Approach to Laboratory Quality Organization Personnel Equipment Stock Management Quality Control Data Management SOP, Documents & Records Occurrence Management Assessment Process Improvement Specimen Management Safety & Waste Management 16

17 Toplam Kalite; Kalite Kontrol (Quality Control, KK) Kalite Güvencesi (Quality Assurance, KG) Kalite Değerlendirme (Quality Assessment, KD) Kalite Değerlendirmesi Kalite Güvencesi Kalite Kontrol Kalite Kontrol: Testin doğru olarak çalışıp çalışmadığını gösteren önlemler Kalite Güvencesi: Testin laboratuvarda uygulama sürecine yönelik, pre analitik ve post analitik süreçleri kapsayan geniş bir anlam ifade eder ve bu bakımdan hizmet alınacak laboratuvarın bu süreçleri de kayıt altına aldığı bir kalitye güvence sistemine sahip olması gerekmektedir. Kalite Değerlendirme: Kalite kontrol ve kalite güvencesi sonucunda oluşturulan laboratuvar verilerinin genellikle bir dış program ile değerlendirilmesini kapsayan süreç 17

18 The Quality Assurance Cycle Sample collection Reporting Personnel competency testing Record keeping and data management Data and Lab Management Safety Customer Service Sample receipt and accessioning QA and QC Genotype testing 18

19 Laboratuvar Alt Yapısı Organization Personnel Equipment Stock Management Quality Control Data Management SOP, Documents & Records Occurrence Management Assessment Process Improvement Specimen Management Safety & Waste Management 19

20 Verilerin Değerlendirilmesi, Yorum

21

22

23

24

25 HIV-Db mutasyon sınıflamaları PR mutasyonları: - Majör DRM - Aksesuar DRM - Diğer RT Mutasyonları: - NRTI DRM - NNRTI DRM - Diğer IN mutasyonları: - Majör DRM - Aksesuar DRM - Diğer None: Yukardaki sınıflamalara girmeyenler Primer ya da Majör Mutasyonlar: Tek başlarına olsalar bile duyarlılığı doğrudan azaltırlar, M184 mutasyonları gibi Aksesuar (Secondary, minör) Mutasyonlar: Virusun fitness ını düzeltir. Duyarlılığı azaltır. İmza (Signature) Mutasyonları: Özel ilaç için ilişkili mutasyonlar (M184V Lamivudin, Emtircitabin, I50L atazanavir Direnci)

26 IAS USA Drug Resistance Mutations Group 2017 Update of the Drug Resistance Mutations in HIV-1 Annemarie M. Wensing, MD, PhD; Vincent Calvez, MD, PhD; Huldrych F. Günthard, MD; Victoria A. Johnson, MD; Roger Paredes, MD, PhD; Deenan Pillay, MD, PhD; Robert W. Shafer, MD; Douglas D. Richman, MD Top Antivir Med. 24(4). Updates available at IAS USA is a not-for-profit, HIV clinical specialist education organization. It is entirely different from and not affiliated with the International AIDS Society IAS USA Wensing et al. Top Antivir Med. 2017;24(4). Updates, user notes, and references available at

27 Mutations in the Reverse Transcriptase Gene Associated With Resistance to Reverse Transcriptase Inhibitors (cont d) Abacavir Didanosine Emtricitabine Lamivudine Stavudine Tenofovir Zidovudine IAS USA Wensing et al. Top Antivir Med. 2017;24(4). Updates, user notes, and references available at

28 Mutations in the Reverse Transcriptase Gene Associated With Resistance to Reverse Transcriptase Inhibitors (cont d) Nonnucleoside Analogue Reverse Transcriptase Inhibitors (NNRTIs) Efavirenz Etravirine Nevirapine Rilpivirine IAS USA Wensing et al. Top Antivir Med. 2017;24(4). Updates, user notes, and references available at

29 Mutations in the Protease Gene Associated With Resistance to Protease Inhibitors Atazanavir +/-ritonavir Darunavir/ ritonavir Fosamprenavir/ ritonavir Indinavir/ ritonavir Lopinavir/ ritonavir IAS USA Wensing et al. Top Antivir Med. 2017;24(4). Updates, user notes, and references available at

30 Mutations in the Protease Gene Associated With Resistance to Protease Inhibitors (cont d) Nelfinavir Saquinavir/ ritonavir Tipranavir/ ritonavir IAS USA Wensing et al. Top Antivir Med. 2017;24(4). Updates, user notes, and references available at

31 Mutations in the Integrase Gene Associated With Resistance to Integrase Strand Transfer Inhibitors Dolutegravir Elvitegravir Raltegravir IAS USA Wensing et al. Top Antivir Med. 2017;24(4). Updates, user notes, and references available at

32 Mutations in the Envelope Gene Associated With Resistance to Entry Inhibitors Enfuvirtide Maraviroc User Notes available at IAS USA Wensing et al. Top Antivir Med. 2017;24(4). Updates, user notes, and references available at

33 Mutations in the Reverse Transcriptase Gene Associated With Resistance to Reverse Transcriptase Inhibitors Nucleoside and Nucleotide Analogue Reverse Transcriptase Inhibitors (nrtis) Multi-nRTI Resistance 69 Insertion Complex (affects all nrtis currently approved by the US FDA) Multi-nRTI Resistance 151 Complex (affects all nrtis currently approved by the US FDA except tenofovir) Multi-nRTI Resistance Thymidine Analogue-Associated Mutations (TAMs; affect all nrtis currently approved by the US FDA other than emtricitabine and lamivudine) IAS USA Wensing et al. Top Antivir Med. 2017;24(4). Updates, user notes, and references available at

34 Direnç Analizinde İzlenecek Ana Yollar Kurala Dayalı Sistemler Yapay Zekaya Dayalı Makine Öğrenmesine Dayalı(Zahiri) 1. Öğrenme Veri Toplama Uzman Grup Genotipler Mut1, Mut2, Mut3, Mut4 Mut1 Mut1, Mut2 Mut4 Fenotipler Tartışma Model Uzlaşı 2. Tahmin Mut1, Mut4 Matthias Döring Max Planck Institute for Informatics,ESCV Workshop Techniques in Clinical Virology December 4, 2015 Dirençli Duyarlı

35 Genotipik Veri Direnç Analizi M184V On-Line direnç Analiz Yazılımları HIV Drug Resistance Database Geno2Pheno HIV-GRADE European system for computer-based clinical management of antiretroviral drug resistance

36

37

38

39

40 Yen infeksiyonlarda direnç nakli Aktarılmış direnç Mutasyon Reversiyon süresi T215Y 2 Ayda %23; 4 ayda %45 M184V 2 Ayda %40; 4 ayda %74 K103N 2 Ayda %36; 4 ayda %63

41 Timidin Analogları Mutasyonları (TAMs) (Zidovudin ya da Stavudine) Yolak -1 Yolak -2 Yüksek düzeyde zidovudine/stavudine direnci ile birlikte diğer NRTI lara da çapraz direnç. Tenofovir dahil M41L L210W T215Y/F Yüksek düzeyde zidovudine/stavudine direnci ile birlikte diğer NRTI lara da Daha dşük düzeyede çapraz direnç. Düşük düzeyde Tenofovir dahil direnci D67N K70R T215Y/F K219Q/E

42 T215 T 215 S T 215 C T 215 D T 215 E T 215 I T 215 V T 215 N T 215 A T 215 L T 215 Y T 215 F Revertan Mutasyonlar

43 Mutasyon Skorları (1) 0 9: Duyarlı (2) 10 14: Olası düşük düzey direnç Büyük olasılıkla tam duyarlı, fakat değerlendirilen dizide daha önce ARV ile karşılaşmış olduğuna işaret eden mutasyonlar söz konusu (3) 15-30: Düşük düzeyde direnç: Suboptimal virolojik yanıt (4) (ortya düzeyde direnç): İlaç illa kullanılmak isteniyorsa, ilacın genetik bariyerinin yüksek olması ya da fazla ilaç seçeneğinin bulunmaması gerekir. (5) 60 ve üzeri: Yüksek düzeyde direnç.

44 Skorlama; Tek tek saptanan mutasyonların etkisi ve bunların kombine etkileri göz önünde bulundurulur. L74I/V skoru 30, M184I/V nin skoru 15 L74I/V + M184I/V skoru (L74I/V) + 15 (M184I/V) + 15 (L74I/V + M184/V) = 60

45 Değerlendirme 0-9 DUYARLI, OLASI DÜŞÜK DÜZEY DİRENÇ, DÜŞÜK DÜZEY DİRENÇ, ORTA DÜZEYDE DİRENÇ >60 YÜKSEK DÜZEYDE DİRENÇ

46 Değerlendirme

47

48 Hizmet Alımı/Sağlanması ve Sonuç Değerlendirmede Akılda Bulundurulması Gerekenler; Yüksek gelirli ve gelişmiş ülkelerde ARD testleri ART uygulamalarının kişiselleştirilerek en üst düzeyde verim alınmasını sağlamayı amaçlamakta Orta ve düşük gelirli ülkelerde bölgesel epidemiyolojik verilerin oluşturulmasını ve buna uygun bölgesel ART rejimlerinin seçimini mümkün kılması beklenmektedir. Bu bakımdan testi uygulayan laboratuvarların ortak kalite kontrol prosedürlerini yürütmesi ve sonuçlarının erişilebilir olması önem taşımaktadır. Bu sayede sağlanacak veriler ile direnç ile ilgili ortaya çıkan yeni mutasyonların takibi ve hatta hedef popülasyonlarda bulaşma ağlarının yapısı daha hızlı anlaşılabilmekte, uygulanacak ART rejimleri popülasyona özgü biçimde daha iyi planlanabilmektedir.

49 Hayatta en hakiki mursit ilimdir, fendir Teşekkürler