ÖZET Doktora Tezi AVRUPA KESTANESİNDE (Castanea sativa Mill.) OLGUNLAŞMAMIŞ KOTİLEDONLARDAN SOMATİK EMBRİYOGENESİS VE BİTKİ REJENERASYONU Mehmet SEZGİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ AVRUPA KESTANESİNDE (Castanea sativa Mill.) OLGUNLAŞMAMIŞ KOTİLEDONLARDAN SOMATİK EMBRİYOGENESİS VE BİTKİ REJENERASYONU Mehmet SEZGİN BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ANKARA 2009 Her hakkı saklıdır.

2 ÖZET Doktora Tezi AVRUPA KESTANESİNDE (Castanea sativa Mill.) OLGUNLAŞMAMIŞ KOTİLEDONLARDAN SOMATİK EMBRİYOGENESİS VE BİTKİ REJENERASYONU Mehmet SEZGİN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Hatice DUMANOĞLU Bu araştırma, Avrupa kestanesinde (Castanea sativa Mill.) Osmanoğlu ve Sarıaşlama çeşitlerinde serbest tozlanma sonucu oluşmuş olgunlaşmamış tohumların kotiledonlarında somatik embriyogenesisi uyarmak ve somatik embriyolardan bitki rejenerasyonunu sağlamak amacıyla yapılmıştır. Kotiledon eksplantlarında somatik embriyogenesisi uyarmak amacıyla başlangıç kültürlerinde temel besin ortamları MS (Murashige ve Skoog), DKW (Driver ve Kuniyuki Walnut) ve WPM (Woody Plant Medium), organik maddeler (L-glutamin (250 mg/l) veya kazein hidrolizat (1000 mg/l)), AgNO 3 (gümüş nitrat) (0 ve 1.7 mg/l), katılaştırıcılar (agar (6 g/l) ya da gelrite (2.1 g/l)) ve 7 farklı büyüme düzenleyici madde kombinasyonu (1) 1 mg/l BA + 2 mg/l KIN mg/l IBA, (2) 1 mg/l BA mg/l TDZ mg/l IBA, (3) 2 mg/l KIN mg/l TDZ mg/l IBA, (4) 1 mg/l BA + 2 mg/l KIN mg/l 2,4-D, (5) 1 mg/l BA mg/l TDZ mg/l 2,4-D, (6) 2 mg/l KIN mg/l TDZ mg/l 2,4-D ve (7) 1 mg/l BA + 1 mg/l NAA denenmiştir. Başlangıç ortamlarında 4 hafta tutulan kotiledon eksplantlar somatik embriyo oluşumu için organik madde, AgNO 3 ve büyümeyi düzenleyici madde içermeyen agar ile katılaştırılmış temel besin ortamlarına transfer edilmiştir. Başlangıç ortamlarının, somatik embriyogenesis oranı ve ortalama embriyo sayısı (adet/kotiledon eksplant) üzerine etkileri aylık periyotlarla alt kültüre alınan kotiledon eksplantlarında 4. ayın sonunda belirlenmiştir. Uygulamalar arasında interaksiyonların ortaya çıktığı Osmanoğlu çeşidinde en yüksek somatik embriyogenesis değerleri (% ) (1), (2) ve (3) no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonlarında, L-glutamin ya da kazein hidrolizat ilave edilmiş AgNO 3 içeren ya da içermeyen agar ya da gelrite ile katılaştırılmış temel besin ortamlarından elde edilmiştir. Bu oran, Sarıaşlama çeşidinde DKW temel besin ortamına ilave edilen (1) ve (2) no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonlarında sırasıyla %12.0 ve %11.2 olarak belirlenmiştir. Uygulamalara göre ortalama somatik embriyo sayısı Osmanoğlu çeşidinde adet/eksplant ve Sarıaşlama çeşidinde adet/eksplant arasında değişmiştir. Genel olarak her iki çeşitte de WPM temel besin ortamında somatik embriyo oluşumuna rastlanmamıştır. Somatik embriyolardan kök, sürgün ve kök+sürgün rejenerasyonu çalışmalarında kurutma (doymuş MgCl 2.6H 2 O bulunan desikatörde 4 gün süreyle), soğuklatma (4 C de 8 hafta), GA 3 (0, 1, 3, 5, 7, 9 mg/l), BA (0.1 mg/l) ve BA+oksin (0.1 mg/l IBA ya da NAA) uygulamaları yapılmıştır. Kurutma, kurutmaya ilave olarak soğuklatma ya da GA 3 (3 mg/l) uygulamalarından sonra BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) içeren makro element düzeyi ½ olan MS çimlendirme ortamına alınan somatik embriyolarda %27.5 rejenerasyon sağlanmıştır. Mayıs 2009, 66 sayfa Anahtar Kelimeler: Kestane, Castanea sativa Mill., somatik embriyogenesis, bitki rejenerasyonu. i

3 ABSTRACT Ph.D. Thesis SOMATIC EMBRYOGENESIS AND PLANT REGENERATION FROM IMMATURE COTYLEDONS OF EUROPEAN CHESTNUT (Castanea sativa Mill.) Mehmet SEZGİN Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Horticulture Supervisor: Prof. Dr. Hatice DUMANOĞLU This study was carried out for induction of somatic embryogenesis and plant regeneration from immature cotyledons of open-pollinated seeds in European chestnut (Castanea sativa Mill.) cultivars Osmanoğlu and Sarıaşlama. To induce somatic embryogenesis from cotyledon explants, basal mediums of MS (Murashige and Skoog), DKW (Driver and Kuniyuki Walnut) and WPM (Woody Plant Medium) supplemented with organic matter (L-glutamine (250 mg/l) or casein hydrolysate (1000 mg/l)), AgNO 3 (silver nitrate) (0 or 1.7 mg/l), gelling agent (agar (6 g/l) or gelrite (2.1 g/l)) and plant growth regulator combinations (1) 1 mg/l BA + 2 mg/l KIN mg/l IBA, (2) 1 mg/l BA mg/l TDZ mg/l IBA, (3) 2 mg/l KIN mg/l TDZ mg/l IBA, (4) 1 mg/l BA + 2 mg/l KIN mg/l 2,4-D, (5) 1 mg/l BA mg/l TDZ mg/l 2,4-D, (6) 2 mg/l KIN mg/l TDZ mg/l 2,4-D, (7) 1 mg/l BA + 1 mg/l NAA were tested in initial cultures. Cotyledon explants were cultured for four weeks in the initial medium. Then, they were transferred to a basal media solidified with agar without plant growth regulators, organic matters and silver nitrate to induce embryogenesis. The effects of initial cultures on the percentage of somatic embryogenesis and average number of embryos per cotyledon explants subcultured monthly were determined at the end of four months. There were interactions among the treatments for Osmanoğlu cultivar. The highest percentages of somatic embryogenesis ( %) were obtained in basal mediums solidified with gelrite or agar, and supplemented with (1), (2) and (3) plant growth regulator combinations plus L-glutamine or casein hydrolysate, and with or without silver nitrate. The highest percentages (12.0% and 11.2%) of somatic embryogenesis for Sarıaşlama were obtained in DKW basal medium supplemented with plant growth regulator combinations of (1) and (2), respectively. The average number of somatic embryo changed between 0 and 0.65 per explant in Osmanoğlu and between 0 and 0.49 per explant in Sarıaşlama. In general, somatic embryo formation was not observed in WPM basal medium for both of the cultivars. In regeneration experiments of root, shoot and root+shoot from somatic embryos dessication (on saturated MgCl 2.6H 2 O in a dessicator for 4 days), cold (at 4 C for 8 weeks), GA 3 (0, 1, 3, 5, 7, 9 mg/l) and BA alone (0.1 mg/l) or in combination with auxins (0.1 mg/l IBA or NAA) treatments were applied. Somatic embryos which were transferred to MS basal medium with half strength macro elements containing 0.1 mg/1 BA mg/l NAA after treatments of dessication or desiccation plus cold or GA 3 (3 mg/l) resulted in 27.5% regeneration. May 2009, 66 pages Key Words: Chestnut, Castanea sativa Mill., somatic embryogenesis, plant regeneration. ii

4 TEŞEKKÜR Biyoteknolojinin önemli bir alanı olan somatik embriyogenesis ve somatik embriyolardan bitki rejenerasyonu konusunda bana çalışma olanağı veren, yardımlarını esirgemeyen ve çalışmalarımın her safhasında beni yönlendiren, fikir ve bilgi tecrübelerini aktaran Danışman Hocam Prof. Dr. Hatice DUMANOĞLU na (Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Bölümü), Tez İzleme Komitesi nde bulunan, her konuda yardım ve desteklerini esirgemeyen Prof.Dr.A.İlhami KÖKSAL a (Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Bölümü) ve Prof. Dr. Cengiz SANCAK a (Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Tarla Bitkileri Bölümü) teşekkürlerimi sunarım. Çalışmamız sırasında, bizlere materyal temini konusunda yardımcı olan Yalova Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü ne, Bursa-Cumalıkızık Köyü nden üretici Ekrem Polat a ve Bursa-İnegöl Yenice Köyü nden üretici Hikmet Yılmaz a teşekkür ederim. Çalışmamızda yardım ve desteklerini esirgemeyen Yrd.Doç.Dr. Ahmet AYGÜN e (Ordu Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Bölümü), Yrd.Doç.Dr. Bekir Şan a (Süleyman Demirel Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Bölümü), Yrd. Doç. Dr. Melda DÖLARSLAN a (Çankırı Karatekin Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü), Araş. Gör. Dr. Emre Şahin DÖLARSLAN a, Zir. Yük. Müh. İsmail TOSUN a, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü personeline ve Çankırı Karatekin Üniversitesi Orman Fakültesi ndeki çalışma arkadaşlarıma teşekkür ederim. Tez Projemizi finanse eden Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Araştırma Projeleri Birimine teşekkür ederim. Ayrıca beni her zaman destekleyen ve yanımda olan aileme şükranlarımı sunarım. Mehmet SEZGİN Ankara, Mayıs 2009 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii SİMGELER DİZİNİ... v ŞEKİLLER DİZİNİ... vi ÇİZELGELER DİZİNİ... vii 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Kestanede Somatik Embriyogenesis ve Bitki Rejenerasyonu Fagaceae Familyasına Ait Diğer Türlerde Somatik Embriyogenesis ve Bitki Rejenerasyonu MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Yöntem Somatik embriyogenesis Somatik embriyoların rejenerasyonu Deneme planı ve verilerin analizi ARAŞTIRMA BULGULARI Somatik Embriyogenesis Osmanoğlu kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranı Osmanoğlu kestane çeşidinde ortalama somatik embriyo sayısı Sarıaşlama kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranı Sarıaşlama kestane çeşidinde ortalama somatik embriyo sayısı Somatik Embriyoların Rejenerasyonu Osmanoğlu ve Sarıaşlama kestane çeşitlerinde gibberellik asit ve kurutma uygulamalarının somatik embriyoların rejenerasyonu üzerine etkileri Osmanoğlu ve Sarıaşlama kestane çeşitlerinde kurutma ve soğuklatma yapılmış somatik embriyolarda benziladenin uygulamalarının rejenerasyon üzerine etkileri Osmanoğlu ve Sarıaşlama kestane çeşitlerinde ön uygulamalar ile birlikte BA+NAA uygulamasının somatik embriyoların rejenerasyonu üzerine etkileri TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ iv

6 SİMGELER DİZİNİ ABA Absizik asit AgNO 3 Gümüş nitrat AIP 2-aminoindan-2-phosphonic acid B-5 Gamborg B-5 temel besin ortamı BA Benziladenin cm Santimetre 2,4-D 2,4-diklorofenoksiasetik asit DKW Driver and Kuniyuki Walnut temel besin ortamı DMSO Dimetil sülfoksit g Gram g/l Gram/litre GA 3 Gibberellik asit GD Gresshoff ve Doy temel besin ortamı IAA İndolasetik asit IBA İndolbütirik asit KIN Kinetin MES 2-[N-Morpholino] ethenesulfonic acid MgCl 2.6H 2 O Magnezyum klorür heksahidrat mg/l Miligram/litre ml Mililitre mm Milimetre M Molar mm Milimolar µm Mikromolar MS Murashige ve Skoog temel besin ortamı mwpm Nitsch ve Nitsch ortamının vitaminlerinin kullanıldığı WPM temel besin ortamı NAA Naftalenasetik asit P24 Teasdale (1992) temel besin ortamı PEMs Proembriyogenik kitleler PVP Polyvinylpyrolidone PVS2 Vitrifikasyon solüsyonu (MS ortamı M sakaroz + %30 gliserol + %15 DMSO + %15 etilen glikol) rpm Revolutions per minute (dakikadaki devir sayısı) SH Schenk ve Hildebrandt temel besin ortamı TDZ Thidiazuron v Volume (hacim) WPM Woody Plant Medium (temel besin ortamı) v

7 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 3.1 Osmanoğlu kestane çeşidine ait meyveler Şekil 3.2 Sarıaşlama kestane çeşidine ait meyveler Şekil 3.3 Kestanede dişi çiçeklerde tam çiçeklenme dönemi Şekil 3.4 Kestanede tam çiçeklenmeden 7 hafta sonra olgunlaşmamış bir meyve yumağı Şekil 3.5 Kestanede tam çiçeklenmeden 7 hafta sonra olgunlaşmamış meyveler Şekil 3.6 Tam çiçeklenmeden 7 hafta sonra olgunlaşmamış bir kestane meyvesi ve tohumu Şekil 3.7 Kotiledon safhasındaki somatik embriyo Şekil 3.8 Somatik embriyoların MgCl 2.6H 2 O çözeltisi konulmuş Nalgene desikatörde kapaklı petriler içerisinde kurutulması Şekil 4.1 Osmanoğlu kestane çeşidinde 3 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu [KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] ve L- glutamin içeren gelrite ile katılaştırılmış DKW temel besin ortamında kotiledon eksplantlar üzerinde somatik embriyolar Şekil 4.2 Osmanoğlu kestane çeşidinde 2 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu [BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] ve AgNO 3 içeren gelrite ile katılaştırılmış MS temel besin ortamında kotiledon eksplantlar üzerinde somatik embriyolar Şekil 4.3 Sarıaşlama kestane çeşidinde 1 no lu büyümeyi düzenleyici kombinasyonunu [BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] ve L- glutamin içeren gelrite ile katılaştırılmış DKW temel besin ortamında kotiledon eksplantlar üzerinde somatik embriyolar Şekil 4.4 Sarıaşlama kestane çeşidinde 2 no lu büyümeyi düzenleyici kombinasyonunu [BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l] ve L- glutamin içeren gelrite ile katılaştırılmış DKW temel besin ortamında kotiledon eksplantlar üzerinde somatik embriyolar Şekil 4.5 Avrupa kestanesinde (C. sativa Mill. cv. Osmanoğlu) kurutma ve soğuklatma ön uygulamaları yapıldıktan sonra BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) çimlendirme ortamında kök + sürgün oluşturmuş bir somatik embriyo vi

8 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 Osmanoğlu ve Sarıaşlama kestane çeşitlerinin dişi çiçek fenolojileri Çizelge 3.2 Murashige ve Skoog (MS) (Murashige and Skoog 1962), Driver ve Kuniyuki Walnut (DKW) (Tulecke and McGranahan 1985) ve Woody Plant Medium (WPM) (Lloyd and McCown 1981) temel besin ortamlarının içeriği Çizelge 4.1 Osmanoğlu kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranları için P değerleri Çizelge 4.2 Osmanoğlu kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranı (%) üzerine büyümeyi düzenleyici madde x organik madde x katılaştırıcı madde interaksiyonunun etkisi (P = 0.045) Çizelge 4.3 Osmanoğlu kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranı (%) üzerine büyümeyi düzenleyici madde x AgNO 3 x katılaştırıcı madde interaksiyonunun etkisi (P = 0.001) Çizelge 4.4 Osmanoğlu kestane çeşidinde somatik embriyo sayıları için P değerleri Çizelge 4.5 Osmanoğlu kestane çeşidinde somatik embriyo sayısı (adet/eksplant) üzerine temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici madde x AgNO 3 x katılaştırıcı madde interaksiyonunun etkisi (P = 0.010) Çizelge 4.6 Sarıaşlama kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranları için P değerleri Çizelge 4.7 Sarıaşlama kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranı (%) ve somatik embriyo sayısı (adet/eksplant) üzerine temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici madde interaksiyonunun etkisi (P = 0.000) Çizelge 4.8 Sarıaşlama kestane çeşidinde somatik embriyo sayıları için P değerleri Çizelge 4.9 Kestane somatik embriyolarında kurutma ve GA 3 uygulamalarında rejenerasyon oranları için P değerleri Çizelge 4.10 Kestane somatik embriyolarında rejenerasyon oranları üzerine kurutma ve GA 3 uygulamalarının etkisi Çizelge 4.11 Kurutma ve soğuklatma yapılmış kestane somatik embriyolarında benziladenin uygulamalarında rejenerasyon oranları için P değerleri vii

9 Çizelge 4.12 Kestane somatik embriyolarında rejenerasyon oranları üzerine BA uygulamalarının etkileri Çizelge 4.13 Kestane somatik embriyolarında ön uygulamalar ve BA + NAA uygulamasında rejenerasyon oranları için P değerleri Çizelge 4.14 Kestane somatik embriyolarında rejenerasyon oranları üzerine ön uygulamalar ile BA+NAA uygulamasının etkileri viii

10 1. GİRİŞ Quercus sp. (Meşe) ve Fagus sp. (Kayın) cinsleri ile birlikte Fagaceae familyasına dahil olan Castanea sp. (Kestane) cinsi 13 farklı türü ile kuzey yarımkürenin doğal bitkileri arasında yer almaktadır. En tanınmışları Castanea mollissima Blume (Çin kestanesi), C. crenata Siebold and Zucc. (Japon kestanesi), C. sativa Miller (Avrupa kestanesi) ve C. dentata (Marshall) Borkh. (Amerikan kestanesi) olan kestane türlerinin dünyada yayılış gösterdiği ve kültürünün yapıldığı başlıca alanlar Asya, Avrupa, Kuzey Amerika ve kısmen de Güney Amerika dır (Miller et al. 1996, Soylu 2004, Vieitez and Merkle 2005, Corredoira et al. 2006a). Kestane türleri içerisinde orijini Anadolu olan Avrupa kestanesi günümüzde Anadolu nun dışında Güney Avrupa, Kuzey Afrika ve Kafkasya da yayılım göstermektedir (Soylu 2004, Vieitez and Merkle 2005). Avrupa kestanesi bitki özellikleri yönüyle kışın yaprağını döken, kendi haline bırakıldığında 30 m kadar boylanabilen, çapı birkaç metreye ulaşabilen dolgun gövdeli, geniş ve dağınık taçlı, yıl yaşayabilen uzun ömürlü ağaçlara sahip bir türdür (Anşin ve Özkan 1997). Bu türün orman ağacı olarak en iyi meşcerelerine Kuzey Doğu Anadolu da Hopa çevrelerinde, Sultan Selim Dağı nda ve Pehlivan Deresi nde rastlanmaktadır. Bunu Marmara yöresi Kapıdağ yarımadası izlemektedir (Anşin ve Özkan 1997). Orman Genel Müdürlüğü nün 2005 yılı verilerine göre ülkemizde toplam ha kestane ormanı bulunmaktadır (Anonim 2006). Bu türün tanence zengin, koyu renkli ve dayanıklı odunu ormancılıkta kereste üretiminde oldukça kıymetlidir. Kaliteli odun hammaddesinin yanı sıra kestanenin meyveleri taze ya da işlenmiş ürün olarak tüketime sunulabilmekte ve arıcılık faaliyetleri kapsamında çiçekleri bal üretiminde kullanılabilmektedir. Böylece sahip olduğu yüksek ekonomik getirisi nedeniyle bu tür, bulunduğu orman bölgelerinde kırsal kalkınma bakımından büyük değer taşımaktadır (Anşin ve Özkan 1997). Meyvesi gıda sektörü için önemli ve aranılan bir hammadde olduğu için yetiştiriciliğinin ekolojik olarak sınırlanmadığı alanlarda modern meyvecilik esaslarına göre kurulacak düzenli kestane bahçeleri de üreticiler için önemli bir gelir kaynağı olma özelliğindedir. 1

11 Ülkemizde kestane meyvesi üretimi Karadeniz, Marmara, Batı Ege ve Batı Akdeniz Bölgeleri ni kapsayan geniş bir coğrafyada aşılı ya da tohumdan yetişmiş ağaçlarda gerçekleştirilmektedir. Aşılı kestane ağaçlarında çeşit olarak Sarıaşlama, Osmanoğlu, Vakit kestanesi, Acemoğlu, Dursun kestanesi, Aşı kestanesi, Sarı kestane, Karamehmet, Hacıibiş, Firdola, Mahmutmolla ve Hacıömer çeşitleri kullanılmaktadır (Soylu 2004). Ülkemiz, 2007 yılı verilerine göre 63 bin tonluk kestane üretimi ile Çin (925 bin ton) ve Güney Kore den (70 bin ton) sonra üçüncü sırada yer almakta ve dünya üretiminde (1.2 milyon ton) %5.2 lik bir paya sahip bulunmaktadır (Anonymous 2007). Ülkemizin son 20 yıllık kestane üretim değerleri incelendiğinde 1987 yılında 90 bin ton olan üretimimizin 2007 yılında %30 oranında azalmış olduğu görülmektedir. Bunun en büyük nedeni Mürekkep Hastalığı (Phytophthora cambivora Petri.) ve Kestane Kanseri nin (Cryphonectria parasitica (Murr.) Barr.) tüm dünyada olduğu gibi ülkemizin kestane plantasyonlarında yaptığı büyük tahribattır. Bu hastalıklara karşı ilaçlı mücadele kesin sonuç vermemekte, ayrıca pratik ve ekonomik de bulunmamaktadır. Hipovirulent ırkların belirlenmesinin yanında (Çeliker ve Onoğur 2001), bu hastalıklara dayanıklı olan Japon ve Çin kestane türleri ile Avrupa kestanesi arasında hibritleme çalışmalarının yapılması ve dayanıklı anaç ve çeşitlerin ıslahı, bu hastalıklara karşı mücadelede en etkili metot olarak bildirilmektedir (Miller et al. 1996, Soylu and Mert 2009). Bu amaçla biyoteknolojik yöntemler, biyolojik ve fizyolojik özellikleri nedeniyle klasik yöntemler ile ıslahın güç ve uzun zaman aldığı bu türde geleneksel metotların etkinliğini arttırmanın yanında, kendi özel teknikleri ile üstün genotiplerin geliştirilmesi için büyük olanaklar sunmaktadır. Bu kapsamda zigot orijinli dokularda somatik embriyogenesis, melezleme ıslahı sonucu elde edilmiş hibritlerin klonal çoğaltımı için önemli bir potansiyeldir. Somatik embriyogenesis birçok bitki türünde yoğun klonal çoğaltımın dışında gen transferi, mutasyonlar, genetik materyalin korunması, in vitro testler ve temel araştırmalar gibi birçok alanda kullanım kolaylığı sağlayan önemli bir biyoteknolojik yöntemdir. Somatik dokulardan in vitro koşullarda embriyo elde edilmesi tekniği olarak tanımlanan somatik embriyogenesisin başarısı üzerine genotip, eksplant tipi ve yaşı, temel besin ortamı, büyümeyi düzenleyici 2

12 maddeler, azot kaynağı, katkı maddeleri, ön uygulamalar, kültür tipi, şeker ve katılaştırıcılar ile inkübasyon koşulları etkili olmaktadır (Özcan vd. 2002, Vieitez and Merkle 2005, Corredoira et al. 2006a, Arnold 2008). Somatik embriyoların ıslah ve çoğaltım amaçlı çalışmalarda rahatlıkla kullanılabilmesi için eksplantlardan somatik embriyo oluşumu ve embriyoların bitkiye dönüşümü için etkin protokollerin geliştirilmesi ya da mevcut protokollerin iyileştirilmesi gerekmektedir. Bu çalışma, Avrupa kestanesinde (C. sativa Mill.) tohumların olgunlaşmamış kotiledonlarından somatik embriyo oluşumu üzerine temel besin ortamlarının, büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonlarının, AgNO 3 (gümüş nitrat), L-glutamin ve kazein hidrolizatın, katılaştırıcı maddelerin (agar ve gelrite) etkilerini araştırmak ve somatik embriyolardan bitki rejenerasyonunda GA 3 (gibberellik asit), kurutma, soğuklatma, BA (benziladenin) ve BA + oksin uygulamalarının etkilerini belirlemek amacıyla yapılmıştır. 3

13 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Kestanede Somatik Embriyogenesis ve Bitki Rejenerasyonu Kestanede somatik embriyogenesis konusunda ilk morfogenetik bulgular 1978 yılında Vietiez et al. (1978) tarafından rapor edilmiştir. Bu çalışmada araştırıcıların embriyogenik sürecin başlangıç aşamalarına ait yapıları elde ettikleri bildirilmiştir (Corredoira et al. 2006a). Gonzalez et al. (1985), Castanea sativa Mill. x C. crenata Siebold and Zucc. kestane hibritinin olgunlaşmamış zigotik embriyolardan izole ettikleri kotiledonları 2,4-D (2,4- diklorofenoksiasetik asit), BA, zeatin ya da kinetin ilave ettikleri MS (Murashige ve Skoog) temel besin ortamında kültüre almışlar ve çalışmanın sonunda embriyoidlere ulaşmışlardır. Vieitez et al. (1990), Castanea sativa Mill. x C. crenata Siebold and Zucc. kestane hibritinin mürekkep hastalığına dayanıklı iki klonunda (HC ve 431), Temmuz ayı ortalarından Ekim ayı ortalarına kadar topladıkları olgunlaşmamış ve olgunlaşmış zigotik embriyo eksplantlarında somatik embriyo oluşumu üzerine 2,4-D ya da pikloramın, BA, KIN (kinetin) ya da zeatin ile oluşturduğu kombinasyonların etkilerini incelemişlerdir. Çalışmada pikloramın bulunduğu ortamlarda hiç bir embriyogenik kallus elde edilememiştir. Olgunlaşmamış zigotik embriyolarda embriyogenik kallus (%6-8), BA sız ya da BA (1 2 mg/l BA) ile birlikte 2,4-D nin (0.5 1 mg/l); zeatin (1 mg/l) ile birlikte 2,4-D nin (0.1 mg/l) bulunduğu MS temel besin ortamı üzerinde elde edilmiştir. Bu embriyogenik kalluslar 2,4-D içermeyen MS ortamına transfer edildiğinde globular ve kalp şekilli somatik embriyolar meydana gelmiştir. Elde edilen somatik embriyolar WPM (Woody Plant Medium) ortamında olgunlaştırılmış, ancak çimlenme sağlanamamıştır. Merkle et al. (1991), Amerikan kestanesinde (C. dentata (Marsh.) Borkh.) somatik embriyo oluşturmak amacıyla serbest tozlanmaya bırakılmış dişi çiçeklerde ovulleri ve olgunlaşmamış embriyoları kültüre almışlardır. Eksplantlar 0.25 mg/l BA ve 6 mg/l 4

14 NAA (naftalenasetik asit) ya da 4 mg/l 2,4-D içeren yarı katı WPM ortamında 1 veya 2 hafta inkübe edilmiş ve daha sonra 0.25 mg/l BA içeren ya da içermeyen WPM ortamına transfer edilmiştir. Ayrıca eksplantların bir kısmı başlangıç ortamında alt kültüre alınmıştır. Çiçeklenmenin tamamlanmasından 6 7 hafta sonra kültüre alınan ovuller 1 2 hafta hormonlu ortamda inkübe edildikten sonra oksin içermeyen ortama transfer edildiğinde, zigotik embriyonun radikul kısmında direk olarak somatik embriyolar meydana gelmiştir. Carraway and Merkle (1997), Amerikan kestanesinde (C. dentata (Marsh.) Borkh.) embriyogenik hatlar elde etmek ve bunlarda bitki rejenerasyonunu sağlamak amacıyla yaptıkları çalışmada eksplant olarak ovulleri, olgunlaşmamış ya da olgun zigotik embriyoları kullanmışlardır. Temel besin ortamı olarak başlangıçta WPM ve DKW (Driver and Kuniyuki Walnut) ortamları test edilmiş, ancak iki ortam arasında bir farklılık bulunmadığı için ileriki aşamalarda WPM ortamı esas alınmıştır. Somatik embriyo oluşumu üzerine iki sitokininin (BA ve TDZ (thidiazuron)), üç oksin (2,4-D, IAA (indolasetik asit) ve NAA) ile oluşturduğu farklı kombinasyonların etkileri belirlenmiştir. Başlangıç kültürlerinde dikkate alınan uygulamalar; (A) büyümeyi düzenleyici maddenin kullanılmadığı kontrol, (B) sadece oksin uygulaması, (C) sadece BA ya da TDZ uygulaması, (D) oksin + BA ya da oksin + TDZ uygulaması, (E) 2 hafta oksin + sitokinin uygulamasından sonra büyümeyi düzenleyici madde içermeyen ortama eksplantların transferidir. Bu uygulamalarda oksinler (2,4-D, IAA ya da NAA) 0.1, 0.5, 3.0, 10.0 ve 20.0 mg/l, sitokininlerden BA 0.25 mg/l ve TDZ 0.1 mg/l dozlarında kullanılmıştır. Aylık periyotlar ile katılaştırılmış (8 g/l fitoagar) ortamlar üzerinde alt kültüre alınan eksplantlar deneme boyunca 25 o C de karanlık koşullarda inkübe edilmiştir. Süspansiyon kültürler ise 3 mg/l 2,4-D mg/l BA içeren 50 ml WPM ortamına 0.5 g proembriyogenik kitlelerin (PEMs) konulması ile yapılmıştır. Bu kültürler 125 rpm hızla çalışan bir karıştırıcı üzerinde 16 saat aydınlık koşullarda inkübe edilmiş ve iki aylık periyotlar ile taze ortamlara transfer edilmiştir. Somatik embriyoların geliştirilmesi için embriyogenik hatlar bu ortamdan, 5 g/l aktif kömür bulunan ya da bulunmayan WPM ortamına taşınmıştır. Somatik embriyoların gelişimi üzerine 30 ya da 60 g/l dozlarındaki sakaroz, maltoz ve fruktozun etkileri de araştırılmıştır. Erken kotiledon safhasındaki somatik embriyolar kurutma 5

15 uygulamalarından önce 12 hafta olgunlaştırılmıştır. Kurutma somatik embriyoları kapaklı boş petri kapları içerisinde laminar hava akışlı kabinde 8 saat ya da steril su içeren petri kapları içerisinde 8 saat süreyle tutma yoluyla yapılmıştır. Kurutma işleminin ardından somatik embriyolar katılaştırılmış ortam üzerinde 4 o C de 12 hafta süreyle soğuklatılmıştır. Daha sonra somatik embriyolar çimlendirilmek üzere taze WPM ortamına transfer edilmiştir. Bitkiler peat + vermikulit ortamları üzerinde dış koşullara alıştırılmıştır. Bu çalışmanın sonucunda etkili embriyogenik kültür oluşumları ovullerden, 4 mm den daha büyük olmayan zigotik embriyolardan ve 6 mm 2 den daha küçük kotiledonlardan sağlanmıştır. Sadece sürekli olarak 2,4-D içeren ortamlarda kültüre alma uygulaması somatik embriyo üretimini desteklemiştir. Embriyogenik kültürler 3 mg/l 2,4-D ve 0.25 mg/l BA ilave edilmiş sıvı WPM ortamında çok hızlı gelişim göstermiştir. Aktif kömür somatik embriyoların miktarını ve gelişimini iyileştirmiştir. Sakaroz, fruktoza göre somatik embriyoların miktarı üzerine olumlu etki yapmış, ancak fruktoz sakaroza göre tek (birleşik olmayan) somatik embriyoların gelişim hızını uyarmıştır. Soğuklatma ile somatik embriyolarda kök gelişimi iyileşmiş, ancak epikotil uzaması ve gerçek yaprak oluşumu yetersiz kalmıştır. Xing et al. (1999), Amerikan kestanesinde (C. dentata (Marsh.) Borkh.) somatik embriyogenesis amacıyla 6 sı kontrollu ve 13 ü açıkta tozlanma sonucu oluşmuş, olgunlaşmamış meyve yumaklarını, tam çiçeklenme ya da tozlamadan 4 7 hafta sonra 5 15 Ağustos tarihleri arasında kültüre almışlardır. Başlangıç ortamı, Nitsch ve Nitsch ortamının (Nitsch and Nitsch 1969) vitaminlerinin kullanıldığı WPM temel besin ortamıdır. Bu ortama 1 g/l kazein hidrolizat, µm (4 mg/l) 2,4-D ve 1.11 µm (0.25 mg/l) BA ilave edilmiştir. Embriyogenesis bu ortam üzerinde 2 hafta aralıklar ile PEMs in alt kültüre alınması ile karanlık koşullarda sağlanmıştır. Somatik embriyolar, BA, NAA ve 20 g/l sakaroz ilave edilmiş Gamborg s B-5 ortamı (Gamborg et al. 1969) üzerinde geliştirilmiştir. Çalışmada BA (0, 0.05, 0.25, 0.5 µm (0, 0.01, 0.06, 0.11 mg/l)) nın NAA (0, 0.05, 0.25, 0.5 µm (0.01, 0.05, 0.09 mg/l)) ile oluşturduğu 16 farklı kombinasyon denenmiştir. Embriyo gelişimi ve olgunluğu için ABA (absizik asit) ve sakaroz ile zenginleştirilmiş ortamların etkisi incelenmiştir. Bu aşamada BA (0.5 µm (0.11 mg/l)), NAA (0.5 µm (0.09 mg/l)) ve 20 g/l sakaroz ilave edilmiş Gamborg s B 5 ortamı standart gelişme ortamı (kontrol) olarak seçilmiştir. ABA uygulaması için bu 6

16 ortama 2 µm (0.5 mg/l) ABA katılmıştır. Olgunlaştırma ortamındaki sakaroz düzeyi (60 g/l) gelişme ortamındaki dozdan daha yüksek tutulmuştur. Somatik embriyolar gelişme ortamı üzerinde kotiledon safhasına ulaştıktan sonra 60 g/l sakaroz ilave edilmiş olgunlaştırma ortamına taşınmıştır. Çimlendirme ortamı olarak 500 mg/l MES (2-[N- Morpholino] ethenesulfonic acid), 500 mg/l PVP 40 (polyvinylpyrolidone) ve 0.89 µm (0.2 mg/l) BA ilave edilmiş mwpm (Nitsch ve Nitsch ortamının vitaminlerinin kullanıldığı WPM) ya da 2 g/l aktif kömür katılmış ½ kuvvetindeki MS temel besin ortamı kullanılmıştır. Gelişme, olgunlaştırma ve çimlenme aşamalarında kültürler 23 ± 2 o C de 16 saat aydınlık koşullarda inkübe edilmiştir. Çalışmanın sonunda kültüre alınan ovullerin %1.6 sı PEMs oluşturmuştur. Geliştirme ve olgunlaştırma aşamalarının ardından kotiledon safhasındaki çimlendirmeye alınmış embriyoların sadece %3.3 ü rejenere olmuştur. İlave olarak embriyoların %6.3 ünde sürgün oluşumu gözlenmiş ve bu sürgünler mikro çelik olarak köklendirilmiştir. Sera koşullarına alınan 20 bitkinin dış koşullara alıştırılmış 6 adedinden 4 ü fidanlık koşullarında geliştirilebilmiştir. Corredoira et al. (2003), yaprak eksplantlarından elde edilmiş Avrupa kestanesi (C. sativa Mill.) somatik embriyolarında olgunlaşma ve çimlenme amacıyla yaptıkları çalışmada embriyo proliferasyonu için hem direk hem de kallus dokusundan indirek somatik embriyogenesis yöntemlerinden yararlanmışlardır. Her iki yöntemde de MS temel besin ortamına 0.1 mg/l BA mg/l NAA ilave edilmiştir. Karbon kaynağı ve konsantrasyonu, embriyoların olgunlaşma ve çimlenme yetenekleri üzerine etkili olmuştur. Bitkiye dönüştürme aşamasında embriyolar %6 sakaroz, %3 ve %6 maltoz içeren aynı besin ortamında olgunlaştırılmıştır. Bu olgunlaştırma ortamından ortalama sürgün uzunluğu, kök uzunluğu ve yaprak sayısında önemli bir gelişme gözlenmemiştir. Ancak, %3 maltoz içeren olgunlaştırma ortamındaki somatik embriyoların %6 sı bitkiye dönüşürken, %33 ü yalnızca kök geliştirerek en iyi sonucu vermiştir. Somatik embriyoların bir kısmı çimlendirme amacıyla %3 maltoz içeren aynı besin ortamında 2 ay süreyle 4 o C de soğuklatılmıştır. Bu uygulamanın, 25 o C de karanlık koşullarda steril kaplar içerisinde uygulanan kısmi kurutma işleminden çok daha iyi sonuç verdiği ortaya konulmuştur. Embriyoların %39 u sürgün ve kök oluşturmuştur. 7

17 Corredoira et al. (2004), zigotik embriyo ekseni ve somatik embriyoların krayoprezervasyonu yoluyla Avrupa kestanesinde (C. sativa Mill.) genetik kaynakların uzun süreli muhafazası konusunda çalışmışlardır. Yaş ağırlık üzerinden %20-24 nem kapsamına kadar laminar akışlı kabin içerisinde kurutulduktan sonra sıvı azot içerisinde depolanan kestane tohumlarının embriyonik eksenlerinde yaşama oranı % arasında ve bunların bitkiye dönüşüm oranı %63 olarak belirlenmiştir. Globular ve kalp şekilli 6-8 mg lık kümeler halinde 7 gün süreyle yüksek şeker içeren ortam üzerinde ön kültürü yapılan somatik embriyolar daha sonra sıvı azot içerisinde depolamadan önce %25 nem düzeyine kadar kurutulmuştur. Çözülmeden sonra embriyogenesisin sürdürülebilirlik oranı %33 olmuştur. Embriyo yığınları yüksek şeker içeren ortam üzerinde 3 gün süreyle ön kültürü yapıldıktan sonra krayoprezervasyon işleminden önce PVS2 vitrifikasyon solüsyonunda (0.4 M sakaroz bulunan MS ortamı içerisinde %30 gliserol, %15 DMSO (dimetil sülfoksit), %15 etilen glikol) 60 dakika bekletilmiştir. Depolama sonrasında embriyogenesisin sürdürülebilirlilik oranı %68 olmuştur. Robichaud et al. (2004), Amerikan kestanesinde (C. dendata (Marshall) Borkh.) 3 hatta olgunlaşmamış kotiledonlardan elde ettikleri somatik embriyolarda amino asitler, ABA, polietilen glikol ve farklı dozlarda sakarozun olgunlaştırma ve çimlendirme üzerine olan etkilerini araştırmışlardır. Başlangıç ortamı olarak 2 mg/l 2,4-D, 1 g/l kazein hidrolizat, 30 g/l sakaroz ve 3 g/l gelrite ilave edilmiş WPW temel besin ortamı kullanılmıştır. Eksplantlar, 23 o C de karanlık koşullarda 4 hafta inkübe edilmiştir. Oluşan proembriyogenik kütleler 4 haftada bir aynı besin ortamında kültüre alınmış ve 2 alt kültür sonrasında olgunlaşan embriyolar üç gruba ayrılarak yaş/kuru ağırlıkları, nişasta seviyeleri ve çimlenme oranları ölçülmüştür. Amino asit uygulaması için ayrılan ilk grup somatik embriyolar 60 g/l sakaroz, 1 g/l kazein hidrolizat, 0, 25 mm L-aspargine, 25 mm L-glutamin, 25 mm L-aspargine, 25 mm L-glutamin ilave edilmiş WPM ortamına dikilmiştir. Sakaroz denemesi, ikinci grup somatik embriyolar ile WPM ortamına 1 g/l kazein hidrolizat, 30, 45, 60, 75 g/l sakaroz ilave edilerek kurulmuştur. Üçüncü grup somatik embriyolar ise WPM besin ortamına 1g/l kazein hidrolizat, 60 g/l sakaroz, 0.38 µm (0.1 mg/l), 3.78 µm (1 mg/l), 7.57 µm (2 mg/l) ABA ve 0, 50, 75, 100 g/l polietilen glikol ilave edilerek dikilmiştir. Tüm ortamlar 23 o C de karanlık koşullarda 4 hafta inkübe edilmiştir. Çimlendirme aşaması için somatik embriyolar, 8

18 önce büyümeyi düzenleyici madde içermeyen 1 g/l kazein hidrolizat ilave edilmiş WPM ortamı üzerinde 4 o C de 4 hafta süre ile soğuklatılmış ve daha sonra yine büyümeyi düzenleyici madde içermeyen 15 g/l sakaroz, 3 g/l gelrite ve 0.5 g/l aktif kömür ilave edilmiş ½ kuvvetindeki WPM ortamı üzerinde 23 o C de 16 saat aydınlık koşullarda çimlendirmeye alınmıştır. Somatik embriyoların %8.78 i çimlenmiş ve 23 bitki dış koşullara alıştırılmıştır. Yapılan uygulamalar sonucunda hatların birinde 25 mm L- aspargine içeren ortam, somatik embriyolarda çimlenme oranını %14.78 e ulaştırarak önemli düzeyde artışa neden olmuştur. Ayrıca kök gelişimini, yaş/kuru ağırlık oranını ve nişasta miktarını da arttırarak önemli etkilerde bulunmuştur. Diğer uygulamalar ile bu özelliklerde çok fazla olmasa da bir artış sağlanmıştır. Andrade and Merkle (2005), Amerikan kestanesinde (C. dentata (Marsh.) Borkh.) somatik embriyoların kök oluşumu ve bitkiye dönüşümü üzerine kültür tipi, soğuk uygulaması, aktif kömür ve somatik embriyo morfolojisinin etkilerini araştırmışlardır. Embriyogenik hatlardan birinde soğuklatılmış (12 hafta) embriyolar %47 oranında bitkiye dönüşürken, soğuk uygulaması yapılmayanlarda bu oran %7 de kalmıştır. Aktif kömür uygulamasında köklenme oranı %77 ve bitkiye dönüşüm oranı %59 olarak belirlenmiştir. Süspansiyon kültüründen alınan somatik embriyoların %46 ve %48 i bitkiye dönüşürken yarı katı ortamdan alınanlarda bu oranlar %7 ve %30 da kalmıştır. Somatik embriyolardan elde edilen bitkilerin %90 ı saksılara alınmış ve nem kontrollü koşullara yerleştirilmiştir. Daha sonra sera koşullarına alınan bitkilerden 100 den fazlası dış koşullara başarıyla alıştırılmıştır. Sauer and Wilhelm (2005), Avrupa kestanesinde (C. sativa Mill.) somatik embriyogenesis amacıyla olgunlaşmamış tohum, ovaryum ya da yalnız ovul eksplantları kullanmışlardır. Eksplantlar 2 yıl süreyle tam çiçeklenme tarihinden bir hafta sonra alınmaya başlamış ve bu işlem 10 hafta boyunca devam etmiştir. Somatik embriyo oluşumları ovaryum kaynaklı eksplantlarda 6. haftada, ovul kaynaklı eksplantlarda 9. haftada (%18) ve tohum kaynaklı eksplantlarda 6. ve 10. haftalarda en yüksek seviyeye (%57.1) ulaşmıştır. İkinci yıl tekrarında ise tam çiçeklenme tarihinden sonraki 5. haftada ovul, 6. haftada ovaryum ve tohum kaynaklı eksplantlarda en yüksek somatik embriyogenesis oranları elde edilmiştir. Besin ortamı olarak P24 besin ortamına 9

19 (Teasdale 1992) 5 µm (1.1 mg/l) 2,4-D µm (0.11 mg /l) BA ilave edilmiştir. 3 hafta bu ortamda aydınlık koşullarda inkübe edildikten sonra P24 ortamına 0.89 µm (0.2 mg/l) BA ekleyerek aydınlık koşullarda tutulmuş ve 4 haftada bir alt kültür yapılmıştır. Embriyogenik hatların gelişmesiyle beraber sekonder embriyogenesis amacıyla eksplantlar BA (0.89 µm (0.2 mg/l)) ve L-glutamin ( mg/l) ilave edilmiş GD (Gresshoff and Doy 1972) ya da P24 temel besin ortamına dikilmiştir. Elde edilen somatik embriyolar olgunlaştırma amacıyla IBA (indolbütirik asit) (0.1 µm (0.02 mg/l)) + BA (0.89 µm (0.2 mg/l)) içeren %0.8 ve %1.1 agar ilave edilmiş P24 temel besin ortamına ya da büyümeyi düzenleyici madde içermeyen ortama dikilmiş ve 5 haftanın sonunda kök, sürgün ve kök + sürgün gelişimleri izlenmiştir. Gelişen bitkiler %1 aktif kömür içeren bitki büyüme düzenleyici içermeyen P24 ortamına aktarılmış ve 5 adet bitki dış koşulara alıştırılmıştır. Şan et al. (2007), dört Avrupa kestanesi (C. sativa Mill.) çeşidinde (Hacibiş, Karamehmet, Osmanoğlu ve Sarıaşlama) serbest tozlanma sonucu oluşmuş tohumların olgunlaşmamış kotiledonlarını somatik embriyogenesis amacıyla tam çiçeklenmeden 5, 6, 7 ve 8 hafta sonra 1 mg/l BA, 2 mg/l KIN, 0.01 mg/l IBA ve 250 mg/l L-glutamin içeren DKW temel besin ortamında kültüre almışlardır. Çalışmada tüm embriyogenik yapıların dikkate alınması ile elde edilen embriyogenik kotiledon oranı ve embriyogenik kotiledon başına globular, kalp, torpido ve kotiledon safhalarındaki toplam embriyo sayısı ikinci alt kültürün sonunda kaydedilmiştir. Embriyogenesis oranı çeşitlere göre % ve embriyogenik kotiledon başına embriyo sayısının arasında değişmiştir. Tam çiçeklenmeden 5, 6 ve 7 hafta sonra toplanmış kotiledonlar embriyogenik bulunmuştur. Corredoira et al. (2008), Avrupa kestanesinde (C. sativa Mill.) somatik embriyoların çok düşük olan rejenerasyon oranlarını artırmak amacıyla yavaş ya da hızlı kurutma, çimlendirme ortamına büyümeyi düzenleyici madde ya da glutamin ilave etme uygulamalarının etkilerini araştırmışlardır. Orijinini olgunlaşmamış zigotik embriyolardan alan üç embriyogenik hat (HV-Z2, CI-3 ve CI-9), 6 hafta aralıklarla proliferasyon ortamında alt kültüre alınmış ve sekonder embriyogenesis yoluyla 5 yıldan uzun bir süre devam ettirilmiştir. Proliferasyon ortamı olarak BA (0.44 µm (0.1 10

20 mg/l)), NAA (0.44 µm (0.1 mg/l) ve glutamin (438 mg/l (3 mm)) içeren 30 g/l sakaroz ve 7 g/l agar ilave edilmiş makro elementleri ½ kuvvetinde olan MS ortamı kullanılmıştır. Tüm kültürler 25/20 o C de 16/8 saat aydınlık/karanlık koşullarda inkübe edilmiştir. Çimlendirme denemeleri öncesinde proliferasyon kültürlerinden izole edilen kotiledon aşamasındaki beyaz, opak ve iki kotiledonlu somatik embriyolar 4 hafta süreyle olgunlaştırma ortamında kültüre alınmıştır. Olgunlaştırma ortamı, sakaroz yerine %3 maltoz kullanılarak, BA ve NAA ilave edilmeden proliferasyon ortamı ile aynı içerikte hazırlanan ortamdır. Olgunlaştırılan somatik embriyolar daha sonra çimlendirme ortamına alınarak 4 C de 2 ay süreyle tutulmuştur. Çimlendirme ortamı olarak 0.44 µm (0.1 mg/l) BA ilave edilmiş temel besin ortamı kullanılmıştır. Çimlendirme üzerine embriyo büyüklüğünün (2-5 ve 6-8 mm) etkisinin de araştırıldığı çalışmada (A) büyümeyi düzenleyici maddelerin kök, sürgün ve bitki rejenerasyonuna etkisini belirlemek amacıyla soğuklatılmış olgun embriyolar 1) büyümeyi düzenleyici madde içermeyen (kontrol), 2) sadece 0.44 µm (0.1 mg/l) BA ilave edilmiş ya da 3) 0.44 µm (0.1 mg/l) BA µm (0.1 mg/l) NAA veya 0.44 µm (0.1 mg/l) BA µm (0.1 mg/l) IBA ilave edilmiş çimlendirme ortamları üzerinde kültüre alınmıştır. Bu kapsamda çimlendirme öncesinde soğuklatma uygulamasının etkisini belirlemek üzere soğuklatılmamış embriyolar da 0.44 µm (0.1 mg/l) BA ilave edilmiş çimlendirme ortamına dikilmiştir. (B) Kurutma uygulamalarının rejenerasyona etkilerini saptamak amacıyla da soğuklatılmış olgun embriyolar steril boş petrilere konulmuş ve bu petriler kapağı açık olarak 0, 1, 2, 3 ya da 4 saat süreyle laminar hava akışlı kabinde bekletilmiştir. Kurutulmuş somatik embriyolar 0.44 µm (0.1 mg/l) BA µm (0.1 mg/l) IBA içeren çimlendirme ortamında kültüre alınmıştır. İlave olarak farklı kurutma biçimleri kapsamında soğuklatılmış olgun embriyolar boş petrilere konulup ağızları kapatıldıktan sonra 1-3 hafta süreyle karanlıkta yavaş kurumaya alınmıştır. Hızlı kurutma ise 2 saat süreyle uygulanmıştır. (C) Glutaminin rejenerasyon üzerine etkisini saptamak üzere soğuklatılmış olgun embriyolar 0, 50, 100, 200, 438 ya da 600 mg/l glutamin ilave edilmiş çimlendirme ortamları üzerinde kültüre alınmıştır. Araştırmanın sonucunda yavaş kurutma uygulamasının somatik embriyoların su kapsamında hafif bir azalmaya neden olduğu ve bu uygulamanın bitki rejenerasyonu, sürgün uzunluğu ve yaprak sayısında hiçbir zaman bir artış sağlamadığı belirlenmiştir. Bununla birlikte çalışmada en iyi sonuçlar, embriyoların nem kapsamını %57-58 e düşüren laminar hava 11

21 akışlı kabin içerisinde 2 saatlik hızlı kurutma uygulaması ile elde edilmiş ve bu uygulama sonucunda bitki rejenerasyonu ve rejenere olan bitkilerin kalitesi yükselmiştir. Bitkiye dönüşüm, çimlendirme ortamına 0.44 µm (0.1 mg/l) BA ve mg/l glutamin ilavesi ile uyarılmış ve bu uygulamaya 0.49 µm (0.1 mg/l) IBA nın da katılmasıyla bitki kalitesi de iyileşmiştir. Çalışmada somatik embriyolardan bitkiye dönüşüm, soğuklatma uygulamasının ardından µm (0.1 mg/l) BA µm (0.1 mg/l) NAA içeren çimlendirme ortamında kültüre alınan embriyolarda yüksek oranda (%23) gerçekleşmiştir. 2.2 Fagaceae Familyasına Ait Diğer Türlerde Somatik Embriyogenesis ve Bitki Rejenerasyonu Jörgensen (1987), Saplı meşe (Q. petrae (Matt.) Lieb.) ve Batı kayını (F. silvatica L.) çiçeklerinden aldığı anterleri somatik embriyogenesis amacıyla kültüre almıştır. Eksplantlar, BA ve 2,4-D (0, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2 mg/l), inositol (100 mg/l), nikotin amid (1 mg/l), pyridoksin hidroklorid (1 mg/l), thiamin (2 mg/l), folik asit (0.4 mg/l), p- aminobenzik asit (0.02 mg/l), biotin (0.01 mg/l), kolin (1 mg/l), askorbik asit (2 mg/l), vitamin A (0.01 mg/), vitamin D2 (0.01 mg/l), pantotenik asit (10 mg/l), vitamin B12 (0.02 mg/l), adenin (2 mg/l), kazein hidrolizat (200 mg/l) ve aktif kömür (2 g/l), glutamin (500 mg/l), serin (30 mg/l), PVP ( mg/l) ve glutamin (1000 mg/l) içeren MS ve WPM ortamlarında kültüre alınmış ve 28 o C de, 16 saat aydınlık koşullarda inkübe edilmiştir. Oluşan embriyogenik kallustan somatik embriyo oluşumu ilk dört günde meydana gelmeye başlamış, ancak sonrasında enfeksiyon nedeniyle kaybedilmiştir. Meşede ise, oluşan embriyolar hızlı bir şekilde gelişmeye devam etmiştir. Maataouı et al. (1990), Mantar meşesinde (Q. suber L.) kallus dokusundan somatik embriyo oluşumu üzerinde yaptıkları histolojik çalışmada in vitro kültürlerde, sera koşullarında tohumdan gelişmiş bitkilerin 6-8 mm uzunluğundaki boğum aralarını eksplant kaynağı olarak kullanmışlardır. Kallus ve somatik embriyogenesisde başlangıç ortamı olarak 111 mm (22 g/l) glukoz, 10 µm (2 mg/l) IBA, 8.88 µm (2 mg/l) BA, 1 g/l kazein hidrolizat ve 8 g/l agar agar ilave edilmiş MS ortamı esas alınmıştır. Kültürler 12

22 27 o C de karanlık koşullarda inkübe edilmiştir. Çalışmada proembriyoların ince duvarlı, küçük vakuollu, nişasta bakımından zengin ve çekirdekçiği belirgin iyi gelişmiş çekirdekli embriyogenik kallus hücrelerinden meydana geldiği bildirilmiştir. Manzanera et al. (1993), Mantar meşesinde (Q. suber L.) somatik embriyogenesis ve bitki rejenerasyonu amacıyla yaptıkları çalışmada embriyogenik kallusu olgunlaşmamış zigotik embriyoların hipokotillerinden elde etmişlerdir. Araştırıcılar tozlanma tarihi olarak belirttikleri Mayıs ayından sonra eksplantları 25 Haziran dan, 19 Eylül e kadar olan periyotta iki hafta aralıklarla almışlardır. Çalışmada, Sommer ortamının (Sommer et al. 1975) makro elementleri ile MS ortamının mikro elementlerini içeren ve ayrıca askorbik asit (11 µm), nikotinik asit (8.1 µm), glutamin (3.4 mm), kalsiyum pantothenate (4.2 µm), pyridoksin HCL (4.9 µm) ve thiamin HCL (3 µm) ilave edilmiş temel besin ortamı kullanılmıştır. Karbon kaynağı olarak sakarozun (87.6 mm) (30 g/l) esas alındığı ortamlar, sıvı ya da 8 g/l agar ile katılaştırılmış olarak kullanılmıştır. Başlangıç aşamasında temel besin ortamlarına 2.3, 4.5, 22.6 ve 45.2 µm (0.5, 1, 5 ve 10 mg/l) dozlarında 2,4-D ilave edilmiştir. Katı ya da sıvı başlangıç ortamları üzerinde 16 saat aydınlık koşullarda 30 gün süreyle inkübe edilen kültürler daha sonra hormonsuz ortama transfer edilmiştir. Embriyogenik kültürlerin 2,4-D bulunan tüm ortamlarda elde edildiği çalışmada, somatik embriyoların kallustan ya da eksplant üzerinde doğrudan meydana geldiği bildirilmiştir. Somatik embriyoların çimlendirilmesinde 5 o C de 2, 4 ya da 10 hafta veya 2 o C de 2 hafta süreyle soğuklatma, 0.3 M veya 0.7 M sorbitol içeren ortam üzerinde 30 gün süreli kültüre alma, distile su ile ıslatılmış filtre kağıdı konulmuş ya da boş kapaklı petriler içerisinde kurutma uygulamaları denenmiştir. Sorbitol uygulamalarının çimlenmeyi engellediğinin belirlendiği araştırmada kurutma uygulamalarının da çimlenme oranını önemli düzeyde arttırmadığı saptanmıştır. Kontrolde %5 düzeyinde belirlenen çimlenme oranı, soğuk uygulamaları ile özellikle 5 o C de 10 hafta ya da 2 o C de 2 hafta bekletme yoluylu %50 nin üzerine ulaşmıştır. Bununla birlikte kök gelişimi yönünde olumlu olan bu uygulamalarda epikotil dinlenmesi, köklü embriyoların 0.4 µm (0.1 mg/l) BA içeren Sommer ortamında bir filtre kağıdı köprüsü üzerinde kültüre alınmasıyla ortadan kaldırılmıştır. 13

23 Kim et al. (1997), (Quercus acutissima Carr.) da olgunlaşmamış kotiledonlardan somatik embriyogenesis çalışmalarında başlangıç aşaması için 1 g/l L-glutamin mg/l prolin + 1 mg/l IBA + 1 mg/l BA + 30 g/l sakaroz + 8 g/l difco-bacto agar ilave edilmiş MS besin ortamını esas almışlardır. Kültürler 25 ± 1 o C de 16 saat aydınlık koşullarda 4 hafta inkübe edilmiştir. Eksplantlar daha sonra büyüme düzenleyici madde içermeyen MS ortamına alınmıştır. Çimlendirme amacıyla kurulan denemelerde embriyolar 1) 0.1 mg/l BA ilave edilmiş WPM ortamı üzerinde 25 ± 1 o C de 16 saat aydınlık koşullarda 4 hafta beklettikten sonra 0.2 mg/l BA içeren ortama aktarılmış; 2) 0.1 mg/l BA içeren WPM ortamında 4 o C de 8 hafta boyunca karanlık koşullarda soğuklatmanın ardından 0.2 mg/l BA bulunan WPM ortamında 25 ± 1 o C de 16 saat aydınlık koşullarda inkübe edilmiş ya da 3) 0.1 mg/l BA mg/l GA 3 ilave edilmiş WPM ortamında 25 ± 1 o C de 16 saat aydınlık koşullarda 4 hafta tutmanın ardından 0.2 mg/l BA içeren WPM ortamına aktarılmıştır. Sekiz hafta sonra sürgün ve kök oluşturan bitkicikler dış koşullara aktarılmıştır. Çimlendirme uygulamalarında en yüksek oran %44 ile 3. uygulamadan elde edilirken soğuk uygulamasında bu oran %4.2 ile en düşük bulunmuştur. Cuenca et al. (1999), Saplı meşede (Q. robur L.) somatik embriyogenesis için eksplant kaynağı olarak tohumdan elde edilmiş bitkilerin boğum arası (5-8 mm) ve yaprak segmentlerini kullanmışlardır. Çalışmada temel besin ortamı, 500 mg/l kazein hidrolizat, %3 sakaroz ve %0.6 agar ilave edilmiş MS ortamıdır. Başlangıç aşamasında BA nın (0.5, 1, 2 mg/l), NAA ya da IBA (1, 2, 4 mg/l) ile oluşturduğu kombinasyonlar denenmiştir. Bu ortamlar üzerinde karanlık koşullarda 6 hafta süreyle inkübe edilen kültürler, 0.1 mg/l BA mg/l NAA ya da 0.1 mg/l BA mg/l IBA bulunan ortama transfer edilmiş ve 16 saat aydınlık koşullarda tutulmuştur. Kültürler 4. haftanın sonunda büyümeyi düzenleyici madde içermeyen temel besin ortamı üzerine taşınmış ve daha sonra aylık periyotlar ile alt kültürlere devam edilmiştir. Somatik embriyolar nodular bir kallusun yüzeyinde indirek olarak meydana gelmiştir. Somatik embriyogenesis oranları %16 dan (yaprak eksplantlarında), %4 e (boğum arası eksplantlarında) kadar değişmiştir. İki kotiledonlu olarak gelişen embriyolar şeffaf ya da opak beyaz görünümlü olmuştur. Bununla birlikte anormal yapılar da gözlenmiştir. Embriyogenik hatlar 0.1 mg/l BA mg/l NAA içeren çoğaltma ortamında alt 14

24 kültüre alınarak korunmuştur. Bulgular saplı meşede zigotik embriyoların dışındaki dokulardan da (gövde ve yaprak segmentleri) embriyogenik kültürlerin elde edilebileceğini göstermiştir. Puigderrajols et al. (2000), Mantar meşesinde (Q. suber L.) somatik embriyolarda sekonder embriyogenesisin büyümeyi düzenleyici madde içermeyen ortamlarda embriyo ekseni üzerinde meydana geldiğini ve kotiledonlar üzerinde nadir olarak ortaya çıktığını bildirmektedirler. Somatik embriyo kotiledonlarının embriyogenik potansiyeli üzerine büyümeyi düzenleyici maddelerin ve embriyo ekseninin etkilerinin araştırıldığı bu çalışmada ise somatik embriyolardan izole edilen kotiledonların büyümeyi düzenleyici madde içermeyen ortamlarda kültüre alındıklarında öldüğü, oysa BA ve NAA içeren besin ortamlarında sekonder embriyolar meydana getirdiği belirlenmiştir. Böylece mantar meşesi somatik embriyolarında kotiledonların embriyogenik tepkisinin yeterli olduğu ve petiol olmadan izole edilmiş kotiledonların embriyogenik özelliğinin ise petiol ile olanlara göre daha düşük olduğu saptanmıştır. Petiollerde somatik embriyolar parankima dokularının iç kısmından ortaya çıkmaktadır. Kotiledonların gösterdiği farklı morfolojik durumlar embriyo ekseninin etkisine işaret etmektedir. Puigderrajols et al. (2001), Mantar meşesinde (Q. suber L.) zigotik embriyo eksplantlarında somatik embriyogenesisi başarmışlar ve embriyogenik hatları büyümeyi düzenleyici madde içermeyen ortamlar üzerinde aylık periyotlar ile yapılan alt kültürler ile korumuşlardır. Bu embriyogenik hatlardan elde edilen olgunlaşmamış somatik embriyolar (şeffaf, iki kotiledonlu, 5 mm uzunluğundaki yapılar) ile yarı olgun somatik embriyolar (beyaz, opak, 1 cm uzunluğundaki yapılar) ya da kesilmiş kotiledonlar sekonder somatik embriyogenesis denemeleri için kullanılmıştır. Besin ortamı olarak %3 sakaroz ve %0.6 agar ilave edilmiş olan SH (Schenk ve Hildebrandt) ortamının makro elementleri (Schenk and Hildebrandt 1972) ile MS ortamının mikro elementleri, Fe-EDTA ve vitaminlerinden oluşmuş ortam esas alınmıştır. Büyümeyi düzenleyici maddelerin etkilerini araştırmak üzere yarı olgun somatik embriyolar ve izole edilmiş kotiledonlar, iki aşamalı olarak önce 10 µm (2.22 mg/l) BA + 10 µm (1.86 mg/l) NAA ortamı üzerinde karanlık ve daha sonra 5 µm (1.11 mg/l) BA + 5 µm (0.93 mg/l) NAA ortamı üzerinde 16 saat aydınlık koşullarda, 20 şer gün süreyle inkübe edilmiştir. 15

25 Embriyolar son olarak büyümeyi düzenleyici madde içermeyen temel besin ortamı üzerinde aydınlık koşullarda tutulmuştur. Sekonder embriyolar somatik embriyoların embriyo ekseni üzerinde görülürken, kotiledonları üzerinde görünüm oranı çok az olmuştur. Gonzales-Benito et al. (2002), Mantar meşesinde (Q. suber L.) somatik embriyoların çimlendirilmesi amacıyla kullandıkları BA nın ( µm ( mg/l)) bitkilerde aktif gelişmeyi artırdığını, bu sitokinine IAA (0.5 µm) ilavesinin etkili olmadığını, düşük BA dozunda (0.04 µm) çimlenmekte olan embriyolarda yeterli kök uzaması elde edildiğini ancak, yüksek dozlarda kök uzamasının engellendiğini bildirmişlerdir. Cvikrova et al. (2003), Sapsız meşede (Q. petraea (Matt.) Liebl.) somatik embriyogenesis üzerine fenilpropanoidlerin biyosentezinin engelleyici etkisi konusunda yaptıkları çalışmada embriyogenik kültürlerde AIP (2-aminoindan-2-phosphonic acid) uygulaması ile fenilpropanoidlerin biyosentezinin engellenmesinin sinamik asit miktarındaki kuvvetli azalma ile ilişkili olduğunu ve lignin kapsamının azaldığını belirlemişlerdir. Yüksek lignin kapsamı ile karakterize edilen kontrol kütürlerinde bulunan koyu yeşil kotiledonlu embriyoların miktarı (%30), AIP uygulamasından sonra fenilpropanoid lignin öncüllerinin seviyesindeki azalma ile düşmüştür (%10). Buna karşılık içsel sinamik asit düzeyinin azalması hücre bölünme aktivitesini ve erken safhadaki somatik embriyoların oluşumunu uyarmıştır. Globular, kalp ve torpido aşamalarındaki somatik embriyoların oranı AIP uygulanmış kültürlerde %25, kontrolde ise %10 olmuştur. Serbest putrescine, spermidine ve sperminin (poliaminler) daha yüksek düzeyleri ve onların bağlı formlarının düşük seviyeleri AIP bulunan ortamlarda 7 haftalık embriyo kültürlerinde belirgin olmuştur. Hernandez et al. (2003), 100 yaşındaki elit bir Mantar meşesi (Q. suber L.) ağacının somatik embriyogenesis yoluyla vejetatif çoğaltımını sağlamışlardır. Araştırıcılar, Mayıs ayında kesilen 4 cm den daha kalın dalların sera koşullarında %85 90 nemde uyarılmasıyla meydana gelen su sürgünlerinden aldıkları yaprak eksplantlarında uyardıkları somatik embriyogenesis sonucunda oluşan somatik embriyoların %40 ını çimlendirmişlerdir. 16

26 Mauri and Manzanera (2003), Pırnal meşesinde (Q. ilex L.) somatik embriyogenesis amacıyla olgunlaşmamış zigotik embriyoları eksplant kaynağı olarak kullanmışlardır. Elde edilen somatik embriyoların gelişimi ve olgunlaştırılması amacıyla yaptıkları çalışmada, farklı zamanlarda topladıkları olgunlaşmamış tohumlardan Ağustos ayında kültüre aldıkları eksplantlar en iyi sonucu vermiştir. Başlangıç aşamasında Gamborg s B-5 temel besin ortamına 10 µm (2.22 mg/l) BA + 10 µm (1.86 mg/l) NAA ilave edilmiştir. Sekonder embriyogenesis için SH, ½ SH, 2SH ve MS sıvı besin ortamlarından SH ve MS sıvı ortamları agar ile katılaştırılmış olanlardan daha iyi sonuç vermiş ve embriyoların taze ağırlığını artırmıştır. Besin ortamlarının makro element konsantrasyonlarını yarıya indirme, somatik embriyoların olgunlaşmasını hızlandırırken sekonder embriyogenesis oluşumunda azalmaya neden olmuştur. Toribio et al. (2004), Mantar meşesinde (Q. suber L.) olgun ağaçlarda su sürgünlerinin yapraklarında somatik embriyogenesis için geliştirilmiş protokolü saplı meşede (Q. robur L.) 100 yaşlı ağaçlarda uygulamışlardır. Mantar meşesi için Hernandez et al. (2003) tarafından iki aşamalı olarak geliştirilen bu tekniğe göre ilk aşamada, eksplantlar %1 sakaroz, %0.6 agar ilave edilmiş ve büyümeyi düzenleyici madde içermeyen Gamborg (1966) besin ortamının ½ kuvvetindeki makro elementleri ile MS ortamının mikro elementleri, vitaminleri ve Fe-EDTA sından oluşmuş temel besin ortamı üzerinde 25 o C de karanlık koşullarda 7 gün süreyle kültüre alınmıştır. İkinci aşamada kültürler %3 sakaroz, %0.6 agar, 10 µm (2.25 mg/l) BA ve 50 µm (9.3 mg/l) NAA ilave edilmiş SH besin ortamının makro elementleri ile MS ortamının mikro elementleri, Fe-EDTA ve vitaminlerinden oluşmuş temel besin ortamı üzerinde 25 o C de karanlık koşullarda 30 gün süreyle tutulmuştur. Bu sürenin sonunda eksplantlar, 0.5 µm (0.1 mg/l) BA ve NAA katılmış olan bir önceki temel besin ortamı üzerinde 25 o C de 16 saat aydınlık koşullarda 30 gün süreyle kültüre alınmıştır. Aynı temel besin ortamı üzerinde yapılan alt kültürlerde ortama büyümeyi düzenleyici madde ilave edilmemiştir. Bununla birlikte saplı meşede yapraklar doğrudan 2.5 µm (0.56 mg/l) BA, 20 µm (3.72 mg/l) NAA, %3 sakaroz, %0.6 agar, %0.05 kazein hidrolizat ilave edilmiş MS temel besin ortamı üzerinde 25 o C de 16 saat aydınlık koşullarda 30 gün süreyle kültüre almışlardır. Somatik embriyoların oluşumu için eksplantlar daha sonra büyümeyi düzenleyici madde 17

27 içermeyen ortama transfer edilmiştir. Sekonder embryogenesis için somatik embriyolar BA (0.44 µm (0.1 mg/l)) ve NAA (0.27 µm (0.05 mg/l)) katılmış MS temel besin ortamında 5 er hafta arayla alt kültüre alınmıştır. Çimlenme öncesinde somatik embriyolar kazein hidrolizat içermeyen makro element düzeyi ½ olan ve %6 sorbitol, %3 sakaroz katılmış besin ortamında 4 hafta süreyle olgunlaştırılmıştır. Çimlenme ortamı olarak 0.44 µm (0.1 mg/l) BA ilave edilmiş makro element düzeyi ½ olan MS besin ortamı kullanılmıştır. Çalışmada, Q. suber L. ağaçlarının dallarından sürdürülmüş su sürgünlerinin yaprak eksplantlarında somatik embriyogenesis oranı genotiplere göre % ve somatik embriyoların çimlenme oranı %17 60 arasında değişmiştir. Corredoira et al. (2006b), Saplı meşede (Q. robur L.) olgun yaprak eksplantlarından elde edilen somatik embriyoların miktarındaki azlığın ve anatomik farklılaşmanın nedenlerini araştırmışlardır. Histolojik çalışmada 100 yaşındaki meşe yapraklarından elde edilen somatik embriyoların hücresel ayrımı üzerinde durulmuştur. Somatik embriyogenesis amacıyla yaprak eksplantları NAA (21.5 µm (4 mg/l)) + BA (2.22 µm (0.5 mg/l)) + kazein hidrolizat (500 mg/l) + sakaroz (30 g/l) + agar (6 g/l) ilave edilmiş MS besin ortamında kültüre alınmış ve kültürler 25 o C de karanlık koşullarda 6 hafta inkübe edilmiştir. Alt kültürlerde NAA (0.54 µm (0.1 mg/l)) + BA (0.44 µm (0.1 mg/l) içeren MS ortamı kullanılmış ve kültürler 25/20 o C ve 16/8 saat aydınlık/karanlık koşullarda 4 hafta bekletilmiştir. Bu periyottan sonra eksplantlar büyüme düzenleyici madde içermeyen ortama taşınmış ve aynı koşullarda inkübe edilmiştir. Histolojik çalışmalar için eksplantların kültüre alınmasından itibaren 14. haftaya kadar her hafta 6 adet eksplant ve meydana gelen embriyogenik doku ayrılmıştır. Araştırmanın sonuçlarına göre somatik embriyogenesis yaprağın üst yüzeyinde oluşmuş kallus dokusundan indirek olarak meydana gelmiştir. Kallus dokusundan embriyogenik hücrelerin farklılaşması kültürlerin haftalarında gerçekleşmiştir. Embriyogenik hücrelerin yoğun olarak proteince zengin bir protoplazma ve yüksek nükleoplazmik oranı sergilediği ve küçük nişasta granülleri içerdiği belirlenmiştir. Bu hücrelerdeki başarılı bölünme birkaç hücreli proembriyoların ve embriyogenik hücre yığınlarının oluşmasını sağlamıştır. 18

28 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bu çalışma, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü ve Çankırı Karatekin Üniversitesi Orman Fakültesi bünyesinde bulunan biyoteknoloji laboratuvarlarında yılları arasında yürütülmüştür. 3.1 Materyal Araştırmada bitkisel materyal olarak Osmanoğlu ve Sarıaşlama Avrupa kestane çeşitleri (Castanea sativa Mill.) kullanılmıştır. Bu amaçla Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü (Yalova) kestane koleksiyon parseli ve iki üretici bahçesinde yer alan ağaçlardan yararlanılmıştır. Üretici bahçelerinden birisi Ekrem Polat a ait olup Bursa da Uludağ eteklerindeki Cumalıkızık Köyü nde, diğeri Hikmet Yılmaz a ait olup Bursa nın İnegöl ilçesinde yine Uludağ eteklerindeki Yenice Köyü nde bulunmaktadır. Osmanoğlu kestane çeşidi: Anadolu orijinli olan bu çeşit seleksiyon yolu ile Bursa yöresinden elde edilmiştir. Ağacı verimli, orta kuvvette ve yayvan şekillidir. Meyveleri orta-iri, genişçe, oval şekilli ve iyi kalitededir. Meyve kabuğu orta kalın, tipik kestane renginde ve parlak, hafif tüylü, yüzeyi hafif aralıklı çizgilidir. Meyve eti krem renginde ve tohum zarı meyve içerisine oldukça girmektedir (Şekil 3.1). Şekil 3.1 Osmanoğlu kestane çeşidine ait meyveler (Anonim 2009) 19

29 Meyve iriliği yıllara göre değişmekle beraber ortalama adet/kg dır. Eylül ayının 3. haftasında olgunlaşmaktadır. Erkenci ve sofralık tüketime uygun olan bu çeşit, aynı zamanda kestane şekerlemesi sanayinde de kullanılmaktadır (Anonim 2000, Soylu 2004, Tosun 2006). Kestane kanseri (C. parasitica (Murr.) Barr.) ve mürekkep hastalığına (P. cambivora Petri.) karşı oldukça hassastır (Uzunoğulları vd. 2001). Sarıaşlama kestane çeşidi: Anadolu orijinli olan ve özellikle Bursa yöresinde yetiştirilen bu çeşit, diğer yörelerde de görülmektedir. Ağacı orta kuvvette ve yarı dik şekilde gelişmektedir. Meyveleri yuvarlağa yakın oval, uç kısma doğru üçgenimsi ve meyve tabanı düzdür. Meyve kabuğu ince, tipik kestane renginde, parlak, tüysüz, yüzeyi aralıklı çizgilidir (Şekil 3.2). Meyve eti krem renginde, tohum zarı meyve içerisine çokça girmekte ve taze iken zor soyulmaktadır. Meyve iriliği yıllara göre ortalama adet/kg arasında değişmektedir. Ekim ayının ilk on gününde hasadı yapılmaktadır. Sofralık tüketime ve kestane hamuru yapımına uygun verimli bir çeşittir (Anonim 2000, Soylu 2004, Tosun 2006). Şekil 3.2 Sarıaşlama kestane çeşidine ait meyveler (Soylu 2004) 20

30 3.2 Yöntem Somatik embriyogenesis Başlangıç aşaması için eksplantların alınması ve dikime hazırlanması: Araştırmada somatik embriyogenesis çalışmalarında başlangıç aşamasında eksplant kaynağı olarak, serbest tozlanma sonucu oluşmuş olgunlaşmamış tohumların kotiledonları kullanılmıştır. Üç yıl boyunca her iki çeşitte dişi çiçeklerin tam çiçeklenme (Şekil 3.3) tarihlerinden (Çizelge 3.1) 7 hafta sonra yıllara göre Temmuz sonu-ağustos başı arasında meyve yumakları (Şekil 3.4) toplanarak bekletilmeden laboratuvara getirilmiş ve meyvelerine ayrılmıştır (Şekil 3.5) (Şan et al. 2007). Bu kapsamda her normal gelişmiş meyve yumağı içerisinden 3 adet meyve çıkarılmıştır. Şekil 3.3 Kestanede dişi çiçeklerde tam çiçeklenme dönemi Çizelge 3.1 Osmanoğlu ve Sarıaşlama kestane çeşitlerinin dişi çiçek fenolojileri Yıl Çeşit Çiçeklenme Başlangıcı Tam Çiçeklenme Çiçeklenme Sonu Osmanoğlu 11 Haziran 18 Haziran 27 Haziran Sarıaşlama 19 Haziran 26 Haziran 5 Temmuz Osmanoğlu 10 Haziran 17 Haziran 25 Haziran Sarıaşlama 18 Haziran 25 Haziran 1 Temmuz Osmanoğlu 1 Haziran 9 Haziran 16 Haziran Sarıaşlama 10 Haziran 17 Haziran 24 Haziran 21

31 Şekil 3.4 Kestanede tam çiçeklenmeden 7 hafta sonra olgunlaşmamış bir meyve yumağı Meyve yumağından ayrılan olgunlaşmamış meyveler (Şekil 3.5), %15 klor içeren ticari sodyum hipokloritin birkaç damla Tween 20 ilave edilmiş %20 lik solusyonunda 15 dakika boyunca sterilize edilmiş ve ardından sodyum hipokloritin dokulardan uzaklaşması için 3 defa 5 er dakika süre ile steril saf su ile aseptik koşullarda çalkalanmıştır. Sterilizasyonun tamamlanmasından sonra laminar hava akışlı kabin içerisinde olgunlaşmamış meyveler açılmış (Şekil 3.6) ve daha sonra tohumların kotiledon kısımlarından yaklaşık 0.5 cm 2 büyüklüğünde eksplantlar bir bistüri yardımıyla kesilerek dikime hazır hale getirilmiştir. Şekil 3.5 Kestanede tam çiçeklenmeden 7 hafta sonra olgunlaşmamış meyveler 22

32 Şekil 3.6 Tam çiçeklenmeden 7 hafta sonra olgunlaşmamış bir kestane meyvesi ve tohumu Başlangıç aşaması için besin ortamı bileşimleri: Olgunlaşmamış kotiledon eksplantlarında somatik embriyogenesisin uyarılması amacıyla başlangıç aşamasında farklı bileşimlerdeki besin ortamları kullanılmıştır. Bu aşamada temel besin ortamlarının, organik maddelerin, AgNO 3 ın, katılaştırıcı tipinin ve büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonlarının etkileri araştırılmıştır. A- Temel besin ortamları 1) MS (Murashige and Skoog 1962) (Çizelge 3.2) 2) DKW (Tulecke and McGranahan 1985) (Çizelge 3.2) 3) WPM (Lloyd and McCown 1981) (Çizelge 3.2) B- Organik maddeler: 1) L-glutamin (250 mg/l) 2) Kazein hidrolizat (1000 mg/l) C- AgNO 3 : 1) 0.0 mg/l 2) 1.7 mg/i D- Katılaştırıcılar: 1) Agar (6 g/l) 2) Gelrite (2.1 g/l) 23

33 Çizelge 3.2 Murashige ve Skoog (MS) (Murashige and Skoog 1962), Driver ve Kuniyuki Walnut (DKW) (Tulecke and McGranahan 1985) ve Woody Plant Medium (WPM) (Lloyd and McCown 1981) temel besin ortamlarının içeriği (A) MAKRO ELEMENTLER g/mol MS Ortamı DKW Ortamı WPM Ortamı mg/l mg/l mg/l Amonyum nitrat (NH 4 NO 3 ) Potasyum nitrat (KNO 3 ) Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl 2.2H 2 O) Kalsiyum nitrat tetrahidrat (Ca(NO 3 ) 2.4H 2 O) Çinko nitrat heksahidrat (Zn(NO 3 ) 2 6H 2 O) Potasyum sülfat (K 2 SO 4 ) Potasyum dihidrojen fosfat (KH 2 PO 4 ) Magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO 4.7H 2 O) (B) DEMİR Soydum-demir EDTA (C 10 H 12 N 2 FeNa) Sodyum EDTA (Na 2 EDTA) Demir sülfat heptahidrat (FeSO 4 7 H 2 O) (C) MİKRO ELEMENTLER Mangan sülfat monohidrat (MnSO 4. H 2 O) Çinko sülfat heptahidrat (ZnSO 4.7H 2 O) Nikel sülfat heksahidrat (NiSO 4.6H 2 O) Borik asit (H 3 BO 3 ) Potasyum iyodür (KI) Potasyum dihidrojen fosfat (KH 2 PO 4 ) Sodyum molibdat dihidrat (Na 2 MoO 4.2H 2 O) Bakır sülfat pentahidrat (CuSO 4.5H 2 O) Kobalt klorür heksahidrat (CoCl 2. 6H 2 O) (D)VİTAMİNLER Myo-Inositol (C 6 H 12 O 6 ) Glisin (C 2 H 5 NO 2 ) Thiamin klorid hidroklorid (C 12 H 8 C l2 N 4 OsxH 2 O) Nikotinik asid (C 6 H 5 NO 2 ) Pridoksol hidroklorid (C 8 H 12 ClNO 3 )

34 E- Büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonları: 1) BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) (Şan et al. 2007) 2) BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 3) KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 4) BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 5) BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 6) KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 7) BA (1 mg/l) + NAA (1 mg/l) (Corredoira et al. 2003) dır. Osmanoğlu ve Sarıaşlama kestane çeşitlerinin her birisi için 168 farklı kombinasyonda hazırlanan besin ortamlarına 30 g/l sakaroz ilave edilmiş ve ortamın ph sı 5.7 ye ayarlanmıştır. Besin ortamlarının sterilizasyonu Hirayama marka dijital kontollü otoklav ile 121 o C ve 1.2 atmosfer basınç altında 20 dakika süreyle yapılmıştır. Otoklavdan çıkarılan besin ortamları laminar hava akışlı kabin içerisinde katılaşmasından hemen önce steril cam petrilere (100 x 10 mm) 40 ar ml dağıtılmıştır. Cam petrilerin sterilizasyonu 121 o C ve 1.2 atmosfer basınç altındaki otoklavda 90 dakika süreyle yapılmış ve bu kaplar kullanılıncaya kadar aseptik koşullarda saklanmıştır. Başlangıç kültürlerinin oluşturulması: Kotiledon eksplantlar besin ortamına aseptik koşullarda yatay pozisyonda dikilmiştir. Her birisine 5 adet eksplantın dikildiği petri kaplarının kapak kısmındaki açıklık nem kaybı ve dışarıdan bulaşmanın engellenmesi amacıyla dikimden hemen sonra streç film ile sarılmıştır. Kültürler 25 x 30 x 25 cm boyutlarındaki kapaklı mukavva kutulara yerleştirilmiş ve iklim odasında 25 ± 1 o C de karanlık koşullarda 4 hafta süreyle inkübe edilmiştir. Alt kültürler ve somatik embriyoların oluşumu: Kotiledon eksplantlar, somatik embriyogenesisin uyarımı için dikildikleri başlangıç ortamlarından kültürlerin 4. haftasının sonunda, somatik embriyoların meydana gelmesi için büyüme düzenleyici madde, AgNO 3, L-glutamin ya da kazein hidrolizat içermeyen aynı temel besin ortamları üzerinde alt kültüre alınmıştır. Alt kültür aşamasında kotiledon eksplantların 25

35 ilk dikildikleri temel besin ortamları dikkate alınmış ve bu amaçla yine MS, DKW ve WPM temel besin ortamları kullanılmıştır. Bu aşamada başlangıçtan farklı olarak katılaştırıcı kapsamında sadece agar (6 g/l) esas alınmıştır. Ortamlara 30 g/l sakaroz ilave edilmiş ve ph 5.7 ye ayarlanmıştır. Ortamların sterilizasyonu yine otoklav ile 121 o C ve 1.2 atmosfer basınç altında 20 dakika süreyle yapılmış ve 100 x 10 mm boyutundaki petrilere 40 ar ml dağıtılmıştır. Kotiledon eksplantlar, taze hazırlanmış bu besin ortamları üzerinde 4 er hafta ara ile toplam 4 kez alt kültüre alınmış ve her defasında başlangıçta dikildikleri besin ortamı kombinasyonunun adı korunmuştur. Çalışmada başlangıç aşamasında kullanılan farklı kombinasyonlardaki ortam bileşimlerinin somatik embriyogenesis üzerine etkileri 4 ay sonra, 4. alt kültürün sonunda, somatik embriyogenesis oranı (%) ve ortalama somatik embriyo sayısının, (adet/embriyogenik kotiledon) hesaplanması ile belirlenmiştir. Somatik embriyogenesis oranı (%), somatik embriyo meydana getirmiş olan toplam kotiledon eksplantların sayısının başlangıç ortamına dikilmiş olan toplam kotiledon eksplant sayısına oranlanması ve sonucun 100 ile çarpılması ile hesaplanmıştır. Ortalama somatik embriyo sayısı (adet/kotiledon eksplant), her bir embriyogenik kotiledon eksplanttan meydana gelen kotiledon safhasındaki embriyo sayısının uygulamadaki tüm eksplant (kotiledon parçası) sayısına bölünmesi ile adet/kotiledon eksplant olarak belirlenmiştir Somatik embriyoların rejenerasyonu Rejenerasyon denemelerinde kotiledon eksplantlardan elde edilen kotiledon safhasındaki somatik embriyolar kullanılmıştır (Şekil 3.7). Rejenerasyon denemelerinde temel besin ortamı olarak 30 g/l sakaroz ve 6 g/l agar katılmış DKW ya da makro elementleri ½ kuvvetinde olan MS temel besin ortamları kullanılmıştır. 26

36 Şekil 3.7 Kotiledon safhasındaki somatik embriyo Deneme konularına göre bu ortamlara farklı büyümeyi düzenleyici maddeler ilave edilmiş ya da edilmemiştir. Ortamların ph sı 5.7 ye ayarlanmıştır. Sterilizasyon için 121 o C ve 1.2 atmosfer basınç altındaki otoklavda 20 dakika tutulan ortamlar steril cam petrilere (100 x 10 mm) 40 ar ml dağıtılmıştır. Somatik embriyolar aseptik koşullarda, kök/epikotil ekseninde kök ucu ortam içerisine gelecek şekilde dikey pozisyonda ve 5 adet/petri olarak dikilmiştir. Rejenerasyon kapsamında tüm kültürler 25 ± 1 o C sıcaklık ve 16 saat aydınlık (35 µmol m -2 s -1 ), 8 saat karanlık koşullara sahip iklim odasında 4 hafta süreyle inkübe edilmiştir. Somatik embriyoların rejenerasyonu kapsamında 3 farklı deneme yapılmıştır. I) Kurutma ve gibberellik asit uygulamaları: Kurutma uygulaması yapılmadan ya da yapıldıktan sonra somatik embriyoların 0, 1, 3, 5, 7 ve 9 mg/l GA 3 içeren DKW temel besin ortamları üzerinde 4 hafta süreyle kültüre alınmasıyla gerçekleştirilmiştir. Kurutma uygulaması, aseptik koşullarda, doymuş MgCl 2.6H 2 O (magnezyum klorür heksahidrat) çözeltisi içeren bir desikatöre yerleştirilmiş kapaklı boş petri kapları içerisinde somatik embriyoların 4 gün süreyle bekletilmesi ile yapılmıştır (Şan and Dumanoglu 2007) (Şekil 3.8). 27

37 Şekil 3.8 Somatik embriyoların MgCl 2.6H 2 O çözeltisi konulmuş Nalgene desikatörde kapaklı petriler içerisinde kurutulması Kurutma uygulaması için önce 1500 ml hacme sahip Nalgene desikatör, dip kısmına konulmuş 40 ml doymuş MgCl 2.6H 2 O çözeltisi ile birlikte otoklavlanarak steril duruma getirilmiştir. Daha sonra laminar hava akışlı kabin içerisinde 50 x 10 mm boyutlarındaki steril kapaklı 4 adet boş petriye 20 şer adet kotiledon safhasında somatik embriyo (Şekil 3.6) konulmuş ve tüm petriler desikatör içerisine yerleştirilmiştir (Şekil 3.8). Çevresi streç film ile sarılan desikatörler kurutma süresince 25 ± 1 o C sıcaklıktaki iklim odasında tamamen karanlık koşullarda bekletilmiştir. II) Kurutma ve soğuklatma yapılmış somatik embriyolarda benziladenin uygulamaları: Bu denemede Corredoira et al. e (2008) göre BA (0.1 mg/l), BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) ve BA (0.1 mg/l) + IBA (0.1 mg/l) uygulamaları esas alınmıştır. Denemelerde kurutma ve soğuklatma uygulamaları yapılmış somatik embriyolar kullanılmıştır. Bu amaçla somatik embriyolar önce kurutulmuş ve daha sonra soğuklatılmıştır. Kurutma uygulaması I. denemede belirtildiği şekilde uygulanmıştır. Soğuklatma uygulaması ise 30 g/l sakaroz ve 6 g/l agar ilave edilmiş, ph sı 5.7 ye ayarlanmış DKW temel besin ortamı üzerinde somatik embriyoların 4 o C sıcaklıkta karanlık koşullarda 8 hafta süreyle tutulmasıyla yapılmıştır. Soğuklatma 28

38 amacıyla somatik embriyolar 40 ar ml besin ortamı konulmuş 100 x 10 mm boyutlarındaki petri kaplarına 15 er adet dikilmiştir. BA ve BA + oksin uygulamaları kapsamında somatik embriyolar, BA, NAA ya da IBA ya ilave olarak 438 mg/l L-glutamin (Corredoira et al. 2008), 30 g/l sakaroz ve 6 g/l agar içeren ve ph sı 5.7 ye ayarlanmış makro elementleri ½ kuvvetindeki MS temel besin ortamına dikilmiştir. III) Kurutma ve Soğuklatma ya da GA 3 (ön uygulamalar) ile BA ve NAA uygulamaları: II. denemede kurutma + soğuklatma yapılmış somatik embriyolarda rejenerasyon oranını artırdığı saptanan BA + NAA uygulamasında kurutma, soğuklatma ya da GA 3 ün etkisini belirlemek üzere bu ön uygulamaların yokluğunda ya da varlığında BA + NAA nın performansını belirlemek üzere yapılmıştır. Bu denemede kurutma ve soğuklatma uygulamaları I. denemede belirtildiği şekilde uygulanmıştır. GA 3 uygulaması ise I. denemedekinden farklı olarak sadece 3 mg/l lik doz ile 10 gün süreyle yapılmıştır. BA + NAA uygulaması 0.1 mg/l dozlarında makro elementleri ½ kuvvetinde olan MS temel besin ortamına ilave edilmiştir. II. denemede belirtildiği gibi bu ortama ayrıca 438 mg/l L-glutamin (Corredoira et al. 2008), 30 g/l sakaroz ve 6 g/l agar ilave edilmiş ve ortamların ph sı 5.7 ye ayarlanmıştır. Rejenerasyon denemeleri kapsamında farklı uygulamaların somatik embriyoların rejenerasyonu üzerine etkileri 4. haftasının sonunda kök oluşturma oranları (%), sürgün oluşturma oranları (%) ve kök + sürgün oluşturma oranlarının (%) hesaplanması ile belirlenmiştir Deneme planı ve verilerin analizi Bu tezde denemelerin tamamı Tesadüf Parselleri Deneme Deseni ne göre kurulmuştur. Somatik embriyogenesis denemelerinde her iki kestane çeşidinde (Osmanoğlu ve Sarıaşlama) somatik embriyo oluşumu üzerine başlangıç aşamasında yer alan 5 farklı 29

39 uygulamanın (temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı) etkisi araştırılmış ve denemeler her birinde 5 adet eksplant (kotiledon parçası) olmak üzere 5 tekerrürlü (petri) olarak kurulmuştur. Bu kapsamda tüm denemeler 2 yıl yinelenmiştir. Somatik embriyoların rejenerasyonu denemeleri kapsamında I. denemede çeşit x kurutma x GA 3 dozları ; II. denemede çeşit x BA uygulamaları ; III. denemede çeşit x ön uygulama kombinasyonları x BA+NAA interaksiyonlarının rejenerasyon başarısı üzerine etkileri araştırılmıştır. Denemeler her birinde 5 eksplant (somatik embriyo) olacak şekilde 5 tekerrürlü olarak kurulmuştur. Bu denemeler en az 2 kez yinelenmiştir. Somatik embriyogenesis ve rejenerasyon denemelerinden elde edilen veriler yinelemelerin ortalaması olarak varyans analizi yöntemi (ANOVA) ile Minitab Paket Programı (MINITAB) ile F-testine göre kontrol edilmiştir (P < 0.05, 0.01, 0.001). Ortaya çıkan önemli farklılıklar Duncan çoklu karşılaştırma testi ile %5 hata sınırı esas alınarak saptanmış ve farklılıklar harfler yardımıyla belirlenmiştir. İstatistik analizlerde yüzde oranların açı değeri karşılıkları kullanılmıştır. 30

40 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1 Somatik Embriyogenesis Osmanoğlu kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranı Osmanoğlu kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranı üzerine temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı arasındaki interaksiyonunun etkisi istatistiksel anlamda önemli bulunmamıştır (P = 0.172). Benzer şekilde deneme konuları arasında 4 lü interaksiyonlarda da P değeri 0.05 in üzerinde belirlenmiştir. Bununla birlikte 3 lü interaksiyonlardan büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu x AgNO 3 x katılaştırıcı (P = 0.001) ve büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu x organik madde x katılaştırıcı (P = 0.045) arasındaki interaksiyonlar istatistiksel anlamda önemli bulunmuştur (Çizelge 4.1). Buna göre Osmanoğlu çeşidinde somatik embriyogenesis verileri Çizelge 4.2 de ve Çizelge 4.3 de sunulmuştur. Bu çeşitte büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu x organik madde x katılaştırıcı interaksiyonu kapsamında 3 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu [KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] x L-glutamin x gelrite %9.7 ile en yüksek somatik embriyogenesis oranını vermiştir (Çizelge 4.2) (Şekil 4.1). Bununla birlikte aynı büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonunda, kazein hidrolizat ve gelrite ile elde edilen %7.3 ile L-glutamin ve agar ile elde edilen %6.0; 1 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonunda [BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] kazein hidrolizat ve gelrite ile elde edilen %7.0 ve 2 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonunda [BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)], L-glutamin ve gelrite ile elde edilen %6.3 lük oranlar arasındaki farklılıklar istatistiksel anlamda önemli bulunmamış ve bu uygulamaların tamamı aynı grup içerisinde yer almıştır. Bu kapsamda büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonlarına 31

41 ait değerler incelendiğinde genel olarak 4, 5, 6 ve 7 no lu kombinasyonlardaki oranların (% ) çok düşük seviyelerde kaldığı görülmektedir (Çizelge 4.2). Çizelge 4.1 Osmanoğlu kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranları için P değerleri Kaynak Serbestlik Derecesi P değeri Temel besin ortamı *** Büyümeyi düzenleyici madde *** Organik madde AgNO Katılaştırıcı * Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici *** Temel besin ortamı x organik madde * Temel besin ortamı x AgNO Temel besin ortamı x katılaştırıcı ** Büyümeyi düzenleyici x organik madde Büyümeyi düzenleyici x AgNO Büyümeyi düzenleyici x katılaştırıcı * Organik madde x AgNO Organik madde x katılaştırıcı AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x AgNO Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x katılaştırıcı Temel besin ortamı x organik madde x AgNO Temel besin ortamı x organik madde x katılaştırıcı Temel besin ortamı x AgNO 3 x katılaştırıcı Büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO Büyümeyi düzenleyici x organik madde x katılaştırıcı * Büyümeyi düzenleyici x AgNO 3 x katılaştırıcı *** Organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı Büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P <

42 Çizelge 4.2 Osmanoğlu kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranı (%) üzerine büyümeyi düzenleyici madde x organik madde x katılaştırıcı madde interaksiyonunun etkisi (P = 0.045) Organik Madde Büyümeyi Düzenleyici Kombinasyonları L-Glutamin Kazein Hidrolizat Agar 1- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 3.3 (4.20) ** defghı * 2.3 (2.87) fghı 2- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 4.0 (4.85) cdefgh 4.3 (5.76) bcdef 3- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 6.0 (7.27) abcde 3.0 (3.75) efghı 4- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 0.7 (0.89) hı 0.3 (0.44) ı 5- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 2.3 (3.10) fghı 0.7 (0.89) hı 6- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 1.0 (1.10) hı 1.3 (1.77) fghı 7- BA (1 mg/l) + NAA (1 mg/l) 2.3 (3.10) fghı 2.3 (2.87) fı Gelrite 1- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 2.7 (3.31) fghı 7.0 (8.12) abc 2- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 6.3 (7.72) abcd 5.0 (5.71) bcdefg 3- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 9.7 (9.97) a 7.3 (8.81) ab 4- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 1.3 (1.77) ghı 1.3 (1.77) hı 5- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 1.7 (1.50) hı 2.0 (2.66) fghı 6- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 3.3 (3.71) efghı 0.7 (0.89) hı 7- BA (1 mg/l) + NAA (1 mg/l) 1.3 (1.54) hı 0.7 (0.89) hı * Farklı harfler uygulamalar arasındaki farklılığı göstermektedir. ** Parantez içindeki rakamlar yüzde değerlerin açı değerleri karşılığıdır. 33

43 Çizelge 4.3 Osmanoğlu kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranı (%) üzerine büyümeyi düzenleyici madde x AgNO 3 x katılaştırıcı madde interaksiyonunun etkisi (P = 0.001) AgNO 3 Büyümeyi Düzenleyici Kombinasyonları 0.0 mg/l 1.7mg/l Agar 1- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 4.3 (5.52) ** bcdef * 1.3 (1.54) fgh 2- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 3.7 (4.64) cdefg 4.7 (5.97) abcde 3- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 5.7 (6.60) abcd 3.3 (4.43) defgh 4- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 0.3 (0.44) h 0.7 (0.89) gh 5- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 2.0 (2.66) efgh 1.0 (1.33) gh 6- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 1.3 (1.54) fgh 1.0 (1.33) gh 7- BA (1 mg/l) + NAA (1 mg/l) 1.3 (1.77) fgh 3.3 (4.20) defgh Gelrite 1- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 2.3 (3.10) defgh 7.3 (8.33) abc 2- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 7.7 (8.56) ab 3.7 (4.87) bcdefg 3- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 8.3 (9.41) a 8.7 (9.37) a 4- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 1.3 (1.77) fgh 1.3 (1.77) fgh 5- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 1.7 (2.21) efgh 2.0 (1.94) fgh 6- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 2.0 (2.42) efgh 2.0 (2.17) efgh 7- BA (1 mg/l) + NAA (1 mg/l) 1.7 (1.98) fgh 0.3 (0.44) h *Farklı harfler uygulamalar arasındaki farklılığı göstermektedir. ** Parantez içindeki rakamlar yüzde değerlerin açı değerleri karşılığıdır. 34

44 Şekil 4.1 Osmanoğlu kestane çeşidinde 3 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu [KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] ve Lglutamin içeren gelrite ile katılaştırılmış DKW temel besin ortamında kotiledon eksplantlar üzerinde somatik embriyolar İçerik olarak 4, 5 ve 6 no lu kombinasyonlar, 1, 2 ve 3 no lu kombinasyonlardan farklı olarak IBA yerine 2,4-D içermektedir. Bulgular, somatik embriyogenesisi uyarmada IBA nın olumlu etki yaptığını ve 7 no lu kombinasyonda yer alan NAA nın da bu bakımdan 2,4-D gibi etkisiz kaldığını göstermektedir (Çizelge 4.2). Osmanoğlu çeşidinde büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu x AgNO3 x katılaştırıcı interaksiyonu (P = 0.001) dikkate alındığında gelrite ile katılaştırılmış temel besin ortamlarında 3 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu [KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)], AgNO3 ile birlikte (%8.7) ya da AgNO3 sız (%8.3); 2 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu [BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] AgNO3 sız (%7.7) (Şekil 4.2) ve 1 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu [BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] AgNO3 ile birlikte (%7.3) en yüksek embriyogenesis oranlarını vermiştir. Bununla birlikte agar ile katılaştırılmış ortamlarda da 2 ve 3 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonları sırasıyla AgNO3 ile birlikte (%4.7) ya da AgNO3 bulunmadan (%5.7) istatistiksel anlamda iyi sonuçlar vermiştir (Çizelge 4.3). Bu kapsamda yine oksin olarak 2,4-D içeren 4, 5 ve 6 no lu ve NAA içeren 7 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonlarında, her iki katılaştırıcı ve AgNO3 dozu ile çok düşük oranlar (%0.33.3) elde edilmiştir (Çizelge 4.2). 35

45 Şekil 4.2 Osmanoğlu kestane çeşidinde 2 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu [BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] ve AgNO 3 içeren gelrite ile katılaştırılmış MS temel besin ortamında kotiledon eksplantlar üzerinde somatik embriyolar Osmanoğlu kestane çeşidinde ortalama somatik embriyo sayısı Osmanoğlu kestane çeşidinde ortalama somatik embriyo sayısı üzerine temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı arasındaki interaksiyon istatistiksel anlamda önemli bulunmamıştır (P = 0.098). Bununla birlikte temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu x AgNO 3 x katılaştırıcı arasındaki interaksiyon istatistiksel anlamda önemli olmuştur (P = 0.010) (Çizelge 4.4). Buna göre Osmanoğlu çeşidinde ortalama somatik embriyo sayısına ait veriler Çizelge 4.5 te sunulmuştur. Osmanoğlu çeşidinde gelrite ile katılaştırılmış MS besin ortamında 3 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu [KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] AgNO 3 ile birlikte (0.65 ± 0.15 adet/eksplant) ya da AgNO 3 olmadan (0.62 ± 0.14 adet/eksplant) en yüksek ortalama somatik embriyo sayılarını vermiştir (Çizelge 4.5) Aynı temel besin ortamı ve büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu, AgNO 3 ilave edilmeden ve katılaştırıcı olarak agarın bulunduğu durumda da istatistiksel anlamda yüksek bir embriyo sayısı vermiştir (0.50 ± 0.15 adet/eksplant) (çizelge 4.5.). 36

46 Çizelge 4.4 Osmanoğlu kestane çeşidinde somatik embriyo sayıları için P değerleri Kaynak Serbestlik Derecesi P değeri Temel besin ortamı *** Büyümeyi düzenleyici madde *** Organik madde AgNO Katılaştırıcı madde * Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici *** Temel besin ortamı x organik madde Temel besin ortamı x AgNO Temel besin ortamı x katılaştırıcı * Büyümeyi düzenleyici x organik madde Büyümeyi düzenleyici x AgNO Büyümeyi düzenleyici x katılaştırıcı * Organik madde x AgNO Organik madde x katılaştırıcı AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x AgNO Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x katılaştırıcı Temel besin ortamı x organik madde x AgNO Temel besin ortamı x organik madde x katılaştırıcı Temel besin ortamı x AgNO 3 x katılaştırıcı Büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO Büyümeyi düzenleyici x organik madde x katılaştırıcı * Büyümeyi düzenleyici x AgNO 3 x katılaştırıcı *** Organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x AgNO 3 x katılaştırıcı ** Temel besin ortamı x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı Büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P <

47 Çizelge 4.5 Osmanoğlu kestane çeşidinde somatik embriyo sayısı (adet/eksplant) üzerine temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici madde x AgNO 3 x katılaştırıcı madde interaksiyonunun etkisi (P = 0.010) DKW MS WPM Büyümeyi Düzenleyici AgNO 3 Madde 0.0 mg/l 1.7 mg/l 0.0 mg/l 1.7 mg/l 0.0 mg/l 1.7 mg/l Kombinasyonları Agar 1- BA (1mg/l) + KIN (2mg/l)+IBA (0.01mg/l) 0.35± ±0.05 bcdef * fgh 0.32±0.14 bcdefg 0.10±0.07 fgh 0.05±0.05 fgh 0.00±0.00 h 2- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 0.20±0.09 defgh 0.45±0.13 abcd 0.25±0.12 cdefgh 0.25±0.12 cdefgh 0.10±0.07 fgh 0.05±0.05 fgh 3- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 0.25±0.10 cdefgh 0.25±0.10 cdefgh 0.50±0.15 abc 0.25±0.10 cdefgh 0.00±0.00 h 0.00±0.00 h 4- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 0.00±0.00 h 0.05±0.05 fgh 0.05±0.05 fgh 0.05±0.05 gh 0.00±0.00 h 0.00±0.00 h 5- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 0.30±0.13 bcdefgh 0.05±0.05 fgh 0.10±0.10 fgh 0.10±0.07 fgh 0.00±0.00 h 0.00±0.00 h 6- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 0.10±0.07 fgh 0.05±0.05 fgh 0.05±0.05 fgh 0.10±0.07 fgh 0.00±0.00 h 0.00±0.00 h 7- BA (1 mg/l) + NAA (1 mg/l) 0.05±0.05 fgh 0.10±0.10 fgh 0.05±0.05 fgh 0.32±0.14 bcdefg 0.10±0.07 fgh 0.15±0.08 efgh Gelrite 1- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 0.20±0.09 defgh 0.63±0.17 a 0.15±0.08 efgh 0.40±0.13 abcde 0.00±0.00 h 0.00±0.00 h 2- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 0.45±0.17 abcd 0.15±0.08 efgh 0.55±0.13 ab 0.50±0.15 abc 0.00±0.00 h 0.00±0.00 h 3- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 0.47±0.16 abcd 0.47±0.17 abcd 0.62±0.14 a 0.65±0.15 a 0.00±0.00 h 0.00±0.00 h 4- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 0.00±0.00 h 0.10±0.07 fgh 0.30±0.15 bcdefgh 0.10±0.07 fgh 0.00±0.00 h 0.00±0.00 h 5- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 0.15±0.08 efgh 0.15±0.08 efgh 0.10±0.07 fgh 0.00±0.00 h 0.00±0.00 h 0.00±0.00 h 6- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 0.10±0.07 fgh 0.15±0.08 efgh 0.15±0.08 efgh 0.05±0.05 fgh 0.00±0.00 h 0.00±0.00 h 7- BA (1 mg/l) + NAA (1 mg/l) 0.05±0.05 fgh 0.05±0.05 gh 0.27±0.15 bcdefgh 0.00±0.00 h 0.00±0.00 h 0.00±0.00 h *Farklı harfler uygulamalar arasındaki farklılığı göstermektedir. 38

48 Bu uygulamaların dışında ortalama somatik embriyo sayısı, DKW temel besin ortamı esas alındığında 1 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu [BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)], gelrite ve AgNO 3 ile birlikte denemenin 2. yüksek değerine (0.63 ± 0.17 adet/eksplant) ulaşmıştır (Çizelge 4.5). Diğer temel besin ortamlarına göre azot içeriği düşük olan (Çizelge 3.2) WPM temel besin ortamı dikkate alındığında tüm uygulamalar için ortalama somatik embriyo sayısı en düşük seviyelerde kalmıştır (0.00 ± ± 0.08 adet/eksplant). Aynı durum DKW ve MS temel besin ortamları esas alındığında tüm katılaştırıcı ve AgNO 3 dozlarında özellikle 4, 5, 6 ve 7 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonlarında da gözlenmektedir. Somatik embriyogenesis oranlarında olduğu gibi oksin olarak 2,4-D ve NAA içeren bu ortamlar ortalama somatik embriyo sayısı üzerine olumsuz etki yapmışlardır (Çizelge 4.5) Sarıaşlama kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranı Sarıaşlama kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranı üzerine temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı arasındaki 5 li interaksiyon istatistiksel anlamda önemli olmadığı gibi bu konuda 4 lü ve 3 lü ve biri dışında 2 li interaksiyonlar arasındaki farklılıklar da önemli bulunmamıştır (Çizelge 4.6). Bu çeşitte somatik embriyogenesis oranı bakımından sadece temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu arasındaki interaksiyon istatistiksel anlamda önemli olmuştur (P = 0.000) (Çizelge 4.6). Buna göre en yüksek değerin %12.0 ile DKW temel besin ortamı x 1 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonundan [BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] elde edildiği çalışmada (Şekil 4.3), aynı temel besin ortamının 2 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu [BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] ile uygulanması sonucunda kaydedilen %11.2 lik embriyogenesis değeri de bununla aynı istatistik grup içerisinde yer almıştır (Çizelge 4.7) (Şekil 4.4). 39

49 Çizelge 4.6 Sarıaşlama kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranları için P değerleri Kaynak Serbestlik Derecesi P değeri Temel besin ortamı *** Büyümeyi düzenleyici madde *** Organik madde AgNO Katılaştırıcı madde Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici *** Temel besin ortamı x organik madde Temel besin ortamı x AgNO Temel besin ortamı x katılaştırıcı Büyümeyi düzenleyici x organik madde Büyümeyi düzenleyici x AgNO Büyümeyi düzenleyici x katılaştırıcı Organik madde x AgNO Organik madde x katılaştırıcı AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x AgNO Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x katılaştırıcı Temel besin ortamı x organik madde x AgNO Temel besin ortamı x organik madde x katılaştırıcı Temel besin ortamı x AgNO 3 x katılaştırıcı Büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO Büyümeyi düzenleyici x organik madde x katılaştırıcı Büyümeyi düzenleyici x AgNO 3 x katılaştırıcı Organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı Büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P <

50 Çizelge 4.7 Sarıaşlama kestane çeşidinde somatik embriyogenesis oranı (%) ve somatik embriyo sayısı (adet/eksplant) üzerine temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici madde interaksiyonunun etkisi (P = 0.000) Büyümeyi Düzenleyici Madde Kombinasyonları Somatik embriyogenesis (%) Somatik embriyo sayısı (adet/eksplant) 1- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 12.0 (13.48)** 2- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 11.2 (11.76) 3- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 8.0 (9.41) 4- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l 4.0 (4.62) 5- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 7.0 (7.71) 6- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 4.0 (4.79) 7- BA (1 mg/l) + NAA (1 mg/l) 2.7 (3.48) 1- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 5.0 (5.95) 2- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 7.0 (7.56) 3- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 2.2 (2.99) 4- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l 1.5 (1.84) 5- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 0.7 (0.99) 6- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 1.2 (1.66) 7- BA (1 mg/l) + NAA (1 mg/l) 3.0 (3.46) DKW a * 0.49±0.07 a ab 0.43±0.07 ab bc 0.37±0.06 b def 0.15±0.04 cdefg cd 0.24±0.05 cd def 0.16±0.04 cdef efg 0.12±0.04 defgh MS de 0.20±0.04 cde cd 0.25±0.05 c efg 0.12±0.04 defgh fg 0.07±0.03 efgh g 0.04±0.02 gh fg 0.06±0.03 fgh efg 0.12±0.04 efgh WPM 1- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 0.0 (0.00) g 2- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 0.0 (0.00) g 3- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l) 1.0 (1.33) fg 4- BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l 0.0 (0.00) g 5- BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 0.0 (0.00) g 6- KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + 2,4-D (0.02 mg/l) 0.0 (0.00) g 7- BA (1 mg/l) + NAA (1 mg/l) 0.0 (0.00) g *Farklı harfler uygulamalar arasındaki farklılığı göstermektedir. ** Parantez içindeki rakamlar yüzde değerlerin, açı değerleri karşılığıdır. 0.0±0.0 h 0.0±0.0 h 0.05±0.02 fgh 0.0±0.0 h 0.0±0.0 h 0.0±0.0 h 0.0±0.0 h 41

51 Şekil 4.3 Sarıaşlama kestane çeşidinde 1 no lu büyümeyi düzenleyici kombinasyonunu [BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] ve L-glutamin içeren gelrite ile katılaştırılmış DKW temel besin ortamında kotiledon eksplantlar üzerinde somatik embriyolar Şekil 4.4 Sarıaşlama kestane çeşidinde 2 no lu büyümeyi düzenleyici kombinasyonunu [BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l] ve L-glutamin içeren gelrite ile katılaştırılmış DKW temel besin ortamında kotiledon eksplantlar üzerinde somatik embriyolar 42

52 Bu değerleri DKW temel besin ortamı x 3 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu [KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] interaksiyonunda elde edilen %8.0 lık somatik embriyogenesis oranı izlemiştir (Çizelge 4.7). Sarıaşlama çeşidinde diğer temel besin ortamlarına göre azot içeriği düşük olan WPM temel besin ortamının (Çizelge 3.2) farklı büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonları ile oluşturduğu uygulamalarının hiç birisinde somatik embriyogenesis uyarılamamıştır. Aynı sonuç, MS temel besin ortamının BA ve IBA nın birlikte bulunduğu 1 ve 2 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonları (Çizelge 4.7) dışındaki 3, 4, 5, 6 ve 7 no lu kombinasyonlarıyla ve DKW temel besin ortamının 7 no lu kombinasyonuyla birlikte kullanıldığı durumda da ortaya çıkmıştır. Bu uygulamaların bazılarında her ne kadar somatik embriyogenesis oranının %3.0 a kadar çıktığı gözlenmişse de bu uygulamalar ile %0.0 değerinin alındığı uygulamalar arasındaki farklılık istatistiksel anlamda önemli olmamıştır (Çizelge 4.7) Sarıaşlama kestane çeşidinde ortalama somatik embriyo sayısı Sarıaşlama kestane çeşidinde ortalama somatik embriyo sayısı üzerine temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı arasındaki interaksiyon istatistiksel anlamda önemli bulunmamıştır (P = 0.537). Ayrıca bu özellik bakımından temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu (P = 0.000) dışındaki tüm interaksiyonlarda da P değeri 0.05 in üzerinde belirlenmiştir (Çizelge 4.8). Sarıaşlama çeşidinde en yüksek ortalama somatik embriyo sayısı, DKW temel besin ortamının 1 no lu [BA (1 mg/l) + KIN (2 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] (Şekil 4.2) ve 2 no lu [BA (1 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonları ile oluşturduğu uygulamalarda sırasıyla 0.49 ± 0.07 adet/eksplant ve 0.43 ± 0.07 adet/eksplant olarak kaydedilmiştir. Bu değerleri, DKW temel besin ortamı x 3 no lu büyümeyi düzenleyici madde kombinasyonu [KIN (2 mg/l) + TDZ (0.1 mg/l) + IBA (0.01 mg/l)] uygulamasının 0.37 ± 0.06 adet/eksplant olan değeri izlemiştir (Çizelge 4.7). 43

53 Çizelge 4.8 Sarıaşlama kestane çeşidinde somatik embriyo sayıları için P değerleri Kaynak Serbestlik Derecesi P değeri Temel besin ortamı *** Büyümeyi düzenleyici madde *** Organik madde AgNO Katılaştırıcı madde Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici *** Temel besin ortamı x organik madde Temel besin ortamı x AgNO Temel besin ortamı x katılaştırıcı Büyümeyi düzenleyici x organik madde Büyümeyi düzenleyici x AgNO Büyümeyi düzenleyici x katılaştırıcı Organik madde x AgNO Organik madde x katılaştırıcı AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x AgNO Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x katılaştırıcı Temel besin ortamı x organik madde x AgNO Temel besin ortamı x organik madde x katılaştırıcı Temel besin ortamı x AgNO 3 x katılaştırıcı Büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO Büyümeyi düzenleyici x organik madde x katılaştırıcı Büyümeyi düzenleyici x AgNO 3 x katılaştırıcı Organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı Büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı Temel besin ortamı x büyümeyi düzenleyici x organik madde x AgNO 3 x katılaştırıcı * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P <

54 4.2 Somatik Embriyoların Rejenerasyonu Osmanoğlu ve Sarıaşlama kestane çeşitlerinde gibberellik asit ve kurutma uygulamalarının somatik embriyoların rejenerasyonu üzerine etkileri Osmanoğlu ve Sarıaşlama kestane çeşitlerinde, gibberellik asit ve kurutma uygulamalarının somatik embriyoların kök, sürgün ve kök+sürgün rejenerasyonları üzerine etkileri bakımından çeşit x kurutma x GA 3 dozları, çeşit x kurutma ; çeşit x GA 3 dozları ve kurutma x GA 3 dozları arasındaki interaksiyonlar ile çeşit kurutma ve GA 3 dozları nın seviyeleri arasındaki farklılıklar istatistiksel bakımdan önemli bulunmamıştır (Çizelge 4.9). Çizelge 4.9 Kestane somatik embriyolarında kurutma ve GA 3 uygulamalarında rejenerasyon oranları için P değerleri Kaynak Serbestlik Derecesi P değeri Kök Sürgün Kök+Sürgün Çeşit Kurutma GA 3 dozları Çeşit x kurutma Çeşit x GA 3 dozları Kurutma x GA 3 dozları Çeşit x kurutma x GA 3 dozları * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P <

55 Her iki çeşitte de kurutma uygulaması yapıldıktan sonra farklı dozlarda GA 3 içeren ortamlarda kültüre alınmış embriyolarda kök, sürgün ve kök+sürgün rejenerasyonu meydana gelmezken, kurutma uygulamasının yapılmadığı durumda (kontrol) Osmanoğlu çeşidinde 3 mg/l GA 3 ve Sarıaşlama çeşidinde 5 mg/l GA 3 dozlarında %10-20 gibi düşük düzeylerde de olsa rejenerasyon meydana gelmiştir (Çizelge 4.10). Bununla birlikte istatistiksel bulgular bu denemede hiç bir uygulamanın kök, sürgün, kök+sürgün rejenerasyonu üzerine önemli bir etkisinin olmadığını ortaya koymuştur (Çizelge 4.9 ve Çizelge 4.10). Çizelge 4.10 Kestane somatik embriyolarında rejenerasyon oranları üzerine kurutma ve GA 3 uygulamalarının etkisi Kök Oluşturma Oranı Sürgün Oluşturma Oranı Kök+Sürgün Oluşturma Oranı Kök Oluşturma Oranı Sürgün Oluşturma Oranı Kök+Sürgün Oluşturma Oranı (%) (%) (%) (%) (%) (%) GA 3 OSMANOĞLU SARIAŞLAMA DOZU Kontrol 0 mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l Kurutma 0 mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l

56 4.2.2 Osmanoğlu ve Sarıaşlama kestane çeşitlerinde kurutma ve soğuklatma yapılmış somatik embriyolarda benziladenin uygulamalarının rejenerasyon üzerine etkileri Osmanoğlu ve Sarıaşlama kestane çeşitlerinde kurutma ve soğuklatma yapılmış somatik embriyoların kök, sürgün ve kök+sürgün rejenerasyonları üzerine benziladenin uygulamalarının etkileri bakımından çeşit x benziladenin uygulamaları arasındaki interaksiyon istatistiksel bakımdan önemli bulunmamıştır (P = 0.976). Çeşitler arasındaki farklılığın da önemli olmadığı (P = 0.794) çalışmada sadece benziladenin uygulamaları kapsamında yer alan kontrol, BA (0.1 mg/l), BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) ve BA (0.1 mg/l) + IBA (0.1 mg/l) arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak önemli bulunmuş (P = 0.000) (Çizelge 4.11) ve çeşitlerin ortalaması olarak uygulamaların kök, sürgün ve kök+sürgün rejenerasyonu üzerine etkileri Çizelge 4.12 de sunulmuştur. Kök oluşturma oranları bakımından en iyi sonucun (%22.0) BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) uygulamasından elde edildiği çalışmada, diğer uygulamalarda bu oran %0.0 olarak kaydedilmiştir (Çizelge 4.12). Çizelge 4.11 Kurutma ve soğuklatma yapılmış kestane somatik embriyolarında benziladenin uygulamalarında rejenerasyon oranları için P değerleri Kaynak Serbestlik Derecesi P değeri Kök Sürgün Kök+Sürgün Çeşit Benziladenin uygulamaları *** *** *** Çeşit x benziladenin uygulamaları * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P <

57 Sürgün oluşturma oranları bakımından da en yüksek sonuç (%24.0) yine bu uygulamadan alınmıştır. Her ne kadar sürgün oluşumu BA (0.1 mg/l) uygulamasında %6.0 oranında ortaya çıkmışsa da bu değer ile kontrol ve BA (0.1 mg/l) + IBA (0.1 mg/l) uygulamasından elde edilen %0.0 lık değer arasında istatistiksel anlamda önemli bir farklılık belirlenmemiştir (Çizelge 4.12). Kök ve sürgün rejenerasyonlarında olduğu gibi kök+sürgün rejenerasyonunun da istatistiksel anlamda diğerlerinden farklı olarak sadece BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) uygulamasında sağlandığı çalışmada bu oran %22.0 olarak kaydedilmiştir (Çizelge 4.12). Çizelge 4.12 Kestane somatik embriyolarında rejenerasyon oranları üzerine BA uygulamalarının etkileri Uygulama Kök Oluşturma Oranı Sürgün Oluşturma Oranı Kök+Sürgün Oluşturma Oranı (%) (%) (%) Kontrol 0.0 b * 0.0 b 0.0 b BA 0.0 b 6.0 b 0.0 b (0.1 mg/l) BA (0.1 mg/l) a 24.0 a 22.0 a NAA (0.1 mg/l) BA (0.1 mg/l) b 0.0 b 0.0 b IBA (0.1 mg/l) *Farklı harfler uygulamalar arasındaki farklılığı göstermektedir. 48

58 4.2.3 Osmanoğlu ve Sarıaşlama kestane çeşitlerinde ön uygulamalar ile birlikte BA+NAA uygulamasının somatik embriyoların rejenerasyonu üzerine etkileri Osmanoğlu ve Sarıaşlama kestane çeşitlerinde, ön uygulama kombinasyonu kapsamında yer alan kurutma, soğuklatma ya da GA 3 ile birlikte BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) uygulamasının somatik embriyoların kök, sürgün ve kök+sürgün rejenerasyonları üzerine etkileri bakımından çeşit x ön uygulama kombinasyonları x BA+NAA interaksiyonu istatistiksel bakımdan önemli bulunmamıştır (P = 0.980). Bu kapsamda çeşitlerin ortalaması olarak sadece ön uygulama kombinasyonları x BA+NAA interaksiyonu önemli olmuştur (P = 0.050) (Çizelge 4.13). Çalışmada, herhangi bir ön uygulamanın yapılmadığı ya da ön uygulama olarak kurutma, kurutma+soğuklatma veya kurutma+ga 3 uygulamalarından birisinin yerine getirildiği somatik embriyolar BA+NAA içeren ortamlar üzerinde kültüre alınmadıklarında kök, sürgün ve kök+sürgün rejenerasyonları meydana gelmemiştir. Bu sonuç (%0.0), BA+NAA uygulamalarında elde edilen değerlerden istatistik olarak ayrılmıştır (Çizelge 4.14). Aynı ön uygulama koşullarında somatik embriyolar, BA+NAA içeren ortamlar üzerinde kültüre alındıklarında rejenerasyonlar ortaya çıkmıştır (Şekil 4.5). Bu bakımdan en düşük rejenerasyon oranı (%16.6) herhangi bir ön uygulamanın yapılmadığı durumda kaydedilmiştir. Bununla birlikte kurutma, kurutma+soğuklatma veya kurutma+ga 3 ün biriyle ön uygulama yapılmış somatik embriyolar BA+NAA uygulaması ile birlikte % arasında değişen oranlarda kök, sürgün ya da kök+sürgün meydana getirmiş ve oranlar arasındaki farklılık istatistiksel anlamda önemli bulunmamıştır. Bulgular, soğuklatma ya da GA 3 uygulamalarına gerek kalmadan, sadece kurutmanın ardından BA+NAA uygulaması ile somatik embriyolarda aynı oranda kök, sürgün, kök+sürgün rejenerasyonunun meydana gelebileceğini açığa çıkarmıştır (Çizelge 4.14). 49

59 Çizelge 4.13 Kestane somatik embriyolarında ön uygulamalar ve BA + NAA uygulamasında rejenerasyon oranları için P değerleri Kaynak Serbestlik Derecesi P değeri Kök Sürgün Kök+Sürgün Çeşit BA+NAA uygulaması Ön uygulama kombinasyonları Çeşit x BA+NAA uygulaması Çeşit x ön uygulama kombinasyonları BA+NAA uygulaması x ön uygulama kombinasyonları * 0.050* 0.050* Çeşit x BA+NAA uygulaması x ön uygulama kombinasyonları * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < Şekil 4.5 Avrupa kestanesinde (C. sativa Mill. cv. Osmanoğlu) kurutma ve soğuklatma ön uygulamaları yapıldıktan sonra BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) çimlendirme ortamında kök + sürgün oluşturmuş bir somatik embriyo 50