GEN MUTASYONU ve DNA ONARIMI

Transkript

1 GEN MUTASYONU ve DNA ONARIMI 1

2 Konular 1. Gen mutasyonlarının sınıflandırılması 1. Mutasyonun nasıl oluştuğuna göre 2. Mutasyonun yerine göre 3. Moleküler değişimin tipine göre 4. Fenotipteki etkisine göre 2. Kendiliğinden oluşan mutasyonlar sebepleri 3. Tetiklenmiş mutasyonların sebepleri 4. Mutasyon tanısı 5. Mutasyonların araştırmalarda kullanımı 6. DNA onarımı

3 1. Mutasyonların sınıflandırılması Mutasyon, DNA dizisindeki değişiklik olarak tanımlanabilir. Mutasyon: Tek bir baz çifti değişiminden, Bir silinme ya da Bir veya daha fazla baz çiftinin eklenmesinden oluşabilir. 3

4 1. Mutasyonların sınıflandırılması Mutasyonlar fenotipte değişikliğe yol açabilir ya da açmayabilir. Organizmanın karakteristiklerini değiştirme derecesi, mutasyonun nerde olduğuna ve mutasyonun geni ne denli değiştirdiğinin derecesine bağlıdır. Mutasyonlar somatik hücrelerde ya da eşey hücrelerinde olabilir. Eşey hücrelerinde olanlar kalıtılır ve bu sebeple, genetik çeşitlilik ve evrimin de temelini oluşturur. 4

5 1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar Mutasyonlar, kendiliğinden ya da tetiklenmiş olarak sınıflandırılabilir 1) Kendiliğinden mutasyon genlerin nükleotid dizilerindeki rastgele değişikliktir. Bu duruma herhangi bir dış etken sebep olmaz Hücre içi biyolojik ve kimyasal tepkimeler sonucu oluşur Genellikle DNA eşlenmesi (replikasyonu) sırasında oluşan hatalardır. 5

6 1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar Mutasyon hızı: Bir nesilde veya gamet oluşumunda bir mutasyonun oluşma olasılığı Kendiliğinden oluşan mutasyonlarda mutasyon hızı için 3 genelleme: 1. Tüm canllarda mutasyon hızı oldukça yavaştır 2. Türler arasında mutasyon hızı farklılık gösterir 3. Aynı organizmada genler arasında mutasyon hızı farklılık gösterir Organizmalar arasındaki değişkenlik, onların hata okuma ve onarım sistemlerinin göreceli etkinliklerinden dolayı oluşabilir.

7 Farklı organizmalar ve bunların farklı genlerinde mutasyon hızları Hız Hızlar faj için bir gen eşlenmesi E.coli için bir hücre bölünmesi Diğer canlılar için bir nesilde gamet oluşumu olarak verilmiştir 1X10-8 = 100 milyon eşlenmede 1 mutasyon

8 1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar 2) Tetiklenmiş mutasyon, herhangi bir dış faktörün etkisi sonucu oluşan mutasyonlardır. Doğal ya da yapay ajanlar sonucu oluşabilir. Ör: UV ışınlar, kimyasallar Mutasyonların yapay olarak tetiklendiklerine dair örnekler: Hermann J. Muller, X ışınlarının Drosophila da mutasyona yol açtığını rapor etmiştir. Lewis J. Stadler, X ışınlarının arpa üzerinde aynı etkiyi yaptığını belirlemiştir. 8

9 1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar Luria-Delbrück düzensiz değişim testi Mutasyonlar rastgele mi oluşur yoksa çevresel etkenler sonucu uyum amacıyla mı oluşur? Salvador Luria ve Max Delbrück, mutasyonların rastgele olarak oluştuğuna dair ilk doğrudan kanıtı sundular. deneylerini E. coli / T1 sistemi ile gerçekleştirdiler. T1 bakteriyofajı E. coli hücrelerin enfekte eden ve onları parçalayan bir bakteri virüsüdür. 9

10 1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar E. coli nin bir büyük bir de çok sayıda küçük sıvı kültürünü oluşturdular. Büyük kaptaki hücreler yüksek yoğunluğa ulaşana kadar büyütüldü Küçük tüplerde 20 milyon hücre olduğunda bunları T1 bakteriyofajı içeren petri kabına ektiler. Büyük kaptaki bakteriler de 20 milyonluk hücreler halinde aynı şekilde ekildi. 10

11 1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar Bakteriyofaj varlığında büyüyebilen bakteriler bu faja dirençli bakteriler olacaktı Büyüyen koloniler sayıldı Mutasyonların rastgele olup olmadığı iki hipotez altında test edildi 11

12 1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar Hipotez 1 Canlının uyumunu artıran mutasyon ise: Her petri kutusunda sabit sayıda bakteri ve faj bulunur. Eğer mutasyonlar ortamda faj bulunduğu için oluşuyorsa her bakterinin direnç oluşturma olasılığı sabit bir değer olmalıdır Dolayısıyla dirençli bakteri sayısında, petri kabından petri kabına ve deneyden deneye çok az oynama olur. 12

13 1.1 Kendiliğinden oluşan ve tetiklenmiş mutasyonlar Hipotez 2 Rastgele mutasyon ise: Eğer mutasyonlar fajın varlığından bağımsız, rastgele olarak meydana geliyorsa bakterinin büyümesi sırasında herhangi bir anda oluşmuş olabilirler Mutasyonlar büyümenin geç döneminde oluştuklarında, çok daha az sayıda dirençli hücre üreyecektir. Mutasyonlar büyümenin erken döneminde oluştuysa çok sayıda dirençli koloni üreyecektir Bu durumda kaptan kaba ve deneyden deneye koloni sayıları değişkenlik gösterecektir. 13

14

15 Deney sonucunda 2. hipotezi doğrular şekilde kaplardaki koloni sayıları arasında büyük farklar görülmüştür. Tüpten tüpe farklı zamanlarda rastgele mutasyon oluştuğunu gösterir Büyük kapta büyütülen bakteriler kontrol grubunu oluşturmuştur. Bu kaptaki hücreler sürekli karıştırılmış ve bakterilerin eşit dağılması sağlanmıştır Dolayısıyla aynı kaptan alınarak farklı petri kaplarında faj üzerinde büyütülen bakterilerin birbirine benzer özellikleri göstermesi beklenir

16 T1 e dirneçli baktreilerin sayısı Örnek no. Aynı kültür (Kontrol) Farklı kültürler Ortalama Değişim

17 1.2 Mutasyonun yerine göre Mutasyonlar oluştukları hücre tipi ya da kromozom bölgelerine göre sınıflandırılabilirler. Somatik mutasyonlar; eşey hücreleri dışında herhangi bir hücrede olabilirler. Eşey hücre mutasyonları, gametlerde oluşur. Otozomal mutasyonlar, otozom kromozomlar üzerinde yer alan genlerde oluşur. X veya Y ye bağlı mutasyonlar 17

18 1.2 Mutasyonun yerine göre Somatik hücrelerdeki mutasyonlar gelecek nesillere aktarılamaz. Diploid bir organizmanın somatik bir hücresinde bir otozomal çekinik mutasyon oluştuğunda bu mutasyonlar yabanıl allel tarafından maskelenir!!! Ancak baskın olursa veya X e bağlı olarak erkekte oluşursa tespit edilebilir Bu tip mutasyonlar da gelişim evresinde oluşursa daha fazla fark edilebilir Erişkin bireylerde oluştuğunda tek bir hücredeki baskın mutasyon diğer binlerce normal hücre tarafından yine maskelenecektir!!! 18

19 1.2 Mutasyonun yerine göre Eşey hücrelerinde meydana gelen mutasyonlar daha önemlidir çünkü yavrulara aktarılırlar Üstelik gametlerden köken alan bu mutasyonlar yavru bireyin tüm hücrelerinde görülecektir ve etkisi daha belirgin olacaktır 19

20 1.3 Moleküler değişiklik tipine göre Nokta mutasyon Yanlış anlamlı (missense) mutasyon Anlamsız (nonsense) mutasyon Sessiz (silent) mutasyon Silinme veya eklenme 20

21 Mutasyon yok Nokta mutasyonlar Sessiz Anlamsız Yanlış anlamlı Koruyan Korumayan DNA düzeyi mrna düzeyi Protein düzeyi Bazik Polar

22 1.3 Moleküler değişiklik tipine göre Bir DNA molekülünde bir baz çiftinin diğer bir baz çiftine dönüşümü nokta mutasyonu olarak adlandırılır. 1) yanlış anlamlı mutasyon: Bir genin protein kodlayan kısmındaki bir kodondaki bir nükleotidde nokta mutasyonu yeni bir aminoasit oluşumuna yol açabilir ÖR: Akondroplazi (cücelik): %80 FGFR2 geni 380 Glisin Arjinin dönüşümü 2) anlamsız (nonsense) mutasyon: kodon, bir durdurucu kodona dönüşür ve protein sentezinin sonlanmasını sağlar ÖR: Marfan sendromu: Fibrillin geni tirozin Dur kodonu dönüşümü 3) Sessiz mutasyon: Nokta mutasyonu bir kodonu değiştirir fakat proteinin o pozisyonda bir aminoasit değişikliğine yol açmazsa sessiz mutasyon oluşur. 22

23 1.3 Moleküler değişiklik tipine göre Gen içinde herhangi bir noktaya bir ya da daha fazla nükleotitin girmesine eklenme, çıkmasına ise silinme adı verilir. Tek bir harfin kaybedilmesi veya eklenmesi sonraki tüm üç harfli kodonların değişmesine sebep olur buna çerçeve kayması mutasyonu denir. 23

24 24

25 1.4 Fenotipik etkilerine göre İşlev kaybı (loss of function) mutasyonu İşlev kazancı (gain of function) mutasyonu Morfolojik bir özelliği etkileyen mutasyonlar Besinsel veya biyokimyasal etki gösteren mutasyonlar Davranış mutasyonları Öldürücü (letal) mutasyonlar Koşullu mutasyonlar Nötral mutasyonlar 25

26 1.4.1 İşlev kaybı/kazancı mutasyonları İşlev kaybı (loss-of-function) mutasyonu gen ürününün işlevini yok eden mutasyondur. yokluk (null) ya da nakavt (knockout) olarak bilinir. İşlev kaybı mutasyonlarının baskın ya da çekinik olması olasıdır. ÖR: Orak hücre anemisi İşlev kazancı (gain-of-function) mutasyonu yeni bir işlev kazanmasına yol açar. Bu mutasyonların çoğu baskındır ÖR: Huntington hastalığı. 26

27 Sessiz mutasyon İşlev kaybı mutasyonu İşlevsiz protein kodlar İşlev kazancı mutasyonu Yeni bir işlevi olan protein kodlar

28 2. Kendiliğinden oluşan mutasyonların sebepleri 1 DNA eşlenmesi hataları DNA polimerazlar eşlenme hatalarının çoğunu yapılarında bulunan 3-5 yönünde çalışan ekzonükleazlarını kullanarak düzeltebilmelerine karşın, Yanlış girmiş nükleotitler replikasyondan sonra kalabilirler. Bu hatalar ağırlıklı olarak nokta mutasyonlarına yol açar. 28

29 Nokta mutasyonlarına ek olarak, DNA replikasyonu küçük eklenme ve silinmelere neden olabilir. Eşlenme sırasında kayma sebebiyle olur : DNA kalıbının bir zincirinin ilmik oluşturup ayrıldığı zaman veya DNA polimerazın kayıp yeniden başlangıç noktasına döndüğü zaman oluşur DNA eşlenme hataları Replikasyon kayması DNA nın herhangi bir bölgesinde olabilir. Fakat tekrarlayan dizilere sahip bölgelerinde ve mutasyona daha açık olan sıcak noktalarda daha fazla görülür. 29

30 2.2 Depürinasyon Çift sarmal DNA daki azotlu bazlardan birinin kaybolması durumudur. Genellikle pürinlerde meydana gelir (adenin veya guanin). Bu durum, DNA nın bir zincirinde apürinik (AP) bölge oluşumuna yol açar. Bu tip hasarların binlercesi memeli hücrelerinde bir günde oluşur AP bölgesi onarılmazsa DNA eşlenmesi sırasında o pozisyonda kalıp rolü oynayacak hiçbir baz bulunmayacaktır. Sonuçta DNA polimeraz, bu bölgedeki nükleotitleri rastgele yerleştirebilir. 30

31 2.3 Deaminasyon Adenin ve sitozindeki bir amino grubunun keto grubuna dönüşmesidir. Sonuçta sitozin urasile ve adenin hipozantine dönüşür. Eşlenme sırasında her iki molekülün de baz eşleşme özellikleri değişmiş olur. Deaminasyon kendiliğinden ya da nitröz asit (HNO 2 ) gibi kimyasal mutajenlerle muamele sonucu oluşabilir. 31

32 2.4 Oksidatif hasar Hücrelerde, normal oksijenli solunum sırasında reaktif oksijen türleri (serbest radikaller) oluşur. Bu radikaller (süperoksitler, hidroksil radikalleri, hidrojen peroksit vb.), DNA nın yapısal bütünlüğü için tehdit oluştururlar. Bu maddeler, yüksek enerjili radyasyon sonucunda da oluşabilir. DNA daki bazlar üzerinde 100 den fazla farklı tip kimyasal modifikasyon oluşturabilirler. 32

33 2.5 Transpozonlar Yer değiştirebilen genetik elementlerdir. Kendiliğinden oluşan mutasyonlara neden olurlar. 33

34 3. Tetiklenmiş mutasyonlar radyasyon veya kimyasallardan kaynaklanır Yaşadığımız çevrede bol miktarda mutajen bulunmaktadır. Doğal mutajenler; Mantar toksinleri Kozmik ışınlar UV ışınları vb dir. Yapay mutajenler ise; Endüstriyel kirleticiler, Tıbbi X ışınları Sigara dumanındaki kimyasallar vb dir. 34

35 3.1 Baz analogları Nükleik asit biyosentezi sırasında pürin ya da pirimidinlerin yerine geçebilen mutajenik kimyasallardır. 5 bromourasil (5-BU), urasilin bir türevidir. 5-BU timin yerine DNA ya girebilir. Diğer bir baz analoğu da adenin yerine geçen 2- aminopurin dir (2- AP). 2-AP timin ile eşleşmeye yatkındır. 35

36 3.2 Alkilleyici ajanlar I. Dünya Savaşı nda keşfedilen kükürt içeren hardal gazı alkilleyici bir ajandır. Nükleotitlerdeki amino veya keto gruplarına CH 3 veya CH 3 CH 2 gibi bir alkil grubu ekler. Bu yolla oluşan 6-etil guanin, adeninin baz analoğu gibi davranır ve timinle eşleşir. 36

37 3.3 UV ışınları Dünyadaki tüm enerji, çeşitli dalga boylarında bir seri elektromanyetik bileşenden oluşur. Kısa dalga boylu ışınlar yüksek enerji taşıdıklarından organik moleküllere zarar verirler. 37

38 3.3 UV ışınları UV radyasyonu, yanyana duran iki timin bazı üzerinde pirimidin dimerleri oluşturur. T-T dimerlerinin yanı sıra, daha az sayıda da olsa C-C ve T-C dimerleri meydana gelebilir. Dimerler DNA yapısını bozar ve normal eşlenmeyi durdurur. 38

39 3.4 İyonize radyasyon X ışınları, gama ışınları ve kozmik ışınlar dokuların derinliklerine kadar girerler. Yolları boyunca karşılaştıkları moleküllerin iyonlaşmasına neden olurlar. X ışınları hücreye girdiğinde karşılaştığı moleküllerin atomlarından elektron atılır. Böylece kararlı moleküller ve atomlar, serbest radikallere ve reaktif iyonlara dönüşür. 39

40 3.3 İyonize radyasyon Bu reaksiyonlar DNA yı etkileyerek nokta mutasyonlar oluşturabilir. Fosfodiester bağlarını kırarak kromozom bütünlüğünü bozar. Buna bağlı olarak silinmeler, yer değiştirmeler ve kromozomal parçalanmalar oluşabilir. 40

41 4. Mutasyonların tanısı Mutasyon süreçlerini çalışabilmek için öncelikle mutasyonları tanılamak gerekmektedir. Bilim insanları genlerin işlevlerini anlamak için mutasyonları incelerler Fakat doğada mutasyonlar nadir görüldüğünden kendileri kimyasallarla mutasyon oluştururlar ve bundan sonra oluşan değişimleri normal organizmayla karşılaştırırlar 41

42 4.1 Bakteri ve mantarlarda tanı Mutasyonların tanısı haploid organizmalarda daha kolaydır. Mutant hücreleri mutant olmayanlardan ayırmak için seçilim (seleksiyon) yapılır. ÖR: Neurospora ekmek üzerinde büyüyen pembe bir küftür. Normalde diploiddir ama vejetatif evrede haploid olduğu için mutasyonlar daha kolay tanımlanabilir. Yabanıl tip, minimal kültür ortamında (glikoz, birkaç organik asit, tuzlar, amonyum nitrat, biotin) üreyebilir. Besinsel mutantlar ise bu ortamda üreyemezler. 42

43 4.1 Bakteri ve mantarlarda tanı Bu mutantlar ancak; aminoasitler, vitaminler ve nükleik asit türevlerince desteklenmiş tam besi ortamında üreyebilirler. Mutant tip, her biri tek bir bileşik ilave edilmiş minimal ortamlarda üremeye bırakılırsa, eksik olan bileşik tespit edilir. Bu yolla mutasyonlar tanımlanabilir. 43

44 4.2 İnsanlarda tanı İnsanlar uygun deneysel organizmalar değillerdir. İnsanlarda mutasyona dayalı bir bozukluğun tespiti için öncelikle soyağacı (pedigri) analizi yapılır. Mutasyonun kalıtımla geçtiği belirlenebiliyorsa; Mutant allelin baskın veya çekinik olup olmadığı veya X e bağlı ya da otozomal olup olmadığı belirlenebilir. 44

45 4.2 Diğer teknikler Enzim aktivitesi analizi Jelde protein hareketliliği Protein ve DNA nın doğrudan analizi Genomik 45

46 5. DNA onarım sistemleri Hata okuma (proofreading) ve yanlış eşleşme (mismatch) onarımı, Replikasyon sonrası (post-replication) onarım ve SOS onarım sistemleri, Fotoreaktivasyon onarımı (bakterilerde UV hasarının geri dönüşümü), Baz ve nükleotit kesip çıkarma onarımı (eksizyon), Ökaryotlarda çift zincir kırık onarımı 46

47 5.1 Hata okuma ve yanlış eşleşme onarımı Bakteri DNA polimeraz yaklaşık olarak her yerleştirmede bir hata yapar Enzim her basamakta hata okuması yaparak hataların % 99 unu yakalar. Hatalı bazları tespit eder, kesip çıkararak doğrusu ile yer değiştirir. Hata okuma sırasında kalan hataları gidermek için yanlış eşleşme (mismatch) onarımı devreye girer. Bu sistemde de yanlış eşleşmeler tanınır, nükleotitler kesilip çıkarılarak yenileriyle yer değiştirilir. 47

48 5.1.2 Yanlış eşleşme onarım sisteminde problem! Onarım sistemi, hangi zincirin doğru hangisinin yanlış olduğunu nasıl tespit edecektir? Zincir seçimi işlevinin, zincir üzerindeki DNA metilasyonuna dayandığı tahmin edilmektedir. Yeni sentezlenmiş zincir geçici bir süre metillenmiş olarak kalır. Onarım enzimi bu zincire bağlanarak yanlış eşlemiş bazları değiştirir. Bakterilerde bu işlem olağanüstü etkilidir, hata sıklığı bin misli azaltılır (hataların % u) 48

49 5.2 SOS onarım sistemi E. coli de bulunan farklı bir hasar onarım sistemidir. Bu tip onarım, DNA hasarına karşı son çare olduğundan SOS onarımı olarak bilinmektedir. Yanlış eşleşmelerin ve boşlukların bulunduğu kısımlara rastgele ve olasılıkla yanlış nükleotitler yerleştirilir. Bu nedenle SOS onarımı mutajeniktir. Bununla beraber, hücreye, aksi halde onu öldürecek olan DNA hasarıyla yaşama şansı verir. 49

50 5.3 Baz ve nükleotit kesip çıkarma onarımı Tüm prokaryot ve ökaryotlarda bulunan onarım sistemleridir. Bozuk bölge veya hata tanınır ve enzimatik olarak bir nükleaz tarafından kesilip çıkarılır. Bu işlem sırasında hatanın bulunduğu bölgedeki komşu birkaç nükleotit de birlikte kesilip çıkarılır. Kesilen zincirde oluşan boşluk, sağlam zincir kalıp olarak kullanılarak doldurulur. Bu işlem genellikle DNA polimeraz I tarafından gerçekleştirilir. DNA ligaz ise en son 3 -OH ucunda kalan çentiği yapıştırır ve boşluğu kapatır. 50

51 51

52 5.4 Xeroderma pigmentosum Bireylerde ağır deri anomalilerine yol açan nadir çekinik bir bozukluktur. Bu bireylerde nükleotit kesip çıkarma mekanizması çalışmamaktadır. Güneş ışığında bulunan UV radyasyonuna maruz kaldıklarında başlangıçta çillenme ve deri yaralanmaları görülür. Daha sonra deri kanserine kadar giden değişik reaksiyonlar ortaya çıkar. Hasta ve normal bireylerden elde edilen fibroblast kültürlerinde UV ile uyarılmış lezyonları onarma yeteneği araştırılmıştır. Hasta bireylerde birden fazla mutant genin olduğu tespit edilmiştir. 52

53 53

54 5.5 Ökaryotlarda çift zincir kırık onarımı Buraya kadar olan kısımda DNA nın sadece bir zincirindeki hasarla ilgilenen onarım yollarını tartıştık. Ancak iyonize radyasyona maruz kalma sonucunda DNA nın her iki zincirinde de kırıklar meydana gelebilir. Bu durumda DNA çift zincir kırık onarımı (DÇK) aktive edilir. Bu süreç aynı zamanda homolog rekombinasyon onarımı olarak da adlandırılır. 54

55 5.5 Ökaryotlarda çift zincir kırık onarımı Hasarlı DNA, hasarsız homoloğu ile rekombinasyon yapar ve yer değiştir. Bu işlem için çift zincir kırığını tanıyan bir enzime ihtiyaç vardır. Çıkarılan hasarlı çift zincir bölgesi, hasar görmemiş kardeş kromatit ile etkileşir. Bu süreç sonucunda DNA polimeraz, hasarsız DNA dizilerini kullanarak hasarlı DNA nın her iki zincirini de yeniden düzenler. Süreç genellikle replikasyondan sonraki S/G 2 fazı sonlarında gerçekleşir. 55

56 56