HÜCRELERİ MİKROSKOPİK İNCELEME YÖNTEMLERİ

Transkript

1 HÜCRELERİ MİKROSKOPİK İNCELEME YÖNTEMLERİ

2 Hücre ve dokuların canlı halde uzun süre veya saydam olarak incelenmesi sınırlı olduğundan; çoğunlukla incelenecek doku parçası organizmadan çıkarılıp kimyasal maddelerle tespit edilir ve hazırlanan preparatlar halinde mikroskopda araştırılır.

3 I.Rutin preparat hazırlanması (=Mikroteknik) II.Özel tekniklerin uygulanması III.Mikroskopik incelemeler

4 Organizmadan alınan materyalin mikroskop altında incelenebilecek hale gelinceye kadar geçirdiği tüm işlemlere mikroteknik denir.

5 Mikroteknik aşamaları: 1) Parçanın alınması 2) Fiksasyon (Tespit) 3) Gömme (İnklüzyon) 4) Kesit alma 5) Boyama 6) Preparatın kapatılması

6 1-PARÇANIN ALINMASI Biyopsi; organizma canlı iken parça alınması Otopsi; ölmüş bir organizmadan parça alınması Işık mikroskopi çalışmaları için doku büyüklüğü ~ 1cm 3 Elektron mikroskopi için ~ 1mm 3 olmalıdır.

7 2-FİKSASYON (TESPİT) Tespit hücreyi öldürür yani hücrelerin esas yapısını oluşturan proteinleri hızla bulundukları yerde çöktürür. Tespitin amacı; hücreyi otoliz ve bakteri sindiriminden korumak,hücre içeriklerinin kaybını önlemek,hücre membranını geçirgen hale sokmaktır. Böylece incelenecek doku canlı hale en yakın şekilde korunur

8 Kimyasal maddelerin karışımları tespit amacıyla kullanılır.bu karışımlara fiksatif (=tespit eriyiği) denir. Fiksatif istenilen amaca uygun olarak seçilir. Elektron mikroskopu yönteminde ikili fiksatif kullanılır. Glutaraldehit proteinleri daha sonra kullanılan osmik asid lipidleri tesbit eder.

9 A) Fiziksel * Mikrodalga * Alev * Havada Kurutma * Dondurma Fiksasyon B) Kimyasal maddeler veya karışımları * Bouin fiksatifi: Pikrik asit + asetik asit + %40 formol

10 3-İNKLÜZYON (=GÖMME) Tespit edilmiş dokuların mikroskoplarda incelenebilmesi için ince yapraklar halinde kesitlerin alınması gerekir. Bunun için dokuların gömme ortamı denen parafin veya selloidin gibi yarı sert ve kolayca kesilebilen maddelerin içine konması gerekir.

11 4- KESİT ALMA Silindirli Mikrotom 3-5 μm kalınlıkta kesit alınır

12 Kriyostat ( 20 veya 40 ºC) Çabuk sonuç alınması gereken biopsi materyalinde, dokulardaki lipidlerin incelenmesinde, enzimlerin histokimyasal araştırılmasında veya kıkırdak gibi az sert ve parafin inklüzyonu yapılması zor olan parçaların kesilmesi için kullanılır.

13 5-BOYAMA Boyalar 1)Doğal Boyalar: Hematoksilen, Orsein, Safran, Karmin 2)Sentetik Boyalar: Asit Boyalar (Eosin) Bazik Boyalar (Metilen Mavisi) Nötr Boyalar (Giemsa) Yağ Boyaları (Sudan III)

14 Karaciğer Boya: Hematoksilen+Eosin (H+E)

15 Karaciğer, Periyodik Asit Schiff (PAS) ile glikojen parlak menekşe. PAS reaksiyonu glikojen, glikozaminoglikanlar ve glikoproteinlerin gösterilmesinde kullanılır

16 6- PREPARATIN KAPATILMASI Dehidratasyon Toluol Kapatma ortamı Lamel ile kapatma

17 II-ÖZEL TEKNİKLERİN UYGULANMASI 1- Histokimyasal metodlar 2- İmmuno(sito)histokimyasal metodlar 3- İn situ hibridizasyon

18 1- Histokimyasal metodlar A- Kimyasal Metodlar: İnorganik ve organik maddeler Nükleik asidlerden DNA nın gösterilmesi. Feulgen reaksiyonu:doku kesiti + Hidroklorik asid Schiff ayıracı (=Bazik fuksin ve sodyum metabisülfit ) Serbest aldehit grupları (Parlak menekşe renk) DNA Feulgen (+), RNA Feulgen (-)

19 METAFAZ Kromozomlar Feulgen (+)

20 B- Fiziksel Metodlar: a-otoradyografi; C 14,I 131, P 32,S 35,H 3 gibi radyoaktif maddeler kullanılır. Dokulardaki radyoaktif maddelerin birikimi fotoğrafik emülsiyonlarda gösterilir. Örneğin; DNA yapısındaki timidin, trityumla işaretlenerek hücrede DNA metabolizmasının yeri ve zamanı araştırılır.

21 b-uv Spektrofotometri; Her maddenin özel bir absorbsiyon spektrumu vardır. Bu metod da o çözeltinin emdiği belli bir dalga boyundaki ışık miktarı ölçülür. Nükleik asitler (DNA veya RNA, 260nm) Proteinler (280nm) Lipidler

22 2-İmmunohistokimyasal (IHK) Metodlar Antijen antikor eşleşmesine dayanır. İşaretlenmiş antikorlar dokuda spesifik antijenlerine bağlanır. Bu antijen antikor kompleksi yerleşimleri ışık veya elektron mikroskopu ile incelenebilir.

23 Antikor İşaretlenmesi 1-Fluorokrom: (Fluoresan izotiyosiyanat, Rodamin) 2-Enzim örneğin; Peroksidaz 3-Metal (Fe, Ag, Au)

24 İmmunohistokimya ile antijen yerleşiminin gösterilmesi: A-Direkt metod: Belli bir antijeni taşıyan doku kesiti işaretli antikor ile inkübe edilir ve oluşan işaretli kompleks mikroskopda antijenin yeri olarak gözlenir.

25 B-İndirekt metod: Hazırlanan işaretsiz birinci (primer) antikorlar normal dokuda bulunan antijenle reaksiyona sokulur. Sonra bu kesitler işaretli ikinci (sekonder)antitavşan antikor ile inkübe edilir. Antijenin yeri işaretlenmeye uygun mikroskopda görülür.

26 İmmunohistokimya Mide, gastrin hücreleri, kırmızı

27 Mide, somatostatin hücreleri kırmızı

28 İHK Kullanım Alanları Hücresel proteinlerin yerleşimleri ve aktivite gösterdikleri alanları saptamada Çeşitli endokrin hastalıkların veya kanser tiplerinin ayrımlanmasında Gelişim biyolojisi çalışmalarında

29 3-İn Situ Hibridizasyon (İSH) Nükleik asitlerin eşleşmesine dayanır: DNA-DNA, RNA-RNA veya DNA-RNA PROB: Radyoaktif veya kimyasal bir madde ile işaretlenmiş belli bir nükleotid dizisinden oluşan tek iplikli DNA veya RNA parçası

30 Radyoaktif veya nonradyoaktif işaretli prob ve hibridizasyon solüsyonu ile hedef RNA veya DNA ile eşleşme sağlanır. Hibridizasyondan sonra yıkama işlemleri ve işaretin ortaya çıkarılması (otoradyografi veya immunohistokimya) işlemlerinden sonra kesitler mikroskopta incelenir.

31 İSH Yöntemi Denatürasyon Hibridizasyon İşaret tayini Bu yöntemin amacı genomdaki yapısal değişiklikleri veya gen ekspresyonundaki mrna seviyelerini saptamaktır.

32

33 peptidi kırmızı görülmekte. ish metod immunohistokimya metodu ile ardışık uygulanarak protein seviyelerindeki değişikliklerde gösterilir. Mide, çift boyama yöntemi, ile gastrin mrna sı mor, gastrin

34 İSH KULLANIM ALANLARI 1) Proteinlerin mrna lokalizasyonu tespitinde 2) Çeşitli kanserlerin teşhisinde onkogenlerin tespitinde 3) Dokulardaki bakteri ve virus enfeksiyonlarının tespitinde 4) Ko-lokalize hormonların saptanmasında 5) Prenatal teşhisde, kromozomal anomalilerin tespitinde 6) Taksonomik çalışmalarda ve moleküler evolusyon çalışmalarında.

35 Nükleik asit hibridizasyon temeline dayanan mikroarray (=mikrodizin) analizi ile aynı anda bir lam veya filtre membran üzerinde yer alan binlerce doku veya hücre örneklerinde DNA veya RNAların karşılaştırmalı sonuçları alınmaktadır. Genlerin ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi için kullanılan mikroarray yöntemi gelecekde tıpta önemli bir teşhis metodu olarak kullanılacaktır.

36 III- MİKROSKOPİK İNCELEMELER

37 1mm=10 3 μm=10 6 =nm=10 7 A İnsan gözü 100μm dan daha dar aralıklı iki noktayı birbirinden ayırt edemez Işık mikroskopu ayırma gücü 0.2 μm Elektron mikroskop ayırma gücü 0.2 nm

38 1-Işık mikroskop: Mikro:küçük, scopein: görmek anlamındadır (Eski Yunanca). Mikroskop, mercek sistemlerinden oluşan optik bir alettir. Işık mikroskopunda büyütme, oküler X objektif büyütmesine eşittir. 2-Faz kontrast mikroskop : Canlı tek tek hücreler veya ince hücre tabakaları incelenir. 3-Diferensiyal interferens kontrast mikroskop: Nomarski lensleri ile canlı hücre ve dokuların üç boyutlu görünmesi sağlanır. 4-Polarizasyon mikroskop : Işık mikroskopuna polarize ışık verebilen bir yapının eklenmesi ile gerçekleşir. Bu mikroskop ile obje koyu zeminde parlak olarak görünür.

39 5-Karanlık alan mikroskop : Canlı ve saydam hücreler özel kondansör nedeniyle sadece objeden yansıyarak gelen ışınları objektife iletirler. Bakterilerin incelenmesi ve sayımında kullanılır. 6-Fluoresan mikroskop : Fluoresan bir madde ile işaretli veya doğal olarak fluoresan veren obje ultraviole (mor ötesi ışık) ile incelenir. 7-Konfokal mikroskop : Işık kaynağı olarak laser kullanılarak bilgisayar yardımıyla üç boyutlu görüntü elde edilir.

40 8-Elektron mikroskop a) Transmisyon elektron mikroskopda, temel elektronların elektromanyetik alanda sapmasıdır. Bu mikroskop ile ince kesitler incelenir. b) Tarayıcı (scanning) elektron mikroskopda, akım incelenecek parçanın yüzeyine çarptırılır. Amaç yüzeyleri incelemektir.

41 KAYNAKLAR 1-Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. : Molecular Biology of The Cell. Fifth Edition Garland Science Taylor & Francis Group New York Weaver R.F. Molecular Biology. Third EditionMcGraw-Hill Higher Education, New York Gartner L.P. and Hiatt J.L.: Color Textbook of Histology. Second Edition W.B. Saunders Company Philadelphia Kierszenbaum A. L. and Tres L.L.: Histology and Cell Biology: An Introduction to Pathology. Third Edition. Mosby Elsevier USA Cooper G.M. and Hausman R.E. : The Cell: A molecular Approach 4th ed. ASM Press Sinauer Associates Inc. USA Epstein R.J. Human Molecular Biology. Cambridge University Press, UK, Pollard T.D. and Earnshaw W.C. : Cell Biology. Elsevier Science USA Lodish H, Berk A, Kaiser C A, Krieger M, Scott M P, Bretscher A, Ploegh H, Matsudaira P. : Molecular Cell Biology. Sixth Edition. W.H. Freeman and Company New York Cooper G.M., Hausmann R.E. Hücre Moleküler Yaklaşım. Üçüncü Baskı.İzmir Tıp Kitapevi Lodish H. et al. Moleküler Hücre Biyolojisi 6. Baskı Çeviri Ed.: Geçkil H, Özmen M, Yeşilada Ö.Palme Yayıncılık, Ankara Temizkan G, Arda N (Ed).: Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler. 3. baskı. Nobel Tıp Kitabevleri Tıbbi Biyoloji Ders Kitabı,Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Yayın No:275,2009.