TESTLERİN ÇALIŞMA ESASLARI

Transkript

1 TESTLERİN ÇALIŞMA ESASLARI ROSE BENGAL Ülkemizde yaygın olarak saptanan zoonotik bir enfeksiyon olan Brusellozun tanısında kullanılan tarama testi için yöntem belirlemektir. Bruselloz hücre içinde yaşayan gram negatif basildir. İnsanlara en çok sığır daha az sıklıkta da olsa keçi, koyun ve süt ürünlerinden GİS aracılığıyla yünlerinden aerosol yoluyla bulaşır. Brucelloza karşı olan antikorlar hastalığın ilk haftasında ortaya çıkar ve hastalığın 3. Ayında en yüksek düzeye ulaşır. Daha sonra giderek azalır ve kaybolur. Bazı kişilerde kanda uzun süre kalabilir. 1- Buzdolabında saklanılan antijen çıkarılır ve oda ısısına gelmesi beklenir. 2- Temiz bir fayans üzerine 50 µl hasta serumu damlatılır. 3- Hasta serumunun yanına 50 µl antijen (kullanıma hazır ticari) damlatılır. 4- Bir eküvyon çubuğu yardımıyla 1,5 cm lik alana yayılır. 5- El yardımıyla veya rotatör üzerinde 4 dk. boyunca karıştırılır. 6- Aglütinasyon olup olmadığı gözlenir. 7- POZİTİF ise tüp aglütinasyon testi uygulanır. Aglütinasyon gözlenmiyorsa tarama testi sonucu NEGATİF olarak verilir. BRUCELLA TÜP AGLÜTİNASYONU Tarama testi olarak kullanılan Rose Bengal testi POZİTİF sonuç verdiğinde var olan antikorun titresini belirlemek için uygulanır. 1- Tüp taşıyıcısına 7 adet cam tüp dizilir. 2- Birinci tüpe 0.9 ml diğer tüplere 0.5 ml serum fizyolojik konulur. 3- Birinci tüpe 100 µl hasta serumu konur. 4- Birinci tüp iyice vortekslenir ve 0.5 ml diğer tüplere sırasıyla aynı işlem uygulanarak dağıtılır. 5- Son tüpe gelindiğinde 0.5 ml alınır tıbbi atık kabına atılır. 6- Hazır olan antijenden her tüpe sırasıyla 0.5 ml konur.

2 7- Tüm tüpler vortekslenir :C de saat inkübasyona bırakılır. 9- Kontrol edilip son aglütinasyonun saptandığı tüpün titresi titrasyon değeri olarak verilir. SALMONELLA TÜP AGLÜTİNASYONU Salmonella tiplendirmesi için yapılır. Salmonella çubuk şeklinde gram negatif basildir. Salmonella tifo, paratifo ve gıda zehirlenmesine yol açar. Salmonella türleri en yaygın olarak serolojilerine göre aglütinasyon testine tabi tutularak sınıflandırılır. 3 evrede çalışılır; Dilüsyon Hazırlama 1-10 ml lik 5 adet plastik tüp dizilir. 2- Birinci tüpe 9.6 ml serum fizyolojik diğer tüplere ise 5 ml serum fizyolojik konulur. 3- Birinci tüpe 400 µl hasta serumu eklenir vortekslenir. 4- Birinci tüpten 5 ml alarak 2. nci tüpe konur vortekslenir. 5- İkinci tüpten 5 ml alınıp 3.ncü tüpe konup vortekslenir. 6- Son tüpe kadar aynı işlem tekrarlanır. 7- Son tüpten de 5 ml alınıp atık kabına atılır. Çalışma Şekli 1- Bir tüp taşıyıcısına her bir antijen için ( H, AH, BH, 0, A0, B0 ) 6 adet tüp dizilir ve kodlanır. 2- Son tüplere 0.5 ml serum fizyolojik konulur (Kontrol tüpü). 3- Dilüsyon yapılmış olan tüplerin birincisini vorteksleyip ilk tüplere 500 µl dağıtılır. 4- Dilüsyon tüplerinden ikincisinden ikinci tüplere hazırlanmış dilüsyon konulur. 5- Sırasıyla tüm tüplerden 500 µl dağıtılarak tamamlanır. 6- Son olarak tüplere kodladığımız antijene uygun olarak tüplere 500 µl uygun antijenden ekleyerek vorteksleriz. İnkübasyon 1- Tüm tüpler 37 :C etüve kaldırılır.

3 2- Dört saat sonra 0 grubu antijenlere ait tüpler buzdolabına, H grubu antijenlere ait tüpler oda ısısına alınır saat inkübe edilip sonuç değerlendirilir. KÜLTÜR NUMUNELERİNİN EKİLECEĞİ BESİYERLERİ Alınan kültür vasatlarının ekimi yapılıp üreme olup olmamasını gözlemlemektir. Boğaz Kültürü- Kanlı agar Burun Kültürü- Kanlı agar, EMB **İdrar Kültürü- Kanlı agar, EMB Gaita Kültürü- Kanlı agar, EMB, Hektoen enterik agar Yara Kültürü- Kanlı agar, EMB Balgam Kültürü- Kanlı agar, EMB, Çukolata agar, SDA **Trakeal Aspirat- Kanlı agar, EMB, Çukolata agar, SDA Bos Kültürü- Kanlı agar, EMB, Çukolata agar, SDA Vagen Kültürü- Kanlı agar, EMB, Çukolata agar, SDA Üretral Akıntı Kültürü- Kanlı agar, EMB, Çukolata agar, SDA Kulak Kültürü- Kanlı agar, EMB, Çukolata agar, SDA Konjuktiva Kültürü- Kanlı agar, EMB, Çukolata agar Diğer Vücut Sıvıları (Periton, pleural sıvı, eklem ve diğerleri ) Kanlı agar, EMB, Çukolata agar, SDA Kan kültürü ( POZİTİF ise ) Kanlı agar, EMB, Çukolata agar, SDA Kan kültürü ( NEGATİF ise) Kanlı agar ** işaretiyle belirtilmiş kültürler kantitatif yolla ekilecektir. *EMB (Eozin Methylene Blue Agar) *SDA (Saborroud Dextroz Agar) Ayrıca BOĞAZ VE TARAMA KÜLTÜRLERİ (PERİNE, AXİLLA, BURUN) İDRAR dışındaki numunelerin tamamından 2 adet yayma hazırlanıp, Gram boya ve Metilen boya ile boyanır. Her sabah tüm besiyerleri ne zaman ekilmiş olursa olsun mutlaka kontrol edilip üremesi olanlar ayrılır. Üreme olmamış gece ekimleri ise her gün öğleden sonra saat 15:00 de tekrar kontrol edilir.

4 GRAM BOYAMA Mevcut bakterinin morfolojik özelliklerinin saptanması amacıyla yapılmaktadır. Örnekten hazırlanmış yaymalarda ya da kültürde üretilmiş bakterinin morfolojik özellikleri hakkında ön bilgi edinerek olası enfeksiyon etkenini saptamamıza yardımcı olur. Gram boyalı preparat hazırlarken kullanılan malzemeler; 1- Kristal viyole 2- Lügol 3- %70 lik Alkol 4- Sulu fuksin 1- Lam üzerine bir damla serum fizyolojik damlatılır. 2- İncelenecek besiyerinden bir koloni alınır. 3- Serum fizyolojikle koloniyi lam üzerinde homojen bir şekilde karıştırılır. 4- Havada veya alevden 3 kez geçirerek tespit edilir. 5- Lam üzerini kaplayacak şekilde KRİSTAL VİYOLE dökülüp 1 dk bekletilir. 6- Tüm boya akana kadar suyla yıkanır. 7- LÜGOL dökülür ve 1 dk bekletilir ve tüm boya akana kadar suyla yıkanır. 8- % 70 lik ALKOL de sn bekletilir ve suyla yıkanır. 9- Lam üzerini kaplayacak şekilde SULU FUKSİN dökülür 30 sn bekletilir suyla yıkanır. 10- Havada kurumaya bırakılıp immersiyon yağı damlatılıp incelenir. NOT: ÖRNEKLERDEN HAZIRLANMIŞ YAYMA PREPARATLARIN BOYANMASI SIRASINDA TESPİT İŞLEMİ ALKOL İLE YAPILMALI ASLA ALEVDEN GEÇİRİLEREK TESPİT EDİLMEMELİ!!! RSV-ADENOVİRÜS Küçük çocuk, bebeklerde solunum yolu infeksiyonu etkeni olarak RSV ve ADENOVİRÜS varlığını tespit etmektir. Rsv-Adenovirüs üst solunum yolu enfeksiyonu etkenidir. Test kalitatif immünokromatografik yöntem ile çalışmaktadır. Test bandı bölgesindeki membran viral

5 antijenlere karşı öncelikle fare monoklonal antikorlarla kaplanmıştır. Test işlemi sırasında test üzerinde önceden kurutulmuş olan renklendirilmiş konjugat ile numunenin tepkimeye girmesi sağlanır. Karışım daha sonra kapiller hareket ile membran üzerinde ileri doğru hareket eder. Numunede bulunan virüsün çeşidine göre farklı renkte çizgiler belirir. Bu renklere göre sonuçlar yorumlanır. 1- Test stribi ve reaktifler, teste başlamadan önce oda sıcaklığına getirilir damla A reaktifinden tüpe eklenir ve swab ile boğazdan alınmış olan sürüntü örnekleri tüpe yerleştirilir. 3- Kontrol swabı tüpün kenarına bastırılarak 10 defa döndürülür solusyonla karıştırılıp çıkarılır. 4- Test düz bir zemine yerleştirilir ve üzerine 150 µl hazırlanan karışımdan test stribine damlatılır dk sonra sonuçlar okunur değerlendirilir. 6- Kontrol çizgisi YEŞİL olarak gözlenir. Tek başına YEŞİL renk NEGATİF(-), YEŞİL-MAVİ renk oluşmuş ise POZİTİF(+) olarak kabul edilir. ENTERİK ADENOVİRUS Gaita örneklerindeki Rotavirusun veya Enterik Adenovirusun tek adımlık renkli kromatografik immüno yöntem ile kalitatif olarak tespitini yapmaktır. Özellikle çocuklarda Gastroenterite neden olan viral etkenlerden Rotavirus ve Adenovirus varlığını saptamak için kullanılır. Başlıca semptomları sulu daire ve kusmadır. 1- Gaita alındıktan en geç 20 dk içinde bakılmalıdır. 2- Test tüpünün kapağı açılarak çubuk yardımıyla numuneden bir parça alınır. Eğer numune sulu ise pipetör yardımıyla 100 µl alınıp tüpün içine konulur. 3- Örnek seyrelticisi içeren tüpün kapağı kapatılır. İyi örnek dağılımı olması için tüp çalkalanır. 4- Test stribi açılıp hazırlanan karışımdan 10 damla damlatılıp sonuç beklenip değerlendirilir. 5- Sonuçlar 10 dk sonra değerlendirilir. 6- Kontrol çizgisi YEŞİL olarak gözlenir.

6 7- Tek başına; YEŞİL renk NEGATİF(-) YEŞİL-KIRMIZI renk ROTAVİRUS POZİTİF(+) YEŞİL-KIRMIZI-MAVİ renk ROTA ADENO POZİTİF(+) HELİCOBACTER PYLORİ(H.pylori) Gastrit, ülser gibi GİS şikayetlerine neden olan H.pylori nin tespitinin kalitatif immunokromatografik yöntem ile hızlıca yapılmasını sağlamaktır. H.pylori mide mukoza tabakasında veya epitelyum katmanında bulunduğunda gastrit ve ülsere neden olan mide ph ına dayanıklı sarmal şeklinde bir bakteridir. H. pylori mide ülseri, gastrit ve kansere yol açabilir. 1- Gaita örnekleri temiz numune kaplarına alınmalıdır. 2- Örnekler toplandıktan hemen sonra test uygulanmalı ya da test edilemeyen örnekler 1-2 gün buzdolabında (2-4 :C) saklanmalıdır. 3- Test tüpünün kapağı açılır çubuk yardımıyla numuneden bir miktar alınır ( numune sıvı olmamalıdır) ve seyreltici solusyonla karıştılır. Numune ve seyrelticinin homojenize olması için çalkalanır. 4- Test stribi açılır ve hazırlanmış karışımdan 150 µl damlatılır test sonucu 5-20 dk beklenerek değerlendirilir. 5- Kontrol çizgisi KIRMIZI olarak gözlenmelidir. 6- Tek başına KIRMIZI renk NEGATİF(-) çift KIRMIZI renk POZİTİF(+) olarak değerlendirilir. GAİTADA GİZLİ KAN (GGK) Gaita örneklerinde insan hemoglobinin kalitatif tespitini yapan kromatografik bir testtir. Kolorektal kanser batı ülkelerinde hastalıklara ve ölümlere yol sebeplerin başında gelmektedir. İmmünokimyasal testler barsakta meydana gelen minimal kanamanın tespitinde spesifik bir teknik olduklarından bozulmamış veya kısmen bozulmuş insan hemoglobinini tespit edebilirler.

7 1- Tüpün kapağı açılır ve temiz kaplarda toplanmış gaita örneklerinden çubuk yardımıyla alınır. 2- Eğer örnek sıvı ise 100 µl sıvı değil ise bir parça alınır tüpün ağzı kapatılır. Örnek dağılımının iyi olabilmesi için çalkalanır. 3- Test stribi açılarak seyrelticiyle karışmış olan numuneden 150 µl damlatılır. Test sonucu beklenir ve değerlendirilir. 4- Kontrol çizgisi YEŞİL olarak gözlenmelidir. 5- Tek başına YEŞİL renk NEGATİF(-) YEŞİL-KIRMIZI renk POZİTİF(+) olarak değerlendirilir. TREPONEMA PALLADİUM(TPHA) Sifiliz (frengi) hastalığı etkeni olan T.palladium un tespitini yapmaktır. Treponema palladium ( sifiliz ) denilen cinsel yolla bulaşan bir hastalıktır. Hastalık erken teşhis ve tedavi edilmediği sürece vücuda yayılarak birçok organda hasara neden olur. Test hasta serumu kullanılarak immunokromatografik yöntem ile hastalığın hızla tanısının konmasına olanak sağlar. 1- Hasta serumundan 10 µl test stribine damlatılır. 2- Serum üzerine ise 4 damla antijen konularak sonuç beklenir. 3- Kontrol çizgisi KIRMIZI olarak gözlenmelidir. 4- Tek başına; KIRMIZI renk NEGATİF(-) Çift KIRMIZI renk POZİTİF(+) olarak değerlendirlir. GAİTA AMİP GİARDİA ARANMASI VE BOYASIZ DİREKT MİKROSKOBİK İNCELEME Gastroenterite neden olan parazitik infeksiyon etkenlerinden Entomoeba spp. ve Giardia spp nin tespitini sağlamaktır. Bu amaç için boyasız preparat hazırlanır.

8 Şekilsiz mukuslu veya kanlı gaita örneklerinde sık olarak rastlanmaktadır. Fresh gaita örneklerinde lökosit, eritrositlerin yanı sıra amip ve giardianın kistik ve trofozoit durumları aranır. 1- Gaita kaplarıyla toplanan numunelerin makroskobik özelliklerine bakılır(şekil, kan ve mukus varlığı) 2- Temiz bir lam üzerine bir damla serum fizyolojik damlatılır. 3- Üzerine eküvyon çubuk ile alınmış gaita örneği konularak homojenize edilir objektifte kondansatör aşağıda olarak en az dk olmak üzere incelenir. PERİFERİK YAYMA Kanın şekilli elemanlarının (eritrosit, lökosit, trombosit) morfolojik ve sayı açısından değerlendirilmesini sağlamaktır. 1- Edtalı hemogram tüpünde gelen kandan bir damla lam kenarına damlatılır. 2- İkinci bir lam veya lamel ile damlatlan kan alttaki lam ile 45 : lik açı yapacak şekilde lam sonuna kadar yayılır. 3- Havada kurumaya bırakılır. 4- Kurumuş olan preparat % 70 lik alkolde 5 dk tespit edilir. 5- Su ile yıkanır. 6- Lam üzerini kaplayacak şekilde giemsa boyası konulur ve 20 dk boyanır. Boya eksildiğinde tamamlanır. 7- Suyla yıkanır ve kurumaya bırakılır. Kurumuş preparat mikroskop altında incelenir.