Biyoloji Bilimleri Araştırma Dergisi 4 (1): , 2011 ISSN: , E-ISSN ,

Transkript

1 Biyoloji Bilimleri Araştırma Dergisi 4 (1): , 2011 ISSN: , E-ISSN , Salmonella enteritidis ile İnfekte Edilen Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus mykiss W.) nın Sindirim Kanalındaki Endokrin Hücrelerinin İmmunohistokimya Teknikleri Kullanılarak İncelenmesi Sibel KÖPRÜCÜ 1* Berrin GENCER TARAKÇI 2 Mustafa SARIEYYÜPOĞLU 1 1 Fırat Üniversitesi, Su Ürünleri Fakültesi, Yetiştiricilik Anabilim Dalı, 23119, Elazığ 2 Fırat Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Elazığ * Sorumlu Yazar Geliş Tarihi : e-posta: skoprucu@firat.edu.tr Kabul Tarihi : Özet Bu çalışmada, Salmonella enteritidis ile intraperitoneal olarak infekte edilen gökkuşağı alabalığında, sindirim kanalı endokrin hücrelerinin lokalizasyonu immunohistokimya boyama teknikleri kullanılarak araştırıldı. Endokrin hücreleri (gastrin, substans P, glukagon, insülin ve calbindin) ABC ve PAP yöntemleri kullanılarak incelendi. Kontrol ve deneme gruplarındaki balıkların endokrin hücreleri incelendiğinde; insülin ve calbindin IR sindirim kanalında rastlanılmadı. Glukagon IR ince bağırsakta, gastrin IR ise midenin pilorik bölgesinde belirlendi. Substans P IR; kontrol grubu balıklarda mide ve ince bağırsakta bulunurken, deney grubu balıklarda saptanamadı. Sonuç olarak, kontrol grubu ve S. enteritidis ile infekte edilen deney grubuna ait balıklar arasında, endokrin hücrelerinin lokalizasyonu açısından farklı bir bulgu gözlemlenmedi. Anahtar Sözcükler: Gökkuşağı alabalığı, Salmonella enteritidis, immunohistokimya, sindirim kanalı, endokrin hücreleri. An Investigation on Endocrin Cells in the Digetive Tract of Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss W.) Infected with Salmonella enteritidis carried out by Immunohistochemical Techniques Abstract In this study, the localization of endocrine cells in digestive tract of rainbow trout infected intraperitoneally with Salmonella enteritidis were investigated by immunohistochemistry staining techniques. Endocrine cells (gastrin, substans P, glucagon, insülin and calbindin) were studied by ABC and PAP methods. The endocrine cells of the fish control and experimental groups examined; insülin and calbindin IR were not found in the digestive tract. Glucagon IR and gastrin IR were determined in the small intestine and in the pyloric stomach respectively. Substans P IR was determined in the both stomach and small intestine of control fish, but not found these of the experimental fish. In conclusion, a different finding was not observed in the localization of endocrine cells between control fish and experimental fish infected with S. enteritidis. Key words: Rainbow trout, Salmonella enteritidis, immunohistochemistry, digetive tract, endocrin cells. GİRİŞ Dünyamız sularında yaşayan teleost balıkların çoğu hala insan gıdası olarak doğadan avlanmak suretiyle temin edilmektedir. Ancak, çeşitli alabalık türleri, sazan, alabalık gibi tatlısu balıkları ile çipura, levrek, kalkan, pisi ve mersin balığı gibi deniz balıklarının tam kontrollü şartlarda üretimi son yüzyıl içinde gerçekleşmiştir. Gittikçe artan talebe paralel olarak yurdumuzun çeşitli bölgelerinde kurulan tatlısu ve deniz balığı yetiştiriciliği işletmelerinde üretilen kültür balıklarında hastalıklar görülmeye başlamıştır. Bu işletmelerde çoğunlukla epizootik oluşturan bakteriyel, fungal, viral ve patojen protozoonların neden olduğu mikrobiyal enfeksiyonların yanı sıra helmint ve krustasean parazitler ile ekolojik faktörlerden ve yetersiz beslenmeden kaynaklanan hastalıklar da dikkati çekmektedir. İntensif kültür tekniklerinin gelişmesi sonucu balık hastalıklarının ortaya çıkması ekonomik zararlara yol açmaktadır. Balıklarda hastalık oluşturan bakteriyel etkenlerden biri de salmonella türleridir. Salmonella bakterileri yaklaşık olarak µm boyunda, 0,7-1,5 µm eninde, çomak şeklinde, sporsuz, kapsülsüz bakterilerdir. Bakteriyolojik boyamalarla iyi boyanırlar ve gram (-) dirler [1-7]. İnsan ve birçok hayvan türünde gastroenteritidis e neden olan salmonella türlerinin bazılarının (S. typhimurium ve S. enteritidis) izolasyon ve identifikasyonu balıklarda da yapılmış ve sazanlarda deneysel olarak uygulanmıştır [8-16], fakat bu

2 142 S. Köprücü ve ark. / Bibad, 4 (1): , 2011 etkenin balıkların sindirim kanalı üzerine etkisine ait araştırmalara rastlanılamamıştır. Bu çalışmada, gökkuşağı alabalığının sindirim kanalında gastrin, substans P, glukagon, insülin, calbindin immunoreaktivitesi incelenerek, Salmonella enteritidis in bu endokrin hücreleri üzerine etkisi araştırıldı. MATERYAL VE METOT Bu çalışma için; 15-18cm uzunluğunda, g ağırlığında ve 1 yaşında olan toplam 60 adet gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) kullanıldı. Gökkuşağı alabalığında enfeksiyon oluşturmada kullanılan referans Salmonella enteritidis suşu Elazığ hayvan hastalıkları hastanesinden temin edildi. Getirtilen suş, Triptic Soy Agar, Gliserinli Nütrient Broth ve Kanlı Agar a ekimleri yapılarak 22 C deki etüvde çoğalmaları sağlandı. Elde edilen kültürler buzdolabında +4 C de saklandı. Suşun özelliklerini kontrol etmek için bazı biyokimyasal ve fizyolojik testler (gram boyama, 22 ve 37 C deki üremeleri, hareket, Mac Conkey agarda üreme, O/F testi, glukoz, xyloz, laktoz, sukroz, mannitol, inositol, sorbitol, indol, voges-prescaure, metil red, H 2 S, ureaz, hemoliz, sitokrom oksidaz, sitrat, katalaz) uygulandı [17]. Buyondaki bakteri sayımı Mc Farland Standart tüpleri yardımıyla yapıldı. Deney hayvanları için 15x10 8 / ml hacminde, 18 saatlik taze kültürler hazırlandı. Çalışmada, 3x2x1 m boyutlarında 2 adet beton havuz kullanıldı. Havuz suyuna bağlanan su motorlarına %99 oranında bakteriyolojik arıtımı sağlayan UV lambalı su arıtma cihazı bağlandı. Arıtma cihazından akan sudan periyodik olarak alınan su örnekleri bakteriyolojik yönden incelendi. Deney bittikten sonra havuz suyu ile havuz formalin ve KMNO 4 ile dezenfekte edildi. Deney balıklarına suş verilmeden önce fenoxietanol (5ml/L) ile genel anestezi uygulandı [18]. Salmonella enteritidis in taze hazırlanmış 18 saatlik kültüründen steril plastik enjektörler kullanılarak 5 cc balıklara intraperitoneal olarak enjekte edildi. Ayrı bir beton havuza ise kontrol grubuna ait balıklar bırakıldı. Salmonella enteritis in alabalıklara intraperitoneal yolla inokülasyonundan sonra balıklar gözlem altında tutuldular. Periyodik aralıklarla balıklara genel anestezi altında usulüne uygun biçimde [19] otopsi yapılarak kardiak mide, pilorik mide, ince ve kalın bağırsaktan doku örnekleri alındı. Alınan doku numuneleri %10 luk nötral tamponlu formalin solusyonu (ph 7,2) içinde saat süreyle tesbit edildi. Gerekli işlemler yapıldıktan sonra parafine emdirilen örneklerden parafin bloklar hazırlandı ve Leica marka kızaklı mikrotomda 5-6 µ kalınlığında kesitler alındı [20]. İmmunohistokimyasal boyama avidin-biotin horseradish peroksidaz kompleks (ABC) tekniği ve peroksidaz anti peroksidaz (PAP) tekniği kullanılarak gerçekleştirildi. Antijeniteyi artırmak ve parafini gidermek için kesitler xylol ve alkol serilerinden geçirildi. Endojenöz peroksidaz aktivitesini azaltmak için ise kesitler metanolle hazırlanmış %0,08 hidrojen peroksidaz (H 2 O 2 ) solüsyonunda bekletildi [21]. Avidin-biotin horseradish peroksidaz kompleks tekniğinde kesitler mouse monoklonal antiserumu (Mouse anti-calbindin IgG) (Sigma) ile saat 4 C de inkübe edildi. Antiserum, 1:200, 1:500, 1:1000 oranlarında phosphate buffer saline (PBS) ile sulandırıldı. Sonra biotinleştirilmiş horse anti-mouse IgG (Dako) ile ve ardından biotinleştirilmiş streptavidin horseradish peroksidaz (Dako) kompleksi ile oda sıcaklığında 1 er saat inkübe edildi. Her iki antiserum PBS ile 1:50 oranında sulandırıldı. Kesitler, her inkübasyon öncesi 30 dk süre ile PBS solüsyonu ile yıkandı. Daha sonra glukoz oksidaz-dab-nikel amonyum sülfat (GDN) substratına [22] daldırılıp, su ile yıkanıp, eosin ile boyanarak ışık mikroskobunda incelendi ve fotoğraflandı. Peroksidaz anti peroksidaz (PAP) tekniğinde kesitler rabbit poliklonal antiserum (Rabbit-anti gastrin-igg, Rabbit-anti Substans P-IgG, Rabbit-anti Glukagon-IgG ve Rabbit-anti İnsülin-IgG) (Sigma) ile saat 4 C de inkübe edildi. Rabbit-anti Gastrin-IgG 1:10000, Rabbitanti Substans P-IgG 1:20000, Rabbit-anti Glukagon-IgG 1:1500, Rabbit-anti İnsülin-IgG 1:1000, oranlarında PBS ile sulandırıldı. Kesitler sonra goat anti-rabbit IgG ile ardından horseradish peroksidaz ile oda sıcaklığında 1 er saat süreyle inkübe edildi. Her iki antiserum PBS ile 1:50 oranında sulandırıldı. Kesitler, her inkübasyon öncesi 30 dk süre ile PBS solüsyonu ile yıkandı. Daha sonra glukoz oksidaz-dab-nikel amonyum sülfat (GDN) substratına [22] daldırılıp, su ile yıkanıp, eosin ile boyanarak ışık mikroskobunda incelendi ve fotoğraflandı. BULGULAR Balıklarda deneysel enfeksiyonu oluşturmada kullanılan Salmonella enteritidis suşunun Triptic Soy Agar üzerinde yapılan ekiminde, 24 saat sonra 1-2mm çapında, toplu iğne başı büyüklüğünde, yuvarlak, kenarları düzgün, konveks, kirli beyaz renkte koloniler, gliserinli nutrient buyon da ise bulanık renkli ve üzerinde ince bir perde oluştuğu tespit edildi. Etkenin morfolojik ve biyokimyasal test sonuçları Tablo 1 de verilmiştir. Balıklara intraperitoneal yolla etken verildikten sonra, balıklar birkaç dakika içinde anestezinin etkisinden kurtulup normal yüzmeye başladılar. Deneme süresince balıklarda herhangi bir farklı davranış ve ölüm olayı görülmedi. Sadece denemenin son günlerine doğru biraz durgunluk başladı Kontrol grubu gökkuşağı alabalığının gastrointestinal kanalında immunohistokimyasal boyamalar kullanılarak yapılan araştırmada; Glukagon immunoreaktif (IR) hücrelere ince bağırsakta rastlanıldı (Şekil 1). Bu hücreler, ince bağırsağın epitel kıvrımlarında lamina epiteliyalisin lateral yüzeylerinin bazale yakın bölgelerinde, prizmatik epitelyum hücrelerinin aralarında tespit edildi. Mide de glukagon IR si gözlenmedi.

3 S. Köprücü ve ark. / Bibad, 4 (1): , Tablo 1. Salmonella enteritidis in morfolojik ve biyokimyasal özellikleri Gram boyama (-) Sorbitol (asit) (+) Şekil Çomak İnositol (-) Hareket (+) Sitrat (+) 22 ve 37 C deki üreme (+) Katalaz (+) Mac Conkey agarda üreme (+) İndol (+) O/F testi F V-P/MR (-)/(+) Glukoz (+) H 2 S (+) Xyloz (asit) (+) Ureaz (-) Laktoz (asit) (+) Hemoliz (+) Sukroz (asit) (+) Sitokrom oksidaz (+) Mannitol (asit) (+) Gastrin içeren endokrin hücrelerine sadece midenin pilorik bölgesinde saptandı (Şekil 2). Bu hücreler, genellikle epitelyum kıvrımların lamina epiteliyalisinin lateral ve dip kısımlarına doğru ve prizmatik hücrelerin lateralinde ve bazen de lamina propriyadaki bezlerde gözlendi. Bağırsak ve kardiak midede gastrin IR hücrelere rastlanılmadı. İnce bağırsak ve midenin pilorik bölümünde substans P IR si görüldü (Şekil 3). Bu hücreler lamina epiteleliyalisin bazal kısımlarına doğru olan bölümünde epiteli oluşturan hücrelerin arasında tespit edildi. Bazen epiteliyalisin altında bulunan bezlerde de bu immunoreaktivite belirlendi. İnsülin ve Calbindin IR si gösteren endokrin hücrelerine mide ve bağırsakta rastlanılmadı. Deneysel olarak enfeksiyon oluşturulan alabalık gruplarının mide ve bağırsakta gözlemlenen glukagon IR ve gastrin IR si kontrol grubundaki bulgularla aynı bulundu (Şekil 4 ve 5). Fakat kontrol grubundaki pilorik mide ve ince bağırsakta belirlenen substans P IR si deney gruplarında saptanamadı. Şekil 1. Kontrol grubu alabalıkların ince bağırsağında glukagon IR hücreler, İHK boyama. X400

4 144 S. Köprücü ve ark. / Bibad, 4 (1): , 2011 Şekil 2. Kontrol grubu alabalıkların pilorik midesinde gastrin IR hücre, İHK boyama, X400. Şekil 3. Kontrol grubu alabalıkların pilorik midesinde substans P IR, İHK boyama, X400.

5 S. Köprücü ve ark. / Bibad, 4 (1): , Şekil 4. Salmonella enteritidis in intraperitoneal enjeksiyon ile enfekte edilmesi sonucunda deney grubu alabalıkların ince bağırsaklarında glukagon IR. İHK boyama, X400. Şekil 5. Salmonella enteritidis in intraperitoneal enjeksiyon ile enfekte edilmesi sonucunda deney grubu alabalıkların ince bağırsaklarında glukagon IR. İHK boyama, X400.

6 146 S. Köprücü ve ark. / Bibad, 4 (1): , 2011 TARTIŞMA VE SONUÇ Gastroenteritise neden olan Salmonella türlerinin bazılarının (S. typhimurium ve S. enteritidis) izolasyon ve identifikasyonu balıklarda da yapılmış ve sazanlarda deneysel olarak uygulanmış [8-16] fakat bu etkenlerin balıkların gastrointestinal kanalındaki endokrin hücrelerine olan etkisine ait immunohistokimyasal çalışmalara rastlanılmamıştır. Gökkuşağı alabalığının sindirim kanalında gastrin, substans P, glukagon, insülin, calbindin immunoreaktivitesi araştırılarak, Salmonella enteritidis in bu endokrin hücreleri üzerine etkisi araştırıldı. Gastrin IR hücrelere, Godus morhua balığının pilorik midesinde [23, 24], Mugil saliens balığının gastrik bezlerinin sefalik bölgesinde [25], Carassius auratus [26] ve Lampetra japonica [27] balıklarının midesinde, alabalığın ise kolesistokinin/gastrin IR sine bağırsak mukozasındaki endokrin hücrelerinde [28-31] tespit edilmiştir. Yapılan bu araştırmada da gastrin IR gökkuşağı alabalığının pilorik midesinde gözlendi. Salmo gairdneri üzerinde yapılan araştırmalarda mide de ve ince bağırsakta çok sayıda substans P içeren hücrelerin olduğu bildirilmiştir [28-31]. Ayrıca Scyliorhnirus stellaris balığının midesinde substans P içeren hücrelere rastlanılmıştır [32]. Gökkuşağı alabalığında yapılan bu çalışmada da mide ve incebağırsakta çok sayıda substans P içeren hücreler saptanmıştır. Barbus conchonius balığında yapılan araştırmalarda [33,34] glukagon immunoreaktivitesi gösteren hücrelere gastro-entero-pankreatik endokrin sistemde bulunduğu bildirilmiştir. Teleostlarda glukagon içeren hücrelerin bağırsaklarda [30, 35, 36], kıkırdaklı balıklarda ise gastrik mukozada yer aldığı bildirilmiştir [37]. Teleostlarda sadece Mugil saliens balığının midesinde gastrik bezlerin üst kısımlarında glukagon IR hücreleri tespit edilmiştir [25]. Bu araştırmada ise glukagon IR ön bağırsak bölümünde görüldü. Midede ise rastlanılmadı. Gökkuşağı alabalığında yapılan bu araştırmada calbindin IR si sindirim kanalında görülmedi. Sonuç olarak, Salmonella enteritidis ile enfeksiyon oluşturulan deneysel gruplarda, gastrin ve glukagon IR leri sindirim kanalında, kontrol grubuna benzer bir dağılım gösterdi. Substans P IR si ise kontrol gruplarda pilorik mide ve ince bağırsakta rastlanmasına rağmen enfekte gruplarda bu immunoreaktiviteye rastlanılmadı. Bu durum enfekte balıkların, enfeksiyon süresince aç bırakılmasına bağlı olabilir. Çünkü substans P nin sindirim kanalı endokrin hücrelerinden sentezlenmesi, alınan besin ile bağlantılıdır [38,39]. KAYNAKLAR [1] Carpenter, P.L., Microbiology. WB. Sounders Co., 2nd Edition, London. [2] Arda, M., Genel Bakteriyoloji. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Yayın No: 342, A.Ü. Basımevi. Ankara. [3] Stainer, R.Y., Adelberg, E.A., Ingraham, J., The microbial world. Printed in the U.S.A. Fourth Edition. U.S.A. [4] Arda, M., Minbay, A., Leleoğlu, N., Akay, Ö., Özel Mikrobiyoloji. Atatürk Ünv. Yayınları. No: 741, A.Ü. Basımevi, s. 659, Erzurum. [5] Bilgehan, H., Klinik Mikrobiyoloji, Özel Bakteriyoloji ve Bakteri Enfeksiyonları. Barış Yayınları Fakülteler Kitapevi. Bornova, İzmir. [6] Bekar, M., Salmonellaların Genel Karakteri ve Tanı Yöntemleri, Seminer notları. Etlik Hayvan Hastalıkları Araştırma Enstitüsü, Ankara. [7] Brock, T.D., Smith, D.W, Madigan, M.T., Biology of Microorganisms. Printed in the U.S.A. Fourth Edition. U.S.A. [8] Heuschman-Brunner, G., Experimental Studies on the possibility and course of infected with Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium. In freshwater fish. Zentralblattfur-bacteriologie- Parasitenkunde-infectionskrankheiten-undhygiene-Erste Abteillung Originale, 158 B: Heft 5, [9] Souter, B.W., Sonstegard-RA., McDermatt-LA., Enteric bacteria in Carp (C. carpio) and white Suckers (Catastomus commersoni). Journal of the Fisheries-Research-Board of Canada, 33 (6), [10] Morse, EY., Greenwood, D E., Meyers, EP., Anderson, YL., Duncan, MA., 1978, Experimental Salmonella infections in Carassius auratus (Goldfish). Journal of Environmental Science and Health, 13A (4), [11] Rejholec, J., Devitalization of Salmonellae in fish meals with propionic acid. Comparative- Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 3 (4), [12] Salte, R., Helleman, A.L., Persistence of Salmonella typhimurium in fish viscera, viscera silage and in chicken feed with a viscera silage supplement. Acta-Agriculture-Scandinavica 32 (4), [13] Hongslo, T., Ljunberg, O., Wierup, Occurence of pathogenic viruses and bacteria in imported aquarium fish. Svensk Veterinartidning, 39 (14), [14] Saber, N., Soliman, M.K., Moustafa, M., Nour, AM., Sorvival of gram negative bacteria in muscular tissue of common carp (Cyprinus carpio) after different types of animal, fish and poultry production. British conference on agric.,7-10 October, Alexandra Univ., Egypt, pp [15] Bocek, A.J., Brady, Y.J., Ragers, W.A., Exposure of silver carp. Hypophthalmichtys

7 S. Köprücü ve ark. / Bibad, 4 (1): , molitrix to Salmonella typhimurium. Aquaculture, 103(1), [16] Muz, A., Sarıeyyüpoğlu, M., Ertaş, H.B., Çetinkaya, B., Şeker, E., Kalender, H., Öngör, H., Aynalı sazan balıklarında oluşturulan deneysel Salmonella enteritidis ve Salmonella typhimurium enfeksiyonunun incelenmesi. Salmonellalar ve Enfeksiyonları Sempozyumu, Aralık, Bursa. [17] Popoff, M., Genus Aeromonas. P Bergey s Manual of Systematic Bacteriology. Ed: Krieg, N.R. Vol I. Barbara W&W, Baltimore. U.S.A. [18] Mattson, N.S., Riple, T.H., Metomidate, a beter anaesthetic for cod (Gadus morhua) in comparation with benzocain, MS-222, Cholorobutanol and phenoxylethanol, Aquaculture, 83, [19] Arda, M. Seçer, S. Sarıeyyüpoğlu, M., Balık Hastalıkları. Medisan Yayın Serisi:61. P Ankara. [20] Luna, L.G., Manual of histological staining methods of the armed forces institute of pathology. New York, Mc Graw-Hill Book Company. [21] Stenberger, L.A., 1986, Immunocytochemistry. 3rd. ed., Wiley, New York. [22] Shu, S., Ju, G., Fan L., The glucose oxidase- DAB-nickel method in peroxidase histochemistry of the nervous system. Neurosci Left, 85, [23] Larsson, L.I., Rehfeld, J.F., Evolution of CCK-like hormones. pp , In: Bloom S.R. (ed.) Gut Hormones, 2nd edition, Churchill Livingstone, Edinburgh. [24] Jonsson, A.C., Holmgreen, S., Holstein, B., Gastrin/CCK-like immunoreactivity in endocrine cells and nerves in the gastrointestinal tract of the cod, Gadus morhua and the effect of peptides of the gastrin/cck family on cod gastrointestinal smooth muscle. Gen. Comp. Endocrinol., 66, [25] Elbal, M.T., Lozano, M.T., Aguellerio, B., The endocrine cells in the gut of Mugil saliens Risso 1810: an immunohistochemical and ultrastuructural study. Gen. Comp. Endocrinol, 70, [26] Himick, BA., Peter, RE., 1994, CCK/gastrinlike immunoreaktivity in brain and gut and CCK supression of feding in goldfish. Am-J- Physiol.,Sep:267 (3pt2): R [27] Yui, R., Fujita, T., Immunocytochemical studies on the pancreatic islets of the ratfish, Chimaera monstrosa. Arch. Histol. Jpn., 49 (3), [28] Holmgren-S., Vaillant, C., Dimaline, R., VIP-, Substance P-, gastrin/cck-, bombesin-, somatostatin- and glukagon-like immunoreactivites in the gut of the rainbow trout, Salmo gairdneri. Cell-Tissue-Res., 223 (1), [29] Powel, M.D., Wright G.M., Burke F., Degranulation of eosinophilic granule cells induced by capsaicin and substans P in the intestine of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum). Cell Tissue Res., 266 (3), [30] Beorlegui, C., Martinez, A., Sesma, P., Endocrine cells and nerves in the pyloric caece and the intestine of Oncorhynchus mykiss (Teleostei): an immunocytochemical study. General and Comp. Endocrinology, 86 (3), [31] Barrenechea, M.A., Lopez, J., Martinez. A., Regulatory peptides in gastric endocrine cells of the rainbow trout Oncorhynchus mykiss: General Distribution and Colocalizations. Tissue and Cell, 26, [32] Cimini, V., Van Noorden, S., Polak, J.M., Co-localization of substans P-bombesin-and peptid histidine isoleucine-like peptides in gut endocrine cells of the dogfish Scyliorhninus stellaris. Anat. Embr., 179: [33] Rombout, J.H.W.M., Grinten, C.P.M., Binkhorst, P.F.M., Thiele, T.J.J., Schooneveld, H., 1986a. Immunohistochemical idenfication and localization of peptide hormones in the gastro-entero-pancreatic (GEP) endocrine system of the Mouse and a stomachless fish, Barbus concnonius. Histochemis. 84 (4-6), [34] Rombout, J.H.W.M., Bol, J., Thiele, T.J.J. 1986b. Ultrastructural characterization of 6 immunoreactive enteroendocrine cells in Barbus conchonius (Teleostei, cyprinidae). Histochemistry, 85 (6), [35] Elbal, M.T., Aguellerio, B., An immunohistochemical and ultrastuructural study of endocrine cells in the gut of a teleost fish. Sparus auratus L. General and Comparative Endocrinology, 64, [36] Abad, M.E., Binkhorst, P.F.M., Elbal, M.T, Rombout, J.H.W.M., A comparative immunocytochemical study of the gastro-enteropancreatic (GEP) endocrine system in a stomachless and a stomach-containing teleost. Gen. Comp. Endocrinol., 66, [37] Tagliafierro, G., Farrini, L., Rossi, G.C., Vacchi, M., Distribution of somatostatin and glukagon immunoreactive cells in the gastric mucosa of some cartilaginous fishes. Gen. Comp. Endocrinol., 75, [38] Inverson, LL., 1982, Substans P. Br. Med. Bull., 38, 277. [39] Walker, J.P., Thompson, J.C., Substance P. In: Thompson J.C. (Ed.), Gastrointestinal Endocrinology. New York, McGraw-Hill, 317.