ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BİBERLERDE (Capsicum annuum L.) ANTER KÜLTÜRÜNDE MEVSİM ETKİSİ VE MİKROSPOR GELİŞİMİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ADANA 2011

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİBERLERDE (Capsicum annuum L.) ANTER KÜLTÜRÜNDE MEVSİM ETKİSİ VE MİKROSPOR GELİŞİMİ YÜKSEK LİSANS TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Bu tez /..../2011 tarihinde aşağıdaki jüri üyeleri tarafından oybirliği/oyçokluğu ile kabul edilmiştir. İmza İmza. İmza. Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof.Dr. Kazım ABAK Doç. Dr. Nuray ÇÖMLEKÇİOĞLU Danışman Üye Üye Bu tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında Hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ BİBERLERDE (Capsicum annuum L.) ANTER KÜLTÜRÜNDE MEVSİM ETKİSİ VE MİKROSPOR GELİŞİMİ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİMDALI Danışman: Jüri: Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Yıl:2011, Sayfa: 89 Prof.Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof Dr. Dr. Kazım ABAK Yard.Doç. Dr. Nuray ÇÖMLEKÇİOĞLU Bu çalışma, yılları arasında Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü seraları ve Doku Kültürü Laboratuarı ile Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Sitoloji Labatuarında yürütülmüştür. Denemede Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü nde yürütülen çalışmalar sonucu düşük sıcaklığa hassas 195 nolu genotip, düşük sıcaklığa tolerant olarak bilinen 421 nolu genotip, yüksek sıcaklığa hassas olan 277A nolu genotip ve yüksek sıcaklığa tolerant olarak standart çeşit tescili yapılan İnan 3363 çeşidi kullanılmıştır Araştırmada iki farklı BAP konsantrasyonu kullanılmıştır. Denenen 4 farklı genotip için en yüksek embriyo uyartımı ve bitkiye dönüşüm oranının belirlenmesi amacıyla anterler farklı zamanlarda kültüre alınmıştır. Kültüre alınan anterlerden elde edilen embriyolar bitki büyüme düzenleyici içermeyen MS ortamlarına alınmıştır. Ayrıca ortamlara dikilen anterler Ekim, Şubat, Mayıs ve Ağustos ayında her iki ortamdan da 0.,1., 2., 3., 4., 8 ve 14. günlerde alınarak carnoy fiksasyon çözeltisi ile sabitlenmiş ve DAPİ ve Asetokarmen boyama yöntemleriyle boyanarak floresan ve ışık mikroskopları ile mikrospor gelişimleri incelenmiştir. Denemenin sonucunda gerek embriyo oluşumu gerekse oluşan embriyoların bitkiye dönüşümü genotiplere, anter alma dönemlerine ve besin ortamlarına göre değişmiştir. Genotipler arasında en yüksek embriyo verimi yüksek sıcaklıklara tolerant olarak belirlenmiş olan İnan 3363 isimli kültür çeşidinden elde edilmiştir. Anter alma dönemlerinden ise en başarılı sonuçlar Nisan ve Ağustos aylarından elde edilmiştir. Besin ortamları arasında ise Kasım, Aralık, Ocak, Nisan ve Eylül aylarında I nolu ortam (MS + 30 g/l sakkaroz + % 0.25 aktif kömür+ 15 mg/l AgNO3 + 4 mg/l NAA + 0.1mg/l BAP) ve Ekim, Mart Mayıs, Temmuz ve Ağustos aylarında II nolu ortam (MS + 30 g/l sakkaroz + % 0.25 aktif kömür+ 15 mg/l AgNO3 + 4 mg/l NAA mg/l BAP) daha başarılı bulunmuştur. Bitkiye dönüşüm, Nisan ayında daha başarılı bulunmuştur. Mikrospor gelişiminde ise tüm genotip ve ortamlarda kültüre alınan anterlerde mikrosporların çekirdekleri yüksek oranda erime ve düşük oranda bölünmeye başlamışlar, çekirdek erimesi ve bölünmesi genotip ve dönemlere göre farklılık göstermiştir. Anahtar Kelimeler: Biber, anter kültürü, mevsim etkisi, mikrospor gelişimi I

4 ABSTRACT MSc THESIS EFFECT OF SEASON ON PEPPER (Capsicum annuum L.) ANTHER CULTURE and MICROSPOR DEVELOPMENT CUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF HORTICULTURE Supervisor: Jury: Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Year:2011, Page: 89 Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof. Dr. Kazım ABAK Asst. Prof Dr. Nuray ÇÖMLEKÇİOĞLU This study was carried out at the Greenhouse and Tissue Culture Laboratory of Alata Horticultural Research Institute and the Histology Laboratory of Department of Horticulture, the Faculty of Agriculture of the Çukurova University between 2009 and Pure line three pepper genotypes one tolerant (421) and one intolerant (195) to lower temperatures, one intolerant (277A) to higher temperatures and tolerant variety (Inan 3363) to higher temperatures derived from a joint study between our department and Alata Horticultural Research Institute were employed in the present study. Two different culture media were used. The anthers were cultured at different periods (12 months) in order to determine the highest embryo stimulation and haploid plant regeneration in the examined four genotypes. Embryos were transferred to hormone free culture media for transform to plant. In addition all anthers were taken on 0.,1.,2.,3.,4.,8., and 14. days of February, May, August and October and fixed with Carnoy s solution. Development of microspores were observed cytologically using 4-6-diamidino-2-phenylindol-2HCl (DAPI) and asetocarmen stain. At the end of the study, it was determined that both embryo development and haploid plant development varied depend on genotype, anther cultivation period and culture medium. The highest embryo ratio was obtained from İnan 3363 cultivar variety that tolerant genotypes to high temperature. The anthers cultured in April and August gave the most yielding results compared to the other periods. The more embryos were obtained from the first medium (Murashige and Skoog + 30 g/l sakaroz % active coal + 15 mg/l silver nitrate + 4 mg/l naphthalene acetic acid + 1 mg/0.1 benzyl amino purin) in the November, December, January, April and September and second medium (Murashige and Skoog + 30 g/l sakaroz % active coal + 15 mg/l silver nitrate + 4 mg/l naphthalene acetic acid + 1 mg/0.5 benzyl amino purin) in October, March, May, July and August. Propotion of empty microspore increased as from first day of culture. Division of nucleus begun on the first day of anther culture. Key words: Pepper, anther culture, microspore development II

5 TEŞEKKÜR Yüksek lisans tez konumun belirlenmesi, yürütülmesi ve yazım aşamasında yönlendirici katkılarıyla desteğini bulduğum Danışman Hocam Sayın Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA ya sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Çalışmamda kullandığım biber genotiplerinin tohumları sağlayan ve her türlü yardımı aldığım Dr. Davut KELEŞ e, Laboratuar çalışmasında yardımlarını esirgemeyen arkadaşlarım Nihal DENLİ, Hasan PINAR ve Ar. Gör. Hatıra TAŞKIN ve Namık Kemal YÜCEL e, çalışmam sırasında idari ve kişisel yardımı esirgemeyen Enstitü müdürü Şekip KESER e, Laboratuar çalışması sırasında gerekli yardımı hiçbir zaman esirgemeyen Haluk İhsan TEKİN e teşekkürlerimi sunarım. Çalışmam sırasında zamanlarını kullandığım ve hiçbir zaman fedakârlıktan kaçınmayan eşim Nurcan ATA ve kızım Hicran ATA ya sonsuz teşekkürler sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER.....IV ÇİZELGELER DİZİNİ....VI ŞEKİLLER DİZİNİ.... VIII SİMGELER VE KISALTMALAR... X 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOT Materyal Denemede Kullanılan Genotipler ve Özellikleri Metot Bitkilerin Yetiştirilmesi Uygun Anterlerin Seçimi Kültür Sırasında Kullanılan Malzemeler Besin Ortamları Anterlerin Çıkarılması ve Besin Ortamına Ekilmesi Mikrospor Gelişim Aşamasının Belirlenmesi Verilerin Alınması ve Değerlendirilmesi BULGULAR ve TARTIŞMA Anter Kültürü Çalışması Farklı Zamanlarda Alınan Anterlerde Embriyo Oluşturan Anter Oranı, Embriyo Oranı, Embriyo Sayısı, Bitkiye Dönüşen Embriyo Oranı ve Gelişen Bitki Oranları Ekim Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Kasım Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Aralık Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları IV

7 Ocak Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Şubat Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Mart Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Nisan Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Mayıs Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Haziran Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Temmuz Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Ağustos Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Eylül Ayında Alınan Anterlerde Embriyo Oluşum ve Bitkiye Dönüşüm Oranları Denenen Genotip ve Ortamların Embriyo Oluşturan Anter Oranı, Embriyo Oranı, Bitkiye Dönüşüm ve Gelişen Bitki Oranı Aylara Göre Embriyo Oluşturan Anter Oranı Aylara Göre Embriyo Oranı Aylara Göre Bitkiye Dönüşüm Oranı Aylara Göre Gelişen Bitki Oranı Mikrospor Gelişimi Nolu Genotipin Mikrospor Gelişimi A Nolu Genotipin Mikrospor Gelişimi İnan 3363 Kültür Çeşidinin Mikrospor Gelişimi Nolu Genotipin Mikrospor Gelişimi SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1 Bitkilerin yetiştirilme dönemleri ve çalışma programı Çizelge 3.2. MS (1962) Besin Ortamının Bileşimi Çizelge 4.1. Ekim döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.2. Kasım döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.3. Aralık döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.4. Ocak döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.5. Şubat döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.6. Mart döneminde embriyo oluşturan anter oranı embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.7. Nisan döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.8. Mayıs döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge 4.9. Haziran döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı VI

9 Çizelge Temmuz döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge Ağustos döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge Eylül döneminde embriyo oluşturan anter oranı, embriyo oranı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo oranı ve gelişen bitki oranı Çizelge Aylara göre embriyo oluşturan anter oranı Çizelge Aylara göre embriyo oranı Çizelge Aylara göre bitkiye dönüşüm oranı Çizelge Aylara göre gelişen bitki oranı Çizelge nolu genotipe ait farklı zamanlarda ve farklı ortamlarda mikrospor gelişim oranı Çizelge A nolu genotipe ait farklı zamanlarda ve farklı ortamlarda mikrospor gelişim oranı Çizelge İnan 3363 genotipine ait farklı zamanlarda ve farklı ortamlarda mikrospor gelişim oranı Çizelge nolu genotipine ait farklı zamanlarda ve farklı ortamlarda mikrospor gelişim oranı VII

10 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil A nolu genotipe ait görünüm Şekil nolu genotype ait görünüm Şekil nolu genotipe ait görünüm Şekil 3.4. İnan 3363 kültür çeşidine ait görünüm Şekil 3.5. Deneme süresince deneme serasındaki maksimum, minimum ve ortalama sıcaklık değerleri Şekil 3.6. Denemede kullanılan genotiplerin anter kültürüne alınan tomurcuklarının ve anterlerinin görünümü (İnan 3363, 421, 195 ve 277A nolu genotipler) Şekil 3.7. Biber anterlerinin sabitlenmesinden bir görüntü Şekil 4.1. II nolu besin ortamında 277A nolu genotipten elde edilen bir embriyo görünümü Şekil 4.2. II nolu besin ortamında 277A nolu genotipten elde edilen bir bitki görünümü Şekil 4.3. II nolu besin ortamında İnan 3363 nolu genotipten oluşmuş embriyo görünümü Şekil 4.4. I nolu besin ortamında 277A nolu genotipten oluşmuş bitki görünümü Şekil 4.5. II nolu besin ortamında İnan 3363 kültür çeşidinden oluşmuş bitki görünümü Şekil 4.6. I nolu besin ortamında 421 nolu genotipden oluşan embriyoların görünümü Şekil 4.7. II nolu besin ortamında 421 nolu genotipden oluşmuş bir bitki görünümü Şekil 4.8. II nolu besin ortamında İnan 3363 nolu genotipten oluşmuş bitki Şekil 4.9. II nolu besin ortamında 195 nolu genotipten oluşmuş embriyo görünümü Şekil II nolu besin ortamında 195 nolu genotipten oluşmuş bitki görünümü Şekil I nolu besin ortamında 195 nolu genotipten oluşmuş embriyo görünümü VIII

11 Şekil Aylara göre embriyo oluşturan anter oranı Şekil II nolu besin ortamında 421 nolu genotipten oluşmuş embriyolar Şekil Aylara göre embriyo oranı Şekil Aylara göre bitkiye dönüşüm oranı % Şekil Farklı ortamlarda farklı genotiplerden oluşmuş bitki görünümleri Şekil Aylara göre gelişen bitki oranı % Şekil nolu genotipin Ekim ayı II nolu besin ortamında mikrospor gelişimi Şekil nolu genotipi II nolu besin ortamında mikrospor gelişimi Şekil Boş, tek, iki, ve üç çekirdekli mikrosporların floresan mikroskobu ile görünümü Şekil A nolu genotipin Ekim ayında I nolu besin ortamında mikrospor gelişimi Şekil , 2 ve 4 çekirdeğe sahip mikrosporlar Şekil İnan 3363 kültür çeşidinin Ağustos ayında mikrospor gelişimi Şekil Boş, tek, iki, ve üç çekirdekli mikrosporların ışık mikroskobu ile görünümü Şekil nolu genotipin Ağustos ayında II nolu besin ortamında mikrospor gelişimi IX

12 SİMGELER VE KISALTMALAR MS Murashige and Skoog MMS Modifiye edilmiş Murashige and Skoog 2,4-D 2,4-Dikloro fenoksi asetik asit AgNO3 Gümüş nitrat NAA Naftalen asetik asit BAP Benzil amino purin BA Benzil adenin ABA Absisik asit K Kinetin HCl Hidrojen klorür KOH Potasyum hidroksit ml Mililitre cm Santimetre gr Gram mg Miligram 1 Litre mg/1 Miligram/litre mg Mikrogram μm Mikromol DAPİ 4'-6-Diamidino-2-phenylindole BDO Bitkiye dönüşen embriyo oranı GEO Gelişen embriyo oranı ES Embriyo sayısı X

13 XI

14 1. GİRİŞ 1. GİRİŞ Bitkiler insanlığın varoluşundan buyana insan beslenmesinde çok önemli bir yere sahiptir. Bitkilerden besin olarak yararlanma ilk doğadan toplama şeklinde başlamış daha sonra üstün olan tipler korumaya alınmış, bu aşamadan sonra da tohumları alınarak ilk kültüre alma işlemleri gerçekleştirilmiştir. FAO 2007 verilerine göre bir kişinin almış olduğu ortalama kalori miktarı günlük 2796 kilo kaloridir. Bu miktarın % i bitkisel kaynaklı gıdalardan sağlanmaktadır. Günlük tüketilen toplam kalorinin % 8.72 si sebzelerden sağlanmaktadır. Bitkiler aynı zamanda ilaç ve kozmetik sanayi, enerji üretimi vb alanlarda ham madde olarak kullanılmaktadır. Solanaceae familyasında yer alan biber (Capsicum annuum L.) besin değeri ve üretiminin hızla artması nedeni ile oldukça önemli bir sebze türüdür. Dünyada toplam sebze üretiminin ( milyon ton) % 3.34 ünü (30.68 milyon ton) biber oluşturmaktadır. Türkiye 97 bin ha alanda yaklaşık 1.76 milyon ton biber üretimi ile dünya biber üreticisi ülkeler arasında üçüncü sırada yer almaktadır (FAO, 2008). Biber gıda olarak tüketiminin yanında ilaç sanayinde de kullanılmaktadır. Biberin anavatanı Orta ve Güney Amerika dır. Capsicum annuum ın geniş bir çeşitlilik gösterdiği Meksika ve Orta Amerika biberin birincil gen merkezidir. Güney ve Orta Avrupa, Afrika, Asya ve Latin Amerika nın bazı kesimleri ikincil gen merkezi olarak bilinmektedir (IBPGR, 1983). 16. yy a kadar Avrupa da bilinmeyen biber, 1493 yılında Kolombo nun Amerika yı keşfinden sonra Portekiz e ve İspanya ya getirilmiş ve 16. yy ın ortalarında da Orta ve Kuzey Avrupa ya yayılmıştır (Greenleaf, 1986). İlk kültüre alınan biber genotipleri ve yabani formları muhtemelen küçük meyveli, çok tohumlu, ince etlidir. Bu bitkilerin tohumları muhtemelen kuşlar ve diğer hayvanlar tarafından yayılmışlardır. Daha sonra insanlar, talepleri doğrultusunda olan bitkileri seleksiyon yolu ile seçmişler ve çoğaltmışlardır. Başlangıçta amatör olarak yapılan bu seçimler artan dünya nüfusu ve tüketici talepleri doğrultusunda profesyonel anlamda ıslah çalışmalarını başlatmıştır. Biberde de 20. yüzyıl boyunca meyve kalitesi, hastalıklara karşı mukavemet, erkencilik, 1

15 1. GİRİŞ verimlilik, abiyotik streslere tolerans ve bitki morfolojisinde önemli ıslah çalışmaları yapılmıştır Biberin güneyde 55 enlem ile kuzeyde 52 enlemleri arasında geniş bir aralıkta yetiştiriciliği yapılmaktadır. Optimum çimlenme sıcaklığı C arasında iken yetiştiricilik için en uygun sıcaklık C arasıdır. Ortam sıcaklıkları 32 0 C yi aştığında veya 15 0 C nin altına düştüğünde gelişmesi yavaşlamaktadır. Ülkemizde ve dünyada yetiştiriciliği yaz aylarında açıkta ve kış aylarında ise örtüaltında yapılmaktadır. Bu mevsimlerde biberin ihtiyaç duyduğu optimum iklim koşulları yeterli düzeyde sağlanamazsa verim ve kalite kayıpları oluşmaktadır. Bu nedenle optimum iklim koşullarının dışında verimliliği ve kaliteyi devam ettirebilen çeşitlerin ıslahına ihtiyaç vardır. Bu anlamda ıslah, bir popülasyonun amaç doğrultusunda genetik yapısının değiştirilerek daha verimli ya da daha dayanıklı hale getirilmesidir ve zaman alan bir süreçtir. Islah süresinin kısaltılmasında son yıllarda kullanılan bitki biyoteknolojisi en önemli araçlardan bir tanesidir. Bitki biyoteknolojisi kısaca biyolojik bilimlerdeki gelişmelerin, teknolojideki gelişmler yardımıyla uyguluamaya ve ticari amaçlara yönelik kullanılması şeklinde tanımlanabilir (Kaya 2001). Bitki biyoteknolojisinin amacı, bitkisel üretimde bilinen klasik yöntemlerle çözülemeyen veya çözümü güç olan problemlere çözüm getirerek, daha ekonomik, kalite ve kantite yönünden daha yüksek bitkisel üretimin gerçekleştirilmesine yardımcı olmaktır (Hatipoğlu, 1997). Bitkilere uygulanan biyoteknolojik yöntemlerden biride Doku Kültürü Teknikleridir. Doku kültürü teknikleri içerisine giren haploid bitki üretimi bitki ıslahında önemli bir yere sahiptir (Heiser, 1976; Andrews, 1985). Haploidi tekniği ıslah sürecini kısalttığı için sebze ıslahında geniş uygulama alanı bulmuştur. Haploid bitkilerin en önemli kullanım alanı kendine uyuşmaz türlerde bile tamamen homozigot katlanmış dihaploid hatların hızlı üretimidir. Geleneksel yöntemlerle de saf hatlar elde edilebilir. Fakat bu işlem yabancı tozlanan bitkilerde 10-12, kendine tozlanan bitkilerde 6-7 yıl sürer. Dioik türlerde ise kendileme olanaksızdır. Haploidi yöntemleri ile bu süre 1-2 yıla inmektedir. 2

16 1. GİRİŞ Klasik ıslah çalışmalarında genotiplerin seçilmesi ve bu seçilen genotiplerin saflaştrılması uzun yıllar almaktadır. Ayrıca düşük ve yüksek sıcaklık gibi abiyotik şartlara toleranslık biberde bir çok gen tarafından kontrol edilmekte buda dayanıklılığın yeni nesillere aktarılmasını zorlaştırmaktadır. Denemeler sonucunda herhangi bir stres faktörüne karşı dayanıklı veya tolerant olduğu belirlenen heterozigot bireylerin istenen özellikleri kaybetmeden saflaştırılması haploidizasyon yöntemi ile daha kolay olmaktadır. Haploid kromozom sayısına sahip bitkilerin elde edilmesi ve bunların kolhisin gibi bazı maddelerle kromozom sayılarının iki katına çıkartılmasıyla bir yıl içerisinde % 100 homozigot saf hatlar elde etmek mümkün olabilmektedir. Böylece 5 6 yıl süren homozigotlaştırma işlemini 1 yılda, ıslah çalışmalarını da 3 4 yıl gibi bir sürede tamamlama olanağı ortaya çıkmaktadır. Doğada ortaya çıkış sıklığı az ve düzensiz olan haploid bitkiler yeterli miktarda olmadığı ve istendiği zaman bulunamadığı için ıslah çalışmalarında kullanılabilme özelliğine sahip değillerdir. Erkek veya dişi gamet hücrelerinden in vitro koşullarda haploid embriyo ve bitki elde etme olanağı sağlayan doku kültürü teknikleri birçok bitki türünde dihaploidlerin elde edilmesinde faydalıdır. Solanaceae ve Cruciferae familyalarına ait türlerin birçoğunda anter ve mikrospor kültürleri yoluyla androgenetik haploidler elde edilebilirken, Cucurbitaceae familyasına ait sebze türlerinde eksik polenle uyartım yoluyla daha olumlu sonuçlar alınabilmektedir. Koleva-Gudeva ve ark. (2007) nın bildirdiğine göre; ilk anter kültürü yoluyla in vitro haploid biber çalışması Wang ve ark. (1973) tarafından yapılmıştır. Biberde anter kültürü yoluyla ilk polen embryogenesisi 1973 yılında George ve Narayanaswamy tarafından yapılmıştır. Tekrar edilebilir metot Dumas de Valux ve ark. (1981) tarafından geliştirilmiştir. Ellialtıoğlu ve Tıpırdamaz (2002) bildirdiğine göre ülkemizde biberde anter kültürü yoluyla ilk çalışmalar Abak (1983) tarafından yapılmış, Türkiye orijinli biber genotiplerinde uygun besi ortamında % 10,38 kadar ulaşan haploid bitki elde edilmiştir. Bu yöntemle oluşan haploid bitkilerin kromozom sayıları katlanarak elde edilen saf hatlar, çeşit geliştirmeye yönelik ıslah programlarında kullanılmıştır. 3

17 1. GİRİŞ Biberde anter kültürü ıslah çalışmalarında kullanılmakta ve bu yolla yeni çeşitler geliştirilmektedir. Ancak embriyo ve bitkiye dönüşümde; yetiştirilme koşulları, ortam, uygulama zamanı ve genotipe göre farklılık göstermesi ve bütün genotiplerde yüksek oranda haploid bitki elde edilememesi yöntemin yaygınlaşmasını engelleyen faktörlerdir. Bu çalışmanın amacı farklı iklim isteğine sahip biber genotiplerinin (düşük ve yüksek sıcaklığa hassas ve tolerant genotiplerin) bir yıl boyunca her ay embriyo ve bitkiye dönüşüm oranları tespit edilerek; farklı iklim istekleri ile embriyo ve bitkiye dönüşüm arasında bir ilişkinin varlığını ortaya çıkarmaktır. Ayrıca farklı mevsimlerde tüm genotiplerden alınan anterlerde mikrospor gelişimi de incelenmiştir. 4

18 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR İlk erkek üreme hücresi kökenli haploid bitki 1920 yılında bodur bir pamuk bitkisinde keşfedilmiştir (Dunwell, 2010). Köksal, (1999) tarafından bildirdiğine göre haploidi konusundaki ilk çalışma 1922 yılında Blakeslee ve ark. tarafından Datura stroamonium bitkisinde yapılmıştır. Daha sonra, pek çok bitki türünde haploid bitki elde etme amacıyla gerek dişi gerekse erkek gamet hücreleri kullanılmıştır yılında Guha ve Maheswari, 1967 yılında da Bourgin in katkılarıyla geliştirilen erkek gamet hücrelerinin kullanıldığı anter kültürü tekniği ile bugün birçok bitkide haploidi yöntemi ıslah programlarında kullanılır hale gelmiştir (Oinuma, 1977; Dumas de Vaulx, 1979; Henry ve Buyser, 1983). Dumas de Vaulx ve ark (1981), Capsicum annuum da anter kültürünün başlangıç döneminde yüksek sıcaklığın (35 C) androgenesise tepkiyi teşvik ettiğini bulmuşlardır. Bajaj, (1990) anter kültüründe başarının genotip, donör bitkinin yetiştirme şartları, anter ve çiçek gözüne yapılan ön uygulamalar, mikrospor gelişme safhası ve inkübasyon koşulları gibi çok sayıda şartlara bağlı olduğunu bildirmiştir. Kristiansen ve Andersen (1993), donör bitkinin sıcaklığı, fotoperiyot ve yaşının mikrospor kültürü üzerine etkisini incelemişler; bitkinin yetiştirme sıcaklığı ve yaşının embriyo gelişimine etkili olduğunu fakat fotoperiyodun etkili olamadığını bildirmişlerdir. Abak (1983), tarafından yapılan bir araştırmada Türkiye orijinli biber materyalinde anter kültürü yoluyla haploid bitki elde etmeye olanak verecek uygun bir besin ortamı ve yöntemi bulmak amaçlanmıştır. Bu amaçla, anter kültürü için en elverişli tomurcuk gelişme döneminin saptanması; kültüre alma işlemi öncesinde uygulanan bazı işlemlerin etkisini incelemeye; besin ortamına katılan büyümeyi düzenleyici maddeler (kinetin ve 2,4-D), sakkaroz ve demir bileşiklerinin değişik dozlarının etkilerini araştırmaya yönelik denemeler yapılmıştır. Elde edilen bulgular ince uzun meyveli yerli biber materyali için en elverişli anter gelişme döneminin (mayoz bölünmeyi izleyen birinci mitoz başlangıcı), tomurcukların mm iriliğine ulaştıkları zamana rastladığını göstermiştir. Anterlerin dikim öncesi nemce 5

19 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR doymuş atmosferde, 25 ºC ve 35 ºC sıcaklıklarda tutulması herhangi bir olumlu etki meydana getirmemiştir. En başarılı sonuçlar, besin ortamına 5 mg/l kinetin, 5 mg/l 2,4-D, 120 g/l sakkaroz, 37.3 mg/l Na 2 EDTA+27.8 mg/l FeSO 4 7H 2 O katılması ile elde edilmiştir. Bu yolla oluşan haploid bitkiler kolhisin yardımıyla diploid hale getirilebilmiş ve saf hatlar üretilebilmiştir. Chuong ve Beversdorf (1985), Brassica napus un 6 ve Brassica carinata nın 1 çeşidinden izole edilen mikrosporları % 13 (W/V) sakkaroz, 0.05 mg/l BA ve 1.00 mg/l NAA eklenerek modifiye edilmiş Nitsch ve Nitsch (NN) ortamında kültüre almışlardır ºC arasındaki sıcaklıklarda embriyogenik tepkiler görülmüştür. En yüksek embriyo yoğunluğu 30ºC de olmuştur ve her anterde 7 54 embriyo gelişmiştir. 30ºC de en yüksek embriyo yoğunluğuna karşın, daha düşük sıcaklıklardaki kültürlerde embriyo kalitesi daha iyi olmuştur. 32ºC de 3 gün inkübasyonu takiben 25ºC de inkübasyon da hem yüksek embriyo verimi hem de yüksek normal embriyo yüzdesi sağlanmıştır. Mikrosporlardan bitkiciklerin gelişimi hem ortamdan hem de genotipten etkilenmiştir. Vegara ve Havranek (1985), biberde yapmış oldukları çalışmada standard ve azaltılmış MS ortamları kullanarak düşük düzeyde embriyo elde ettiklerini, aktif kömürün varlığı embriyo gelişmini ve kültürün canlılığını uzattığını ve anterlerden uzaklaştırılarak başka ortamlara alınan embriyoların tamamının bitkiye dönüştüklerini bildirmişlerdir. Ayrıca ortamdaki FeEDTA varlığının globuler embriyonun oranını artırdığını bildirmişlerdir. Morison ve ark (1986), Capsicum annuum un farklı genotiplerinde yapılan anter kültüründe elde edilen embriyo sayısının ve bunların bitkiye dönüşüm oranlarının farklı olduğunu bildirmişlerdir. Oluşan embriyoların çoğunun bitkiye dönüşmediği, embriyonun bir ucundan kök diğer ucundan kallus oluşumu şeklinde anormal bitki oluşumu gözlendiğini bildirmişlerdir. Lu ve ark. (1991), 22 yazlık buğday çeşidini tarla, sera ve büyütme çemberinde yetişmişler ve ortamlara alınan anterlerde kallus verimini incelemişlerdir. Açık arazi koşullarında yetişen bitkilerden alınan anterlerde kallus verimi yüksek bulunmuş, bunun bitkinin yaşamış olduğu stres faktörlerinin neden 6

20 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR olabiliceğini bildirmişlerdir. Ayrıca denemeye alınan genotipler arasında kallus verimi açısından farklılık bulmuşlardır. Karakullukçu ve Abak (1992), dört değişik patlıcan genotipinin anter kültürüne verdikleri yanıtı incelemişlerdir. En iyi sonuç Halep Karası çeşidinden %7.8 oranında embriyo verimi, % 4.4 oranında haploid bitki ile elde edilmiştir. Adana Topağı, Birecik Yerlisi ve Black Beauty çeşitlerinin anterlerinde irileşme olmuş, kallus gelişmiş, ancak embriyo ve haploid bitki gelişmemiştir. Yang ve ark. (1992), ilkbaharda çiçek tablası oluşturan karnabar genotipinde embriyogenesis için donör bitkinin yetiştirildiği kültür koşulları, tomurcuk büyüklüğü, karbon kaynağı ve miktarı ve sitokinin (BAP) miktarını araştırmışlar; C sıcaklığın olduğu kış ve ilkbahar aylarının yaz ve erken aylarından daha uygun olduğunu, tomurcuk büyüklüğünün ilk polen mitozu aşamasının daha yüksek olduğunu, sukrozun en iyi karbon kayanağı olduğunu ve 140 mg/l en uygun doz olduğunu ve sitokinin kaynağı olan BAP ın embryo verimini negatif yönde etkilediğini bildirmişlerdir. Tiainen (1992), patateste yapmış olduğu anter kültürü çalışmasında Ağustos ayından Temmuz ayına kadar her ay anterleri kültüre almıştır. Ayrıca tomurcuklar +6 C ve +30 C ön sıcaklık uygulamalarına tabi tutulmuştur. Çalışmada hiçbir ön uygulamanın yapılmadığı kontrol grubu ve +6 C lik ön uygulamanın iyi sonuç verdiği belirlenmiştir. Sonuçlar aylar bazında değerlendirildiğinde, Eylül ve Ekim aylarında yüksek sonuçlar (% 15-20) elde edilmiştir. Ancak bu embriyolardan sadece % 6-8 oranında bitkiye dönüşüm sağlanmıştır. Şubat-Mayıs arasındaki aylarda alınan anterlerde embriyo oluşum oranı % 1-3 oranında olmuştur. Karakullukçu ve Abak (1993), besin ortamına değişik düzeylerde katılan bazı organik maddelerin (sakkaroz, glukoz), aktif kömür ve büyümeyi düzenleyicilerin (kinetin, zeatin, 2,4-D, NAA) patlıcan anter kültüründe haploid bitki oluşumu üzerine etkilerini araştırmışlardır. İlk 12 gün boyunca % 12 sakkaroz; % 3 glikoz veya % 6 sakkaroz + % 6.3 glukoz uygulamalarından daha iyi sonuç vermiştir. Aktif kömürün embriyo oluşumuna olumlu bir etkisi gözlenmemiştir. Anterler, kinetin + 2,4-D kombinasyonlarında, zeatin + 2,4-D veya kinetin + NAA kombinasyonlarına göre daha iyi cevap vermişlerdir. Çalışmanın değişik 7

21 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR aşamalarında 5 mg/l kinetin + 5 mg/l 2,4-D ve % 12 sakkaroz kullanılan ortamlarda % 12.1 (Baluroi F1), % 1.5 (Kemer) ve %3.8 (Halep Karası) oranlarında embriyo elde edilmiştir. Mityko ve ark (1995), biberde 4 ıslah hattı, 7 kültür çeşidi ve bunların melezlerinin anter kültürüne tepkisini incelemişlerdir. Korolla ile kaliksin aynı uzunlukta olduğu ya da bir parça geçtiği aşamada toplanan tomurcuklar ilk 8 gün karanlıkta bekletilmiştir. Anterlerin kültüre alınmasından gün sonra embriyo oluşumları gözlenmiştir. İki kültür çeşidi dışındaki bütün genotiplerde bitkiye dönüşüm sağlanabilmiştir. Flow sitometri ile ploidi seviyeleri belirlenen androgenik bitkilerden, haploid ve spontan dihaploidler elde edilebilmiştir. Bitkiye dönüşüm oranları kullanılan genotiplere göre değişmiştir. En iyi sonuç Feherözön çeşidinden elde edilmişledir. Matsubara ve ark (1998), 6 biber genotipini Temmuz ayından Kasım ayına kadar her ay anterleri 0.004mg/l 2,4 D, 0.1 mg/l kinetin, 30 gr/l sukroz ve 2 g/l gelrite içeren MS ortamına dikerek 35 0 C 24 saat inkübe etmişler ve 25 0 C de 16 aydınlık 8 saat karanlık koşullarda kültür koşullarına bırakmışlardır. Sıcaklığın C olduğu Eylül ve Ekim aylarında embriyo ve kallus oluşumu diğer zamanlara göre daha yüksek bulunmuştur. Cheongyang ve Fusihimi Amenega çeştilerinde kallus daha yüksek bulunurken Shishitou ve California Wonder çeşitlerinde embriyo daha çok oluştuğunu bildirmişlerdir. Dias ve Martins (1999), Brassica oleracea nın 27 genotipinde, anter kültürü yöntemi ile embriyo elde edilmesinde gümüş nitratın 3 farklı konsantrasyonunun etkisini araştırmışlardır. Besin ortamına gümüş nitrat ilave edilmesiyle embriyo verimi genotiplerin büyük bir kısmında önemli derecede yükselmiştir. En iyi sonuçlar 10 mg/l AgNO 3 eklenmesi ile elde edilmiştir. Elde edilen sonuçlar Brassica oleracea genotiplerinde anter kültürü ortamına gümüş nitrat ilavesinin embriyo üretimini artıracağını göstermiştir. Çömekçioğlu ve ark. (1999), Şanlıurfa ve Kahramanmaraş biber popülasyonlarında MS ortamına eklenen 4mg/ NAA, 0.1 mg/l BAP, % 0.25 aktif kömür, 30 g/l sakkaroz ile AgNO 3 0 ve 10 mg/l dozlarını denemişler; 0 mg/l AgNO 3 dozunda her iki popülasyonda da embriyo elde edemediklerini 10 mg/l AgNO 3 8

22 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR dozunda Şanlıurfa popülasyonunda % 30.0, Kahramanmaraş popülasyonunda ise % 7.5 embriyo elde ettiklerini bildirmişlerdir. Terzioğlu ve ark. (2000), tarafından Kahramanmaraş biber populasyonunda anter kültürü yapılarak, iki farklı inkübasyon koşulunun embriyo oluşumu üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Denemeler sonucunda 29 0 C de ve sürekli ışıklandırılan koşullarda bekletilen anterlerden elde edilen embriyo sayısı, ilk sekiz gün 35 0 C ve karanlıkta tutulan, daha sonra fotoperiyodik düzende aydınlatılan ve 25 0 C ye ayarlanmış iklim odasında bekletilen anterlerden elde edilen embriyo sayısından daha fazla bulmuşlardır. Çiner ve Tıpırdamaz (2002), Capsicum annuum L. tomurcuklarına 4 0 C de 48 ve 96 saat sürelerde bekletilerek yapılan soğuk şoku uygulamalarının, besin ortamına % 0.25 oranında aktif kömür katılmasının embriyo oluşumuna etkileri incelemişlerdir. MS temel besin ortamına 4 mg mg/l Naftalen Asetik Asit (NAA) ve 1 mg/l Benzil Adenin (BA) veya 1 mg/l NAA ve 4 mg/l BA, % 0.8 agar ve % 3 sakkaroz katılmıştır. En yüksek embriyo oluşumu 4 mg/l NAA ve 1 mg/l BA ve aktif kömür içeren MS besin ortamında kültüre alınan hiçbir ön uygulama yapılmayan kontrol grubu anterlerinden elde edilmiştir. Ortalama androgenik embriyo oluşumu % 12.5 civarında olduğunu belirlemişlerdir. Besin ortamına katılan büyüme düzenleyicileri ve aktif kömürün biber anter kültüründe embriyo oluşturma frekansı üzerinde, soğuk şoku uygulamalarına göre daha etkin olduğu belirlenmiştir. Diğer yandan bu biber genotipinin mikrospor gelişim aşamalarını araştırmışlardır. Sitolojik incelemeleri asetokarmin ezme yöntemi ve parafin metodu kullanılarak yapmışlardır. Tomurcuk büyülükleri, tomurcuk ve anter morfolojileri tanımlanmış ve mikrospor aşamalarını belirlemişlerdir. Çapı 5 mm, uzunluğu 7 mm olan, korolla seviyesinin kaliks ile aynı veya biraz daha uzun olduğu gelişme dönemindeki tomurcukların tek çekirdekli ve 1. polen mitozu aşamasındaki mikrosporları içerdiğini saptamışlardır Ellialtıoğlu ve Tıpırdamaz (2002), ülkemizde biberde anter kültürü yoluyla ilk çalışmaların Abak (1983) tarafında yapılmış olduğunu, Türkiye orijinli biber genotiplerinde uygun besi ortamında % e kadar ulaşan haploid bitki elde edildiğini bildirmiştir. Bu yöntemle oluşan haploid bitkilerin kromozom sayıları 9

23 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR katlanarak elde edilen saf hatlar, çeşit geliştirmeye yönelik ıslah programlarında kullanılmıştır. Ercan ve ark., (2001) 5 adet biber çeşidinde yaptıkları anter kültürü çalışmasında 3 farklı besin ortamının kinetin, BA, NAA, 2,4-D ve aktif kömür içeren toplam 11 farklı versiyonunu kullanmışlardır. Araştırmada, %1 aktif kömür+5 mg/l 2,4-D+5 mg/l kinetin içeren ortamlar ile aktif kömür+4 mg/l NAA+0.1 mg/l BA içeren MS besin ortamında, 35 C de 8 gün karanlıkta bekletilen anterlerden embriyo elde edilebilmiştir. Ellialtıoğlu ve Tıpırdamaz, (2002) 11B14 ve Demre Sivrisi biber çeşitlerine ait çiçek tomurcuklarına yapılan soğuk şoku uygulamalarının ve besin ortamına çift fazlı sistemde katılan aktif kömürün; anter kültüründe, anterlerdeki içsel absisik asit miktarı üzerine etkilerini inceledikleri çalışmalarında; denemelerde kullanılan soğuk şokları ve aktif kömür katkısının, anterlerdeki ABA miktarını azaltırken; embriyo oluşturma yönünde olumlu bir etki yapmadığı bildirmişlerdir. Rodeva ve ark. (2004), 20 Bulgaristan biber genotipinin anter kültürüne uygunluğunu denedikleri çalışmasın 2 genotip indirek organagesis olurken diğer genotipler direk embriyogenesis olduğunu bildirmişlerdir. Çağlar ve ark. (2004), Kahramanmaraş kırmızı biberlerinde (Capsicum annuum L.) androgenesis yoluyla in vitro haploid embriyo oluşturma amaçladıkları çalışmalarında MS ortamına eklenen NAA, 2,4-D, ve ile sitokininlerden BAP ve kinetinin farklı dozları, ayrıca besin ortamlarına eklenen aktif kömür (% 0.25) ve AgN0 3 (10 mg/l) dozları ve yedi gün süre ile 4 o C, 29 o C ve 35 o C karanlık ön uygulamasının 37 farklı kombinasyonu denemişler; bazı ortamlarda sadece kallus olurken, MS + 0.1mg/l BAP + 4 mg/l NAA + % 0.25 aktif kömür + 10 mg/l AgNO 3 bileşimli besin ortamına dikilen anterlerde hiç kallus gelişimi olmadan % 2.8 oranında haploid embriyo gelişimi sağladıklarını bildirmişlerdir. Büyükalaca ve ark. (2004), biber bitkisinde İn vitro da anter kültürü yöntemi ile haploid embriyo üretimi için besin ortamalarına eklenen dört farklı gümüş nitrat konsantrasyonunu (5, 10, 15, 20 mg/l) test etmişlerdir. Anterleri hem açık alandan hemde serada yetiştirilen bitkilerden toplamışlar, test edilen bütün konsantrasyonlarda farklı üretim oranlarıyla haploid embriyo oluşumu 10

24 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR gözlemlenmişlerdir. En yüksek embriyo veriminin 15 mg/l gümüş nitrat içeren ortamdan elde edildiğini, ve serada yetiştirilen bitkilerden alınan anterlerin, açık alanda yetiştirilen bitkilerden alınan anterlere göre daha fazla embriyo verdiğini bildirmişlerdir. Mohamed ve Refaei (2004), yazlık kabaklarda yaptıkları çalışmada tohum ekimlerini Mart, Nisan ve Mayıs ile Eylül, Ekim ve Kasım aylarında gerçekleştirmişler ve bitkilerden anterleri kültür ortamlarına alarak kallus ve bitkiye dönüşümünü incelemişlerdir. Gün uzunluğunun daha az, sıcaklığın düşük olduğu Mart, Ekim ve Kasım aylarında kallus çapı ve rejenere olmuş bitki oranının diğer aylara göre yüksek olduğunu bildirmişlerdir. Rejenere olan bitkilerin sitolojik olarak incelediklerinde de ise % 60 nın haploid % 23 nın diploid % 17 sinin aneuploid olduğunu bulmuşlardır. Taşkın (2005), biberde anter kültürü ile ilgili yaptığı bir çalışmada; Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsünde üç defa kendilenmiş düşük sıcaklığa tolerant olarak belirlenen A71, A269, A313 nolu genotipleri, orta derecede tolerant olarak belirlenen A109 nolu genotipi ve duyarlı olarak belirlenen A74 nolu genotipi ve dört farklı kültür ortamı kullanmıştır. Denenen 5 farklı genotip anterler farklı zamanlarda kültüre almıştır. Ayrıca kültüre alınan ortamlarda gelişmesini tamamlayamayan embriyolar 10 gün süresince 0.5 mg/l absisik asit içeren besin ortamına alınarak absisik asitin embriyo olgunlaşmasına etkisi belirlenmeye çalışmıştır. Denemenin sonucunda gerek embriyo oluşumu gerekse oluşan embriyoların bitkiye dönüşümünün genotiplere, anter alma dönemlerine ve besin ortamlarına göre farklı olduğunu ve genotipler arasında en yüksek embriyo verimini soğuğa tolerant olarak belirlenmiş olan 269 nolu genotipten, anter alma dönemlerinden ise en başarılı sonuçlar Nisan ve Mayıs aylarından elde ettiğini, besin ortamları arasında ise (MS + 30 g/l sakkaroz + % 0.25 aktif kömür + 15 mg/l gümüş nitrat + 4 mg/l NAA + 1 mg/l BAP) ve (modifiye edilmiş MS + 30 g/l sakkaroz + % 0.25 aktif kömür + 15 mg/l gümüş nitrat + 4 mg/l NAA + 0.1mg/l BAP) diğer ortamlara göre daha fazla sayıda embriyo tespit etmiştir. Ayrıca olgunlaşmamış embriyolara absisik asit uygulamasından olumlu bir sonuç alınamadığını bildirmiştir. Sayılır ve Özzambak (2005), 6 kültür çeşidi kullanarak 3 tomucuk büyüklüğü 11

25 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ve MS ve N temel besin ortamalarına eklenen 4 mg/l NAA+ 0.1 mg/l BA aktif karbon ve havuç eksraktı ve bunlardan hiçbirinin eklenmediği 6 farklı kültür ortamı kullanarak yaptıkları çalışmalarında, Çarliston Bağcı 5-6 mm tomurcuk büyüklüğü ve MS+4 mg/l NAA+ 0.1 mg/l BA % 0.1 aktif kömür ve 200 ml havuç ekstraktı en iyi sonucu verdiğini bildirmişlerdir. Ercan ve ark. (2006), donör bitkinin yetiştirme mevsimi ve yaşının anter kültüründe embriyo oluşumuna etkisini araştırmışlar; Sera Demre 8 ve Kekova F1 çeşitlerini kullanarak yaptıkları çalışmada kış sezonunda Sera Demre 8 çeşidi en yüksek embriyo vermiş, her iki çeşitte de en yüksek embriyo oranına 4 aylık bitkilerden alınan anterlerden elde etmişlerdir. Koleva-Gudeva ve ark. (2007), 5 farklı ortam, 3 farklı ön uygulama ve 9 genotip ile biberde yaptıkları anter kültürü çalışmasında ortamlar ve genotipler arasında farklılık olduğunu bildirmişlerdir. Nowaczyk ve Kisia (2006), ıslah hatları ATZ1, PO ve bunların melezi ile yaptıkları anter kültürü çalışmasında anderogenesis % 40 ile ATZ1, % 3.0 PO ve % 1,5 ATZ1 x PO olduğunu bildirmişlerdir. En uygun safhanın taç yaprağın çanak yaprağa eşit veya daha uzun olduğu safha olduğunu tespit etmişlerdir. Keiffer ve ark., (1992) alabaş da yaptıkları anter kültürü çalışmasında kullandıkları 6 genotipde yüksek oranda embriyo elde ettiklerini bildirmişler. Ayrıca kültür süresince mikrospor canlılığını incelemişler, kültürün 9. günü canlı mikrospor oranının % 0 a kadar düştüğünü mikrospor canlılığı ile embriyo verimi arasında ilişkinin olmadığını ve kültürün ilk günlerinde yüksek sıcaklığa mikrosporların hassas olduğunu bildirmişlerdir. Kaltchuk-Santos (1997), 2 adet erken çiçeklenen Brezilya soya fasulyesi çeşitlerine C ön soğuk uygulaması yapmıştır. 0, 5, ve 10. gün soğuk şoku uyguladıkları bitkilerden çiçek tomurcukları toplayarak yaptıkları anter kültürü çalışmasında ilk 4 hafta mikrospor bölünmesini incelemişler, ön soğuk uygulamasının simetrik bölünmeyi veya çoklu çekirdek varlığını etkilemediğini bildirmişlerdir. Çok çekirdekli yapıların simetrik veya asimetrik bölünme sonucu olabiliceğini bildirmişlerdir. Kallus ve embriyo uyartımı için en iyi ortamın B

26 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR mg/l 2,4-D ve 0.5 mg/l BA olduğunu bildirmişlerdir. Histolojik analizin bu sonuçları desteklediğini bildirmişlerdir. Nitta ve ark. (1997), kolza ve lahana üzerinde yaptıkları anter kültürü çalışmasıda kültürün ilk 24 saatinde mikrosporun hacimsel olarak büyüdüğünü ve embriyonik ve embriyonik olmayan mikrosporların aynı özellikleri taşıdığını, bundan sonra embriyonik mikroporların 2 farklı morfolojik değişikliğe uğradığını, birincisi hücre hacminin çimlenme açıklığından genişlediğini, ikncisi mikrospor yığınlarının hücre yüzeyinde hacimsel olarak büyüdüğünü, binucleate mikrosporların bölünmesini ilk üç günde meydana geldiğini ve mikrospor bölünmelerin sırasıyla kolzada % 42.8, 61.8 ve 56.8 asimetrik, % 43.2, 38.2 ve 57.2 si simetrik, lahanada ise % 94.8, 81.4 ve 78.5 asimetrik, % 5.4, 18.6 ve 21.5 simetrik olduğu, bildirmişlerdir. Peng ve ark. (1997), farklı büyüklükteki kuşkonmaz çiçek tomurcuklarını , , , , ve mm olarak erken, orta ve geç tek çekirdekli olarak sınıflayarak 7 gün soğuk ön uygulamaya tabii tuttuktan sonra çiçek tomurcuklarının safhalarının değiştiğini bildirmişlerdir. Bu aşamada yaptıkları incelemede tek hücreli mikrosporların simetrik olarak daha çok bölündüğünü bildirmişlerdir , , mm büyüklüğünde çiçek tomurcukları için bölünmenin % 4.9, % 27.2 ve % 11.4 oranında simetrik gerçekleştiği bildirilmiştir , , mm büyüklüğünde tekrar sınıflanan çiçek tomurcuklarında çıkartılan anterler 500 mg/1 cassein hydrolysate, 800 mg/1 glutamine, 2000 mg/l maya ekstraktı, 2 mg/1 NAA, 1 mg/l BA ve % 6 sukroz içeren MS kültür ortamına dikmişler, mikrosporun kallus üretimi ile geç tek çekirdekli mikrospor aşaması arasında önemli bir ilişki bulmuşlardır. Kuşkonmazda simetrik ilk bölünme ile mikrospor androgenesisinin meydana geldiği bildirmişlerdir. Pescitelli ve Petolino (1998) mısır anter kültüründe in vivo ve in vitro mikrospor gelişmesini belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmada; farklı zamanda kültüre alınan anterlerde mithramycin boyama yardımıyla floresan mikroskobu ile anormal mikrospor bölünmesi, çok çekirdekli kütleler, ve embriyo benzeri yapıları incelemişlerdir. Anormal mikrospor bölünmesinin kültürün 7. günü en yüksek seviyeye çıktığını, vejetatif hücrelerin bölünmesinin % 50 yi aştığını, çok çekirdekli 13

27 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR kütlelerin ve embriyo benzeri yapıların ilk olarak 14 günde ortaya çıktığını ve mikrosporların çoğunluğunun çok çekirdek yapıya ulaşamadığını bildirmişleridir. Kim ve ark. (2004), yaptıkları sitolojik çalışmada 0.1 mg/l NAA ve 0.1 mg/l kinetin içeren ortamlara anterleri yerleştirmişler ve yerleştirilen anterlerde 0, 2, 4, 7, 9, ve 14. günlerde DAPİ boyama yöntemi ile mikrosporların gelişimini incelemişlerdir. Anter kültürünün ikinci gününden itibaren ölü polen sayısında önemli bir artış gözlemlemişlerdir. Kültürün 4. gününden itibaren vegetatif çekirdek bölünmesi sonucu oluşan 4 ve daha fazla miktarda hücre çekirdeğinin görüldüğünü ve genaratif çekirdek bölünmesi sonucu oluşan bir embriyoya rastlamadıklarını bildirmişlerdir. Pintos ve ark (2005), mantar meşesi (Quercus suber L.) bitksinde yaptıkları anter kültürü çalışmasında; ilk 4 hafta kültüre alınan anterleri sitolojik yönden incelemişlerdir. Mikrosporların çoğunluğunun ön sıcaklık uygulamasına olumlu tepki verdiğini, ön sıcaklık uygulamasının simetrik bölünmeyi teşvik ettiğini, simetrik olarak bölünmeye başyan mikrosporların çoğunluğunun proembriyoyu oluşturduğunu, kültürün 24. günü globuler ve kotilodenal embriyonun gözlendiğinin ve bu embriyoların bitkiyi oluşturduğunu bildirmişlerdir. Gonzalez ve Jouve (2005) üç tritikale genotipinin anterlerini 2 hafta C de ön uygulamaya tabi tuttuktan sonra; 2 farklı dozda 2,4-D içeren N6 ortamı içerisine anterleri dikmişler ve 0, 1, 2, 3, 5, 8, 10, 14 ve 21. günlerde ortamlardan alınarak mikrospor bölünmesini inceledikleri çalışmalarında, ön uygulama süresince mikrosporlar yaşarken kültürün ilk gününden itibaren ölmeye başladığını, ölüm oranlarının 21 günde % arasında değiştiğini, simetrik bölünme ortamlarda % asimetrik bölünme ise % olarak gerçekleştiğini bildirmişlerdir Supena ve ark., (2005), biberde yapmış oldukları mikrospor çalışmasında kültürün ilk haftasından itibaren çekirdek bölünmesinin gerçekleştiği, boş mikrosporların arttığı ve mikrosporların düşük oranda bölünerek embriyo elde ettiklerini bildirmişlerdir. Bal ve ark. (2009), tütün mikrospor embriyogenesinde kullanılan protokolu modifiye ederek patlıcan mikrosporları üzerinde kullanmışlardır. B ortamına 14

28 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR mannitol ekleyerek 6 gün süresince 33 0 C stres uygulanan mikrosporların ve AT3 ortamına aktarıldığını ve daha sonra +4 0 C, C ve C de 2 gün süresince inkübe edildiğini, ön uygulamadan sonra 0.25 M maltoz içeren AT3 ortamına tranfer edildiğini ve 25 0 C karanlık koşullarda tutulduğunu bildirmişlerdir. Bu uygulamalara tabi tutulan mikrosporların 1 ve 2 hafta sonra çok çekirdekli yapılar oluşturduğunu ve DAPİ boyama yardımıyla gözlemlediklerini bildirmişlerdir. Simetrik bölünmenin 2 gün 33 0 C uygulamaya tabi tutulan sadece tek çekirdekli mikrosporlarda % 19.4 oranında gerçekleştiğini bildirmişlerdir. Zhang ve ark. (2009), yapmış oldukları sitolijik ve histolojik çalışmada floresans mikroskobu, ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu ile anter kültürü için ortamlara konan anterleri incelemişler, ölü mikrospor oranının kültürün ikinci gününden itibaren dramatik bir şekilde arttığını bildirmişlerdir. Ortamlara konan anterlerde 2 farklı gelişme tipinin olduğunu bildirmişlerdir. İlk çekirdek bölünmesi asimetrik olarak meydana geldiğini ve ortaya 2 hücreli tipik polen ortaya çıktığını ve embryonun da polen hücresinin vejataif çekirdeğinin asimetrik olarak devamlı bölünmesi ile meydana geldiğini bildirmişlerdir. 15

29 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 16

30 3.MATERYAL METOT 3.MATERYAL VE METOT Bu çalışma yılları arasında Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü Uygulama Alanı ve Doku Kültürü Laboratuarında ve Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Sitoloji Laboratuarında yürütülmüştür. Araştırmada kullanılan bitkisel materyaller Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü nün biber ıslah materyalleridir Materyal Denemede Kullanılan Genotipler ve Özellikleri Çalışmada kullanılan bitkisel materyaller Keleş (2007) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada düşük sıcaklığa toleransı ve hassasiyeti belirlenmiş olan 421 ve 195 notu genotipler ile Yüksek Sıcaklıklara Toleranslı Güney Doğu Anadolu Bölgesine Uygun Biber (Capsicum Annuum L.) Genotiplerinin Belirlenmesi Projesi kapsamında seçilen ve İnan 3363 adı ile çeşit tescili yapılan genotip ile yüksek sıcaklıklara hassasiyeti bilinen 277A genotiplerdir. 277A Nolu genotip: Yüksek sıcaklığa sıcaklığa duyarlı olduğu belirlenmiştir. Çarliston biber tipindedir. Gövde uzunluğu yaklaşık 28 cm. gövde de orta tüy oluşumu vardır. Yaprak rengi koyu yeşildir ve yapraklar mızrak şeklindedir. Yaprakta tüy oluşumu ortadır. Taç yaprak rengi beyazdır. Taç yapraklar çan şeklindedir. Çanak yaprakta renklenme yoktur. Anter rengi mavi, filament rengi sarıdır. Meyve şekli sivridir. Şekil 3.2 de 277A nolu genotipe ait görünüm yer almaktadır. 17

31 3.MATERYAL METOT Şekil A nolu genotipe ait görünüm 195 nolu genotip: Düşük sıcaklığa duyarlı olduğu belirlenmiştir. (Keleş 2007). Süs biber tipindedir. Gövde uzunluğu yaklaşık 32 cm dir. Gövde de tüy oluşumu azdır. Yaprak rengi yeşildir ve yapraklar mızrak şeklindedir. Yaprakta tüy oluşumu azdır. Taç yaprak rengi beyazdır. Taç yapraklar çan şeklindedir. Çanak yaprakta renklenme yoktur. Anter rengi mavi, filament rengi beyazdır. Meyve şekli sivridir. Şekil 3.2 de 195 nolu genotipe ait görünüm yer almaktadır Şekil nolu genotype ait görünüm 18

32 3.MATERYAL METOT 421 nolu genotip: Düşük sıcaklığa toleranslı olduğu belirlenmiştir (Keleş 2007). Sivri biber tipidir. Gövde uzunluğu yaklaşık 10 cm dir. Gövde de tüy yoğunluğu azdır. Yaprak rengi koyu yeşildir ve yaprak şekli ovaldir. Yapraklarda tüy oluşumu seyrektir. Taç yaprak rengi beyazdır. Taç yapraklar çan şeklindedir. Çanak yaprakta renklenme yoktur. Anter rengi açık mor, filament rengi beyazdır. Meyve şekli sivridir. Şekil 3.4 de 421 nolu genotipe ait görünüm yer almaktadır. Şekil nolu genotipe ait görünüm İnan 3363: Yüksek sıcaklığa toleranslı olarak, Güneydoğu Anadolu bölgesinde seleksiyon yolu ile ıslah edilmiştir. Dolmalık biber tipindedir. Kurutularak toz biber yapımında kullanılmaktadır. Olgunluk öncesi yeşil meyve renkli dar üçgen meyve yapısına sahiptir Şekil 3.4 de 3363 nolu genotipe ait görünüm yer almaktadır. 19

33 3.MATERYAL METOT Şekil 3.4. İnan 3363 kültür çeşidine ait görünüm 3.2. Metot Bitkilerin Yetiştirilmesi Büyükalaca ve ark. (2004) tarafından yapılan bir çalışmaya göre sera koşullarında yetiştirilen donör bitkilerin embriyo uyartımının açık koşullarda yetiştirilen bitkilere göre daha yüksek bulunduğu bildirilmiştir. Bu sebeple bu çalışmada bitkiler sera koşullarında yetiştirilmiştir. Çizelge 3.1 de bitkilerin yetiştirilme dönemi ve çalışma programı gösterilmiştir. Çizelge 3.1. Bitkilerin yetiştirilme dönemleri ve çalışma programı Tohum ekimi Fide dikimi Tomurcuk Alınma Zamanı 27/07/ /09/2009 Ekim 2009 Kasım 2009 Aralık 2009 Ocak 2010 Şubat 2010 Mart 2010 Nisan /02/ /04/2010 Mayıs 2010 Haziran 2010 Temmuz 2010 Ağustos 2010 Eylül