4/1/2013. Gıdalarda Karbonhidrat Tayinleri. Karbonhidratların sınıflandırılması. Bazı bitkisel ve hayvansal gıdaların karbonhidrat oranları

Transkript

1 Gıdalarda Karbonhidrat Tayinleri GIDA ANALİZLERİ-7 KARBONHİDRAT ANALİZLERİ Karbonhidratlar, genel olarak C n (H 2 O) n formülü ile gösterilen organik bileşiklerdir. Bunlar bitkilerde fotosentez yoluyla sentez edildikleri için çoğunlukla bitkisel gıdalara özgü bileşenlerdir. Ancak hayvanlarda da birçok hayati dokunun yapı maddesi olarak bulunabilirler. Yine hayvanlar ve özellikle bitkiler, kullanmadıkları enerjiyi karbonhidrat olarak depolayabilirler. Hayvanlarda glikojen, bitkilerde nişasta depo karbonhidratları olarak bulunur. Bazı bitkisel ve hayvansal gıdaların karbonhidrat oranları Bitkisel gıda % Hayvansal gıda % Toz şeker 99 Bal 81 Pirinç 78 Dondurma 18 Un 74 İnsan sütü 6 Reçel 65 İnek sütü 5 Ekmek 52 Karaciğer 3 4 Muz 21 Et 1 Elma 12 Yumurta Portakal suyu 10 salatalık 2 Karbonhidratların sınıflandırılması Moleküldeki basit şeker ünitelerinin sayısına göre; Monosakkaritler: Basit şekerler olarak adlandırılan ve gıdalarda fazlaca bulunan en önemli karbonhidrat gurubudur. Örneğin, glikoz, galaktoz, mannoz ve früktoz Disakkaritler: İki monosakkaritin birleşmesiyle meydana gelmişlerdir. Örn; sakkaroz (glikoz-fruktoz), Laktoz (glikoz-galaktoz), maltoz (glikozglikoz) Oligosakkaritler:İkiden daha fazla (3-10) monosakkaritin birleşmesiyle meydana gelmiş şekerlerdir. Örn. Raffinoz (glikoz-galaktoz-fruktoz), stakioz (galaktoz-galaktoz-glikoz-fruktoz). Polisakkaritler: Yapısında 10 veya daha fazla ( ) monosakkarit molekülü içeren karbonhidratlardır. Örneğin, nişasta, selüloz, pektin Karbonhidratların sınıflandırılması Bulundukları yere göre a. Hayvansal kaynaklı karbonhidratlar (glikojen, laktoz) b. Bitkisel kaynaklı karbonhidratlar (selüloz, nişasta) c. Mikrobiyal kaynaklı karbonhidratlar (dekstran, ksantan gum) Fonksiyonlarına göre a) Çatı ve iskelet maddesi olanlar (selüloz, hemiselüloz, lignin) b) Depo maddesi olanlar (nişasta, glikojen) c) Jelleşme özelliği gösterenler (pektin) Karbonhidratların genel özellikleri Optikçe aktiflik: Bazı karbonhidratlar doğrusal polarize ışığın salınım düzlemini değiştirme özelliğine sahiptirler. Hidroliz: Karbonhidratlar, konsantre asit veya enzimlerle hidrolize olarak yapı taşlarına kadar parçalanabilirler. Suda çözünürlük: Genel olarak karbonhidratların molekül ağırlıkları arttıkça, suda çözünürlükleri de azalır. Tatlılık gücü: Genelde karbonhidratların molekül ağırlıkları büyüdükçe, tatlılık dereceleri azalmaktadır 1

2 Karbonhidratların genel özellikleri Karamelize olabilme: Bazı karbonhidratlar o C lerde ısıtıldıklarında kahverengiye dönüşürler. Fermantasyon: Bazı karbonhidratlar çeşitli mikroorganizmalarda (bakteri, maya vb) bulunan enzimlerle fermente olarak etilalkol, laktik ve asetik asit gibi ürünlere parçalanırlar. Jelleşme: Bu özelliğe sahip olan polisakkaritler agar, pektin ve bir dereceye kadar nişastadır. Koyulaştırıcı özellik: Bazı organizma ve bitkilerden elde edilen polisakkarit yapısındaki gumlar ile nişasta gıda sanayinde koyulaştırıcı ajan olarak kullanılmaktadır. Karbonhidratların genel özellikleri Osmotik basınç: Bazı karbonhidratlar belli bir konsantrasyona ulaştıkları zaman osmotik basınç göstererek antimikrobiyel etki yapabilirler. Antinütrisyonel etki: Yine bazı karbonhidratlar beslenme üzerinde olumsuz bir etki gösterebilirler. Örn, laktoz, bazı kişilerde bağırsak hastalıklarına neden olur. Spesifiklik: Bazı karbonhidratlar, belirli gıdalara özgüdür. Örn, inülin sadece yer elmasında, graminin ise çavdarda bulunan früktanlardır. Diyet lifi: Normal şartlarda asit, enzim vb etkilerle parçalanamayan karbonhidratlar diyet lifi olarak isimlendirilirler ve beslenmede çok önemli bir yere sahiptirler. Özellikle selüloz, hemiselüloz, lignin, pektinler bu grupta yer alır. Karbonhidratların gıdalardaki genel fonksiyonları Karbonhidratlar, bitki ve hayvanlar için besin ve enerji kaynağı olarak fonksiyon görür. Bitkisel gıdalar için tekstür ve yapı maddesi olarak görev yaparlar. Gıdaların tat ve lezzeti açısından önemlidirler. Bazı işlenmiş gıdalarda (ekmek, kek, jöle, dondurma, şekerleme, reçel vb) arzu edilen tekstür ve yapının oluşumu için önemlidirler. Yine birçok gıda maddesinde renk oluşumu için önemlidirler (örn, esmerleşme, karamelizasyon ve maillard reaksiyonları gibi) Karbonhidratların gıdalardaki genel fonksiyonları Fermente gıdaların hazırlanması sırasında asit ve diğer birçok aroma bileşiklerinin oluşumu için gereklidirler. Diğer gıdaların vücutta hazmedilmesi ve dışarı atılmasına yardım ederler. Bazı meyve sularının durultulmasında fonksiyon görürler (özellikle pektinler). Yine bazı gıdaların muhafazasında önemlidirler. Örn, gıdaya sakkaroz, fruktoz, invert şeker ilave edilerek gıdaların dayanıklılığı artırılabilir. Gıdalarda karbonhidrat tayini yapılmasının nedenleri Gıdalarda karbonhidrat tayini yapılmasının nedenleri Gıdanın genel bileşim analizlerinin yapılmasında karbonhidrat tayinlerinin yapılması gereklidir. Gıda maddelerinin enerji değeri ve besin içeriğinin belirlenmesinde yine karbonhidrat tayinlerinin yapılmasına gerek duyulur. Bazen karbonhidrat tayinleri, fermente gıdaların üretiminde fermente olabilir karbonhidrat oranının belirlenmesinde kullanılır. Bazı meyvelerin olgunluk seviyelerinin tespitinde karbonhidrat tayinlerinden yararlanabilir. Bitkisel gıdalar karbonhidratça zengindir. İşlenmiş bazı hayvansal gıdalara bitkisel kökenli gıdaların katılıp katılmadığının belirlenmesi de yine toplam karbonhidrat tayini ile gerçekleştirilir. Bazı gıdalarda çözülebilir ve çözünemez karbonhidratların miktarı çok önemli bir kalite kriteri olabilmektedir. Gıdalarda koruyucu amaçla katılan karbonhidratlar (şekerler) için, ortamda osmotik basınç için yeterli şeker olup olmadığının belirlenmesi amacıyla bu tayinler yapılmaktadır. Şeker endüstrisinde, şeker ekstraktında ve posada kalan şeker miktarının belirlenmesi amacıyla karbonhidrat tayinleri yapılır. 2

3 Gıdalarda karbonhidrat tayini yapılmasının nedenleri Gıdalarda taklit ve tağşiş olup olmadığının tespit veya kontrolünde çeşitli karbonhidrat tayinlerinde başvurulur. Örn; Çeşitli et ürünlerine bitkisel dolgu maddelerinin (selüloz, nişasta, mısır şurubu vb) katılıp katılmadığının belirlenmesinde bazı şeker veya karbonhidrat testlerine baş vurulur. Balın suni olup olmadığı da diğer bazı testlere ilaveten hidroksi metil furfural (HMF) tayini ile belirlenir. Şayet balda HMF oranı fazla ise bal sunidir denilir, çünkü bu bileşik balda ya hiç bulunmaz yada çok az bulunur. Gıdalarda karbonhidrat tayinleri Kalitatif analiz metotları Bu metotlarla bazı gıdalarda karbonhidratların varlığı veya yokluğu araştırılır. Molisch Testi: karbonhidratların derişik H 2 SO 4 ile monosakkarite kadar parçalanmasından sonra dehidrate olarak furfurallara dönüşmesi ve bunların da a-naftol ile mor menekşe renk vermesi ile karbonhidrat varlığı test edilir Bazı gıda maddelerine (örn, et ve fırın ürünlerine) bazen süt tozu veya peynir altı suyu gibi ürünleri katılır. Bu gibi durumlarda gıdalarda laktoz tayini yapılır. OH -naftol Benedict testi: Bu testte de, bazı şekerlerin indirgenlik özelliklerinden yararlanılarak tayin işlemleri yapılır. Burada, karbonhidrat alkali şartlarda okside edilir ve bazı elementlerin indirgenmesi sağlanır (Örneğin bakır (+2) bakır (+1) e indirgenir. Barfoed Testi: bakır asetat ve asetik asitten oluşan çözelti kullanılır. Her iki testte Cu +2 iyonları indirgenerek (Cu +1 ) haline dönüşür ve kırmızı-pas renkli Cu 2 O çökeltisi meydana gelir. Zayıf asit çözeltilerinde monosakkaritler disakkaritlerden daha kolay indirgenirler. Bu nedenle bu test, ph ve ısıtma süresi dikkatle ayarlanarak mono ve disakkaritlerin ayrımında kullanılabilir Seliwanoff testi: Bu testle şekerlerin keton gruplarından faydalanılarak karbonhidrat analizleri gerçekleştirilir. Bial s Testi: pentozlar için (riboz, ksiloz vb.) spesifiktir. Pentozlar sıcak HCl ile hızla furfurallara dönüşür. Ferrik iyonlar ve orsinol varlığında furfurallar mavi-yeşil ve zeytin rengi oluşturur. Fruktoz vb. şekerlerin derişik asitlerle dehidrasyonu ile oluşan HMF, resorsinol ile reaksiyonu sonucu kırmızı- turuncu renk verir. CH 3 OH HO OH OH orsinol resorsinol 3

4 Kantitatif metotlar İyot testi: Bir çok polisakkaritin iyot ile reaksiyona girerek maviden siyaha kadar değişen bir renk verdiği bilinmektedir. Bu test özellikle nişasta tayininde kullanılmaktadır. Kantitatif metotlarla karbonhidratların miktarları belirlenebilmektedir. Gıdalarda karbonhidrat analizleri için aşağıdaki işlem basamaklarının bir kısmının veya tümünün yapılması gerekebilir. Bunlar; 1. Tayin amacına göre gıda içerisindeki bazı karbonhidratların ekstraksiyonu 2. Gıda içerisindeki renk veren diğer bileşiklerin uzaklaştırılması (pigment vb) 3. Suda çözünen veya çözünmeyen diğer bileşenlerin uzaklaştırılması Kantitatif Karbonhidrat Analizlerinde Kullanılan Temel Analiz Yöntemleri Optik analiz metotları Refraktif metotlar: Bir şeker çözeltisinin refraktif indeksi, o şekerin konsantrasyonu ile direkt olarak ilgilidir. Çeşitli şeker konsantrasyonlarına göre hazırlanan tablolar ile, Abbe veya el refraktometresinde okunan refraktif indeks değerleri karşılaştırılarak kantitatif tayinler yapılabilmektedir. El refraktometresi Dijital Abbe tipi refraktometre Polarimetrik metotlar: Optik rotasyon yöntemi adı da verilen bu metot, şekerlerin polarize ışık düzlemini, konsantrasyonları oranında çevirmeleri ilkesine dayanmaktadır. Bu yöntemde asimetrik karbon atomuna sahip şeker veya karbonhidratların, polarize ışığın yönünü belirli bir oranda çevirmesinden analiz ortamında bulunan optikçe aktif karbonhidratların miktarı kolaylıkla belirlenebilmektedir. Polarimetreler şeker endüstrisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Spektroskopik yöntemler UV-visible spektroskopisi ve kolorimetrik yöntemler: UV visible spektrofotometreler kullanılarak bir çok karbonhidratın analizi yapılabilmektedir. Örneğin karbonhidratlara sülfürik asit varlığında fenol çözeltisi ilave edildiğinde oluşan renkli kompleks 470 nm de ölçülerek bu karbonhidratların miktarı belirlenebilir. Bu amaçla farklı konsantrasyonlardaki karbonhidratların standart çözeltileri kullanılarak kalibrasyon eğrisinin çıkarılması gerekmektedir. Titrimetrik (indirgenme-yükseltgenmeye dayalı) metotlar Bazı şekerlerin ihtiva ettiği serbest aldehit ve keton gruplarının indirgenlik özelliğinden faydalanılarak gerçekleştirilen kimyasal analiz metotlarıdır. Luff-Schoorl Lane-Eynon Bu metotların en önemlisi Lane-Eynon metotudur. Bu metot invert şekerlerin fehling çözeltisindeki bakırı indirgemesi esasına dayanır. Bu metotla invert şeker ve toplam şeker tayini yapılabilir. 4

5 Biyokimyasal metotlar Kromatografik metotlar Enzimatik metotlar: Enzimatik metotlarda ise, mono, oligo ve polisakkaritlerin çeşitli enzimlerle muamele edilerek ortaya çıkan ürünlerden hareketle tayin işlemleri gerçekleştirilir. Bu amaçla α amilaz, β amilaz glikoamilaz, invertaz gibi enzimler kullanılır. Mikrobiyolojik metotlar: Bazı mayaların seçici fermantasyon özelliğinden yararlanılarak pentoz, heksoz, laktoz, maltoz gibi şekerlerin analizi yapılabilmektedir. Bu yöntemlerde çok az miktarlardaki karbonhidratlar bile tespit edilebilmektedir. Bu amaçla kullanılan metotlar, a. Gaz kromatografisi b. İnce tabaka kromatografisi c. Kolon kromatografisi d. İyon değiştirme kromatografisi e. Yüksek Basınçlı Sıvı romatografisi (HPLC) Ham selüloz tayini Ham selüloz tayini Bitkisel gıda maddelerinde bulunan ve insanlar tarafından sindirilemeyen ham selüloz, beslenme açısından ayrı bir öneme sahiptir. Ham selüloz örnekteki selüloz ve ligninin bir ölçüsüdür. Diyet lifi içinde yer alan hemiselüloz, pektinler ve hidrokolloidler asit ve alkali ile parçalandığı için ham selüloz bu maddeleri içermemektedir. Taze sebze ve meyvelerde selüloz miktarı, az olmasına rağmen, kartlaşmış (yani tazeliğini yitirmiş) olanlarda ise daha fazladır. Gıda içerisindeki yüksek ham selüloz oranı, kaliteyi düşüren en önemli faktörlerden birisidir. Ancak ham selülozun bir çok olumlu yönleri de mevcuttur. İnsanlarda bağırsak fonksiyonlarının düzenlenmesi ve kan LDL kolestrol seviyesinin düşürülmesinde ham selülozun, önemli rol oynadığı bildirilmektedir. Ham selüloz tayini Ham selüloz oranı belirlenecek yağı uzaklaştırılmış gıda örneği sırasıyla sülfürik asit ve sodyum hidroksit ile kaynatıldıktan sonra Gooch krozesinden süzülür. Kalıntı sırasıyla saf su, aseton ve eterle yıkanarak çözünmeyen kısmın miktarı saptanır. Nişasta tayini Gıdalarda en fazla bulunan depo polisakkaritlerden birisi nişastadır ve iki tip glikoz polimeri içerir. Amiloz düz zincirli Amilopektin dallanmış zincirli Bu fraksiyonlar basınç ve sıcaklık uygulaması ile birbirinden ayrılabildiği gibi nişasta, sıcak ve doymuş CaCl 2 çözeltisi ile ekstrakte edilebilir. Ayrıca amiloz iyot ile mavi renkli bir kompleks oluşturur. 5

6 Hidroksimetilfurfurol (HMF) HMF gıdalarda enzimatik olmayan esmerleşme reaksiyonlarında bir ara ürün olarak meydana gelir. Gıdada bulunan HMF ürüne uygulanan işlemin sıcaklığı ve süresi, depolama sıcaklığı ve süresi hakkında bilgi verir. Ürüne uygulanan ısıl işlemin sıcaklığı ve depolama sıcaklığı ne kadar yüksek olursa HMF nin miktarı da o denli yüksek olur. Gıdada HMF istenmemektedir. Ürünün tadında, renginde ve kokusunda istenmeyen değişikliklere yol açar. Meyvelerde doğal halde bulunmayan bu madde meyveye uygulanan ısıl işlemin şiddetine (sıcaklık-süre) paralel olarak ortaya çıkar. Bu madde miktarı meyve sularında bir kalite kriteri olarak değerlendirilmektedir. Ayrıca HMF normal olarak balın bir bileşeni değildir. Fakat çok az miktarda da olsa taze ballarda da bulunabilmesine rağmen, genellikle sıcaklığın ve depolamanın etkisi ile oluşur. Bundan dolayı baldaki HMF miktarı kalitenin önemli bir kriteri olarak kabul edilmektedir. Balın uzun süre depolanması ve yüksek sıcaklıkta ısıtılması sonucu bu oran, ppm e kadar yükselebilir. Bu oranın 150 ppm den daha yüksek bulunması bala invert şeker katıldığının bir belirtisi olarak kabul edilir. Hidroksimetilfurfurol (HMF) tayini Metodun esası, HMF nin paratoluidin ve barbutirik asit ile muamele edildiğinde renkli bir maddeye dönüşmesidir. Ortaya çıkan veya oluşan rengin absorbansı 550 nm de okunarak önceden hazırlanan bir kalibrasyon eğrisine göre miktar tayini yapılır. Yöntemin İlkesi Lane-Eynon Yöntemi Alkali ortamda ve kaynama sıcaklığında kompleks olarak bağlı Cu-2 iyonunun, indirgen şekerler tarafından Cu-1 okside indirgenmesidir. Buna göre; bir alkali-kompleks-cu çözeltisi, şeker içeren örnekten hazırlanmış çözeltiye kaynama sıcaklığında titre edilmekte ve titrasyonun son noktasını belirlemede redoks indikatörü olarak metilen mavisi kullanılmaktadır. Ortamdaki bakırın tümünün Cu-I okside indirgenmesi tamamlandıktan sonra metilen mavisi indirgenerek renksiz formuna dönüşmektedir. İşte rengin kaybolduğu bu anda titrasyona son verilir. Lane Eynon yöntemi ile şeker tayininde; örnekten doğrudan hazırlanan çözeltinin titrasyonu ile indirgen şeker İnversiyondan sonraki titrasyon ile toplam şeker bulunur. İkisi arasındaki farkın 0.95 ile çarpımıyla sakkaroz miktarı bulunur (1 mol sakkaroz inversiyonda 1 mol su alır ve 95 g sakkarozdan 100 g indirgen şeker oluşur) Örneğin Hazırlanması Şeker tayini yapılacak numune; taze meyve-sebze ise; belirli bir miktar doğrudan doğruya blenderde parçalanır (gerekirse su ilave edilir ve seyreltme faktörü göz önünde bulundurulur) Kuru gıda ise; belirli bir miktar tartılır ve ölçü balonuna ilave edilerek üzerine 60±5 o C deki saf su ilave edilip (250ml ye kadar) 30 dakika çalkalanır ve daha sonra soğutulur. İndirgen şeker miktarına bağlı olarak belirli bir miktar örnek alınması gerekir (çözeltisinin 1 ml sinde 1-3 mg invert şeker olması için). 6

7 Kullanılan Çözeltiler: 1. Fehling 1 çözeltisi: g (CuSO 4.5H2O) tartılır saf su il 1 L tamamlanır ve filtre edilir. 2. Fehling 2 çözeltisi: 346 g K-Na-tartarat.4H 2 O (Senyet tuzu / Rochelle tuzu) ve 100 g NaOH tartılır ayrı ayrı suda çözündürülerek birbirleri ile karıştırılır ve 1 L ye tamamlanarak 2 gün sonra filtre edilir. 3. İndirgen şeker stok çözeltisi: 9.5 g sakkaroz 100 ml lik ölçü balonu içerisinde saf su ile çözündürülür ve üzerine 5 ml derişik HCl eklenerek saf su ile 100 ml ye tamamlanır. Oda sıcaklığında 3 gün bekletilir ve saf su ile 1 l ye seyreltilerek invert şeker stok çözeltisi hazırlanmış olur. 4. İndirgen şeker standart çözeltisi: indirgen şeker stok çözeltisinden 50 ml alınarak 250 ml lik balon jojeye konulur. Üzerine 1-2 damla fenol fitalein damlatılarak 5N NaOH ile nötrleştirilir ve saf su ile çizgisine tamamlanır. Hazırlanan bu çözeltinin ml sinde 2 mg indirgen şeker bulunur. 5. Carrez 1 çözeltisi: 15 g potasyum ferrosiyanid (K4[Fe(CN6)].3H2O) saf suda çözündürülür ve 100 ml ye tamamlanır 6. Carrez 2 çözeltisi: 20 g çinko sülfat (ZnSO4.7H2O) saf suda çözündürülüp 100 ml ye tamamlanır. 7. metilen mavisi indikatörü (%1): 1 g metilen mavisi tartılır ve 100 ml ye tamamlanır. İşlem Faktör tayini: Faktör, 5 ml fehling 1 ve 5 ml fehling 2 çözeltilerinin indirgediği şeker miktarıdır. Bu miktarın belirlenmesinde indirgen şeker standart çözeltisi doğrudan doğruya kullanılır. Bu amaçla bürete indirgen şeker standart çözeltisi doldurulur. Daha sonra bir erlenmayere 5 ml fehling 1 ve 5 ml fehling 2 çözeltisi konur. Üzerine ml saf su ilave edilerek ısıtılmaya başlanır. Kaynamanın başlangıcından sonraki 2. dak nın sonuna doğru 2-3 damla metilen mavisi damlatılır. Ve hemen büretteki çözelti ile titasyona başlanır. Metilen mavisi damlatıldığında mavi olan renk bakır kırmızısı rengine dönüştüğünde titrasyona son verilir. Sonuç olarak: indirgen şeker standart çözeltisinin 1 ml sinde bulunan şeker miktarı ile titrasyon sırasında bu çözeltinin harcanan miktar çarpıldığında, faktör mg olarak bulunmuş olur. F= sarfiyat x harcanan çözeltinin ml sinde bulunan indirgen şeker miktarı İndirgen şeker tayini 1. Homojen hale getirilmiş örnekten tahmini şeker miktarına göre tartılıp 250 ml lik balon jojeye aktarılır. 2. Alınacak örnek miktarı örneğin şeker içeriğine göre farklılık gösterir. Miktar, durulmadan sonra filtre edilerek elde edilen şeker çözeltisinin ml sinde 1-3 mg olacak şekilde olmalıdır. 7

8 3. Balon jojeye gerekli miktar örnek alındıktan sonra, balon yarısına kadar saf su ile doldurulur. Tahmini indirgen şeker miktarına göre alınması gereken örnek miktarı İndirgen şeker oranı (%) Tartılacak örnek miktarı (g) Üzerine 10 ml Carrez 1 ve 10 ml Carrez 2 çözeltileri ilave edilir ve saf sul ile çizgisine tamamlanır. 5. Durultmanın gerçekleşmesi için bir süre beklendikten sonra filtre edilir 6. Titrasyon için bürete doldurulur ml lik erlenmayer içine 5 ml Fehling 1 ve 5 ml Fehling 2 doldurulur üzerine ml saf su eklenir 8. Faktör tayininde olduğu gibi titrasyon yapılır. Hesaplama V 2 xf İndirgen şeker miktarı (mg/g-ml)= VxV 1 V: titrasyonda harcanan çözelti miktarı (ml) V 1 : alınan örnek miktarı (ml-mg) V 2 : seyreltme hacmi (ml) F: faktör Toplam şeker tayini: indirgen şeker tayini için hazırlanan filtrattan 10 ml alınarak 100 ml lik ölçü balonuna konur. Üzerine 5 ml konsantre HCl yavaş yavaş ilave edilir Balonun kapağı kapatılarak sakkarozun inversiyonu için C lik su banyosunda 5 dak tutulur. Süre sonunda balon içeriği akan su altında soğutulur. Birkaç damla fenol fitalein damlatılarak 5 N NaOH ile nötralize edilir. Bunun sonrasında fenol fitaleinin verddiği kırmızı renk kayboluncaya kadar birkaç damla seyreltik HCl (0.5 N) eklenir. Daha sonra ölçü balonu çizgisine tamamlanır ve titrasyonda kullanılmak üzere bürete doldurulur. Daha önce anlatıldığı şekilde titrasyon yapılır Hesaplama V 2 xf x2 İndirgen şeker miktarı (mg/g-ml)= VxV 1 V: titrasyonda harcanan çözelti miktarı (ml) V 1 : alınan örnek miktarı (ml-mg) V 2 : seyreltme hacmi (ml) F: faktör 8